特許第6440369号(P6440369)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2015.5.11 β版

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特許6440369フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6440369
(24)【登録日】2018年11月30日
(45)【発行日】2018年12月19日
(54)【発明の名称】フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/52 20060101AFI20181210BHJP
   C12N 15/63 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 9/04 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 1/00 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 1/15 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 1/19 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 1/21 20060101ALI20181210BHJP
   C12N 5/10 20060101ALI20181210BHJP
   C12Q 1/54 20060101ALI20181210BHJP
   C12P 21/02 20060101ALI20181210BHJP
   H01M 8/16 20060101ALI20181210BHJP
【FI】
   C12N15/52 Z
   C12N15/63 Z
   C12N9/04 DZNA
   C12N1/00 Z
   C12N1/15
   C12N1/19
   C12N1/21
   C12N5/10
   C12Q1/54
   C12P21/02 A
   H01M8/16
【請求項の数】13
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2014-44009(P2014-44009)
(22)【出願日】2014年3月6日
(65)【公開番号】特開2015-167506(P2015-167506A)
(43)【公開日】2015年9月28日
【審査請求日】2017年2月20日
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小谷 勝重
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼木 純
(72)【発明者】
【氏名】田中 功二
(72)【発明者】
【氏名】角矢 博保
(72)【発明者】
【氏名】佐々木 典子
(72)【発明者】
【氏名】岩佐 尚徳
(72)【発明者】
【氏名】小澤 一道
(72)【発明者】
【氏名】平塚 淳典
(72)【発明者】
【氏名】横山 憲二
【審査官】 千葉 直紀
(56)【参考文献】
【文献】 国際公開第2014/045912(WO,A1)
【文献】 特開2011−139677(JP,A)
【文献】 日本農芸化学会大会講演要旨集, (2013), Vol. 2013, p. 3C15A15
【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集, (2012), Vol. 64, p. 42, 2Cp16
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12N 15/00
C12Q 1/00 〜 3/00
C12N 1/00 〜 7/08
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
PubMed
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
UniProt/GeneSeq
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の(a)〜(d)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
(d) 上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項2】
Thermoascus aurantiacus由来である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項3】
糖鎖が付加された、請求項1または2に記載のタンパク質。
【請求項4】
請求項1または2に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項5】
以下の(A)〜(D)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(A) 配列番号3または4に記載の塩基配列からなるDNA
(B) 配列番号3または4に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるDNA
(C) 上記(A)または(B)のDNAの塩基配列と、イントロンとを含むDNA
(D) 上記(A)〜(C)のいずれかのDNAと90%以上の相同性を有し、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項6】
請求項4または5に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項7】
請求項4または5に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項8】
請求項4または5に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項9】
請求項7に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項10】
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【請求項11】
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【請求項12】
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【請求項13】
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【0002】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の従来の例としては、グルコースオキシダーゼ(EC 1.1.3.4)が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、血糖センサ用酵素として古くから利用されているが、その理由は、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有しているからである。
【0003】
グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいて、グルコースの測定は、グルコースを酸化してD−グルコノ−1,5−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることによってなされる。しかし、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【0004】
このような問題を回避するために、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)(NAD(P)GDH:EC1.1.1.47)や、ピロロキノリンキノン(PQQ)依存性のGDH(PQQGDH:EC1.1.5.2)が、血糖センサ用酵素として用いられている。
【0005】
これらは、溶存酸素の影響を受けない点で有利である。しかし、NAD(P)GDHは安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であり測定が煩雑であるといった欠点がある。また、PQQGDHは基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の信頼性に乏しいという欠点がある。
【0006】
このような欠点が解消された酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素(FADGDH:EC1.1.99.10)が注目されている。FADGDHは、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素としてグルコースからD−グルコノ−1,5−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Aspergillus oryzaeやAspergillus terreusといった常温性糸状菌から発見されている。FADGDHは、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているという利点を有している。
【0007】
Aspergillus oryzae、または、Aspergillus terreus)由来のFADGDHについては、例えば、特許文献1(国際公開第2004/058958号)、特許文献2(国際公開第2006/101239号)、特許文献3(特開2008−178380号公報)、特許文献4(特開2008−154573号公報)、特許文献5(特開2008−154574号公報)、特許文献6(特開2010−193913号公報)、特許文献7(国際公開第2008/001903号)、特許文献8(特開2011−55836号公報)、特許文献9(特開2011−217755号公報)に開示されている。
【0008】
酵素等を含むグルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合があり、グルコースセンサ用試薬等の保管時の環境温度が高温になる場合も考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は熱安定性が高いことが望ましい。
【0009】
上述のAspergillus属糸状菌由来のFADGDHは、野生株から培養・精製して得られたものである場合は、ある程度の熱安定性を有している。しかし、大量生産に最も適している遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたFADGDHは、野生株から培養・精製して得られたFADGDHと比べて、熱安定性が大きく劣ることが分かっている(特許文献10:国際公開第2009/119728号)。なお、このように熱安定性が低下するのは、遺伝子組換え大腸菌によって生産された酵素には、表面に糖鎖が付加されていないためであると考えられている。
【0010】
このような遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたFADGDHの熱安定性を向上させるために、例えば、遺伝子レベルでアミノ酸配列を改変する方法が検討されている(特許文献10)。ここでは、特定の変異を加えたFADGDHの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えFADGDHを発現させた場合に、野生株で産生されたFADGDHと同等程度の熱安定性(50℃で15分間加熱処理した場合のGDH活性の安定性)を有するFADGDHが得られることを開示している。しかし、Aspergillus属糸状菌由来のFADGDHを部分的に改変したものであるため、野生株のAspergillus属糸状菌由来のFADGDHよりも、さらに熱安定性に優れ、より過酷な条件でも失活し難い特性を有するFADGDHを得ることは容易でないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第2004/058958号
【特許文献2】国際公開第2006/101239号
【特許文献3】特開2008−178380号公報
【特許文献4】特開2008−154573号公報
【特許文献5】特開2008−154574号公報
【特許文献6】特開2010−193913号公報
【特許文献7】国際公開第2008/001903号
【特許文献8】特開2011−55836号公報
【特許文献9】特開2011−217755号公報
【特許文献10】国際公開第2009/119728号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというFADGDHの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、Thermoascus aurantiacus由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。
【0014】
また、本発明は、以下の(a)〜(d)のいずれかのタンパク質にも関する。
(a) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
なお、このタンパク質もThermoascus aurantiacus由来であることが好ましい。
【0015】
また、上記のタンパク質は、糖鎖付加されたタンパク質であることが好ましい。
また、本発明は、上記のタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
【0016】
また、本発明は、以下の(A)〜(D)のいずれかのDNAからなる遺伝子にも関する。
【0017】
(A) 配列番号3または4に記載の塩基配列からなるDNA
(B) 配列番号3または4に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるDNA
(C) 上記(A)または(B)のDNAの塩基配列と、イントロンとを含むDNA
(D) 上記(A)〜(C)のいずれかのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【0018】
また、本発明は、上記の遺伝子を含む組換えベクターにも関する。
また、本発明は、上記の遺伝子を含む形質転換体にも関する。
【0019】
また、本発明は、上記の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。
【0020】
また、本発明は、上記の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。
【0021】
また、本発明は、上記のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコースセンサにも関する。
【0022】
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたバイオ燃料電池にも関する。
【発明の効果】
【0023】
本発明においては、好熱性糸状菌由来のFADGDH活性を有するタンパク質(酵素)を見出したことにより、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというFADGDHの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することができる。また、このようなグルコース測定用酵素を用いることにより、グルコース濃度測定試薬やグルコースセンサ作製時や輸送時の酵素の熱失活が低減され、該酵素の使用量低減や測定精度の向上が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図1】実施例1でのTh.aurantiacus(6766および9748)の縮重PCR産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
図2】Th.aurantiacus(6766)由来FADGDH遺伝子全領域を含むDNA断片の塩基配列を示す図である。
図3図2に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
図4】Th.aurantiacus(9748)由来FADGDH遺伝子全領域を含むDNA断片の塩基配列を示す図である。
図5図4に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
図6】Th.aurantiacus(6766)由来FADGDH遺伝子のORFの塩基配列、および、Th.aurantiacus(9748)由来FADGDH遺伝子のORFの塩基配列の各々から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
図7】実施例4において、実施例2(大腸菌発現)のTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHについてのSDS−PAGEの結果を示す図である。
図8】実施例4において、実施例3(酵母発現)のTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHについてのSDS−PAGEの結果を示す図である。
図9】実施例5において、実施例2(大腸菌発現)のTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHについての吸収スペクトルを示す図である。
図10】実施例5において、実施例3(酵母発現)のTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHについての吸収スペクトルを示す図である。
図11】実施例6の「温度安定性」評価におけるTh.aurantiacus(6766および9748)の残活性率を示すグラフである。
図12】Thermoascus crustaceusについての「温度安定性」評価における残活性率を示すグラフである 。
図13】実施例6の「温度依存性」評価におけるTh.aurantiacus(6766および9748)の相対活性を示すグラフである。
図14】実施例6の「pH安定性」評価におけるTh.aurantiacus(6766および9748)の残活性率を示すグラフである。
図15】実施例6の「pH依存性」評価におけるTh.aurantiacus(6766および9748)の相対活性を示すグラフである。
図16】実施例6の「固定化酵素電極での応答性」評価におけるTh.aurantiacus(6766および9748)についての電流値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
(実施形態1)
本実施形態の発明は、好熱性糸状菌であるThermoascus aurantiacus(Th.aurantiacus)由来のタンパク質であって、FADGDH活性を有するタンパク質(酵素)である。
【0026】
これまで、好熱性糸状菌由来のFADGDH活性を有するタンパク質は知られておらず、FADGDHの熱安定性を向上する方策としての、好熱性糸状菌由来のFADGDH活性を有するタンパク質の探索も行われていなかった。また、好熱性糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、FADGDH活性を有するタンパク質を探索するのは、FADGDHの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。
【0027】
本発明者らは、好熱性糸状菌のゲノムDNAを独自の手法で調べることにより、いくつかの好熱性糸状菌がFADGDH活性を有するタンパク質を産生していることを見出した。すなわち、FADGDHを産生することが知られている常温性糸状菌(Aspergillus属糸状菌)に由来するFADGDHの一次構造(アミノ酸配列)の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、好熱性糸状菌ゲノムDNAを鋳型とする縮重PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行ない、そのPCR産物を分析することにより、好熱性糸状菌がFADGDH活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。
【0028】
常温性糸状菌由来FADGDHのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、YDYIVVGGGTSGL、QVLRAGKALGGTSTINGMAYTRAEDVQID、RSNFHPVGTAAMM、または、NVRVVDASVLPFQVCGHLVSTLYAVAERAである。
【0029】
縮重PCR用のプライマーは、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーを用いることが好ましい。
【0030】
このような好ましいプライマーのうち、センスプライマーの塩基配列としては、
(A) 5’−TAYGAYTAYATCGTTYTKGGAGGCGG−3’(配列番号5)、
(B) 5’−CAAGTKCTNCGTGCRGGRAAGGCCCTTGG−3’(配列番号6)、
(C) 5’−ACSCGCGCMGAGGATGTCCAGAT−3’(配列番号7)
が挙げられる。
【0031】
アンチセンスプライマーの塩基配列としては、
(D) 5’−CATCATGGCAGCMGTKCCGACGGGRTGGAAGTT−3’(配列番号8)、
(E) 5’−GTGCTMACCAARTGGCCGCARACCTGGAA−3’(配列番号9)
が挙げられる。
【0032】
本発明のタンパク質(酵素)は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。ただし、本発明のFADGDH活性を有する組換えタンパク質は、意外にも、表面に糖鎖が付加されている場合(例えば、組換え酵母や好熱性糸状菌の野生株が産生したFADGDH)だけでなく、表面に糖鎖が付加されていない場合(例えば、組換え大腸菌によりFADGDHを製造した場合)でも、従来と比べれば比較的優れた熱安定性を有する傾向を有している。このため、実用的に問題のない熱安定性を有するものが得られる限り、組換え大腸菌により糖鎖が付加されていない組換えFADGDHを製造してもよく、この場合、製造効率の面では非常に有利であり、大幅な製造コストの削減が可能である。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のFADGDH活性を測定し、その熱処理前のFADGDH活性値に対する比率を求めることにより判断される。FADGDH活性は、種々公知の方法で測定することができる。
【0033】
(実施形態2)
本実施形態の発明は、以下の(a)〜(d)のいずれかのタンパク質である。
【0034】
(a) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号1または2に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 上記(a)または(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【0035】
配列番号1は、「野生型のThermoascus aurantiacus(6766)由来のFADGDHのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。配列番号2は、「野生型のThermoascus aurantiacus(9748)由来のFADGDHのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。Thermoascus aurantiacusは好熱性糸状菌である。
【0036】
シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号1のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、一旦は合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。
【0037】
なお、本実施形態のタンパク質も、好熱性糸状菌由来のタンパク質であることが好ましい。
【0038】
(実施形態3)
本実施形態の発明は、上記実施形態1または2のタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、以下の(A)〜(D)のいずれかのDNAからなる遺伝子が挙げられる。
【0039】
(A) 配列番号3または4に記載の塩基配列からなるDNA
(B) 配列番号3または4に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるDNA
(C) 上記(A)または(B)のDNAの塩基配列と、イントロンとを含むDNA
(D) 上記(A)〜(C)のいずれかのDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【0040】
配列番号3は、「野生型のThermoascus aurantiacus(6766)由来のFADGDHをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。配列番号4は、「野生型のThermoascus aurantiacus(9748)由来のFADGDHをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。
【0041】
「上記(A)または(B)のDNAの塩基配列と、イントロンとを含むDNA」とは、上記(A)または(B)のDNAの塩基配列をエキソンとし、そのエキソン配列の途中にイントロン配列が介在しているDNAである。
【0042】
また、本実施形態の遺伝子には、上記(A)または(B)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつGDH活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子も含まれる。
【0043】
ここで、ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、ハイブリダイズの条件としては、「0.02%SDSを含む5×SSC中で40〜70℃」の条件が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件としては、例えば、「2×SSC、0.1%SDS、室温(25℃)」の条件が挙げられる。ストリンジェントな条件では、配列番号3または4に示す塩基配列と90%以上の相同性、好ましくは95%以上の相同性、より好ましくは97%以上の相同性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることが好ましい。
【0044】
本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態1または2のタンパク質をコードするものであればよく、FADGDHの発現を向上させるように、コドン出現頻度(Codon usage)を変えた塩基配列なども含まれる。
【0045】
(実施形態4)
本実施形態の発明は、実施形態3の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態3の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に導入され、該宿主はFADGDHを生産する形質転換体となる。
【0046】
(実施形態5)
本実施形態の発明は、実施形態3の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、大腸菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、好ましくは大腸菌、酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物である。生産効率の点からは大腸菌を用いることが好ましい。大腸菌としては、例えば、大腸菌JM109、大腸菌DH5α、大腸菌W3110、大腸菌C600などが使用できる。また、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Pichia pastoris(P.pastoris)、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombeが使用できる。
【0047】
本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態4の組換えベクターで形質転換された大腸菌または酵母が挙げられる。
【0048】
(実施形態6)
本実施形態の発明は、実施形態3の遺伝子を用いた好熱性糸状菌由来のFADGDHの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態5の形質転換体を用いることにより、FADGDHを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
【0049】
好熱性糸状菌由来のFADGDHの遺伝情報を有するDNA(実施形態3の遺伝子)は、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主に導入される。宿主については、上記実施形態5で説明した宿主と同様である。なお、大腸菌でFADGDH活性を有するタンパク質を生産する場合、上記遺伝子のN末端にあるシグナルペプチドを残したままでは十分な生産能が得られないことがあるため、シグナルペプチド(ゲノム情報からシグナルペプチドと推定されるアミノ酸配列)を削除した上記遺伝子を大腸菌に導入することが好ましい。
【0050】
宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル(例えばコンピテントハイJM109;東洋紡績)を用いても良い。宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。
【0051】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のFADGDHを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【0052】
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【0053】
培地温度は菌が発育し、FADGDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、好ましくは20〜42℃程度であり、酵母の場合、好ましくは20〜35℃程度である。培養時間は培養条件によって異なるが、FADGDHが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は6〜72時間程度である。培地pHは菌が発育しFADGDHを生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはpH5.0〜9.0程度である。
【0054】
培養物中のFADGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはFADGDHが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。一方、FADGDHが菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してFADGDHを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【0055】
このようにして得られたFADGDH含有溶液からFADGDHを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒(例えばメタノール、エタノール、アセトン)による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤或やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、FADGDHを精製することもできる。
【0056】
好熱性糸状菌由来のFADGDHの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態3の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によって好熱性糸状菌由来のFADGDHを製造することも可能である。
【0057】
(実施形態7)
本実施形態の発明は、実施形態1または2のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
【0058】
グルコース濃度測定試薬は、実施形態6の方法により製造されたFADGDHを少なくとも1回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該FADGDH以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態(例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液)で提供され得る。
【0059】
グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質(酵素:FADGDH)が固定化される。
【0060】
固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質(FADGDH)をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。
【0061】
(実施形態8)
本実施形態の発明は、実施形態1または2のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【0062】
恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型FADGDHを固定化した電極を用い、対極(例えば白金電極)および参照電極(例えばAg/AgCl電極)を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【0063】
(実施形態9)
本実施形態の発明は、実施形態1または2のタンパク質(FADGDH)を用いたバイオ燃料電池である。FADGDHは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。
【実施例】
【0064】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0065】
(実施例1)
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門(NBRC)より購入した好熱性糸状菌であるTh.aurantiacus(6766)〔Thermoascus aurantiacus(NBRC6766)〕およびTh.aurantiacus(9748)〔Thermoascus aurantiacus(NBRC9748)〕を、ポテトデキストロース培地(Difco Laboratories)または麦芽エキス培地(2%麦芽エキス、2%グルコース、0.1%ペプトン)を用いて好気的に培養した。培養後の好熱性糸状菌からWizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)を用いてゲノムDNAを抽出した。
【0066】
既報のアスペルギルス属糸状菌(Aspergillus oryzae、Aspergillus terreus)に由来するFADGDHの一次構造(アミノ酸配列)の共通部分に着目して、本発明者らが独自に設計した後述のプライマーを用いて、好熱性糸状菌(Th.aurantiacus)ゲノムDNAを鋳型とする縮重PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行なった。
【0067】
縮重PCR用のセンスプライマーとしては、
プライマーA(5’−TAYGAYTAYATCGTTYTYGGAGGCGG−3’)、
プライマーB(5’−CAAGTKCTNCGTGCRGGRAAGGCCCTTGG−3’)、
プライマーC(5’−ACSCGCGCMGAGGATGTCCAGAT−3’)
のいずれかを用いた。
【0068】
アンチセンスプライマーとしては、
プライマーD(5’−CATCATGGCAGCMGTKCCGACGGGRTGGAAGTT−3’)、
プライマーE(5’−GTGCTMACCAARTGGCCGCARACCTGGAA−3’)のいずれかを用いた。
【0069】
なお、上記プライマーA〜Eは配列中にミックス塩基(K、N、M、R、S、Y)を含んでいるが、プライマーA〜Eの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。
【0070】
上記の好熱性糸状菌から得たゲノムDNAを鋳型として、上記3種のセンスプライマーと2種のアンチセンスプライマーとの組み合わせによる6通りの縮重PCRを行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動(1.2%アガロースゲル)に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりPCR産物の存在を確認した。
【0071】
その結果、Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)の2種の好熱性糸状菌のゲノムを鋳型として得られたPCR産物について、約1.8kbのDNAバンドが検出された(図1(a)および(b)の*印)。なお、図1において、レーンMはマーカー(Gene Ladder Wide 1(0.1−20kb):Nippon Gene)であり、レーン1はプライマーAとDの組合せを用いた場合、レーン2はプライマーAとEの組合せを用いた場合、レーン3はプライマーBとDの組合せを用いた場合、レーン4はプライマーBとEの組合せを用いた場合、レーン5はプライマーCとDの組合せを用いた場合、レーン6はプライマーCとEの組合せを用いた場合を示している。
【0072】
縮重PCRで増幅されたDNA断片を、pCR−Blunt−II−TOPO(Life Technologies)に連結した後に、大腸菌DH5α(宝酒造)にサブクローニングした。挿入DNA断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来FADGDH遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)のゲノムにFADGDH遺伝子が存在することが示唆された。
【0073】
なお、上記プライマーA〜E以外のいくつかのプライマーを用いた場合は、アスペルギルス属糸状菌由来FADGDH遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅は確認できなかった。
【0074】
(実施例2)
本実施例では、Th.aurantiacus(Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748))由来FADGDHを大腸菌を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【0075】
(1)Th.aurantiacusからのFADGDH遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子部分断片をプローブとするゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Th.aurantiacusゲノムDNAを各種制限酵素(New England BioLabs)で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているDNA断片を20 X SSC(3M NaCl、0.3M クエン酸三ナトリウム、pH7.0)を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン(Hybond−N+; GE Healthcare)に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブDNA(DIG DNA Labeling and Detection Kit; Roche)を混合し、65℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたDNA断片はアルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体(DIG DNA Labeling and detection Kit)を用いて検出した。
【0076】
その結果、SacIのレーンから約4.0kbの位置にプローブとハイブリダイズするDNAバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来FADGDH遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)が約1.8kbであることから、プローブとハイブリダイズするこの約4.0kBのSacI断片が、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
【0077】
次に、Inverse PCRにより、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子の開始コドン近傍領域を含む5’−flanking領域と、終始コドン近傍領域を含む3’−flanking領域のクローニングを試みた。
【0078】
SacIで切断したTh.aurantiacusのゲノムDNAを調製用アガロースゲルに供し、約4.0kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をT4リガーゼ(宝酒造)により環状化し、Inverse PCRの鋳型とした。Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー6766_9748GSP2(5’−GGATTGTACGAGGCACCTGCCGCCATCTGC−3’)、および、プライマー6766_9748GSP3(5’−TGAACGCGACAGTCCTACAGCGCCTGTTCC−3’)を用いてInverse PCRを行なった結果、約3.0kbの位置に単一のDNA断片が検出された。
【0079】
このDNA断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子の5’−flanking領域と3’−flanking領域の増幅に成功したことが分かった。
【0080】
次に、5’−flanking領域および3’−flanking領域の配列に基づいて設計したプライマー6766_9748GSP7(5’−AGAGATCTCTGTCAATTTCTTACGGAAGCT−3’)と6766_9748GSP8(5’−TAGATATCTTTTTCTTTCTTTAATGACGTG−3’)を用いてTh.aurantiacus由来ゲノムDNAを鋳型とするPCRを行なった。
【0081】
その結果、単一の約2.6kbのDNA断片の増幅が確認され、このDNA断片がTh.aurantiacus由来FADGDH遺伝子全領域を含んでいることが分かった。
【0082】
(2)Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子の塩基配列解析
Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子全領域を含むDNA断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Th.aurantiacus(6766)由来FADGDH遺伝子全領域を含むDNA断片の塩基配列を図2に示す。また、Th.aurantiacus(9748)由来FADGDH遺伝子全領域を含むDNA断片の塩基配列を図4に示す。
【0083】
スプライシング部位をGT−AG則に基づいて予測することにより、これらの塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Th.aurantiacus(6766)由来FADGDH遺伝子は、4つのエキソン(エキソン1;355bp、エキソン2;619bp、エキソン3;620bp、エキソン4;215bp)から構成される1809bpのORF(603アミノ酸をコード)を含んでいた(図2の下線部および図3参照)。また、Th.aurantiacus(9748)由来FADGDH遺伝子は、4つのエキソン(エキソン1;355bp、エキソン2;619bp、エキソン3;620bp、エキソン4;215bp)から構成される1809bpのORF(603アミノ酸をコード)を含んでいた(図4の下線部および図5参照)。
【0084】
図6に、このようにして特定されたTh.aurantiacus(6766)由来およびTh.aurantiacus(9748)由来のFADGDH遺伝子のORF(FADGDHコーディング領域)の塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。なお、図6では、Th.aurantiacus(6766)由来の遺伝子から類推されるアミノ酸配列(上段)と、Th.aurantiacus(9748)由来の遺伝子から類推されるアミノ酸配列(下段)とを併記している。
【0085】
図6に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーSignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン(Met1)から16番目のアラニン(Ala16)までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図6に示すアミノ酸配列において、FAD結合に重要なFAD結合モチーフ(Gly−Gly−Gly−Thr−Ser−Gly)は完全に保存されていた。Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)由来FADGDHを大腸菌および酵母で発現させる際には、このシグナルペプチドを含まないDNA配列で発現ベクターを構築した。
【0086】
さらに、Th.aurantiacus(Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748))由来FADGDHのアミノ酸配列(図6)を、他の好熱性糸状菌(Thermoascus crustaceus、Talaromyces emersonii)由来FADGDHと比較した。表1に、Th.aurantiacus由来FADGDHのアミノ酸配列と他の糸状菌由来FADGDHとのアミノ酸配列の相同性を示す。
【0087】
【表1】
【0088】
表1に示すように、Th.aurantiacus由来FADGDHのアミノ酸配列と他の好熱性糸状菌由来FADGDHとのアミノ酸配列の相同性は57.0〜66.1%であった。このことから、Th.aurantiacus由来でない他の好熱性糸状菌は、Th.aurantiacus由来FADGDHのような極めて高い耐熱性(実施例6参照)は有していないことから、Th.aurantiacus(6766)由来およびTh.aurantiacus(9748)由来のFADGDHのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上)の相同性を有するタンパク質であれば、高い耐熱性を有する可能性が高いと考えられる。
【0089】
(3)Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子発現型プラスミドの作製
Th.aurantiacus〔Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)〕由来のFADGDH遺伝子のコーディング領域をOverlap extension PCRにより合成した。
【0090】
まず、各エキソンをPCR増幅した。エキソン1のPCR増幅には、プライマーとして、6766_9748E1S(5’−ACCATGTTATTTTGTGTGAGGATTCTCAGT−3’)と6766_9748E1A(5’−GCCATCCCATTGATCGTGCTCGACCCACCG−3’)を用いた。エキソン2のPCR増幅には、プライマーとして、6766_9748E2S(5’−GATCAATGGGATGGCTTATGCTCGCGCGGA−3’)と6766_9748E2A(5’−TAGAATCCTTGGATTTCCAACTCCAGAAAG−3’)を用いた。エキソン3のPCR増幅には、プライマーとして、6766_9748E3S(5−AATCCAAGGATTCTAAACCAGTACAACATC−3)と6766_9748E3A(5’−GAGCGGTAGCTTGCTTTGATCCAGTTCTCC−3)を用いた。エキソン4のPCR増幅には、プライマーとして、6766_9748E4S(5’−AGCAAGCTACCGCTCAAATTTCCACCCTGT−3’)と6766_9748E4A(5’−AGGTTACAGAGCGGCAGCATCCTCCTTGAC−3’)を用いた。なお、これらのプライマーは、Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)に共通である。
【0091】
増幅したエキソン1とエキソン2をOverlap−extension PCRにより連結し、また同時にエキソン3とエキソン4もOverlap extension PCRにより連結した。Overlap extension PCR により合成した両DNA断片を再度Overlap extension PCRにより連結し、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子のコーディング領域を合成した。
【0092】
次に、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子コーディング領域を鋳型として、発現型プラスミド作製用プライマー6766_9748Esc1(5’−AAACATATGGCCACTTCGCTATCATCACGT−3’)および6766_9748Esc2(5’−TTTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGAGCGGCAGCATCCTCCTTGACCAT−3’)を用いたPCRを行ない、成熟型FADGDHをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したTh.aurantiacus由来成熟型FADGDHをコードする遺伝子のC末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン(CAC)が付加されている。
【0093】
増幅したDNA断片をNdeIおよびHindIIIで切断した後に、大腸菌用発現ベクターpET−21b(+)(Novagen)の同一制限酵素サイトに連結することにより、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子発現型プラスミドを作製した。
【0094】
(4)Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子の大腸菌における発現と組換え酵素の精製
Th.aurantiacus〔Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)〕由来FADGDH遺伝子発現型プラスミドを大腸菌BLR(DE3)株(Novagen)に導入した。発現型プラスミドを保有するBLR(DE3)をLB培地(100μg/mLアンピシリン含有)で一晩培養した(前培養)。本培養用LB培地(100μg/mLアンピシリン含有)に前培養液を1%植菌し、4時間ほど37℃で好気的に培養した。その後、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.1%となるように添加し、25℃で約20時間培養を続けた。
【0095】
培養後の大腸菌を集菌し、PBS緩衝液(140mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、1.5mM リン酸二水素カリウム、pH7.4)に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をPBS緩衝液に懸濁した。PBS緩衝液に懸濁した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離(8000g、10分間、4℃)することにより上清(全菌体画分)と沈殿(未破砕菌体)に分離した。全菌体画分をさらに遠心分離(12000g、20分間、4℃)し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分をPBS緩衝液で平衡化したNi−NTA Agarose(QIAGEN)カラム(直径0.7cm、高さ1.0cm)に供した。カラムをPBS緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を100mMイミダゾールを含む20mM Hepes−NaOH緩衝液(pH7.5)で溶出した。
【0096】
溶出画分を20mM Hepes−NaOH緩衝液(pH7.5)で平衡化したQ Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)カラム(直径0.7cm、高さ2.5cm)に供した。カラムを20mM Hepes−NaOH(pH7.5)で洗浄した後に、吸着したタンパク質を100mM NaClを含む20mM Hepes−NaOH緩衝液(pH7.5)で溶出した。溶出画分をAmicon Ultra−15 MWCO10(Millipore)を用いて脱塩処理を施し、Th.aurantiacus由来FADGDH精製標品とした。
【0097】
(実施例3)
本実施例では、Th.aurantiacus由来FADGDHを酵母(Pichia pastoris)を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【0098】
まず、Th.aurantiacus〔Th.aurantiacus(6766)およびTh.aurantiacus(9748)〕由来FADGDH遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー6766_9748Pic1(5’−AAAGAATTCGCCACTTCGCTATCATCACGT−3’)および6766_9748Pic2(5’−TTTGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGAGCGGCAGCATCCTCCTTGACC−3’)を用いたPCRを行ない、成熟型FADGDHをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したTh.aurantiacus由来成熟型FADGDHをコードする遺伝子のC末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン(CAC)が付加されている。増幅したDNA断片をEcoRIおよびNotIで切断した後に、P.pastoris用分泌発現ベクターpPIC9(Life Technologies)の同一制限酵素サイトに連結することにより、Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型FADGDHをコードする遺伝子をpPIC9に連結することにより、成熟型FADGDHをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。
【0099】
Th.aurantiacus由来FADGDH遺伝子分泌発現型プラスミドをP.pastoris GS115株(Life Technologies)に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したGS115株をBMG培地(100mMリン酸カリウム緩衝液pH6.0、1.34%酵母ニトロゲンベース、4×10−5%ビオチン、1%グリセロール)で2日間培養した(前培養)。前培養により取得した菌体をBMM培地(100mM リン酸カリウム緩衝液pH6.0、1.34%酵母ニトロゲンベース、4×10−5%ビオチン、0.5%メタノール)に植菌し、5日間ほど30℃で好気的に培養した。
【0100】
培養後の培養上清を回収し、PBS緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をPBS緩衝液で平衡化したNi−NTA Agarose(QIAGEN)カラム(直径2.0cm、高さ2.0cm)に供した。カラムをPBS緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を200mMイミダゾールを含む20mM Hepes−NaOH緩衝液(pH7.0)で溶出した。溶出画分をAmicon Ultra−15 MWCO10(Millipore)を用いて脱塩処理を施し、Th.aurantiacus由来FADGDH精製標品とした。
【0101】
(実施例4)
<SDS−PAGE>
実施例2および3で得られた計4種のFADGDH精製標品〔大腸菌で発現し、精製されたTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHを含む溶液、および、酵母で発現し、精製されたTh.aurantiacus(6766および9748)由来FADGDHを含む溶液〕中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット(Pierce BCA Protein Assay Reagent; サーモフィッシャーサイエンティフィック)を用いたBCA法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、FADGDH5μgを含む精製標品を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した。
【0102】
SDS−PAGEはLaemmliの方法に準じて行なった。SDS−ポリアクリルアミドゲルとしては、「e−PAGEL 10−20%」(アトー)を使用した。泳動後のゲルはCBB(Coomassie Brilliant Blue)ベースの染色液「GelCode Blue Safe Protein Stain」(サーモフィッシャーサイエンティフィック)により染色した。タンパク質マーカーには、「Protein Ladder (10−250kDa)」(New England BioLabs)を使用した。
【0103】
また、実施例3のFADGDH精製標品については、別途、染色液として、PAS(Periodic acid Schiff stain)染色液「Pierce Glycoprotein Staining Kit」(サーモフィッシャーサイエンティフィック)を用いる以外は、同様のSDS−PAGEを行った。なお、PAS染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
【0104】
SDS−PAGEの結果を図7(実施例2の精製標品)および図8(実施例3の精製標品)に示す。なお、図8の左側がCBBベースの染色液を用いた場合、図の右側がPAS染色液を用いた場合の結果である。図7および図8(左側)に示されるように、大腸菌で発現したTh.aurantiacus由来FADGDH、および、酵母で発現したTh.aurantiacus由来FADGDHの両者共に、電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことが分かった。また、図8(右側)に示されるように、実施例3の精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質(FADGDH)であることが分かった。
【0105】
(実施例5)
<吸収スペクトル計測>
実施例2および3で得られたFADGDH精製標品を実施例4での濃度測定値に基づいて希釈し、2mg/mLの酵素溶液(FADGDH溶液)を調製した。該FADGDH溶液の吸収スペクトルを、UV/可視分光光度計DU−800(Beckman Coulter)用いて計測した。また、上記FADGDH溶液にグルコースを終濃度150mMとなるように添加した溶液、および、上記FADGDH溶液に還元剤である亜二チオン酸ナトリウム粉末を添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図9(実施例2の精製標品)および図10(実施例3の精製標品)に示す。
【0106】
図9および10に示されるように、FADGDH溶液の吸収スペクトルでは、典型的なFAD由来のピークが観察された(図9および10の「FADGDH」)。一方、グルコース添加後のFADGDH溶液の吸収スペクトルでは、FADに由来するピーク(350〜500nmの吸収ピーク)が消失した(図9および10の「FADGDH+グルコース」)。亜二チオン酸ナトリウム添加後のFADGDH溶液の吸収スペクトルでも、FADに由来するピークは消失した(図9および10の「FADGDH+亜二チオン酸ナトリウム」)。
【0107】
これらの結果から、大腸菌および酵母にて発現し、精製されたTh.aurantiacus由来FADGDHは、両者共に補酵素として酸化型FADを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、大腸菌および酵素によって生産された本発明の好熱性糸状菌由来のFADGDHは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというFADGDHの利点を有している。
【0108】
(実施例6)
本実施例では、実施例2および3で得られたFADGDH精製標品について、FADGDHの酵素活性に関する以下の各種特性(温度安定性、温度依存性、pH安定性、pH依存性、固定化酵素電極での応答性)に関する評価試験を行った。なお、本実施例における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。
【0109】
[酵素活性測定原理]
D−グルコース + 1−methoxyPMS + FADGDH
→ D−グルコノ−1,5−ラクトン + 1−methoxyPMS(還元型)
+ FADGDH(酸化型)
1−methoxyPMS(還元型) + DCPIP
→ 1−methoxyPMS + DCPIP(還元型)
還元型1−メトキシフェナジンメトサルフェート(1−methoxyPMS)による2,6−ジクロロフェノリンドフェノール(DCPIP)の還元により生じた還元型DCPIP量は、分光光度計を用いて600nmの吸光度を測定することにより計測した。
【0110】
[酵素活性の定義]
酵素の活性(FADGDH活性)は、37℃、pH7.0の条件下において還元型DCPIPを1分あたりに1マイクロモル形成させるFADGDH量を1ユニットとして定義する。
【0111】
具体的に、FADGDH活性は、後述の吸光度変化(ΔODTEST、ΔODBLANK)から以下の式により求められる。
【0112】

FADGDH活性(U/mL)
=[(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.1]/(16.3×0.1×希釈率)

なお、式中の各定数は、
3.1 : FADGDH溶液混和後の反応液の容量(mL)
16.3 : DCPIPのミリモル分子吸光係数(mM−1・cm−1
0.1 : FADGDH溶液の容量(mL)
である。
【0113】
[活性測定方法]
(1) キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
0.1M リン酸カリウムバッファー(pH7.0) 1.5mL
1M グルコース溶液 0.9mL
1.75mM 2,6-Dichlorophenolondophenol(DCPIP) 0.12mL
20mM 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate(1-mPMS) 0.021mL
10% TritonX−100 0.06mL
O 0.399mL
(2) 37℃で10分間プレインキュベートする。
(3) FADGDH溶液を0.1mL加えて転倒混和し、37℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて600nmでの吸光度を記録し、1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を算出する。
(4) 対照として、酵素液(上述の反応液にFADGDH溶液を加えた液)の代わりに等量の酵素希釈用液(50mMのリン酸バッファー(pH7.0)に0.01%のTritonX−100を添加した液)について、(3)と同様に吸光度変化を記録し、1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を算出する。
【0114】
<温度安定性>
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、上記pH安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が7U/mLとなるように酵素溶液(FADGDH溶液)を調製した。これらのFADGDH溶液をマイクロチューブに分注し、PCRマシーンを用いて40℃〜70℃の範囲の数種の温度で15分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率(残活性率)を求めた。結果を図11に示す。なお、ECは大腸菌で発現したもの、PPは酵母で発現したものを示す。
【0115】
図11に示されるように、Th.aurantiacus由来FADGDHは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか(糖鎖付加の有無)に関わらず、65℃以下では極めて高い安定性を示し、70℃でも高い活性を保持していた。このような極めて高い温度安定性は、他の好熱性糸状菌由来のFADGDHと比べても明らかに顕著なものである。
【0116】
比較のために、他の好熱性糸状菌由来のFADGDHの一例として、同じThermoascus属であるThermoascus crustaceus由来のFADGDH(大腸菌発現および酵母発現)についての同様の温度安定性試験の結果を図12に示す。図12に示されるように、Thermoascus crustaceus由来のFADGDHは、大腸菌発現のものでは50℃で活性が低下し、また酵母発現のものでは60℃で活性が低下した。なお、図12の試験結果は、本発明者らが既に出願した国際特許出願PCT/JP2013/074199の図22(明細書の段落[0150]、[0151])と同じデータに基づくものである。
【0117】
<温度依存性>
ここでは、酵素活性の温度依存性の評価を行った。まず、上記pH安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が0.05〜0.2U/mLとなるように酵素溶液(FADGDH溶液)を調製した。これらのFADGDH溶液について、4℃〜70℃の範囲で酵素活性を測定し、37℃での活性を100(%)としたときの相対活性を求めた。結果を図13に示す。
【0118】
図13に示されるように、Th.aurantiacus由来FADGDHは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか(糖鎖付加の有無)に関わらず、高温域で活性が上昇し、示適温度は70℃以上であった。このような高温での極めて高い活性は、他の好熱性糸状菌由来のFADGDHと比べても明らかに顕著なものである。
【0119】
<pH安定性>
ここでは、酵素活性のpH安定性の評価を行った。まず、実施例2および3で得られたFADGDH精製標品の各々について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて各精製標品を水で希釈することで、酵素活性が14U/mLとなるような酵素溶液(FADGDH溶液)を調製した。
【0120】
これらのFADGDH溶液に対して、所定のpHに調整された0.1MのBritton−Robinson広域緩衝液を等量混合し、pHを2.0〜11.0の範囲で変化させた複数の酵素溶液を調製し、各酵素溶液の調製直後の酵素活性を測定した。次に、各試料溶液を25℃で20時間インキュベートした後に酵素活性を測定して、インキュベート前の酵素活性に対するインキュベート後の酵素活性の割合(残活性率)を求めた。結果を図14に示す。
【0121】
図14に示すように、Th.aurantiacus由来FADGDHの場合、大腸菌発現であるか酵母発現であるか(糖鎖付加の有無)に関わらず、pH3.0以上の広い範囲で安定であった。
【0122】
<pH依存性>
ここでは、酵素活性のpH依存性の評価を行った。上記pH安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が0.2U/mLとなるような酵素溶液(FADGDH溶液)を調製した。pHを4.0〜9.0の範囲で変化させた複数の酵素活性測定溶液を調製し、それぞれのpH条件における酵素活性を測定した。最も活性が高かったpH条件における酵素活性を100(%)とし、他の各pH条件における酵素活性の比率を相対活性として求めた。結果を図15に示す。
【0123】
図15に示すように、Th.aurantiacus(6766)由来FADGDHは大腸菌発現ではpH6.0、酵母発現ではpH6.0〜7.0が至適pHであり、Th.aurantiacus(9748)由来FADGDHは、大腸菌発現であるか酵母発現であるか(糖鎖付加の有無)に関わらず、pH5.0が至適pHであった。Th.aurantiacus由来FADGDHはpH4.0〜9.0の広範囲で70%以上の相対活性を保っていることが示された。
【0124】
<固定化酵素電極での応答性>
白金電極表面に、実施例2および3で得られたTh.aurantiacus(6766および9748)由来のFADGDH精製標品を東洋合成工業(株)社製のUV架橋性高分子であるBiosurfine−AWP−MRHと混合したものを塗布し、自然乾燥ののちにUVを照射して固定化酵素電極(計2種)を作製した。この固定化酵素電極を用いて、水溶液中のグルコース濃度に対する応答性を評価した。
【0125】
pH7.4のリン酸カリウムバッファーを溶媒とし、0.2Mのフェリシアン化カリウムを含む溶液とさらに0.5Mのグルコースを含むグルコース・フェリシアン化カリウム溶液を調整した。固定化酵素電極と対極・参照電極として9mmの白金電極をフェリシアン化カリウム溶液に浸して0.3Vの電圧を印加し、目的の濃度までグルコース溶液を滴下しながら固定化酵素電極と対極との間に生じる電流値を測定し、滴下グルコース濃度に応じて生じる電流値変化をグルコース濃度に対してプロットした。そのプロットに対し、0〜300mMの範囲において、最小二乗法により回帰直線を引いた。結果を図16に示す。ECは大腸菌で発現した実施例2の精製標品、PPは酵母で発現した実施例3の精製標品を示す。
【0126】
図16において、それぞれR(決定係数:相関係数Rの二乗)は0.996、0.992であり、ほぼ1であることから、非常に直線性が高いことが示された。したがって、大腸菌での発現か酵母での発現かにかかわらず、Th.aurantiacusT由来FADGDHを用いて、精度よく、さらに広い濃度域でグルコース濃度を定量できることが示唆される。
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
図16
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]