特許 6419073 ドパミン神経細胞の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6419073

(24)【登録日】2018年10月19日

(45)【発行日】2018年11月7日

(54)【発明の名称】ドパミン神経細胞の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20181029BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALI20181029BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0793

   C12N5/0797

【請求項の数】10

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2015-530994(P2015-530994)

(86)(22)【出願日】2014年8月6日

(86)【国際出願番号】JP2014071352

(87)【国際公開番号】WO2015020234

(87)【国際公開日】20150212

【審査請求日】2017年4月20日

(31)【優先権主張番号】特願2013-163062(P2013-163062)

(32)【優先日】2013年8月6日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】庄司 昌伸

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０８１１７２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 J. Cell. Biochem.，２０１０年 ２月 １日，Vol.109, No.2，p.292-301

【文献】 Nature，２０１１年１１月 ６日，Vol.480, No.7378，p.547-551

【文献】 Development，２０１１年１０月，Vol.138, No.20，p.4363-4374

【文献】 Stem Cells，２０１２年１１月，Vol.30, No.11，p.2400-2411

【文献】 J. Neurochem.，２００７年１１月，Vol.103, No.3，p.962-971

【文献】 Biochem. Biophys. Res. Commun.，２０１０年 ４月 ９日，Vol.394, No.3，p.639-645

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

底板細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法：
（１）（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程。

【請求項2】

培地が、さらにアスコルビン酸またはその塩を含む培地である、請求項１記載の製造方法。

【請求項3】

培地が、さらにアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地である、請求項１又は２記載の製造方法。

【請求項4】

ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項5】

ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項6】

アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項7】

ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰであり、
ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸
であり、
アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、請求項３記載の製造方法。

【請求項8】

（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬。

【請求項9】

（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するためのキット。

【請求項10】

底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ドパミン神経細胞の製造方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られたドパミン神経細胞を含む医薬、ならびに該方法に使用するための試薬およびキットも提供する。

【背景技術】

【0002】

ドパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ；３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン）は、多様な作用を持つ生体内分子であり、主に中枢神経系における神経伝達物質として機能する。生体内では、ドパミンはアミノ酸チロシンを起点としてチロシン水酸化酵素およびドーパ脱炭酸酵素の二つの酵素の働きにより細胞内で生合成される。

【0003】

ドパミン神経細胞は、神経伝達物質としてドパミンを合成し、放出する神経細胞であり、脳内では主に中脳に存在し、一部は視床下部に存在する。中脳に存在するドパミン神経細胞は、運動や情動の制御において重要な役割を果たしており、中脳ドパミン神経細胞が変性・脱落すると、例えばパーキンソン病などの重篤な神経変性疾患が引き起こされ得る。このような神経変性疾患を治療するために最も期待されている治療的アプローチの一つが、ドパミン神経細胞を対象に移植する細胞移植療法である。

【0004】

現在、ドパミン神経細胞を得る方法として、胚性幹細胞（本明細書中、ＥＳ細胞と称することがある）や人工多能性幹細胞（本明細書中、ｉＰＳ細胞と称することがある）などの幹細胞を神経外胚葉に分化させた後、さらにドパミン神経細胞へと分化誘導する方法が知られている。
最近、底板細胞（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ）から中脳のドパミン神経細胞が産生されることが報告された。また、中脳ドパミン神経細胞を得るために２種類のＳＭＡＤ（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）シグナリング阻害剤を用いて幹細胞を底板細胞に分化させる方法（特許文献１、非特許文献１）や、ヒト幹細胞から底板細胞を誘導し、さらに神経栄養因子とともに底板細胞を培養することにより中脳ドパミン神経細胞を誘導する方法（特許文献２、非特許文献２〜４）、ヒトＥＳ細胞にＧＳＫ３ｂｅｔａ阻害剤およびアクチビン／Ｎｏｄａｌ阻害剤を作用させることにより効率的に底板細胞を誘導する方法（非特許文献５）が相次いで報告されている。

【0005】

しかし、これらの方法によって得られるドパミン神経細胞の産生効率は依然として低く、また、当該細胞は酸化ストレスや薬剤刺激への応答性をインビトロで再現できないなど機能的にも十分でない。従って、高品質のドパミン神経細胞を効率的に得る方法の開発が依然として求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１２／００９４３８１号明細書

【特許文献2】国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレット

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６（２０１０）３３６−３４７

【非特許文献2】Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８０（２０１１）５４７−５５３

【非特許文献3】Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １（２０１２）７０３−７１４

【非特許文献4】Ｘｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０（２０１２）１６５５−１６６３

【非特許文献5】Ｄｅｎｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０（２０１２）２４００−２４１１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、高品質なドパミン神経細胞をより効率的に製造する方法を提供することである。さらに本発明は、該方法により得られたドパミン神経細胞を含む医薬、ならびに該方法に使用するための試薬およびキットの提供も目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、神経前駆細胞を（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養することにより、高密度に、再現性良くドパミン神経細胞を製造できることを見出した。さらに、得られたドパミン神経細胞が、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質および機能を有するなど、高品質なドパミン神経細胞であることを確認し、本発明を完成するに至った。

【0010】

即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］底板細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法：
（１）（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；
［２］培地が、さらにアスコルビン酸またはその塩を含む培地である、上記［１］記載の製造方法；
［３］培地が、さらにアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地である、［２］記載の製造方法；
［４］ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰである、［１］記載の製造方法。
［５］ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド（ＰＤ１８４３５２）、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸（ＳＵ５４０２）
である、［１］記載の製造方法；
［６］アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、［３］記載の製造方法；
［７］ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰであり、
ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド（ＰＤ１８４３５２）、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸（ＳＵ５４０２）
であり、
アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、［３］記載の製造方法；
［８］［１］記載の製造方法で得られたドパミン神経細胞を含む、医薬；
［９］（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬；
［１０］（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するためのキット；
［１１］底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤の使用。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、神経前駆細胞から高品質のドパミン神経細胞をより効率的に製造することができる。本発明により製造されたドパミン神経細胞は、従来の方法により製造されたドパミン神経細胞では観察されなかった酸化ストレスや薬剤刺激への応答性が観察されるなど、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有する。従って、本発明により製造されたドパミン神経細胞は、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において、高い生着率を達成でき、極めて有用であるだけでなく、当該疾患の予防および／または治療に有用な化合物のスクリーニング、化合物の毒性評価、創薬ターゲットの検証、疾患メカニズムの解析など様々な用途に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

図１は分化誘導因子を様々な組み合わせで添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて底板細胞を誘導し、培養１３日目に底板細胞マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合、〔Ａｌｌ〕はＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、プルモルファミン（Ｐｕｒ）およびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）の５種類すべてを使用した条件を示す。〔−因子名〕はそれぞれの因子を除いた条件を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図２は底板細胞を誘導し、培養１３日目に抗ＦＯＸＡ２抗体および抗ＬＭＸ１Ａ抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株を用いた。赤色はＦＯＸＡ２陽性細胞の核、緑色はＬＭＸ１Ａ陽性細胞の核、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図３は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）およびＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）を様々な組み合わせで添加して培養を行い、４５日目にＮＵＲＲ１の発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図４は図３と同様に分化誘導を行い、培養４５日目に抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。
図５は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）およびＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）を添加して培養を行い、４５日目（２５３Ｇ１株）または５２日目（２０１Ｂ７株）に抗ＴＨ抗体、抗ＮＵＲＲ１抗体および抗ＦＯＸＡ２抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を、マゼンタ色はＦＯＸＡ２陽性細胞の核を、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図６は図５の２５３Ｇ１株を用いて得られた結果について高倍率で観察した図を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図７は図５と同様に分化誘導を行い、培養５０日目に高ＫＣｌ刺激によるドパミンの放出能を評価した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用い、独立した２つの実験結果を示す。ＣｔｒｌはＨＢＳＳで、ＫＣＬは５５ｍＭ ＫＣｌを含むＨＢＳＳで刺激した条件を示す。また、Ｙ軸の値はコントロール群のドパミン放出量を１としたときの相対値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図８は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）およびジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）に加え、各種ＭＥＫ阻害剤（ＦＧＦＲ阻害剤を含む）を添加して培養を行い、４５日目にＮＵＲＲ１の発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図９はヒトｉＰＳ細胞からの底板細胞およびドパミン神経細胞への分化誘導法の模式図を示す。
図１０は図９の方法に従って分化誘導を行った際の、各種分化マーカーの経時的な発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔Ａｌｌ〕は図９に従って行い、〔−〕はＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨおよびプルモルファミンを除いて、〔−ＳＨＨ〕はＳＨＨのみを除いて、〔−Ｐｕｒ〕はプルモルファミンのみを除いて分化誘導を行ったことを示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１１は図９で示した工程３において、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）およびアクチビンＡ（Ａｃｔ）を様々な組み合わせで添加して分化誘導を行い、培養２６日目にドパミン神経細胞マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１２は図１１と同様に分化誘導を行い、培養２６日目に抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。
図１３は図９で示した工程３において、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）およびアクチビンＡ（ＡＣＴ）を添加して分化誘導を行い、培養２６日目に細胞を凍結保存した。この細胞を解凍し、ＡＡ、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤおよびＡＣＴを様々な組み合わせで添加して２週間培養した後、ドパミン神経マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１４は図１３と同様に凍結保存した細胞を解凍し、ＡＡ、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤおよびＡＣＴを添加して２週間培養した後、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図１５は図９で示した工程３において、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１（Ｃｏｎｔｒｏｌ群；左側４枚のパネル）またはアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ群；右側４枚のパネル）を添加して分化誘導を行い、培養２６日目に細胞を回収してマウス線条体に移植した。移植４週後、組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図１６は図１５と同様に移植を行い、移植８週後に組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
図１７は図１５と同様に移植を行い、移植１２週後に組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。

【0014】

本明細書において、「ドパミン神経細胞」とは、ドパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ；３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン）を産生する能力を有する神経細胞を意味する。ドパミン神経細胞は常にドパミンを産生している必要はなく、ドパミン産生能力を有していればよい。また、産生されるドパミン量は特に限定されない。
生体内に存在するドパミン神経細胞のなかでも特に黒質緻密部や腹側被蓋野などの中脳に存在するドパミン神経細胞は、インビトロでは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＦＯＸＡ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２）、ＮＵＲＲ１（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ １）遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現により特徴付けることができる。また、上記中脳に存在するドパミン神経細胞は、インビトロでは、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ（ＬＩＭ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ）、ＮＵＲＲ１遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現でも特徴付けることができる。
底板細胞を本発明の製造方法に供して得られる「ドパミン神経細胞」は、中脳に存在するドパミン神経細胞（すなわち、中脳ドパミン神経細胞）である。

【0015】

本明細書において、「神経前駆細胞」とは、分化後にドパミン神経細胞を生成することのできる細胞をいい、具体的には、例えば、底板細胞、中間体フィラメントタンパク質Ｎｅｓｔｉｎなどの発現マーカーにより特徴付けられる神経外胚葉の細胞などが挙げられるが、最も好ましくは底板細胞である。

【0016】

本明細書において、「底板細胞」（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ｃｅｌｌ）とは、脊髄から間脳にかけて、神経管の腹側正中に位置する形態的に特殊化したオーガナイザー細胞を意味する。底板細胞のなかでも特に腹側中脳に位置する底板細胞は、インビトロでは、ＦＯＸＡ２やＬＭＸ１Ａ遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現により特徴付けることができる。

【0017】

本明細書において、「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的にはＥＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒト多能性体性幹細胞（神経幹細胞）が挙げられ、好ましくは、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞、さらに好ましくはｉＰＳ細胞である。

【0018】

ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するＥＳ細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ＥＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するＥＳ細胞が挙げられる。
ＥＳ細胞の具体例として、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物などのＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、およびこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。
各ＥＳ細胞は当該分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：７６３４−８）によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）などから購入可能である。
ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）などから購入可能である。

【0019】

ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するｉＰＳ細胞を使用できる。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ｉＰＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するｉＰＳ細胞が挙げられる。
ｉＰＳ細胞の具体例として、皮膚細胞などの体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８；２６：１０１−１０６）が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１−４）などが挙げられる。
作製されたｉＰＳ細胞は、その作出方法によらずいずれも本発明に用いられうる。
ヒトｉＰＳ細胞株としては、具体的には、２５３Ｇ１株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、２０１Ｂ７株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）（７３歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）（５６歳男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）（新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）などが挙げられる。

【0020】

１．ドパミン神経細胞の製造方法
本発明は、神経前駆細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法（以下、本発明の製造方法と称することもある）：（１）（ｉ）ｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）アナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程、を提供する。

【0021】

本発明の製造方法で使用される神経前駆細胞を得る方法としては、特に限定されず、対象となる動物胚から直接採取することもできるが、大量に神経前駆細胞を得るという観点からは、幹細胞を出発材料として製造することが好ましい。

【0022】

幹細胞から神経前駆細胞を製造する方法としては、特に限定されず、低分子ＢＭＰ阻害剤の存在下で多能性幹細胞を培養する方法や、ストローマ細胞との共培養による分化誘導法（ＳＤＩＡ法）など自体公知の方法を利用することができる。

【0023】

本発明の製造方法で使用される神経前駆細胞は、分化後にドパミン神経細胞を生成することができる限りいずれの細胞であってもよいが、底板細胞を出発細胞として使用することが最も好ましい。従って、以下に、幹細胞を底板細胞に分化させる方法を具体的に記載する。

【0024】

１−１．幹細胞を底板細胞に分化させる方法
本分化方法は、底板細胞分化誘導因子を含む培地で幹細胞を培養する工程を含む。

【0025】

本分化方法（分化誘導方法）において幹細胞は、通常培養器上で培養される。ここで用いられる培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。好ましくは、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートなどである。培養器は、幹細胞を維持・培養するのに適するようなコーティングが施されていることが好ましい。具体的にはフィーダー細胞や、細胞外基質成分でコーティングされた培養器を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ）など）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線など）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣなど）処理などで不活化されていることが好ましい。細胞外基質成分としては、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなどの繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞接着性タンパク質、あるいはマトリゲルなどの基底膜成分などが挙げられる。

【0026】

本分化方法で使用される底板細胞分化誘導因子は、底板細胞への分化を誘導する物質であれば特に限定されず、底板細胞分化誘導因子として公知のいかなる物質をも使用することができる。ここで、物質には、低分子化合物、ペプチド、タンパク質などが含まれる。底板細胞分化誘導因子の例としては、ＢＭＰ阻害剤、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９（４‐（６‐（４‐（ピペラジン‐１‐イル）フェニル）ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン‐３‐イル）キノリン塩酸塩）、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）など；ＴＧＦβファミリー阻害剤、例えば、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド）、Ａ−８３−０１（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−フェニルチオカルバモイル−４−キノリン−４−イルピラゾール）など；ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）など；Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔ、例えば、プルモルファミン（Ｎ−（４−モルフォリノフェニル）−２−（１−ナフチルオキシ）−９−シクロヘキシル−９Ｈ−プリン−６−アミン）、ＳＡＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−（３−ピリジニルベンジル）−Ｎ’−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン）など；成長因子、例えば、Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ８）などが挙げられる。これらはＡｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社、Ｒ＆Ｄ社、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。

【0027】

本発明者らは、本分化方法において、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１（任意選択でＳＨＨを含んでもよい）を含む培地で３〜５日間一次培養した後、ＬＤＮ１９３１８９およびＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で５〜８日間二次培養することにより、より効率的に幹細胞を底板細胞へと分化誘導することができることを見出した。
従って、上記底板細胞分化誘導因子としてＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１を組み合わせて用いることにより、ＳＨＨなどのタンパク成分を培地に添加しなくとも、効率的に幹細胞を底板細胞へと分化誘導することができ、従来よりも安価に底板細胞、ひいてはドパミン神経細胞を製造することが可能となる。

【0028】

本分化方法における培地中の底板細胞分化誘導因子の濃度は、用いる因子の種類によって適宜設定されるが、例えば、底板細胞分化誘導因子としてＬＤＮ１９３１８９、プルモルファミン、ＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、それぞれ、通常０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭである。底板細胞分化誘導因子としてＳＢ４３１５４２を使用する場合の濃度は、通常１〜２０μＭ、好ましくは５〜１５μＭである。底板細胞分化誘導因子としてＳＨＨを使用する場合の濃度は、通常１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３００ｎｇ／ｍｌである。

【0029】

本分化方法で用いる培地は、上記底板細胞分化誘導因子を含有している限り特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下では、基礎培地と称することもある）に底板細胞分化誘導因子を添加してなるものである。
上記基礎培地は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地、Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ−Ａ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの基礎培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の培地であれば培地の組成は製造元によらず同等である。底板細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、およびこれらの混合培地が基礎培地として好適に用いられる。
本分化方法で用いられる培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。ここで、無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない基礎培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、成長因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。本分化方法で用いられる培地が血清含有培地である場合、該血清としてはウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）などの哺乳動物の血清が使用できる。該血清の培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。

【0030】

本分化方法で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、またはこれらの均等物が挙げられる。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
本分化方法では、血清代替物としてＮ２サプリメントやＢ−２７サプリメント（Ｂｒｅｗｅｒ Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９３）３５，５６７）が好適に培地中に添加され得る。
その場合、培地中のＮ２サプリメントの濃度は、０．１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは０．５〜２重量％であり、Ｂ−２７サプリメントの濃度は、０．１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは１〜５重量％である。
ノックアウトシーラムリプレースメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の試薬あるいは添加物であれば組成は製造元によらず同等である。

【0031】

本分化方法で用いられる培地はまた、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）または抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）などを含有してもよい。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
培養温度、ＣＯ_２濃度などの他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。

【0032】

本分化方法において、幹細胞が底板細胞に分化したことの確認は、底板細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子を底板細胞マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記底板細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法などによって行なうことができる。中脳に分化する上記底板細胞マーカーの例としては、ＦＯＸＡ２やＬＭＸ１Ａ遺伝子／タンパク質が挙げられる。

【0033】

１−２．神経前駆細胞からドパミン神経細胞を製造する方法（本発明の製造方法）
上記分化方法により得られた底板細胞などの神経前駆細胞は、（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程により、ドパミン神経細胞へとさらに分化させることができる。神経前駆細胞として底板細胞を使用する場合、本発明の製造方法によれば、底板細胞からドパミン神経細胞への分化誘導時に通常使用される脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）やグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの神経栄養因子の培地への添加は必須ではない。

【0034】

本発明の製造方法で使用されるｃＡＭＰアナログは、細胞との接触時に細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることが可能な、ｃＡＭＰに類似した構造を有する化合物であれば特に限定されない。
上記ｃＡＭＰアナログの例としては、８−ブロモｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰ、８−チオメチルｃＡＭＰなどが挙げられる。これらは、Ｓｉｇｍａ社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、和光純薬工業社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
本発明の製造方法において使用されるｃＡＭＰアナログとしては、ジブチリルｃＡＭＰが好ましい。
ｃＡＭＰアナログの培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰアナログの種類によって適宜設定されるが、ｃＡＭＰアナログとしてジブチリルｃＡＭＰを用いる場合の濃度は、通常０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭである。

【0035】

本発明の製造方法で使用されるＭＥＫ阻害剤は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ＥＲＫ Ｋｉｎａｓｅ；ＭＥＫ）阻害活性を有する物質を指し、ＭＥＫの働きを阻害する限り、ＭＥＫシグナル伝達経路の上流因子に対する阻害剤（例えば、ＦＧＦレセプター阻害剤）も本発明のＭＥＫ阻害剤に含まれる。
上記ＭＥＫ阻害剤の例としては、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−イオドフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−イオドフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ＳＵ５４０２（３−［４−メチル−２−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］−プロパン酸）、ＰＤ１７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ′−（１，１−ジメチル）尿素）などが挙げられる。これらは、Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
また、ＭＥＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡなどもＭＥＫ阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既報に従って合成することができる。
本発明の製造方法において使用されるＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２またはＳＵ５４０２が好ましい。
ＭＥＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＭＥＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＭＥＫ阻害剤としてＰＤ０３２５９０１またはＰＤ１８４３５２を使用する場合の濃度は、通常０．１〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。ＭＥＫ阻害剤としてＳＵ５４０２を使用する場合の濃度は、通常０．１〜２０μＭ、好ましくは５〜１５μＭである。

【0036】

本発明の製造方法において、ｃＡＭＰアナログとＭＥＫ阻害剤とは、培地中に同時に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。ｃＡＭＰアナログとＭＥＫ阻害剤とは、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。

【0037】

本発明の製造方法で用いる培地は、上記１−１．の分化方法で例示した基礎培地（所望により前記で例示した各種添加物、血清または血清代替物を含有していてもよい）にｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤を添加することにより作製される。
本発明の製造方法で用いられる培地は、前記の底板細胞の製造方法にて用いた基礎培地と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、同種の基礎培地を用いて作製されたものであることが好ましい。

【0038】

本発明の製造方法で用いる培地に、上記のｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤に加えて、アスコルビン酸またはその塩を加えることにより、さらに効率的に高品質のドパミン神経細胞を製造することができる。
本発明の製造方法で使用され得るアスコルビン酸塩の例としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
アスコルビン酸またはその塩が培地に添加される場合の濃度は、通常０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１ｍＭである。
アスコルビン酸またはその塩は、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アスコルビン酸またはその塩は、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地中に添加されることが簡便であり、また好ましい。

【0039】

本発明の製造方法においては、上記のｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤に加えて、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を培地に添加して神経前駆細胞を培養することにより、さらに効率的に高品質のドパミン神経細胞を製造することができるばかりでなく、ドパミン神経細胞への分化誘導期間も短縮することができる。アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としては、アクチビン受容体様キナーゼ−４及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−７を活性化する限り特に限定されないが、例えば、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１、Ｖｇ１、アクチビンなどが挙げられる。好ましくはアクチビン（特に、アクチビンＡ）である。

【0040】

アクチビンはＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）ファミリーに属する大きさ２４ｋＤのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、２個のβサブユニットがＳＳ結合を介して２量体を構成している（Ｌｉｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，７７９−７８２；Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，７７６−７７９）。アクチビンには、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢが知られているが、本発明の製造方法においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンも使用することができる。本発明の製造方法でアクチビンを使用する場合には、アクチビンとしては特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、該アクチビンとしてはヒト、マウスなどいずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明の製造方法にてアクチビンを使用する場合には、用いる神経前駆細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の神経前駆細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
本発明の製造方法における培地中のアクチビンの濃度は、用いるアクチビンの種類によって適宜設定されるが、アクチビンとしてアクチビンＡを使用する場合の濃度は、通常０．１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌである。
アクチビンは、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アクチビンは、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地中に添加されることが簡便であり、また好ましい。

【0041】

本発明の製造方法は、神経前駆細胞の培養に適した培養温度（通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度）で、１〜１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ_２インキュベーター内にて培養することによって実施される。

【0042】

本発明の製造方法において、神経前駆細胞がドパミン神経細胞に分化したことの確認は、ドパミン神経細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子をドパミン神経細胞マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記ドパミン神経細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法などによって行なうことができる。中脳に存在する上記ドパミン神経細胞マーカーの例としては、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１遺伝子／タンパク質が挙げられる。
また、本発明の製造方法により得られたドパミン神経細胞が、インビボにおけるドパミン神経細胞と同質の機能を有することの確認は、ドパミンの放出、酸化ストレスや薬剤刺激への応答性を評価することによって行うことができる。

【0043】

本発明の製造方法を用いれば、上記１−１．の分化方法により得られた底板細胞以外の底板細胞または神経前駆細胞を出発材料として、高品質のドパミン神経細胞を効率良く製造することもできる。

【0044】

本発明の製造方法では、神経前駆細胞をドパミン神経細胞へと効率的に分化誘導することにより、高品質のドパミン神経細胞を大量に製造することができる。このドパミン神経細胞は、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有することから、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において医薬として利用すれば、高い生着率を達成できる。また、当該疾患の治療薬を開発するためのツールとしても有用である。

【0045】

本発明の製造方法の過程で得られる細胞及び本発明のドパミン神経細胞は、凍結保存及び解凍することができる。細胞の凍結及び解凍方法は、当該分野において公知であり、細胞の分化能、生存能、ドパミン産生能等に影響しない限り、特に限定されない。例えば、本発明のドパミン神経細胞は、ＰＢＳで洗浄後、細胞分散液（例、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により細胞を培養皿から剥離させた後、細胞分散液を除き、凍結保存液（例、セルバンカー２（株式会社ＬＳＩメディエンス））に懸濁して、−８０℃で保存することができる。また、解凍方法としては、例えば、３７℃の恒温槽中で解凍し、凍結保存液を遠心洗浄後、培地に懸濁させて用いる方法等が挙げられる。本発明の製造方法の過程で得られる細胞を凍結及び融解した場合、融解後の細胞からも、Ｎｕｒｒ１陽性ドパミン神経を誘導することが可能である。

【0046】

２．ドパミン神経細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の製造方法により製造されたドパミン神経細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
ここでドパミン神経細胞は、上記した本発明の製造方法により得られた細胞であれば特に限定されない。
該医薬において、ドパミン神経細胞はそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、ドパミン神経細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。また、ドパミン神経細胞が必要量以上に増殖することを防止するために、上記処理と組み合わせて、マイトマイシンＣ前処理などによる増殖の抑制や、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を当該細胞に導入して、その後、必要に応じて未活性型の薬を投与し、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を導入した細胞の中だけでその薬を毒物に変化させて細胞を死滅させる方法（自殺遺伝子療法）などの処理に付してもよい。

【0047】

本発明の医薬は、安全で低毒性であり、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル）に投与することができる。
本発明の医薬のヒトへの投与形態（移植方法）としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）もしくはＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．；３４４：７１０−９（２００１）に記載されるような手法が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、脳のドパミン欠乏領域へと投与（移植）される。
本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作製されたドパミン神経細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。また、本発明の医薬の投与量（移植量）および投与回数（移植回数）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜決定することができる。

【0048】

本発明のドパミン神経細胞を含む医薬は、それ自体の投与（移植）により、患者体内に効率的に生着でき、その結果、患者体内での効率的なドパミンの産生（放出）が可能となる。従って、本発明の医薬は、ドパミンの産生（放出）低下に起因する疾患、例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、てんかんおよび統合失調症などの神経変性疾患の治療に有用である。

【0049】

３．その他の用途
本発明のドパミン神経細胞は、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有するため、医薬化合物、好ましくは神経変性疾患治療用化合物のスクリーニングに有用である。例えば、試験化合物を単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、本発明のドパミン神経細胞に加え、当該細胞の形態または機能的な変化を測定することにより、当該試験化合物が医薬として有用であるか否かを評価することができる。機能的な変化の例としては、当該細胞から産生または放出されるドパミン量を計測することにより行うことができる。ここで、ドパミン神経細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を呈する細胞が好ましく、特に好ましくは、疾患由来の体細胞から作製された幹細胞を分化誘導することにより製造されたドパミン神経細胞である。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられ得る。

【0050】

上記スクリーニングを用いて得られる医薬は、生理学的に許容し得る添加剤を用いて、公知の方法に従って製剤化することができる。
このようにして得られる製剤の剤形としては、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などの経口剤；注射剤などの非経口剤が挙げられる。これら製剤における有効成分（上記スクリーニング方法により選択された化合物）の含量は例えば、０．１〜９０重量％である。
前記添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤；結晶性セルロースなどの賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤；油脂、注射用水、植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）などの液状担体；溶解補助剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）；溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）；無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）；保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）；酸化防止剤が挙げられる。
前記注射用水としては、例えば、生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどを含む等張液があげられる。
上記スクリーニングによって得られる医薬（好ましくは、神経変性疾患治療薬）は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
該医薬の投与量および投与回数は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜設定される。

【0051】

本発明のドパミン神経細胞は、化合物の毒性評価に用いることもできる。例えば、試験化合物を単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、本発明のドパミン神経細胞に加え、当該細胞の形態または機能的な変化を測定することにより、当該試験化合物が毒性を有するか否かを評価することができる。機能的な変化の例としては、当該細胞から産生または放出されるドパミンの量を計測することにより行うことができる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は、上記スクリーニングに記載したような塩を形成していてもよい。

【0052】

本発明の製造方法により得られたドパミン神経細胞は、さらに、創薬ターゲットの検証や疾患メカニズムの解析などにも使用することができる。

【0053】

別の実施態様において、本発明は、（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、神経前駆細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬およびキットも提供する。
上記試薬およびキットは、さらに（１）アスコルビン酸またはその塩および／または（２）アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含んでいてもよい。
上記ｃＡＭＰアナログ、ＭＥＫ阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としては、本発明の製造方法に使用可能であるものが挙げられる。

【0054】

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

【0055】

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

【実施例】

【0056】

［参考例１］
未分化ヒトｉＰＳ細胞の維持培養
ヒトｉＰＳ細胞としては２５３Ｇ１株（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８；２６：１０１−１０６）または２０１Ｂ７株（Ｃｅｌｌ．２００７；１３１：８６１−８７２）を使用した。
未分化状態のｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株または２０１Ｂ７株）の維持培養は、（ｉ）フィーダー細胞を使用する方法、または（ｉｉ）使用しない方法の２通りで行った。

【0057】

（ｉ）フィーダー細胞を使用する方法
フィーダー細胞としてマイトマイシンＣ（和光純薬）処理により増殖不活性化したマウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ、北山ラベス社）をゼラチンコートしたプレート上に播種したものを使用した。本方法では、培地として４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）と０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養を行った。培地交換は毎日行い、６〜７日ごとに継代を行った。上記継代は、霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル社製）を用いて細胞塊の状態でｉＰＳ細胞をプレートから剥離させた後、剥離させたｉＰＳ細胞を新しいフィーダー細胞上に播種することにより行った。

【0058】

（ｉｉ）フィーダー細胞を使用しない方法
フィーダー細胞を使用しない方法では、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコートしたプレートを用いた。本方法では、培地として０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（和光純薬）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用い、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養を行った。培地交換は毎日行い、６〜７日ごとに継代を行った。上記継代は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを用いて細胞塊の状態でｉＰＳ細胞をプレートから剥離させた後、剥離させたｉＰＳ細胞を、ビトロネクチンをコートした新しいプレート上に播種することにより行った。

【0059】

［参考例２］
ヒトｉＰＳ細胞の前培養
底板細胞への分化誘導の前培養として、上記参考例１に記載の（ｉ）または（ｉｉ）の方法で維持培養した未分化ヒトｉＰＳ細胞を９６穴プレートに播種した。

【0060】

（ｉ）フィーダー細胞上で維持したｉＰＳ細胞を使用する場合
まず細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液で１０秒間処理し、軽くピペッティングしてＭＥＦｓをある程度除去した。続いて、ＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃で５分間処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を９６穴プレートに１穴あたり１．５〜２×１０^４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１日間培養（前培養）した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地を用いた。

【0061】

（ｉｉ）フィーダー細胞を使用しない方法で維持したｉＰＳ細胞を使用する場合
まず細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を０．５ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを用いて３７℃で１０分間処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を９６穴プレートに１穴あたり１．５〜２×１０^４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１日間培養（前培養）した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８を使用した。上記９６穴プレートとしては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１／３０〜１／４０希釈したものを添加して、３７℃で一晩コーティングしたものを用いた。

【0062】

［参考例３］
ヒトｉＰＳ細胞から底板細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞から底板細胞への分化誘導は次の方法で行った。
上記参考例２に記載した前培養後の培地を、底板細胞への分化誘導因子（ＬＤＮ１９３１８９（０．５μＭ、Ａｘｏｎ ＭｅｄＣｈｅｍ社）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、和光純薬）、プルモルファミン（０．５μＭ、Ｍｅｒｃｋ社）、ＳＨＨ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ、Ａｘｏｎ ＭｅｄＣｈｅｍ社））を含む分化誘導培地に交換し（培養０日目）、３７℃、５％ＣＯ_２下で５日間培養した。その後、培地を、０．５μＭ ＬＤＮ１９３１８９および１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含む分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２下で５〜８日間培養した（計１０〜１３日間）。ここで、上記分化誘導培地としては、（ａ）２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、以下、Ｎｅｕｒｏ／Ｂ２７と記載）、または（ｂ）１％Ｎ２（和光純薬）と２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（以下、Ｎ２Ｂ２７と記載）を用いた。なお、これらの培養期間中、培地交換は３〜４日毎に行った。

【0063】

各底板細胞への分化誘導因子（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミン、ＳＨＨおよびＣＨＩＲ９９０２１）の有無による底板細胞マーカーの発現変動を調べるため、培養１３日目の細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡ画分を精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した後、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、底板細胞マーカーであるＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａの遺伝子発現量を測定した。結果を図１に示す。ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１の５種類すべてを添加した場合（図１中、Ａｌｌ）でＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａが共に高い発現を示したことから、上記５種類すべてを添加した場合に効率的に底板細胞を誘導できることが判った。また、上記５種類からＳＨＨを除いた場合（図中、−ＳＨＨ）でも、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの発現はある程度上昇したことから、ＳＨＨを使用しない、すなわち分化誘導因子として化合物のみを添加する場合でも底板細胞を誘導できると考えられた。また、上記５種類に加え、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化させた神経外胚葉を中脳領域の方向へ誘導する因子として広く用いられているＦＧＦ８を添加しても、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの発現はほとんど変化しなかったことから（図１中、Ａｌｌ＋ＦＧＦ８）、本系ではＦＧＦ８は必須ではないと考えられた。

【0064】

次に、培養１３日目のＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａタンパク質の発現を調べるため、抗ＦＯＸＡ２抗体および抗ＬＭＸ１Ａ抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１の５種類すべてを使用して１３日目まで培養した後、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）を添加して室温で３０分間インキュベートし、細胞の固定を行った。１次抗体として抗ＦＯＸＡ２抗体（ｓｃ−６５４４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）および抗ＬＭＸ１Ａ抗体（ＡＢ１０５３３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。分化誘導培地として前記（ａ）または（ｂ）のいずれを使用した場合にも、大部分の細胞がＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａタンパク質を共に発現している様子が観察された。

【0065】

以上の結果から、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１を添加した分化誘導培地で５日間、その後ＬＤＮ１９３１８９およびＣＨＩＲ９９０２１を添加した分化誘導培地で５〜８日間培養することにより、効率的に底板細胞を誘導できることが明らかとなった。

【0066】

［実施例１］
底板細胞からドパミン神経への分化誘導
参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目に培地を（Ａ）０．１ｍＭ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ社）、０．５ｍＭ ジブチリルｃＡＭＰ（ＳＩＧＭＡ社、以下、ｄｂｃＡＭＰと記載）および３μＭ ＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）０．１ｍＭ アスコルビン酸および０．５ｍＭ ｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３０日以上培養した。なお、上記培養期間中、３〜４日毎に培地交換を行った。

【0067】

［試験例１］
ドパミン神経細胞分化誘導後の中脳ドパミン神経細胞マーカー遺伝子およびマーカータンパク質の発現解析
培養４５日目に細胞を回収し、中脳ドパミン神経細胞の分化、成熟化および機能維持に極めて重要な転写因子として知られるＮＵＲＲ１の発現変動を調べた。その結果を図３に示す。アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加して分化誘導することでＮＵＲＲ１の発現は上昇したが、この２因子に加えＰＤ０３２５９０１を添加することによって発現がさらに大きく上昇した。
次に、中脳ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨ、ＮＵＲＲ１およびＦＯＸＡ２タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体、抗ＮＵＲＲ１抗体および抗ＦＯＸＡ２抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（Ａ）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して分化誘導を進め、培養４５〜５２日目に４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。１次抗体として抗ＴＨ抗体（ＡＢ１５２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗ＮＵＲＲ１抗体（ＰＰ−Ｎ１４０４−００、Ｐｅｒｓｅｕｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ社）および抗ＦＯＸＡ２抗体（ｓｃ−６５４４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体、Ａｌｅｘａ５６８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ６４７標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４、図５および図６に示す。いずれの条件においてもＴＨタンパク質を発現する細胞が同じように観察されたが、ＰＤ０３２５９０１を添加（実施例１、（Ａ））することによってＮＵＲＲ１タンパク質の染色が明らかに強陽性となり（図４）、また、ＴＨ、ＮＵＲＲ１およびＦＯＸＡ２タンパク質を同時に発現する細胞が多数観察された（図５）。図６は、高倍率で観察したときの染色像を示す。以上の結果は、２５３Ｇ１および２０１Ｂ７株でほぼ同様に得られた。
これらのことから、底板細胞を前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導することにより、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤を加えない場合に比して、数十倍も効率的に中脳ドパミン神経細胞を誘導できることが判明した。

【0068】

［試験例２］
ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１を添加した培地で誘導したドパミン神経細胞の機能評価
参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（Ａ）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して分化誘導を進め、培養５０日目に高ＫＣｌ刺激によるドパミンの放出能を評価した。
上記評価は次のように行った。分化誘導した細胞の培地をＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、一晩培養した。翌日ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カルシウムおよびマグネシウム含有）中で３７℃、５％ＣＯ_２下で１時間インキュベートを行い、ＨＢＳＳ（コントロール）または５５ｍＭ ＫＣｌを添加したＨＢＳＳに交換して、３７℃、５％ＣＯ_２下で１５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、上清を回収してフィルターろ過（ＵＦＣ３０ＨＶＮＢ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）した後、０．０１Ｎ ＨＣｌおよび１００μＭ ＥＤＴＡを添加し、得られた試料は分析まで−８０℃で保存した。分析には微量生体試料分析システムおよびＨＴＥＣ５００（エイコム社）、電気化学検出器ＥＰＣ−５００（エイコム社）を使用し、エイコム社のマニュアル（エイコム情報 Ｎｏ．２５）に従って、試料中に含まれるドパミン量の測定を行った。結果を図７に示す。前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導することにより、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加を明確に検出することができるようになった。前記（Ｂ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導した場合には、ロットによってドパミン放出が認められない場合があったが、前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導した場合には、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加は、異なるロットでも再現よく検出できた。このことから、ＰＤ０３２５９０１によって分化系が安定化したことが示唆された。また、２５３Ｇ１および２０１Ｂ７株で若干の応答の違いが認められたが、ＰＤ０３２５９０１を添加した場合では、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加が安定して検出され、異なる細胞株間において高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加が確認された。

【0069】

［実施例２］
各種ＭＥＫ阻害剤（ＦＧＦＲ阻害剤を含む）の検討
前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７におけるＰＤ０３２５９０１に代えて、ＰＤ１８４３５２（Ａｘｏｎ ＭｅｄＣｈｅｍ社）、ＳＵ５４０２（ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）阻害剤、和光純薬）またはＰＤ１７３０７４（ＦＧＦＲ阻害剤、Ａｘｏｎ ＭｅｄＣｈｅｍ社）のいずれかを含む培地により中脳ドパミン神経細胞を誘導できるか否かについて検討を行った。

【0070】

参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（１）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子、（２）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子、（３）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび３μＭ ＰＤ１８４３５２、（４）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび１０μＭ ＳＵ５４０２、または（５）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび０．１μＭ ＰＤ１７３０７４を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３０日以上培養した。なお、上記培養期間中、３〜４日毎に培地交換を行った。培養４５日目に細胞を回収し、ＮＵＲＲ１の発現変動を調べた結果を図８に示す。２５３Ｇ１株では、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２またはＳＵ５４０２の添加でＮＵＲＲ１の発現が上昇し、２０１Ｂ７株では４種類すべてでＮＵＲＲ１の発現が上昇した。一方、ＭＥＫパスウェイを活性化することが知られているＰＬＸ４０３２は効果が認められなかった。
以上の結果から、ＮＵＲＲ１の発現上昇はＭＥＫ（または上流のＦＧＦＲ）阻害作用に起因していることが示唆された。

【0071】

［試験例３］
分化誘導過程における各分化マーカーの発現変動
上記参考例、実施例および試験例の結果を元に、図９に示した３つの工程からなるドパミン神経分化系を設定し、未分化ｉＰＳ細胞からの分化誘導過程における各種分化マーカーの発現を調べた。

【0072】

工程１では、０．５μＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、０．５μＭ プルモルファミン、２００ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨおよび１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で５日間培養した。工程２では０．５μＭ ＬＤＮ１９３１８９および１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で８日間培養した（計１３日間）。工程３では、０．１ｍＭ アスコルビン酸、０．５ｍＭ ｄｂｃＡＭおよび３μＭ ＰＤ０３２５９０１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で３２日間培養した（計４５日間）。培養後、各種分化マーカーの経時的な発現変動を、参考例３と同様の方法を用いて測定した。発現解析の結果を図１０に示す。

【0073】

対照として、分化誘導因子を添加しない条件（図中、−）、ＳＨＨのみを除いた条件（図中、−ＳＨＨ）またはプルモルファミンのみを除いた条件（図中、−Ｐｕｒ）で培養し、工程２以降はすべて図９に示した条件で分化誘導した群の検討も行った。

【0074】

すべて添加した条件（図中、Ａｌｌ）では、底板細胞マーカーであるＦＯＸＡ２の発現は分化誘導７日目まで上昇し、分化誘導の終了までその発現量が維持されていた。中脳に分化する底板細胞マーカーであるＬＭＸ１Ａの発現は、分化誘導に伴い経時的に上昇し続けた。ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現は培養２０日目から急激に増加した。一方、ＳＨＨのみを除いた条件（図中、−ＳＨＨ）においても、すべて添加した条件（図中、Ａｌｌ）と同様の発現パターンを示したことから、ＳＨＨは必須ではないことが示唆された。しかしながら、プルモルファミンのみを除いた条件（図中、−Ｐｕｒ）ではＦＯＸＡ２の発現が低い状態であったことから、底板細胞の誘導にはプルモルファミンの添加が必須であると考えられた。

【0075】

［実施例３］
底板細胞からドパミン神経細胞への分化誘導の効率化
ＰＤ０３２５９０１に加え、工程３においてドパミン神経細胞への分化を促進させる因子を探索した。その結果、アクチビンＡを工程３において添加した場合に、ドパミン神経細胞への分化効率が上昇することが見出された。

【0076】

参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ｍＭ アスコルビン酸、０．５ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３μＭＰＤ０３２５９０１、２０ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）のうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとしてアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１、およびアクチビンＡを添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換してさらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後の細胞を回収し、ＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現変動を参考例３と同様の方法で調べた結果を図１１に示す。アクチビンＡのみを添加した場合、ＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現はほとんど上昇しなかった。しかしながら、アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰとともにアクチビンＡを添加した場合はＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現が顕著に増加し、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびアクチビンＡとともにＰＤ０３２５９０１を添加した場合はさらに大きく上昇した。一方で、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１を添加した場合は、培養２６日目の時点ではアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびアクチビンＡを添加した場合よりも低いレベルであった。

【0077】

次に、ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ｍＭ アスコルビン酸、０．５ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３μＭ ＰＤ０３２５９０１、２０ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡのうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとして分化誘導因子を添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換してさらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。１次抗体として抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を同時に添加することで、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現する細胞が顕著に増加している様子が観察された。これらの結果は、ＴＨおよびＮＵＲＲ１遺伝子の発現変動の結果とよく一致するものであった。

【0078】

以上の結果から、底板細胞の誘導後アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡを添加することで、従来よりも短い分化誘導期間（計２６日間）で、効率よく中脳ドパミン神経細胞を誘導できることが明らかとなった。

【0079】

［試験例４］
分化誘導２６日目における凍結保存
参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で中脳底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ ｍＭ アスコルビン酸、０．５ ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３ μＭ ＰＤ０３２５９０１、２０ ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、さらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃、２０−３０分間処理して分散させた。遠心洗浄後、約２ｘ １０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｔｕｂｅの濃度で細胞をセルバンカー２（十慈フィールド）に懸濁し、−８０℃で凍結保存した。
凍結保存した細胞を３７℃の恒温槽に浸して解凍し、遠心洗浄を行った後、９６穴プレートに１穴あたり２ｘ１０^４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２週間培養した。上記９６穴プレートとしては、ＭａｔｒｉｇｅｌをＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１／３０−１／４０希釈したもの、またはＬａｍｉｎｉｎ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社）をＤＭＥＭ／Ｆ１２で１０ μｇ／ｍｌの濃度に希釈したものを添加して、３７℃で一晩コーティングしたものを用いた。培養液としては、０．１ ｍＭ Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、０．５ ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３ μＭ ＰＤ０３２５９０１、２０ ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）のうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとしてアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、 ＰＤ０３２５９０１、およびアクチビンＡを添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いた。
解凍後２週間培養した細胞を回収し、ドパミン神経マーカーであるＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａの発現変動を参考例３と同様の方法で調べた結果を図１３に示す。アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を同時に添加することで、各分化マーカーは最も高い発現を示した。これらの因子を添加しない場合（図中、−）では、分化マーカーの発現レベルは低かったことから、解凍後は分化因子が必須であることがわかった。またこのときＹ２７６３２（１０ μＭ）の有無について検討を行ったが、マーカーの発現レベルにほとんど差は認められなかった。
次に、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。解凍後２週間培養した細胞に４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間固定した後、１次抗体として抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体と反応させ、さらに１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１４に示す。

【0080】

以上の結果から、分化誘導２６日目の細胞が凍結保存可能であること、さらに解凍後、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を添加して培養することにより、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質を発現する中脳ドパミン神経を効率よく誘導できることが明らかとなった。

【0081】

［試験例５］
移植実験
参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で中脳底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ ｍＭ アスコルビン酸、０．５ ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３ μＭ ＰＤ０３２５９０１または０．１ ｍＭアスコルビン酸、０．５ｍＭ ｄｂｃＡＭＰ、３ μＭ ＰＤ０３２５９０１、２０ ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡを添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して、さらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄しＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３７℃、１０分間処理して分散させ、Ｎｅｕｒｏ／Ｂ２７培地で細胞濃度を１ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓ／μｌに調整し、移植まで氷上で保持した。
マウス線条体への移植実験は以下のように行った。１２匹８週齢の雄性ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（日本チャールズリバー）をＣｏｎｔｒｏｌ群とアクチビンＡ群（各群６匹）に分けた。Ｃｏｎｔｒｏｌ群への移植はアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１を添加して培養した細胞を用い、アクチビンＡ群への移植はアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１、アクチビンＡを添加して培養した細胞を用いた。マウスはペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）麻酔下で頭部術野の毛を剃り、イソジンを塗布した。数分後に０．１％オスバン水溶液を浸したメンバンにてイソジンを拭取って皮膚を消毒し、脳定位固定装置（デビット・コフ、米国Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ社）に固定した。頭皮を正中から切開して、骨膜を剥離し、マウスのＢｒｅｇｍａおよびＬａｍｂｄａを暴露した。線条体の座標（ＡＰ： ＋０．５ ｍｍ；ＭＬ： ＋１．８ｍｍ）は「Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」を参照し、電動ドリル（φ０．５ｍｍ）を用いて頭蓋骨に穴を開け、ハミルトンシリンジを頭蓋骨表面から深さＤＶ：−３．５ ｍｍに挿入し、細胞（１ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓ／μｌ、２μｌ）を１０分間かけて移植した。移植後、頭部の切り口を縫合し回復させた。移植して４週、８週および１２週後に各群から２匹ずつサンプリングを行った。マウスをイソフルラン吸引麻酔後断頭放血し、頭部を４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、頭蓋骨を剥いた後３０％のサッカロース液にて２４時間脱水を行った。その後、脳を凍結包埋し、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて凍結切片（４０ μｍ）を作製した。ドパミン神経の組織染色は抗ＴＨ抗体と抗ヒト特異的Ｎｕｃｌｅｉ抗体（ＭＡＢ１２８１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）（ｈＮｕｃ）を用いて行った。
移植４週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のマウス線条体からＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞がわずかに（５％以下）観察された程度であったが（図１５左）、アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞が多数観察された（４０％以上、図１５右）。移植８週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の脳切片ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は４週後に比べ増えたが、アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は４週に比べさらに増加し、５０％以上であった（図１６）。移植１２週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の脳切片ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は８週後よりさらに増加したが、１０％未満であった。アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は８週に比べ、顕著な増加は認められなかった（図１７）。

【0082】

以上の結果から、中脳底板細胞に誘導した後、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡを添加した培地で培養した細胞は、マウス線条体でドパミン神経に効率よく分化し、３ヶ月以上定着し続けることが明らかとなった。

【0083】

本出願は、日本で出願された特願２０１３−１６３０６２（出願日：２０１３年８月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

【産業上の利用可能性】

【0084】

本発明によれば、神経前駆細胞から高品質のドパミン神経細胞をより効率的に製造することができる。本発明により製造されたドパミン神経細胞は、従来の方法により製造されたドパミン神経細胞では観察されなかった酸化ストレスや薬剤刺激への応答性が観察されるなど、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有する。従って、本発明により製造されたドパミン神経細胞は、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において、高い生着率を達成でき、極めて有用であるだけでなく、当該疾患の予防および／または治療に有用な化合物のスクリーニング、化合物の毒性評価、創薬ターゲットの検証、疾患メカニズムの解析など様々な用途に使用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】