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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6420910
(24)【登録日】2018年10月19日
(45)【発行日】2018年11月7日
(54)【発明の名称】顕微鏡および画像取得方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20181029BHJP
G02B 21/36 20060101ALI20181029BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20181029BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
G02B21/36
G01N21/64 E
【請求項の数】16
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2017-532315(P2017-532315)
(86)(22)【出願日】2015年8月5日
(86)【国際出願番号】JP2015072224
(87)【国際公開番号】WO2017022096
(87)【国際公開日】20170209
【審査請求日】2018年1月31日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１５年３月１１日〜１４日に開催された２０１５年 第６２回 応用物理学会春季学術講演会にて発表 ２０１５年３月２９日〜４月１日に開催されたＦｏｃｕｓ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ２０１５ Ｇ▲ｏ▼ｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにて発表
(73)【特許権者】
【識別番号】000000376
【氏名又は名称】オリンパス株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100118913
【弁理士】
【氏名又は名称】上田 邦生
(74)【代理人】
【識別番号】100142789
【弁理士】
【氏名又は名称】柳 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100163050
【弁理士】
【氏名又は名称】小栗 眞由美
(74)【代理人】
【識別番号】100201466
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 邦彦
(72)【発明者】
【氏名】土井 厚志
(72)【発明者】
【氏名】井元 兼太郎
(72)【発明者】
【氏名】高橋 晋太郎
(72)【発明者】
【氏名】瀧本 真一
(72)【発明者】
【氏名】藤田 克昌
(72)【発明者】
【氏名】米丸 泰央
【審査官】
越河 勉
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００６／０６１９４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１２−１９８２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−３９３２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Katsumasa Fujita, et al.，Saturated excitation microscopy with image subtraction，Proceedings of Focus on Microscopy 2015, parallel sessions Optical Theory 3: Computer reconstructed，Focus on Microscopy society，２０１５年 ３月３１日，parallel session 3/31 forums，17:10-17:30，http://www.focusonmicroscopy.org/2015/
【文献】
Yasuo Yonemaru, et al.，Saturated Excitation Microscopy with Optimized ExcitationModulation，CHEMPHYSCHEM，ドイツ，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.，２０１４年 ２月 ２日，vol.15，p.743-749
【文献】
Rainer Heintzmann, et al.，Saturated patterned excitation microscopy.aconcept for optical resolution improvement，J. Opt. Soc. Am. A，米国，Optical society of America，２００２年 ８月，Vol. 19, No. 8，p.1599-1609
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０２Ｂ ２１／００
Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射部と、
各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出部と、
該信号光検出部により取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡。
各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出部と、
該信号光検出部により取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡。
【請求項2】
前記信号光が蛍光であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項3】
前記照射部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項4】
前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項5】
前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項6】
前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、
前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項２に記載の顕微鏡。
前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項7】
前記画像生成部が、前記照射光が照射されるライン毎、前記信号光画像毎、前記信号光画像のピクセル毎、または、複数の前記信号光画像のスタック毎に前記差分を演算する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項8】
前記画像生成部が、前記差分の演算処理を行うロックインアンプを備え、該ロックインアンプにより前記信号光画像のピクセル毎に前記差分を演算する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項9】
前記照射部が、相互に照射強度が異なる３以上の前記照射光を前記試料に別々に照射し、
前記画像生成部が、前記複数の正規化光信号に対する差分を複数回行う請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
前記画像生成部が、前記複数の正規化光信号に対する差分を複数回行う請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項10】
前記画像生成部が、デコンボリューション機能を有する請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項11】
照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射ステップと、
各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出ステップと、
該信号光検出ステップにより取得された複数の信号光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算する演算ステップと、
該演算ステップにより得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成ステップとを含む画像取得方法。
各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出ステップと、
該信号光検出ステップにより取得された複数の信号光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算する演算ステップと、
該演算ステップにより得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成ステップとを含む画像取得方法。
【請求項12】
前記信号光が蛍光であることを特徴とする、請求項１１に記載の画像取得方法。
【請求項13】
前記照射ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１１または請求項１２に記載の画像取得方法。
【請求項14】
前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１１または請求項１２に記載の画像取得方法。
【請求項15】
前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１２に記載の画像取得方法。
【請求項16】
前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、
前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１２に記載の画像取得方法。
前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１２に記載の画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、顕微鏡および画像取得方法に関するものである。【背景技術】
【0002】
回折限界を超える高い空間分解能を有する顕微鏡技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１においては、蛍光が飽和するような強度のレーザ光を試料に照射し、変復調技術を利用して蛍光の飽和成分に該当する信号のみを検出して画像を生成している。蛍光の飽和が生じている領域においては、励起光に対する蛍光の発生効率の非線形性が高く、これを検出することでスポット径を小さくできることを利用して、高い空間分解能を実現することができる。
【0003】
さらに具体的には、特許文献１は、励起光の強度を変調し、それよりも高次の周波数で復調している。蛍光が飽和していない状態においては、蛍光の時間変化は励起光の時間変化と等しくなるが、蛍光が飽和している箇所では、蛍光と励起光の時間変化は異なる様相を示すようになる。その変化分が、結果として変調した周波数の高次周波数成分として現れるので、この高次周波数成分のみをロックインアンプで復調することにより検出している。【0004】
また、特許文献１には、蛍光が飽和する強度を含む２以上の強度の励起光を照射して、それぞれ画像を取得し、励起光強度に対する蛍光強度の関係をフィッティングすることで非線形成分のみを抽出する手法も開示されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第４４８７０７８号公報
【特許文献2】特許第５３１１５９５号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｄａｎｉｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ １９（８）， ０８６００６ （Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
特許文献１に記載された変復調を利用した飽和成分の検出技術では、飽和成分の信号を部分的に検出しているに過ぎない。例えば、レーザ光が周波数ｆで変調されるものとすると、レーザ光の強度ＩＥｘ（ｔ）と蛍光の強度ＩＦｌ（ｔ）は下記の（１）式、（２）式により表すことができる。【数1】
【数2】
【0008】
また、特許文献１に記載されたフィッティングを利用する検出技術では、各ピクセルにおいてフィッティング処理を行う必要があり、膨大な計算量が必要となるとともに、フィッティングによる誤差が画像に影響する。【0009】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる顕微鏡および画像取得方法を提供することを目的としている。【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１態様は、照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射部と、各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出部と、該信号光検出部により取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和また非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡である。【0011】
本態様によれば、照射部により試料の同一箇所に対して別々に照射された各照射光の照射強度に対応する強度の光信号が信号光検出部によりそれぞれ取得される。この場合において、少なくとも１つの照射光が信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有しているので、画像生成部により、これらの光信号の光強度成分が一致するよう正規化された複数の正規化光信号の差分を演算することで、信号光の飽和または非線形増減成分のみを効率よく抽出して信号光画像を生成することができる。したがって、複数の正規化光信号の差分を演算するだけの簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。本態様においては、前記信号光が蛍光であってもよい。【0012】
上記態様においては、前記照射部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。このように構成することで、信号光検出部により取得された光信号をそのまま正規化光信号として差分の演算処理を行うことができ、差分の演算処理を簡易にすることができる。また、光信号のダイナミックレンジが狭くなるのを回避することができる。
【0013】
上記態様においては、前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件を調整することなく、信号光の飽和成分を正確に抽出することができる。
【0014】
上記態様においては、前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。このように構成することで、簡易な差分の演算処理で、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
【0015】
上記態様においては、前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件の調整に手間を掛けずに、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
【0016】
上記態様においては、前記画像生成部が、前記照射光が照射されるライン毎、前記信号光画像毎、前記信号光画像のピクセル毎、または、複数の前記信号光画像のスタック毎に前記差分を演算することとしてもよい。このように構成することで、信号光画像毎またはスタック毎に差分を演算する場合は、照射光ごとに画像をある程度形成してから演算処理を行うことができ、差分処理を簡易にすることができる。また、ライン毎またはピクセル毎に差分を演算する場合は、環境温度の変化の影響などによって照射光の照射時間の揺らぎや試料の位置ずれなどが生じたとしても、誤差を生じ難くすることができる。
【0017】
上記態様においては、前記画像生成部が、前記差分の演算処理を行うロックインアンプを備え、該ロックインアンプにより前記信号光画像のピクセル毎に前記差分を演算することとしてもよい。このように構成することで、市販されているロックインアンプを利用して差分の演算処理を簡易かつ正確に行うことができる。
【0018】
上記態様においては、前記照射部が、相互に照射強度が異なる３以上の前記照射光を前記試料に別々に照射し、前記画像生成部が、前記複数の正規化光信号に対する差分を複数回行うこととしてもよい。このように構成することで、光信号におけるより高次の飽和成分に基づいて信号光画像を生成して、より高度の空間分解能を実現することができる。
【0019】
上記態様においては、前記画像生成部が、デコンボリューション機能を有することとしてもよい。このように構成することで、差分の演算処理時に負の強度成分が発生したとしても、負の強度成分を含まない信号光画像を生成することができる。また、空間周波数の高周波成分を強調してより高い分解能を実現することができる。
【0020】
本発明の第２態様は、照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射ステップと、各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出ステップと、該信号光検出ステップにより取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算する演算ステップと、該演算ステップにより得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成ステップとを含む画像取得方法である。【0021】
本態様によれば、照射ステップにより試料の同一箇所に対して別々に照射された各照射光の照射強度に対応する強度の光信号が信号光検出ステップによりそれぞれ取得される。この場合において、少なくとも１つの照射光が信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有しているので、演算ステップによるこれらの光信号の光強度成分が一致するよう正規化された複数の正規化光信号の差分の演算処理により、信号光の飽和または非線形増減成分のみを効率よく抽出することができる。したがって、画像生成ステップにより、Ｓ／Ｎ比が向上されたより高い空間分解能を有する信号光画像を生成することができる。本態様においては、前記信号光が蛍光であってもよい。【0022】
上記態様においては、前記照射ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。このように構成することで、信号光検出ステップにより取得された光信号をそのまま正規化光信号として差分の演算処理を行い、差分の演算処理を簡易にすることができる。また、光信号のダイナミックレンジが狭くなるのを回避することができる。
【0023】
上記態様においては、前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件を調整することなく、信号光の飽和成分を正確に抽出することができる。
【0024】
上記態様においては、前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。このように構成することで、簡易な差分の演算処理で、２光子励起観察によりＳ／Ｎ比が向上されたより高い空間分解能を有する信号光画像を生成することができる。
【0025】
上記態様においては、前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件の調整に手間を掛けずに、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
【発明の効果】
【0026】
本発明によれば、簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができるという効果を奏する。【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図2】本発明の第１実施形態に係る画像取得方法を説明するフローチャートである。
【図3A】第１レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。
【図3B】第２レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。
【図4A】本実施形態の比較例として、相互に同じ照射時間で照射強度のみを変えた第１比較用レーザ光と第２比較用レーザ光を試料に照射した場合の第１比較用蛍光と第２比較用蛍光のＰＳＦを示す図である。
【図4B】各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように照射強度およびパルス幅が設定された第１レーザ光と第２レーザ光を試料に照射した場合の第１蛍光と第２蛍光のＰＳＦを示す図である。
【図4C】ＰＳＦの中心部である非線形成分（飽和成分）のみが抽出された状態を示す図である。
【図5】本発明の第２実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図6A】本実施形態の比較例として、従来のように直径１００ｎｍの蛍光ビーズを波長８００ｎｍの励起光で２光子励起観察した結果の一例を示す図である。
【図7】第３レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。
【図8】本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【図9A】第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。
【図9B】第１レーザ光と第２レーザ光の照射により発生する各蛍光の蛍光信号の変化を示す図である。
【図10】本発明の第５実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【0028】
〔第１実施形態〕本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光顕微鏡１は、図１に示すように、１光子励起により試料Ｓを観察可能な構成を有している。すなわち、蛍光顕微鏡１は、レーザ光（照射光）を射出する光源装置（照射部）３と、光源装置３から射出されたレーザ光を試料Ｓに照射する照明光学系（照射部）５と、レーザ光が試料Ｓに照射されることにより発生する蛍光（信号光）を検出する検出光学系（信号光検出部）７と、検出光学系７により取得された蛍光信号（光信号）に基づいて蛍光画像（信号光画像）を生成するＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）のような処理装置（画像生成部）９とを備えている。
【0029】
光源装置３は、レーザ光を発生するレーザ光源１１と、レーザ光源１１から発せられたレーザ光を変調する光変調部１３とを備えている。光変調部１３は、例えば、音響光学素子であり、レーザ光源１１からのレーザ光を所定の強度および所定のパルス幅の矩形形状からなるパルスに変調することができるようになっている。
【0030】
本実施形態においては、光変調部１３は、レーザ光源１１からのレーザ光を相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光に切り替えて択一的に射出させるようになっている。また、光変調部１３は、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、これらレーザ光の照射強度およびパルス幅（照射時間）を設定するようになっている。【0031】
照明光学系５は、光源装置３から射出されたレーザ光を２次元的に走査させる２軸ガルバノスキャナ（以下、単にスキャナという。）１５と、スキャナ１５により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１７と、瞳投影レンズ１７により集光されたレーザ光を略平行光にする結像レンズ１９と、結像レンズ１９により略平行光にされたレーザ光を試料Ｓに照射する一方、試料Ｓの蛍光物質が励起されることにより発生する蛍光を集光する対物レンズ２１とを備えている。【0032】
スキャナ１５は、互いに交差する揺動軸回りに揺動可能な一対のガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂを備えている。このスキャナ１５は、これら一対のガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの中間位置が対物レンズ２１の瞳位置と共役な位置関係となるように配置されている。また、スキャナ１５は、各ガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの揺動角度に応じて、直交するＸ方向とＹ方向にレーザ光を走査させることができるようになっている。【0033】
検出光学系７は、対物レンズ２１により集光されてレーザ光の光路を戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー２３と、ダイクロイックミラー２３により分岐された蛍光を集光する集光レンズ２５と、集光レンズ２５により集光された蛍光の通過を制限するピンホール２７と、ピンホール２７を通過した蛍光を検出する検出器２９とを備えている。【0034】
ダイクロイックミラー２３は、光変調部１３を通過したレーザ光源１１からのレーザ光をスキャナ１５に向けて透過させる一方、試料Ｓから対物レンズ２１、結像レンズ１９および瞳投影レンズ１７を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を集光レンズ２５に向けて反射するようになっている。【0035】
ピンホール２７は、試料Ｓと光学的に共役な位置に配置されており、共焦点光学系を構築している。このピンホール２７は、試料Ｓにおける対物レンズ２１の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させることができるようになっている。検出器２９は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、検出した蛍光の輝度に相当する蛍光信号を処理装置９に送るようになっている。
【0036】
処理装置９は、スキャナ１５から送られてくるレーザ光の走査位置と、その走査位置にレーザ光が照射されることにより発生する蛍光が検出されたときに検出器２９から送られてくる蛍光信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を生成するようになっている。処理装置９により生成された蛍光画像は、図示しないディスプレイに表示したり、図示しないメモリに保存したりすることができるようになっている。【0037】
本実施形態においては、処理装置９は、相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光に対応して検出器２９から送られてくる２つの蛍光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて蛍光画像を生成するようになっている。光変調部１３により、各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、検出器２９から送られてくる２つの蛍光信号は、飽和が生じていない非飽和成分（光強度成分）が互いに一致するよう正規化されている。したがって、検出器２９から出力される２つの蛍光信号がそれぞれ正規化蛍光信号（正規化光信号）となる。【0038】
次に、本実施形態に係る画像取得方法について説明する。本実施形態に係る画像取得方法は、図２のフローチャートに示されるように、一方が蛍光を飽和させる照射強度を有し、相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光を試料Ｓの同一箇所に別々に照射する照射ステップＳ１と、各レーザ光が試料Ｓに照射されることにより発生する蛍光をそれぞれ検出する蛍光検出ステップ（信号光検出ステップ）Ｓ２と、蛍光検出ステップＳ２により取得された複数の蛍光信号を、対応する各レーザ光の照射強度とパルス幅とに基づき、飽和が生じていない非飽和成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化蛍光信号の差分を演算する演算ステップＳ３と、演算ステップＳ３により得られた差分信号を用いて蛍光画像を生成する画像生成ステップＳ４とを含んでいる。
【0039】
このように構成された蛍光顕微鏡１および画像取得方法の作用について説明する。本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法により試料Ｓを観察するには、光変調部１３によりレーザ光を変調して、相互に照射強度とパルス幅が異なる２つのレーザ光によりそれぞれ蛍光画像を取得する。
【0040】
具体的には、まず、図３Ａに示すように、光変調部１３により、レーザ光源１１から発生させたレーザ光を１ピクセル毎に蛍光が飽和しない強度（ＩＥＸ１）でΔｔ１のパルス幅となるように変調する。以下、このように変調されたレーザ光を第１レーザ光という。図３Ａにおいて、縦軸はレーザ光の強度を示し、横軸は照射時間を示している。図３Ｂ、図７、図９Ａにおいて同様である。【0041】
光変調部１３から射出された第１レーザ光は、ダイクロイックミラー２３を透過してスキャナ１５により走査され、瞳投影レンズ１７により集光される。そして、第１レーザ光は、結像レンズ１９により平行光にされて対物レンズ２１により試料Ｓに照射される（照射ステップＳ１）。これにより、スキャナ１５の各ガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの揺動角度に応じて、第１レーザ光が試料Ｓ上で２次元的に走査される。【0042】
第１レーザ光が走査されて試料Ｓの蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光は、対物レンズ２１により集光されて結像レンズ１９、瞳投影レンズ１７、スキャナ１５を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２３によりレーザ光の光路から分岐される。【0043】
そして、蛍光は集光レンズ２５により集光され、試料Ｓにおける対物レンズ２１の焦点位置において発生した蛍光のみがピンホール２７を通過して、検出器２９により検出される（蛍光検出ステップＳ２）。これにより、処理装置９において、検出器２９により取得された蛍光の蛍光信号と対応するレーザ光の走査位置とに基づいて試料Ｓの蛍光画像が生成される。処理装置９により生成された蛍光画像はディスプレイに表示させてもよい。【0044】
次に、図３Ｂに示すように、光変調部１３により、レーザ光源１１から発生させたレーザ光を１ピクセル毎に蛍光が飽和する強度（ＩＥＸ２）でΔｔ１よりも短いΔｔ２のパルス幅となるように変調する。ＩＥＸ２＞ＩＥＸ１である。以下、このように変調されたレーザ光を第２レーザ光という。これら第１レーザ光と第２レーザ光は、互いに１ピクセル分の露光における照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、照射強度（ＩＥＸ１，ＩＥＸ２）および照射時間（Δｔ１，Δｔ２）が設定されている。【0045】
第２レーザ光は、第１レーザ光の場合と同様に、試料Ｓ上で２次元的に走査される。これにより、試料Ｓの蛍光物質が励起されて発生した蛍光が検出器２９により検出され、処理装置９により試料Ｓの蛍光画像が生成される。【0046】
続いて、処理装置９により、第１レーザ光により発生した蛍光が検出されることによって検出器２９により取得された蛍光信号と、第２レーザ光により発生した蛍光が検出されることによって検出器２９により取得された蛍光信号との差分が演算され（演算ステップＳ３）、得られた差分信号を用いて蛍光画像が生成される（画像生成ステップＳ４）。【0047】
ここで、１ピクセル間に第１レーザ光で発生する蛍光（以下、第１蛍光とする。）の強度は下記の（３）式で示され、１ピクセル間に第２レーザ光で発生する蛍光（以下、第２蛍光とする。）の強度は下記の（４）式で示される。【数3】
【数4】
【0048】
第１レーザ光（ＩＥＸ１）は蛍光が飽和しない条件であるため、（３）式においてはβの項は存在しない。また、レーザの時間波形が矩形波であるため、Δｔ１およびΔｔ２内での時間積分は、それぞれΔｔ１およびΔｔ２との積と置き換えられる。一方、第２レーザ光（ＩＥＸ２）は蛍光が飽和する強度であるため、（４）式においてはβの項が残る。【0049】
この場合において、光変調部１３により、１ピクセル分の露光における第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、下記の（５）式が成り立つ。【数5】
【0050】
これにより、処理装置９において、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差分が演算されることで、下記の（６）式に示されるように、αがある線形項を消去して、βの非線形成分項のみ、すなわち、蛍光の飽和成分のみを抽出することができる。【数6】
【0051】
（６）式では、（４）式のβの成分が減衰することなく残っており、これは本手法が蛍光の飽和成分をロスなく高効率に検出できることを意味している。したがって、処理装置９により、（６）式の差分演算処理によって得られた差分信号に基づいて蛍光画像が生成されることで、蛍光の飽和成分のみを利用した高い分解能をＳ／Ｎ比が高い状態で実現することができる。【0052】
次に、ここまで数式を用いて説明した内容について、図を用いて概念的に説明する。図４Ａ，４Ｂ，４Ｃは蛍光の点像強度分布（ＰＳＦ）を示したものである。図４Ａ，４Ｂ，４Ｃにおいて、縦軸は蛍光の強度を示し、横軸は位置を示している。図６Ｃ、図９Ｂにおいて同様である。図４Ａは、本実施形態の比較例として、相互に同じ照射時間で照射強度のみを変えた第１比較用レーザ光と第２比較用レーザ光を試料Ｓに照射した場合の第１比較用蛍光と第２比較用蛍光のＰＳＦを示している。第１比較用レーザ光は蛍光が飽和しない強度に変調されたものであり、第２比較用レーザ光は蛍光が飽和する強度に変調されたものである。
【0053】
第１比較用蛍光と第２比較用蛍光は飽和の有無により形状が異なるが、レーザ光の照射強度が異なるために蛍光強度も大きく異なることになる。差分によって飽和成分のみを抜き出して空間分解能を向上させるということは、図４Ａに示すＰＳＦの裾部分（すなわち、飽和が生じていない蛍光強度部分）を差分によって効率的にゼロに近づけるということであるが、図４Ａの状態では第１比較用蛍光と第２比較用蛍光の強度の差が大きいため、差分演算を行っても裾部がゼロにはならない、すなわち、線形成分が残ってしまう。【0054】
これに対し、本実施形態においては、光変調部１３により、図４Ｂに示すように、飽和が生じていない非飽和成分（線形成分）が一致するよう第１蛍光と第２蛍光の強度が正規化されているので、第１蛍光と第２蛍光とで同図に示すＰＳＦの裾部が一致し、中心部が飽和によって強度に差が出る状態となる。【0055】
したがって、処理装置９により、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差分を演算することで、図４Ｂの裾部（線形成分）がゼロとなり、図４Ｃに示すように、ＰＳＦの中心部である非線形成分（飽和成分）のみを効率的に抽出することができる。これにより、ＰＳＦの幅を狭くして空間分解能を高めることができる。【0056】
以上説明したように、本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法によれば、片方が蛍光を飽和させる照射強度を有する２つのレーザ光を試料Ｓに照射し、処理装置９により、レーザ光に対応する蛍光信号の非飽和成分が一致するよう正規化された２つの蛍光信号の差分を演算することで、蛍光の飽和成分のみを効率よく抽出して蛍光画像を生成することができる。したがって、２つの蛍光信号の差分を演算するだけの簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。【0057】
本実施形態においては、光変調部１３により、（５）式が成り立つように第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度とパルス幅を予め設定することとした。これに代えて、処理装置９により、差分演算の際に、（５）式が実質的に成り立つように第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号を係数倍して正規化することとしてもよい。あるいは、第１レーザ光および第２レーザ光の照射強度とパルス幅の設定と、第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号の係数倍の双方を行うこととしてもよい。このように正規化された蛍光信号が正規化蛍光信号となる。【0058】
この場合、例えば、各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率ｋを（７）式とする。【数7】
【0059】
そして、処理装置９により、（７）式に示すように、レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｋを設定し、第１蛍光の（３）式に比率ｋを乗算してから第２蛍光の（４）式との差分を演算することとすればよい。【0060】
このようにすることで、下記の（８）式に示すように、αのある線形項を消去してβの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。【数8】
【0061】
また、通常、βは負の値であるので、差分演算の方向は（６）式や（８）式に示すように、非飽和状態で取得した蛍光信号から飽和状態で取得した蛍光信号を減算する方が望ましいが、特に限定するものではない。また、各レーザ光のパルス波形についても矩形である必要は無く、差分時に（５）式が成り立てばよい。
【0062】
また、本実施形態においては、第１レーザ光は蛍光が飽和しない強度に設定することとしたが、第１レーザ光も蛍光が飽和する強度に設定することとしてもよく、αの項（線形項）が差分によって消去できればよい。この場合は、βの項も差分されたものが出力されることになる。【0063】
また、本実施形態においては、非線形項として２次の項までを示したが、３次以降の成分が発生していてもよい。この場合においても、差分によって線形項が消去されるので、２次以降の高次項が全て検出されることになる。【0064】
また、実際に蛍光画像を取得する際には、蛍光が飽和しない強度の第１レーザ光で先に蛍光画像を取得し、その後に、蛍光が飽和する強度の第２レーザ光で蛍光画像を取得することが望ましい。第２レーザ光の方が第１レーザ光よりも照射強度が強いため、第１レーザ光による画像取得を先に行うことで、観察の途中で蛍光の退色が起きる可能性を低減することができる。なお、第２レーザ光の照射時間は短いため、第２レーザ光を用いた画像取得であっても蛍光の退色は生じ難い。【0065】
また、本実施形態においては、処理装置９がデコンボリューション機能を有し、差分演算後の蛍光画像をデコンボリューションすることとしてもよい。例えば、測定条件の誤差で（５）式を満たせない場合や、（５）式ではなく下記の（９）式となるような係数Ｍを設けて、この式を満たすように差分演算時に第１蛍光の蛍光信号や第２蛍光の蛍光信号に係数Ｍを乗算したり、もしくは光変調部１３でレーザ光の照射強度とパルス幅を設定したりする場合は、差分演算時にＰＳＦに負の強度成分が発生する。
【数9】
【0066】
この負の強度成分を含んだＰＳＦの形状を予めシミュレーションや実測定で把握しておき、把握したＰＳＦの形状を用いて差分演算後の蛍光画像をデコンボリューションすれば、負の強度成分を含まない蛍光画像を復元することが可能になる。この場合、負の成分を含んだＰＳＦは空間周波数の高周波が強調されたものになっており、デコンボリューションにより、空間分解能をより向上させることが可能にある。【0067】
また、本実施形態においては、蛍光画像毎に差分を演算することとしたが、これに代えて、例えば、処理装置９により、複数の蛍光画像のスタック毎、レーザ光が照射されるライン毎、または、蛍光画像のピクセル毎のいずれかのタイミングで差分を演算することとしてもよい。【0068】
蛍光画像毎や複数の蛍光画像のスタック毎に差分を演算する場合は、励起光ごとに画像をある程度形成してから演算処理を行うことができ、差分処理を簡易にすることができるという利点がある。一方、レーザ光のライン毎や蛍光画像のピクセル毎に差分を演算する場合は、環境温度の変化の影響などによって、レーザ光の照射時間に揺らぎが生じたり、試料Ｓが載置されるステージがドリフトして試料Ｓに位置ずれが生じたりしたとしても、誤差を生じ難くすることができるという利点がある。【0069】
また、本実施形態においては、光変調部１３として音響光学素子を例示して説明したが、レーザ光の照射強度とパルス幅を調整できればどのような構成でもよい。例えば、光変調部１３として電気光学素子など他の素子を利用することとしてもよいし、あるいは、光変調部１３を用いずにレーザ光源１１を直接変調することとしてよい。また、本実施形態においては、スキャナ１５として、２軸ガルバノスキャナを例示して説明したが、例えば、ステージにより試料Ｓを保持してステージスキャンすることとしてもよく、２軸ガルバノスキャナに限定されるものではない。
【0070】
〔第２実施形態〕次に、本発明の第２実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、第１実施形態の１光子励起観察に代えて、２光子励起観察を行う点で第１実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【0071】
本実施形態に係る蛍光顕微鏡１は、図５に示すように、レーザ光源１１として、チタンサファイアレーザなどの超短パルスレーザを備えている。また、ピンホール２７を備えず、試料Ｓから発せられて対物レンズ２１により集光された蛍光を結像レンズ１９に入射させる前にダイクロイックミラー２３によりレーザ光の光路から分岐させて集光レンズ２５に入射させるようになっている。【0072】
本実施形態においても、光変調部１３は、レーザ光を矩形パルスで照射強度とパルス幅が異なる２つのレーザ光に切り替えるとともに、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、これら２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅を設定するようになっている。【0073】
この場合の１ピクセル間に第１レーザ光で発生する第１蛍光の強度は下記の（１０）式で示され、１ピクセル間に第２レーザ光で発生する第２蛍光の強度は下記の（１１）式で示される。【数10】
【数11】
【0074】
１光子励起の場合の（３）式、（４）式と比較して、（１０）式、（１１）式に示されるように、２光子励起の場合は、非飽和成分がレーザ光の照射強度の２乗に比例し、飽和成分がレーザ光の照射強度の４乗に比例する点で異なる。光変調部１３により、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、上記の（５）式に相当する式として下記の（１２）式が成り立つ。【数12】
【0075】
そして、処理装置９により、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号の差分が演算されることで、上記の（６）式と同様に、下記の（１３）式に示されるように、αのある線形項を消して、βの非線形成分項のみ、すなわち、飽和成分のみを抽出することができる。【数13】
【0076】
このように、（１２）式の条件のように、１ピクセル間のレーザ光の照射強度の２乗の時間積分が第１レーザ光と第２レーザ光で等しいようにするところが第１実施形態の１光子励起の場合と大きく異なる点である。【0077】
本実施形態により取得される蛍光画像の一例とその比較例等を図６Ａ，６Ｂ，６Ｃに示す。図６Ａは、本実施形態の比較例として、従来のように、直径１００ｎｍの蛍光ビーズを波長８００ｎｍのレーザ光で２光子励起観察した結果である。蛍光画像内に複数個のビーズが表示されている。【0078】
一方、図６Ｂは、本実施形態により、図６Ａと同じビーズを同じ集光位置で２光子励起観察した結果である。図６Ｂは、図６Ａと比べて蛍光ビーズのサイズが小さく見えており、空間分解能が向上していることが分かる。【0079】
図６Ａにおいて１から５の数字で示したビーズのラインプロファイルを示したのが図６Ｃである。図６Ｃは、各ビーズの重心位置を横切る位置でラインプロファイルを取得し、重心位置を中心にラインプロファイルを取る位置を回転させて、各ラインプロファイルを足し合わせて平均化し、この工程を各ビーズについて行って１から５のビーズのラインプロファイルの平均を取ったものである。図６Ｃにおいて、破線は図６Ａの従来の２光子観察手法で観察したビーズのラインプロファイルであり、実線は図６Ｂに示す本実施形態の２光子励起観察で観察したビーズのラインプロファイルである。【0080】
図６Ｃのラインプロファイルから明らかなように、本実施形態によれば、従来の２光子励起観察と比較して空間分解能を向上することができる。なお、図６Ｃのラインプロファイルは蛍光ビーズのサイズも含んでいるため、顕微鏡の分解能そのもの（ＰＳＦ）ではない。すなわち、本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法によれば、ＰＳＦの分解能の向上度は図６Ｃの結果よりも大きくなる。【0081】
本実施形態においては、光変調部１３によるレーザ光の変調により蛍光信号を正規化することとしたが、これに代えて、処理装置９が、対応する各レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率により、蛍光信号を正規化することとしてもよい。【0082】
この場合、例えば、各レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率ｋを（１４）式とする。【数14】
【0083】
そして、処理装置９により、（１４）式に示すように、レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率ｋを設定し、第１蛍光の（１０）式に比率ｋを乗算してから第２蛍光の（１１）式との差分を演算することとすればよい。【0084】
このようにすることで、下記の（１５）式に示すように、βの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。【数15】
【0085】
〔第３実施形態〕次に、本発明の第３実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、照明光学系５が、相互に照射強度が異なる３以上のレーザ光を試料Ｓに別々に照射し、処理装置９が、複数の正規化蛍光信号に対する差分を複数回行う点で第１実施形態と異なる。蛍光顕微鏡１の構成は図１と同様である。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【0086】
本実施形態では、１光子励起観察と２光子励起観察のどちらでも利用可能であるが、１光子励起観察について説明する。光変調部１３は、相互に照射強度とパルス幅が異なる３つのレーザ光を択一的に射出するようになっている。例えば、３つのレーザ光を図３Ａに示す第１レーザ光と、図３Ｂに示す第２レーザ光と、図７に示す第３レーザ光とし、これらを試料Ｓに照射することにより発生する蛍光をそれぞれ第１蛍光、第２蛍光、第３蛍光とする。第３レーザ光は、例えば、１ピクセル毎に第２レーザ光よりも強い照射強度で、Δｔ２よりも短いΔｔ３のパルス幅を有するものとする。
【0087】
光変調部１３は、第１蛍光が飽和成分を含まず、第２蛍光が励起レーザに対して２次の非線形応答を示す飽和成分までを含み、第３蛍光が３次の飽和成分までを含み、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各々のレーザ光の照射強度およびパルス幅を調整するようになっている。【0088】
この場合の第１蛍光の強度は下記の（１６）式で示され、第２蛍光の強度は（１７）式で示され、第３蛍光の強度は（１８）式で示される。【数16】
【数17】
【数18】
【0089】
これら３つのレーザ光のパルス形状は矩形であり、照射時間の積分はパルス幅による乗算に等しくなっている。光変調部１３による各レーザ光の照射強度とパルス幅の設定により、上記の（５）式が成り立ち、第１実施形態と同様に、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号と差分によって上記の（６）式が成り立つ。
【0090】
同様に、第１蛍光と第３レーザ光に対しても下記（１９）式が成り立ち、第１蛍光の蛍光信号と第３蛍光の蛍光信号との差分により（２０）式が成り立つ。【数19】
【数20】
【0091】
（６）式および（２０）式は双方ともαがある線形項が消去された形となっている。処理装置９において、（２０）式をＩ２ＥＸ２Δｔ２／Ｉ２ＥＸ３Δｔ３倍してから（６）式と（２０）式の成分で差分演算することで、下記の（２１）式のようになる。
【数21】
【0092】
（２１）式においては、蛍光強度がレーザ光の照射強度の２乗に比例するβの項も消去され、３乗に比例するγの項のみが残っている。これは、第１実施形態では２次以降の非線形項が検出されるのに対して、第３実施形態では３次以降の非線形項が検出されるということを意味する。したがって、本実施形態によれば、更なる空間分解能の向上を実現することができる。【0093】
本実施形態は３次までに限定されるわけではなく、Ｓ／Ｎ比が許す限り、画像取得と差分回数を増やすことで検出される非線形項の次数を上げて空間分解能を向上させることが可能である。なお、第１蛍光は線形成分のみ、第２蛍光は２次の非線形成分までを含み、第３レーザ光は３次の非線形成分まで含むと仮定したが、いずれもそれよりも高次の非線形成分を含んでいてもよい。また、本実施形態は１光子励起に限定されるものではなく、第２実施形態と同様に、２光子励起観察においても利用できる。【0094】
本実施形態においては、処理装置９が、対応する各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、蛍光信号を正規化することとしてもよい。この場合、例えば、第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率を上記の（７）式とし、第１レーザ光と第３レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率を下記の（２２）式とする。
【数22】
【0095】
そして、処理装置９により、（７）式に示すレーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｋを第１蛍光の（１６）式に乗算してから第２蛍光の（１７）式との差分を演算することとすればよい。このようにすることで、上記の（８）式に示すように、αのある線形項を消去してβの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。【0096】
また、処理装置９により、（２２）式に示すように、レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｌを設定し、第１蛍光の（１６）式に比率ｌを乗算してから第３蛍光の（１８）式との差分を演算することとすればよい。【0097】
このようにすることで、下記の（２３）式に示すように、αのある線形項を消去してβとγを含む非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。【数23】
【0098】
そして、処理装置９により、（８）式と（２３）式に基づき、下記の（２４）式に示すように、レーザ光の照射強度の時間積分値に対する比率ｋおよび比率ｌを利用することで、高次の非線形成分（飽和成分）のみを抽出することができる。【数24】
【0099】
〔第４実施形態〕次に、本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、図８に示すように、処理装置９が、差分の演算処理を行うロックインアンプ３１を備え、ロックインアンプ３１により蛍光画像のピクセル毎に差分を演算する点で第１実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【0100】
光変調部１３は、図９Ａに示すように、１ピクセルを検出する時間内に第１レーザ光と第２レーザ光を複数回切り替えて、交互に特定周波数で試料Ｓに照射するようになっている。図９Ａでは１ピクセル間に各レーザ光の切り替えを２回繰り返しているが、回数はこれに限られるものではない。また、光変調部１３は、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各々のレーザ光の照射強度およびパルス幅を調整するようになっている。【0101】
各レーザ光の照射により発生する蛍光の蛍光信号の変化を図９Ｂに示す。各々のピクセルの信号値は第１レーザ光および第２レーザ光で発生した第１蛍光および第２蛍光の蛍光信号の各ピクセル時間内での積分値となるが、図９Ｂにおいては第１蛍光および第２蛍光の信号値をドットで示している。【0102】
光変調部１３による各レーザ光の照射強度とパルス幅の設定により、（５）式（２光子励起では（１２）式）が満たされているので、第１蛍光と第２蛍光の信号強度の差は非線形成分のみとなる。また、光変調部１３が、図９Ａのように、第１レーザ光と第２レーザ光を交互に特定周波数で試料Ｓに照射することで、図９Ｂのように、その特定周波数で交互に発生する第１蛍光と第２蛍光が検出器２９により検出される。【0103】
ロックインアンプ３１は、検出器２９と処理装置９との間に配置されており、検出器２９から送られてくる図９Ｂに示す第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号を検出して、光変調部１３の特定周波数で復調するようになっている。これにより、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差を取り出すことができる。【0104】
本実施形態によれば、検出器２９から出力される蛍光信号を演算処理して処理装置９で差分演算を行わなくても、市販のロックインアンプ３１を通してから処理装置９で処理するだけで、飽和成分のみを利用した蛍光画像を作成することができる。この場合、処理装置９は蛍光画像の作成と表示を行うだけとなる。【0105】
また、これまでは蛍光の飽和について述べてきたが、励起光強度の増加による蛍光信号の非線形応答であれば他の現象についても本案は利用可能である。例えば、蛍光のスイッチングが生じる蛍光タンパクや合成色素では励起光強度の増加によって異性化が生じる。これも励起光強度の増加に対する非線形応答（蛍光の非線形増減）であるため、飽和と同様に本案を適用することで、空間分解能を向上することができる。この場合、飽和が生じていない非飽和成分が互いに一致するよう各蛍光信号を正規化する上記各実施形態と同じようにして、非線形増減が生じていない光強度成分が互いに一致するよう各蛍光信号を正規化することとすればよい。【0106】
また、これまでは信号光が蛍光の場合について述べてきたが、本案は照射レーザ光強度の増加によって信号光が非線形応答する他の光検出の場合にも有用であり、例えば、特許文献２にあるような、反射、吸収、散乱、多光子効果にも利用できる。以下、これら現象に対する効果について述べる。【0107】
〔第５実施形態〕本実施形態では信号光が試料から発せられた蛍光ではなく、レーザ光が試料に照射された際に生じる反射光や散乱光、透過光、または多光子効果で生じる光成分などの場合である。まず、信号光が反射光乃至後方散乱光である場合について述べる。なお、ここで述べる散乱はミー散乱、レイリー散乱のことを差す。装置構成図を図１０に示す。
本実施形態の説明において、上述した各実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【0108】
図１０は図１とほぼ同じであるが、ダイクロイックミラー２３がビームスプリッタ３３に置き換わり、ビームスプリッタ３３と集光レンズ２５との間にダイクロイックフィルタ３５が挿入されている点が異なる。図１０において、レーザ光源１１から出射された光は試料Ｓの蛍光を誘起するものである必要は無く、レーザ光が試料Ｓで反射乃至後方散乱された成分が信号光として検出される。即ち、試料Ｓに入射したレーザ光は試料Ｓによって反射乃至後方散乱を受けて、反射光乃至後方散乱光が対物レンズ２１で集光される。その後反射光乃至後方散乱光はビームスプリッタ３３によって偏向され、ダイクロイックフィルタ３５を経て、ピンホール２７を通過し、検出器２９で検出される。【0109】
ここで、レーザ光の強度を上げると、試料Ｓ内でレーザ光の非線形成分が発生する。即ち、レーザ光の波長をλとすると、波長がλ／ｎ（ｎ：２以上の自然数）の高調波が発生する。ダイクロイックフィルタ３５はレーザ光の波長と同じ波長を透過させ、試料Ｓ内で生じた非線形成分を含む他の波長をカットするように設計されている。よって、ダイクロイックフィルタ３５を透過して検出器２９で検出される信号は非線形成分を含まない反射光乃至後方散乱光のみとなる。ここで、試料Ｓに入射したレーザ光の強度に着目すると、レーザ強度が高く非線形成分が発生している場合は、非線形成分が発生した分だけ、レーザ光と同波長の成分の強度が減少することになる。よって、非線形成分が発生していない状態においては、レーザ光の試料Ｓによる反射光乃至後方散乱光の強度は試料Ｓに入射するレーザ光の強度に比例するが、非線形成分が発生する状態においては、非線形成分が発生した分だけ非線形な減少が生じることになる。これは上記の蛍光の飽和と同様の効果であり、上記の式の蛍光強度Ｉｆｌをそれぞれ反射強度ＩＲｅ、散乱強度ＩＳｃと置き換えても式が成り立つ。即ち、反射や散乱においても、照射条件の異なる複数のレーザ光を入射して差分処理を行うことで、非線形成分のみを抽出し、それに基づいて画像を取得することができる。この場合、蛍光の飽和と同様に、空間分解能が向上した画像を取得できることになる。【0110】
また、上記の説明では反射光乃至後方散乱光を検出するようにしたが、試料Ｓを透過した透過光乃至前方散乱光を検出するようにしてもよい。この場合においても、ダイクロイックフィルタ３５でレーザ光と同じ波長成分のみを抜き出して、検出器２９で検出する。照射条件の異なるレーザ光を照射して信号光を取得し、その信号を差分処理することで非線形成分のみを抽出して空間分解能を向上させる点については同じである。【0111】
また、上記ダイクロイックフィルタ３５は、レーザ光と同じ波長をカットし、他の波長を透過するようにしてもよい。その場合はレーザ光と異なる波長の成分が検出器２９によって検出されることになる。例えば、ハイパーレイリー散乱、高調波発生、ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、四光波混合、誘導放出、差周波発生、和週波発生、パラメトリック蛍光、または誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）などの各種光を検出してもよい。この場合、ラマン散乱のように信号光強度に対するレーザ光強度の関係が線形である場合、実施形態１の（５）式と同様にレーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように照射条件を設定する。また、高調波発生のように信号光強度とレーザ光強度の関係が非線形である場合は実施形態２の（１２）式のようにレーザ光の照射強度を非線形次数分だけ累乗したものの照射時間内の積分値が等しくなるように照射条件を設定する。なお、この際に差分によって取り出される非線形成分は、少なくとも信号光が発生するための非線形効果の次数よりも高次の非線形成分となる。即ち、２次の高調波発生であるＳＨＧで考えると、少なくとも信号光が発生するための非線形効果の次数は２次であるが、本案の差分によって取り出される高次成分は３次以降の非線形成分となる。また、（７）式や（１４）式のような比率ｋを用いて差分処理を行ってもよく、第３実施形態のように複数回の差分を行ってより高次の非線形成分のみを取り出すことや、第４実施形態のようにロックインアンプを利用して非線形成分のみを取り出すことも可能である。【0112】
加えて、非線形光学効果により発生する信号光の非線形な増加成分を検出してもよい。例えば、試料が過飽和吸収体等の場合、レーザ光強度を増加することで非線形な信号光の増加が生じる。この非線形な増加成分のみを本案の差分で取得することも可能である。また、非特許文献１のような光音響信号の検出にも利用することができる。この場合は、本案と同様に試料に照射するレーザ光の照射強度と照射時間を複数条件で設定し、各々の条件化においてトランスデューサで検出された音響信号の差分を取ることで、レーザ光吸収の高次非線形成分を抽出して空間分解能を向上させることができる。このように、本案は光照射に対する信号の非線形応答成分を検出するものであり、その現象は何でもよく、上記に限られるものではない。また、これまでは試料に照射する光をレーザ光として述べてきたが、これは非線形応答が生じるためにはレーザのような強い光源が適しているからであり、非線形応答を生じさせる強度を有するものであればどのような光源でもよい。【0113】
以上、本発明の各実施形態およびその変形例について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。【符号の説明】
【0114】
１ 蛍光顕微鏡（顕微鏡）３ 光源装置（照射部）
５ 照明光学系（照射部）
７ 検出光学系（信号光検出部）
９ 処理装置（画像生成部）
Ｓ１ 照射ステップ
Ｓ２ 蛍光検出ステップ（信号光検出ステップ）
Ｓ３ 演算ステップ
Ｓ４ 画像生成ステップ