特許 6410909 軟骨形成促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6410909

(24)【登録日】2018年10月5日

(45)【発行日】2018年10月24日

(54)【発明の名称】軟骨形成促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/44 20060101AFI20181015BHJP

   A61K 38/40 20060101ALI20181015BHJP

   A61K 35/20 20060101ALI20181015BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20181015BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20181015BHJP

   A23L 33/19 20160101ALI20181015BHJP

   A23K 10/20 20160101ALI20181015BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20181015BHJP

   A23K 20/189 20160101ALI20181015BHJP

   A23K 20/158 20160101ALI20181015BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/44

   A61K38/40

   A61K35/20

   A61P19/02

   A61P43/00 111

   A23L33/19

   A23K10/20

   A23K20/147

   A23K20/189

   A23K20/158

【請求項の数】6

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-212956(P2017-212956)

(22)【出願日】2017年11月2日

(62)【分割の表示】特願2014-513374(P2014-513374)の分割

【原出願日】2013年4月30日

(65)【公開番号】特開2018-30880(P2018-30880A)

(43)【公開日】2018年3月1日

【審査請求日】2017年12月1日

(31)【優先権主張番号】特願2012-105509(P2012-105509)

(32)【優先日】2012年5月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】711002926

【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】高野 義彦

(72)【発明者】

【氏名】奈良 貴幸

(72)【発明者】

【氏名】加藤 健

(72)【発明者】

【氏名】森田 如一

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０８−１５１３３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／４４

Ａ２３Ｋ １０／２０

Ａ２３Ｋ ２０／１４７

Ａ２３Ｋ ２０／１５８

Ａ２３Ｋ ２０／１８９

Ａ２３Ｌ ３３／１９

Ａ６１Ｋ ３５／２０

Ａ６１Ｋ ３８／４０

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とし、前記乳由来塩基性タンパク質画分は、
１）ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分子量が３,０００〜８０,０００の範囲の数種のタンパク質よりなり、
２）９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含み、
３）タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなり、
４）タンパク質のアミノ酸組成は、塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有する、変形性関節疾患の予防、改善、治療剤。

【請求項2】

請求項１記載の前記変形性関節疾患の予防、改善、治療剤を含有する変形性関節疾患の予防、改善、治療用飲食品及び/又は飼料。

【請求項3】

乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とし、前記乳由来塩基性タンパク質画分は、
１）ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分子量が３,０００〜８０,０００の範囲の数種のタンパク質よりなり、
２）９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含み、
３）タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなり、
４）タンパク質のアミノ酸組成は、塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有する、変形性関節疾患の予防・改善用サプリメント。

【請求項4】

乳由来塩基性タンパク質画分の分解物を有効成分とし、前記乳由来塩基性タンパク質画分は、
１）ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分子量が３,０００〜８０,０００の範囲の数種のタンパク質よりなり、
２）９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含み、
３）タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなり、
４）タンパク質のアミノ酸組成は、塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有するものであり、
前記乳由来塩基性タンパク質画分の分解物の平均分子量が４０００以下である、変形性関節疾患の予防、改善、治療剤。

【請求項5】

請求項４記載の前記変形性関節疾患の予防、改善、治療剤を含有する変形性関節疾患の予防、改善、治療用飲食品及び/又は飼料。

【請求項6】

乳由来塩基性タンパク質画分の分解物を有効成分とし、前記乳由来塩基性タンパク質画分は、
１）ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による分子量が３,０００〜８０,０００の範囲の数種のタンパク質よりなり、
２）９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含み、
３）タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなり、
４）タンパク質のアミノ酸組成は、塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有するものであり、
前記乳由来塩基性タンパク質画分の分解物の平均分子量が４０００以下である、変形性関節疾患の予防・改善用サプリメント。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とする、軟骨形成を促進する軟骨形成促進剤、及びこの軟骨形成促進剤を配合した軟骨形成促進用食品又は飼料に関する。

【背景技術】

【0002】

軟骨は、関節や鼻部、耳介部などに存在するが、このうち、関節軟骨は個体の運動機能を補助する役割を有している。
2009年のROADプロジェクト調査結果によると、日本の変形性関節症（Osteoarthritis、ＯＡ）患者数は、膝については2500万人、腰椎については3800万人と報告されており、その男女の内訳は、膝は男性860万人、女性1670万人、腰椎は男性1890万人、女性1900万人であるが、この数は年々増加している。ＯＡは骨粗鬆症と並び高齢者の日常生活動作（ADL）や生活の質（QOL）を低下させることから、根治的な治療方法の確立が望まれている。
関節軟骨組織は、軟骨細胞が産生するコラーゲンやヒアルロン酸、プロテオグリカンから構成され、網目構造を取るコラーゲン繊維間にプロテオグリカンやヒアルロン酸が存在することで、多量の水分を保持している。つまり、関節軟骨は、コラーゲンならびにプロテオグリカンによりそのクッション性を保持している。
関節周囲の血行が悪くなり酸素の供給が低下すると、軟骨細胞によるプロテオグリカンなどの産生が低下することや、死滅した軟骨細胞が滑膜を刺激、炎症を起こし、関節に痛みが生じることとなる。さらに、炎症時のサイトカインの放出により、さらに軟骨細胞死を誘導し、痛みの症状が激化する。
このため、ＯＡの対症療法としては、痛み止めや抗炎症製剤の投与、高分子ヒアルロン酸（ヒアルロン酸ナトリウム）の関節腔内への注入等があげられ、また、対症療法以外の方法としては、近年、軟骨細胞の分化促進または軟骨細胞の肥大化の抑制、軟骨細胞によるコラーゲン、プロテオグリカンの転写、合成促進などのアプローチが取られ始めている。

【0003】

軟骨の構成成分の一つであるプロテオグリカンは、糖鎖の一種である硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とコアタンパクからなり、ＧＡＧとコアタンパクが共有結合した構成となっている。プロテオグリカンについては、上述したＯＡに対する効果のほか、軟骨細胞中のプロテオグリカン量は、前駆軟骨細胞から軟骨細胞への分化、増殖の過程において増加することが知られており（非特許文献１）、軟骨形成に重要な役割をもつことが示唆されている。また、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンに抗肥満剤、抗糖尿病剤としての効果（特許文献１）や、炎症性疾患や自己免疫疾患の予防治療、臓器移植時の拒絶反応の抑制、アレルギーの処置に有用であることが報告されている（特許文献２）。また、生体におけるプロテオグリカンの合成を促進することにより、抗老化用皮膚外用剤としての効果も報告されている（特許文献３）。

【0004】

一方、プロテオグリカンの生合成については、転写因子であるＳｏｘ９を高発現させた細胞において、軟骨細胞分化が促進し、プロテオグリカンやII型コラーゲンの産生が増加するという報告（非特許文献２）や、硫酸化グリコサミノグリカン上のコンドロイチン４硫酸のＧａｌＮＡｃの四位に硫酸基を転移するコンドロイチン4-O-硫酸基転移酵素−１（Ｃ４ＳＴ−１）を変異させたマウスでは、コンドロイチン硫酸の合成量が減少し、軟骨形成不全の症状が観察されたとの報告がある （非特許文献３）。このため、プロテオグリカンの生合成に関しては、Ｓｏｘ９及びＣ４ＳＴ−１の活性促進が重要であると考えられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１０−１２６４６１号公報

【特許文献2】特開２００７−１３１５４８号公報

【特許文献3】特開２００６−０２８０７１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】J. Biol. Chem., 265, 10, 5903-5909, 1990

【非特許文献2】Biochem. Biophys. Res. Commun. 301, 2, 338-343, 2003

【非特許文献3】BMC Musculoskelet Disord. 26 2004

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本願発明は、新規の軟骨形成促進剤の提供を課題とする。また本願発明は、新規のプロテオグリカン合成促進剤の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の構成からなるものである。
（１）乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とする軟骨形成促進剤。
（２）前記軟骨形成促進が、プロテオグリカンの合成促進によるものであることを特徴とする（１）記載の軟骨形成促進剤。
（３）乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とするプロテオグリカン合成促進剤。
（４）乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とする関節疾患の予防、改善、治療剤。
（５）前記関節疾患が変形性関節疾患である（４）記載の関節疾患の予防、改善、治療剤。
（６）乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とする関節疾患の予防・改善用サプリメント。
（７）前記関節疾患が、変形性関節疾患である（６）記載の関節疾患の予防・改善用サプリメント。
（８）（１）乃至（２）記載の軟骨形成促進剤を配合してなる軟骨形成促進用飲食品及び／または飼料。
（９）（３）記載のプロテオグリカン合成促進剤を含有する飲食品及び／または飼料。
（１０）乳由来塩基性タンパク質画分分解物を有効成分とする軟骨形成促進剤。
（１１）前記軟骨形成促進が、プロテオグリカンの合成促進によるものであることを特徴とする（１０）記載の軟骨形成促進剤。
（１２）乳由来塩基性タンパク質画分分解物を有効成分とするプロテオグリカン合成促進剤。
（１３）乳由来塩基性タンパク質画分分解物を有効成分とする関節疾患の予防、改善、治療剤。
（１４）前記関節疾患が、変形性関節疾患である（１３）記載の関節疾患の予防、改善、治療剤。
（１５）乳由来塩基性タンパク質画分分解物を有効成分とする関節疾患の予防・改善用サプリメント。
（１６）前記関節疾患が、変形性関節疾患である（１５）記載の関節疾患の予防・改善用サプリメント。
（１７）（１０）乃至（１１）記載の軟骨形成促進剤を配合してなる軟骨形成促進用飲食品及び／または飼料。
（１８）（１２）記載のプロテオグリカン合成促進剤を含有する飲食品及び／または飼料。
（１９）前記乳由来塩基性タンパク質画分分解物が、乳由来塩基性タンパク質画分をタンパク質分解酵素で処理して得られるものであることを特徴とする（１０）または（１１）に記載の軟骨形成促進剤。
（２０）前記タンパク質分解酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン及びパパインよりなる群から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする（１９）に記載の軟骨形成促進剤。
（２１）乳由来塩基性タンパク質画分及び／または乳由来塩基性タンパク質画分分解物を１０ｍｇ／日以上摂取することによる関節疾患の予防、改善、治療方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明の軟骨形成促進剤は、軟骨細胞分化制御因子であるＳｏｘ９およびコンドロイチン4-O-硫酸基転移酵素-1（Ｃ４ＳＴ−１）のｍＲＮＡの発現を促進することにより軟骨細胞の分化やプロテオグリカンの合成を促進し、効果的に軟骨形成を促進することができる。また本発明のプロテオグリカン合成促進剤は、プロテオグリカンの合成を促進し、関節疾患に対する予防・改善・治療効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】乳由来塩基性タンパク質画分によるＣ４ＳＴ−１ ｍＲＮＡ発現への濃度依存的影響を示す。

【図2】乳由来塩基性タンパク質画分によるＣ４ＳＴ−１ ｍＲＮＡ発現への時間依存的影響を示す。

【図3】乳由来塩基性タンパク質画分による軟骨分化制御因子Ｓｏｘ９ ｍＲＮＡ発現への濃度依存的影響を示す。

【図4】乳由来塩基性タンパク質画分による軟骨分化制御因子Ｓｏｘ９ ｍＲＮＡ発現への時間依存的影響を示す。

【図5】乳由来塩基性タンパク質画分によるプロテオグリカン合成量への影響を示す。

【図6】乳由来塩基性タンパク質画分による変形性膝関節症への効果を示す。

【図7】乳由来塩基性タンパク質画分分解物によるプロテオグリカン合成量への影響を示す。

【図8】乳由来塩基性タンパク質画分分解物による変形性膝関節症への効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、乳由来塩基性タンパク質画分を有効成分とすることを特徴としている。
本発明の乳由来塩基性タンパク質画分は、次の性質を有している。
１）ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によると分子量３,０００〜８０,０００の範囲の数種のタンパク質よりなる。
２）９５重量％以上がタンパク質であって、その他少量の脂肪、灰分を含む。
３）タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼよりなる。
４）タンパク質のアミノ酸組成は、リジン、ヒスチジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸を１５重量％以上含有する。

【0012】

この乳由来塩基性タンパク質画分は、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳など哺乳類の乳から得ることができ、例えば、乳または乳由来の原料を陽イオン交換体に接触させて塩基性タンパク質を吸着させた後、この陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、ｐＨ５を越え、イオン強度０．５を越える溶出液で溶出して得る方法（特開平５−２０２０９８号公報）、アルギン酸ゲルを用いて得る方法（特開昭６１−２４６１９８号公報）、無機の多孔性粒子を用いて乳清から得る方法（特開平１−０８６８３９号公報）、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法（特開昭６３−２５５３００号公報）などが知られており、本発明では、このような方法で得られた乳由来塩基性タンパク質画分を用いることができる。また得られた乳由来塩基性タンパク質画分をさらに、タンパク質分解酵素で処理して平均分子量４，０００以下の乳由来塩基性タンパク質画分分解物として用いることもできる。なお、タンパク質分解酵素としては、市販されているプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ（商品名）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（商品名）、プロチンＳＤ−ＡＹ１０（商品名）等の食品・工業用プロテアーゼが使用できるほか、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、パパイン等の酵素を挙げることができる。また、これらのタンパク質分解酵素を適宜組み合わせて使用してもよい。

【0013】

本発明では、上記の乳由来塩基性タンパク質画分をそのまま軟骨形成促進剤、又はプロテオグリカン合成促進剤として用いることが可能であり、また、乳由来塩基性タンパク質画分の他に、糖類や脂質、タンパク質、ビタミン類、ミネラル類、フレーバー等、他の医薬品、飲食品や飼料に通常使用する原材料等を混合することや、さらに常法に従い粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などに製剤化することも可能である。また、塗布剤としては、乳液、クリーム、ローション、パックなど通常の塗布形態で用いることができる。これらの塗布剤は常法により製造し、本発明の有効成分である乳由来塩基性タンパク質画分をその製造過程で適宜配合すればよい。
また、乳由来塩基性タンパク質画分に加えて、他の軟骨形成促進効果を示す成分や、関節疾患の改善効果を有する他の成分と併用することも可能である。

【0014】

本発明の軟骨形成促進剤の配合量としては、特に制限はないが、成人一人一日あたり、乳由来塩基性タンパク質画分を１０ｍｇ以上摂取することにより軟骨形成促進効果、プロテオグリカン合成促進効果が期待できるので、この量を確保できるようにすればよい。

【0015】

本発明の乳由来の軟骨形成促進用飲食品、プロテオグリカン合成促進用飲食品としては、通常の飲食品、例えばヨーグルト、乳飲料、ウエハース、デザート等に乳由来塩基性タンパク質画分を配合すればよい。これらの軟骨形成促進用飲食品については、成人一人一日あたり、乳由来塩基性タンパク質画分を１０ｍｇ以上摂取させるために、飲食品の形態にもよるが飲食品１００ｇあたり塩基性タンパク質画分を１〜１００ｍｇ配合することが好ましい。また、本発明の軟骨形成促進剤は、通常の飼料、例えば家畜用飼料やペットフード等に乳由来塩基性タンパク質画分を配合すればよい。たとえばこれらの飼料について、乳由来塩基性タンパク質画分を配合する場合、飼料１００ｇあたり乳由来塩基性タンパク質画分を１〜１００ｍｇ配合することが好ましい。

【0016】

本発明では、乳由来塩基性タンパク質画分を配合する方法に特に制限はないが、例えば、溶液中で添加、配合するには、乳由来塩基性タンパク質画分を脱イオン水に懸濁あるいは溶解し、撹拌混合した後、医薬品、飲食品や飼料の形態に調製して使用する。撹拌混合の条件としては、乳由来塩基性タンパク質画分が均一に混合されればよく、ウルトラディスパーサーやＴＫホモミクサー等を使用して撹拌混合することも可能である。また、当該組成物の溶液は、医薬品、飲食品や飼料に使用しやすいように、必要に応じて、ＲＯ膜等での濃縮や、凍結乾燥して使用することができる。本発明では、医薬品、飲食品や飼料の製造に通常使用される殺菌処理が可能であり、粉末状であっては乾熱殺菌も可能である。従って、本発明の乳由来塩基性タンパク質画分を含有する液状、ゲル状、粉末状、顆粒状等様々な形態の医薬品、飲食品や飼料を製造することができる。

【実施例】

【0017】

以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

【0018】

［実施例１］
陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール（富士紡績社製）４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０ｌ（ｐＨ６．７）を流速２５ｍｌ／分で通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、０．９８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着した塩基性タンパク質画分を溶出した。そして、この溶出液を逆浸透膜（ＲＯ膜）により脱塩して、濃縮した後、凍結乾燥して、乳由来塩基性タンパク質画分粉末２１ｇを得た（実施例品1）。得られた乳由来塩基性タンパク質画分について、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定したところ、分子量は３,０００〜８０,０００の範囲に分布しており、成分組成は表１に示すとおりであった。また、６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した後、アミノ酸分析装置（Ｌ−８５００型、日立製作所製）でそのアミノ酸組成を分析した結果、表２に示したように塩基性アミノ酸が１５重量％以上含まれていた。さらに、ＥＬＩＳＡ法により、そのタンパク質組成を分析したところ、表３に示すように、４０％以上のラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼが含まれていた。

【0019】

【表1】

【0020】

【表2】

【0021】

【表3】

【0022】

［試験例１］
乳由来塩基性タンパク質画分によるプロテオグリカン合成酵素のｍＲＮＡ発現への影響についてリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討を行った。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。細胞は、マウスＥＣ由来間葉系細胞であるＡＴＤＣ５細胞を用いた。ＡＴＤＣ５細胞を２４穴プレートに０．５×１０５cells／wellになる様に播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２環境下にて１週間培養した。
乳由来塩基性タンパク質画分及び対照区として精製したラクトフェリンをそれぞれ０．１％、０．５％、１％（ｗ／ｖ）になるようＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解したものを培養した細胞に添加し、１２時間培養した。
培養した細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡの回収およびｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、培養した細胞にＲＮＡ抽出剤であるＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容チューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層（水層）を新たな１．５ｍｌ容チューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得た。得られた沈殿物は、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とした。１μg分のＲＮＡからTakara PrimeScriptTMRT reagent Kit を用いてｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、SYBR Green （Takara SYBR Prime Ex Taq II）を使用したリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張を４０サイクル反応させた。プライマーは表４に記載のＣ４ＳＴ１用プライマーを使用した。結果を図1に示す。なお、※は対照群と比較して有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。

【0023】

【表4】

【0024】

図１より、乳由来塩基性タンパク質画分によるＣ４ＳＴ−１のｍＲＮＡ発現は、乳由来塩基性タンパク質画分の濃度に依存して亢進することが明らかとなった。また、乳タンパク質の一つであるラクトフェリンに比較してより高いＣ４ＳＴ−１のｍＲＮＡ発現亢進効果を有することが明らかとなった。

【0025】

［試験例２］
乳由来塩基性タンパク質画分によるプロテオグリカン合成酵素のｍＲＮＡ発現への作用時間による影響についてリアルタイムＰＣＲ方法を用いて検討した。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。
方法は試験例１に記載の方法に準じた。すなわち、乳由来塩基性タンパク質画分を２時間から４８時間までＡＴＤＣ５細胞に添加した後、ｔｏｔａｌＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを行った。対照区は、乳由来塩基性タンパク質画分を投与せず、２時間から４８時間まで培養したＡＴＤＣ５細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成してリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図２に示す。

【0026】

図２により、乳由来塩基性タンパク質画分によるＣ４ＳＴ−１のｍＲＮＡ発現は、乳由来塩基性タンパク質画分にてＡＴＤＣ細胞に作用させてから４時間で有意に亢進し、１２時間から２４時間でピークに達し、４８時間では減少した。

【0027】

［試験例３］
乳由来塩基性タンパク質画分による軟骨分化制御因子のｍＲＮＡ発現への影響についてリアルタイムＰＣＲ方法を用いて検討を行った。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。また、試験例１と同じく、対照区として精製したラクトフェリンを用いた。方法は試験例１に記載の方法に準じた。プライマーは表５に記載のＳｏｘ９用プライマーを使用した。結果を図３に示す。

【0028】

【表5】

【0029】

図３により、乳由来塩基性タンパク質画分によるＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現は、ホエー分解物の濃度に依存して亢進することが明らかとなった。また、乳タンパク質の一つであるラクトフェリンに比較してより高いＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現亢進効果を有することが明らかとなった。

【0030】

［試験例４］
乳由来塩基性タンパク質画分による軟骨分化制御因子のｍＲＮＡ発現への作用時間による影響についてリアルタイムＰＣＲ方法を用いて検討した。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。
方法は試験例１に記載の方法に準じた。すなわち、乳由来塩基性タンパク質画分を２時間から４８時間までＡＴＤＣ５細胞に添加した後、ｔｏｔａｌＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを行った。対照区は、乳由来塩基性タンパク質画分を投与せず、２時間から４８時間まで培養したＡＴＤＣ５細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成してリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図４に示す。

【0031】

図４により、乳由来塩基性タンパク質画分によるＳｏｘ９のｍＲＮＡ発現は、乳由来塩基性タンパク質画分をＡＴＤＣ細胞に作用させてから２時間で有意に上昇し、４時間から６時間でピークに達し、１２時間以降は減少した。

【0032】

［試験例５］
乳由来塩基性タンパク質画分によるプロテオグリカン合成への影響について、酸性ムコ多糖測定キット（プライマリーセル ＡＫ０３）を用いて、プロテオグリカン量（コンドロイチン硫酸量）の測定を行った。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。測定は、以下の方法で行った。
ＡＴＤＣ５細胞を１×１０５cells／wellになるように１２穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて３７℃、ＣＯ２環境下で培養した。培養４日後、キット中の酵素溶液（一袋／１０ｍｌ水）を２００μｌ／wellなるよう添加し細胞可溶化させ、可溶化液を１．５ｍｌ容チューブに回収した後６０℃にて１時間処理しサンプルとした。サンプルおよび標準用コンドロイチン硫酸液（１〜５０μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつチューブに分注し、反応液（発色原液０．４ｍｌ/緩衝液１２．６ｍｌ）を１．３ｍｌ添加し、１０〜２０分後内にＯＤ６５０ｎｍにて吸光値を測定した。標準用コンドロイチン硫酸液の吸光値から求めた標準曲線及びサンプルの吸光値より濃度を決定した。結果を図５に示す。

【0033】

図５より、乳由来塩基性タンパク質画分の濃度に依存して、プロテオグリカン量が有意に上昇した。

【0034】

［試験例６］
乳由来塩基性タンパク質画分による軟骨形成への影響について、変形性膝関節症自然発症マウスであるＳＴＲ／ＯＲＴマウスを用いた乳由来塩基性タンパク質画分投与試験を行った。乳由来塩基性タンパク質画分として実施例品１を用いた。測定は、以下の方法で行った。１５週齢のＳＴＲ／ＯＲＴマウスを１０匹ずつ生理食塩水群と乳由来塩基性タンパク質画分をマウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ投与する群に分け、投与はそれぞれマウス用金属製胃ゾンデにより１日あたり１回の強制経口投与を行った。正常対照群として正常マウス（ＣＢＡ／ＪＮ）１０匹も設定した。１２週間の飼育終了後、各群のマウスを屠殺し、後肢の膝関節を切除し取り出した後、骨軟骨組織を４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳに希釈した４％パラフォルムアルデヒドで４℃、１８時間の固定を行い、さらに一晩かけて７０％から１００％のエタノール系列にて脱脂し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝液に組織を浸潤させ、４℃にて２週間かけて脱灰した。組織をパラフィン包埋し、４μｍの薄切標本を作製した。組織標本は脱パラフィン、再親水化した後、Ｓａｆｒａｎｉｎ‐Ｏ染色を行い、関節炎の進展度のスコアであるＭａｎｋｉｎスコア（表６）に従ってスコア化した。
結果を図６に示す。

【0035】

【表6】

【0036】

図６により、乳由来塩基性タンパク質画分投与により、生理食塩水投与に比較してＳＴＲ／ＯＲＴマウスのＭａｎｋｉｎスコアが有意に低下した。これは、乳由来塩基性タンパク質画分投与によりマウスの軟骨形成が促進されたことにより、変形性膝関節症の症状が緩和されたことを示す。

【0037】

［実施例２］
（液状栄養組成物の調製）
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分５gを４９９５gの脱イオン水に溶解し、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯ ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合して乳由来塩基性タンパク質画分１００ｍｇ／１００ｇの乳由来塩基性タンパク質画分溶液を得た。この乳由来塩基性タンパク質画分溶液５．０ｋｇに、カゼイン４．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１８．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機（第１種圧力容器、ＴＹＰＥ：ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所社製）で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。このようにして得られた液状栄養組成物には、すべて沈殿等は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、この液状栄養組成物は、１００ｇあたり、乳由来塩基性タンパク質画分を１０ｍｇ含有し、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0038】

［実施例３］
（ゲル状食品の調製）
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分２ｇを７０８ｇの脱イオン水に溶解し、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＴ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。この溶液に、ソルビトール４０ｇ、酸味料２ｇ、香料２ｇ、ペクチン５ｇ、乳清タンパク質濃縮物５ｇ、乳酸カルシウム１ｇ、脱イオン水２３５ｇを添加して、撹拌混合した後、２００ｍｌのチアパックに充填し、８５℃、２０分間殺菌後、密栓し、本発明のゲル状食品５袋（２００ｇ入り）を調製した。このようにして得られたゲル状食品には、すべて沈殿等は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、このゲル状食品には、１００ｇあたり、乳由来塩基性タンパク質画分が２００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0039】

［実施例４］
（飲料の調製）
酸味料２ｇを７０６ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分４ｇを溶解し、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＴ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。このようにして得られた飲料には、すべて沈殿は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、この飲料には、１００ｇあたり、乳由来塩基性タンパク質画分が４００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0040】

［実施例５］
（飼料の調製）
実施例品１の乳由来塩基性タンパク質画分２ｋｇを９８ｋｇの脱イオン水に溶解し、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫII １６０型；特殊機化工業社製）にて、３６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合して乳由来塩基性タンパク質画分を２ｇ／１００ｇ含有する乳由来塩基性タンパク質画分溶液を得た。この乳由来塩基性タンパク質画分溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明のイヌ 用飼育飼料１００ｋｇを製造した。なお、このイヌ用飼育飼料には、１００ｇあたり、乳由来塩基性タンパク質画分が２００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0041】

［実施例６］
（錠剤の調製）
表４に示す配合で原料を混合後、常法１ｇに成型、打錠して本発明の錠剤を製造した。なお、この錠剤１ｇ中には、乳由来塩基性タンパク質画分が１００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0042】

【表7】

【0043】

［実施例７］
実施例１と同様の方法によって得られた乳由来塩基性タンパク質画分粉末５０ｇを蒸留水１０リットルに溶解した後、１％パンクレアチン（シグマ社製）を添加し、３７℃で２時間反応させた。反応後、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた後、乳由来塩基性タンパク質画分分解物４８．３ｇを得た（実施例品７）。

【0044】

［実施例８］
実施例１と同様の方法によって得られた乳由来塩基性タンパク質画分１２０ｇを精製水１．８リットルに溶解した後、４５℃に保持してプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ（天野エンザイム社製）を２０ｇ添加し、２時間反応させた。８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、凍結乾燥して乳由来塩基性タンパク質画分分解物を９５ｇ得た（実施例品８）。

【0045】

［試験例７］
実施例品７および実施例品８を用いて乳由来塩基性タンパク質画分分解物によるプロテオグリカン合成への影響を検証した。試験方法は試験例５の方法にしたがって実施した。結果を図７に示す。

【0046】

図７より、乳由来塩基性タンパク質画分分解物は、プロテオグリカン量を有意に上昇した。

【0047】

［試験例８］
実施例品７および実施例品８を用いて乳由来塩基性タンパク質画分分解物による軟骨形成への影響を検証した。ＳＴＲ／ＯＲＴマウスへの乳由来塩基性タンパク質画分分解物の投与量はマウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇとしたほか、試験方法は試験例６の方法にしたがって実施した。結果を図８に示す。

【0048】

図８の結果から、乳由来塩基性タンパク質画分と同様に、乳由来塩基性タンパク質画分分解物投与により、生理食塩水投与に比較してＳＴＲ／ＯＲＴマウスのＭａｎｋｉｎスコアが有意に低下した。つまり、乳由来塩基性タンパク質画分分解物投与によりマウスの軟骨形成が促進し、変形性膝関節症の症状が緩和された。

【0049】

（飲料の調製）
酸味料２ｇを７０６ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品７の乳由来塩基性タンパク質画分分解物４ｇを溶解し、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＴ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。このようにして得られた飲料には、すべて沈殿は認められず、風味に異常は感じられなかった。なお、この飲料には、１００ｇあたり、乳由来塩基性タンパク質画分分解物が４００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0050】

［実施例９］
（錠剤の調製）
表８に示す配合で原料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の錠剤を製造した。なお、この錠剤１ｇ中には、乳由来塩基性タンパク質画分分解物が１００ｍｇ含まれており、軟骨形成促進及び／またはプロテオグリカン合成促進効果を有していた。

【0051】

［実施例１０］

【表8】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】