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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】6446151
(24)【登録日】2018年12月7日
(45)【発行日】2018年12月26日
(54)【発明の名称】検査デバイス及びデバイス
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20181217BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20181217BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 ZZNA
C12M1/00 A
【請求項の数】13
【全頁数】37
(21)【出願番号】特願2018-69069(P2018-69069)
(22)【出願日】2018年3月30日
【審査請求日】2018年4月2日
(31)【優先権主張番号】特願2017-218552(P2017-218552)
(32)【優先日】2017年11月13日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000006747
【氏名又は名称】株式会社リコー
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(72)【発明者】
【氏名】和泉 賢
(72)【発明者】
【氏名】瀬尾 学
(72)【発明者】
【氏名】川島 優大
(72)【発明者】
【氏名】大▲崎▼ 優介
【審査官】
山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１５−１９５７３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１７／０５６２５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００２−０８２１２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５３３４９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１６−００００５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１８／０５１８０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１５／１５７３６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
LIANHUA, D. et al.，Comparison of four digital PCR platforms for accurate quantification of DNA copy number of a certifi，Scientific reports，２０１５年 ８月２５日，5:13174, DOI:10.1038/srep13174，特に要約，Material and Methods，表２，第８ページ下から第３行〜第９頁最終行
【文献】
PINHEIRO LB. et al.，Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification，Anal. Chem.，２０１２年，Vol.84 No.2，Page.1003-1011, DOI:10.1021/ac202578x，特に要約，第１００４頁左欄，EXPERIMENTAL SECTION，第１００７頁左欄第４行〜同右欄第１５行，図１，図２
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
Ｇ０１Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのウェルを有し、
少なくとも１つの前記ウェル内に配された細胞から抽出された核酸の絶対数の情報と、前記核酸の絶対数の不確かさの情報とを有することを特徴とするデバイス。
少なくとも１つの前記ウェル内に配された細胞から抽出された核酸の絶対数の情報と、前記核酸の絶対数の不確かさの情報とを有することを特徴とするデバイス。
【請求項2】
前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた請求項１に記載のデバイス。
【請求項3】
前記核酸の長さが２０以上１０，０００以下の塩基長である請求項１から２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項4】
前記核酸が自然界には存在しない非天然の塩基配列を有する請求項１から３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項5】
前記核酸が特定の塩基配列を有し、前記核酸のＧＣ含有率が前記特定の塩基配列の３０％以上７０％以下である請求項１から４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項6】
前記不確かさの情報における不確かさの要因が、液滴中の細胞数、前記細胞の細胞周期、前記ウェル内に配置された細胞数、及び前記ウェル内のコンタミネーションの少なくともいずれかである請求項１から５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項7】
前記核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさの情報を識別可能な識別手段を有する請求項１から６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項8】
前記細胞が酵母である請求項１から７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項9】
前記ウェル内に、プライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを有する請求項１から８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項10】
前記ウェルが複数であって、
前記各ウェル内の核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさを各ウェル毎の情報として有する請求項１から９のいずれかに記載のデバイス。
前記各ウェル内の核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさを各ウェル毎の情報として有する請求項１から９のいずれかに記載のデバイス。
【請求項11】
前記ウェルが保持される基材と、前記基材の前記ウェルを密閉可能な密閉手段を有し、前記識別手段は、前記密閉手段と前記基材との間に配置される請求項７から１０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項12】
核酸を増幅可能なＰＣＲ装置の評価に用いられるデバイスであって、
少なくとも１つのウェルを有し、
少なくとも１つの前記ウェル内に配された細胞から抽出された核酸の絶対数の情報と、前記核酸の絶対数の不確かさの情報とを有するデバイス。
少なくとも１つのウェルを有し、
少なくとも１つの前記ウェル内に配された細胞から抽出された核酸の絶対数の情報と、前記核酸の絶対数の不確かさの情報とを有するデバイス。
【請求項13】
前記デバイスによる核酸増幅の結果と、前記核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさの情報とを、前記ＰＣＲ装置の管理に用いる請求項１２に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、検査デバイス及びデバイスに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、分析技術の高感度化により、測定対象をコピー数単位で測定することが可能となっており、食品、環境検査、及び医療へ、微量核酸を検出する遺伝子検出技術の産業利用が求められている。特に、病原体や未承認の遺伝子組み換え食品は、検体中に含まれていないことを確認することが多く、高いレベルでの検出精度が要求される。
【0003】
例えば、分子生物学研究分野で多く使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、その技術特性から、理論上１コピーの核酸からでも増幅が可能とされている。このような微量の遺伝子検出においては、定量解析を行う場合に、標準試薬を用いる必要があり、例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を限界希釈し、得られた希釈液のリアルタイムＰＣＲの結果から、目的とするコピー数を含む希釈液を選別する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に遺伝子組み換え技術により導入し、培養した細胞を単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試薬の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、核酸増幅技術を含む遺伝子検査に基づく分析検査の性能評価を行うことができる検査デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記課題を解決するための手段としての本発明の検査デバイスは、少なくとも１つのウェルを有し、少なくとも１つのウェル内の増幅可能な試薬の絶対数及び当該増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報を有する。
【発明の効果】
【0006】
本発明によると、核酸増幅技術を含む遺伝子検査に基づく分析検査の性能評価を行うことができる検査デバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
（検査デバイス）本発明の検査デバイスは、少なくとも１つのウェルを有し、少なくとも１つの前記ウェル内の増幅可能な試薬の絶対数及び当該増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報を有し、識別手段、基材を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【0009】
本発明は、低コピー数の核酸を含む試料から核酸を検出する際に、その系の検出感度、特に検出下限値を把握することは、検査の精度管理上重要であるが、先行技術文献では、低コピー数の核酸を含む試料から検体を採取する際に、含まれる核酸の量に応じてポアソン分布に従うランダムなばらつきが発生するため、検査装置自体の精度を向上させることが困難であるという知見に基づくものである。
【0010】
また、従来の精度管理に用いる低コピー数の核酸標準物質では、低コピー数の核酸標準物質を作製する際に生じる不確かさが示されておらず、精度管理の信頼性を保証することができないことがあるという知見に基づくものである。
【0011】
本発明の検査デバイスを用いると、低コピー数の増幅可能な試薬を含む試料から目的の試薬を検出する際に、測定結果の信頼性を評価することができる。なお、本発明において「低コピー数」とは、増幅可能な試薬の「コピー数が少ないこと」を意味する。
【0012】
増幅可能な試薬の絶対数とは、ウェル内に含まれる増幅可能な試薬（例えば、核酸）の既知のコピー数を意味する。なお、ここで増幅可能な試薬の分子数がコピー数に対応付けられる場合もある。増幅可能な試薬の絶対数は、１００コピー以下が好ましく、１０コピー以下がより好ましい。
増幅可能な試薬の絶対数は、異なる２種類以上の整数であることが好ましい。
増幅可能な試薬の絶対数の組み合わせとしては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の場合、１、３、５、７、９の場合、２、４、６、８、１０の場合などが挙げられる。
また、増幅可能な試薬の絶対数の組み合わせは、例えば、１、１０、１００、１,０００の４水準としてもよい。複数の異なる絶対数の組み合わせによる本発明の検査デバイスを用いて、検量線の作成を行うことができる。
【0013】
不確かさとは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」とＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。不確かさとしては、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ Ｇｕｉｄｅ９８−３）、及びＪａｐａｎ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ Ｂｏａｒｄ Ｎｏｔｅ １０ 試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、目的の試薬を細胞に導入し、当該細胞をカウント・分注して作成する場合、各ウェル内の目的の試薬の数の不確かさの要因としては、細胞内の増幅可能な試薬の数、細胞をプレートに配置する手段、配置された細胞がプレートの適切な位置に配置された頻度、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより増幅可能な試薬が細胞懸濁液中に混入することによる試薬のコンタミネーションなどが挙げられる。
【0014】
＜ウェル＞ウェルは、その形状、数、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ウェルの形状としては、核酸などを配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、基板上の区画などが挙げられる。
ウェルの数は、少なくとも１つであり、２以上の複数であることが好ましく、５以上がより好ましく、５０以上が更に好ましい。
ウェルの数が１つであるものとしては、例えば、ＰＣＲチューブなどが挙げられる。
ウェルの数が２以上であるものとしては、例えば、マルチウェルプレートが好適に用いられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、２４、４８、９６、３８４、又は１,５３６のウェルプレートが挙げられる。
ウェルの容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な核酸検査装置に用いられる試料量を考慮すると、１μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
ウェルの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
ウェルの色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。
【0015】
＜基材＞検査デバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
【0016】
＜識別手段＞検査デバイスは、増幅可能な試薬の絶対数及びその不確かさの情報を識別可能な識別手段を有することが好ましい。
識別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷などが挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
識別手段に記憶させる情報としては、増幅可能な試薬の絶対数及びその不確かさの情報以外にも、例えば、分析結果（活性値、発光強度等）、増幅可能な試薬の数（例えば、細胞の数）、細胞の生死、特定塩基配列のコピー数、複数のウェルのうちどのウェルに増幅可能な試薬が充填されているのか、増幅可能な試薬の種類、測定日時、測定者の氏名などが挙げられる。
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
【0017】
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、ウェルに増幅可能な試薬を分注する際に増幅可能な試薬の個数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。
【0018】
＜その他の部材＞その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材などが挙げられる。
【0019】
−密閉部材−検査デバイスは、ウェルへの異物混入は充填物の流出などを防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。
密閉部材としては、少なくとも１つのウェルを密閉可能であり、１つ１つのウェルを個別に密閉乃至開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成することが好ましい。
密閉部材の形状としては、ウェル内壁径と一致するキャップ状、又はウェル開口部を被覆するフィルム状であることが好ましい。
密閉部材の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂などが挙げられる。
密閉部材としては、全てのウェルを一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要なウェルと不必要なウェルとの接着強度が異なるように構成されていることが好ましい。
【0020】
前記ウェルは、プライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを含むことが好ましい。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)において、鋳型ＤＮＡに特異的な１８塩基〜３０塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅したい領域を挟むようにフォワードプライマーとリバースプライマーとの２か所（一対）設定される。
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)において、例えば、酵素としてＤＮＡポリメラーゼ、基質として４種の塩基（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）、Ｍｇ２＋（２ｍＭの塩化マグネシウム）、最適ｐＨ（ｐＨ７．５〜９．５）を保持するバッファーなどが挙げられる
【0021】
検査デバイスは、増幅可能な試薬が０コピーのネガティブコントロールのウェル、増幅可能な試薬が１０コピー以上のポジティブコントロールのウェルを有していることが好ましい。ネガティブコントロールで検出が検知されたとき、及びポジティブコントロールで不検出が検知されたときは、検出系（試薬や装置）に異常があることが示唆される。ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを設けておくことにより、問題が生じたときにユーザーは直ちにそれに気づくことができ、測定を中止して問題がどこにあるかの点検を行うことができる。
【0022】
ここで、図１は、本発明の検査デバイス１の一例を示す斜視図である。図２は、図１の検査デバイス１の側面図である。検査デバイス１は、基材２に複数のウェル３が設けられており、ウェル３内（ウェルを構成するウェル壁面で囲まれる内側の空間領域）に増幅可能な試薬としての核酸４が特定コピー数で充填されている。この検査デバイス１は増幅可能な試薬の絶対数及び当該増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報が関連付けられている。なお、図１及び図２は検査デバイス１が、密閉部材５にてウェル３の開口部が被われている例を示している。例えば、図１及び図２に示すように、各ウェル３に充填する試薬の数とその数の不確かさ（確からしさ）の情報、もしくはこれらの情報と関連付けられた情報を記憶するＩＣチップまたはバーコード（識別手段６）が、密閉部材５と基材２との間で且つウェルの開口部以外の位置に配置されている。これは、識別手段の意図しない改変等を防止するのに好適である。
また、検査デバイスが識別手段を有することで、識別手段を有しない一般のウェルプレートとの区別可能である。このため、取り違えを防止することが可能である。
【0023】
図３は、本発明の検査デバイスの増幅可能な試薬を充填するウェルの位置の一例を示す図である。図３中のウェル内の数字は増幅可能な試薬の絶対数を表す。図３中の数字が記載していないウェルは試料やコントロール測定用のウェルである。図４は、本発明の検査デバイスの増幅可能な試薬を充填するウェルの位置の他の一例を示す図である。図４中のウェル内の数字は増幅可能な試薬の絶対数を表す。図４中の数字が記載していないウェルは試料やコントロール測定用のウェルである。
【0024】
増幅可能な試薬は核酸であることが好ましい。核酸が細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。
【0025】
−核酸−核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなども含まれる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。また、核酸としては、プラスミドも使用することができる。核酸は修飾又は変異されていてもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させたもの（例えば、ペプチド核酸など）などが挙げられる。これらは、生物から得られる天然物であっても又はそれらの加工物であってもよく、或いは、遺伝子組換技術を利用して製造されたものでも、また化学的に合成されたものでもよい。
【0026】
核酸は、担体に担持された状態で扱うことが好ましい担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。なお、増幅可能な試薬としての核酸は、粒子形状をした担体(担体粒子）に担持（より好ましくは内包）されている態様などが好ましい。細胞としては、遺伝子導入を行うことができる細胞であれば特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、前述の細胞種を問わず使用することができる。
核酸は、特定の塩基配列を有することが好ましい。特定とは、特に定められていることを意味する。
特定の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
非天然の塩基配列を用いる場合、ＧＣ含有率が特定の塩基配列の３０％以上７０％以下であることが好ましい（例えば、配列番号１など参照）。
特定の塩基配列の塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０以上１０，０００以下の塩基長など挙げられる。
感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含んでいることが好ましい（例えば、配列番号２及び３など参照）。
【0027】
核酸としては、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。核酸として、遺伝子導入により導入された核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサー、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。遺伝子導入により導入される核酸の数は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。なお、遺伝子導入により導入される核酸の数が１種類の場合にも、目的に応じてタンデムに同様の塩基配列を導入してもよい。
【0028】
遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が狙いの場所に狙いのコピー数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ−ｉｎ、Ｊｕｍｐ−ｉｎなどが挙げられる。これらの中でも、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
【0029】
−細胞−細胞は、核酸を有し、生物体を形成する構造的及び機能的単位を意味する。
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0030】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。
【0031】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【0032】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【0033】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【0034】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【0035】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、ウェル内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【0036】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0037】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【0038】
−−光を受光したときに発光可能な細胞−−光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【0039】
−−蛍光色素−−蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、がより好ましい。
【0040】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【0041】
−−蛍光タンパク質−−蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0042】
−−蛍光標識抗体−−蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0043】
細胞の体積平均粒径としては、遊離状態において、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。
【0044】
細胞の体積平均粒径としては、例えば、下記の測定方法で測定することができる。作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることにより体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
【0045】
細胞懸濁液における細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞数が、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞数としては、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【0046】
核酸を有する細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0047】
＜検査デバイスの製造方法＞以下、増幅可能な試薬として特定の核酸を有する細胞を用いた検査デバイスの製造方法について説明する。
本発明の検査デバイスの製造方法は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、前記液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、ウェル内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程と、を含み、各工程の不確かさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【0048】
＜＜細胞懸濁液生成工程＞＞細胞懸濁液生成工程は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。
溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。
生成とは、作り出すことを意味する。
【0049】
−細胞懸濁液−細胞懸濁液は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。
特定の核酸を有する複数の細胞については、上述したとおりである。
【0050】
−−溶剤−−溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
【0051】
−−添加剤−−添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【0052】
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。
【0053】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【0054】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【0055】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【0056】
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
【0057】
核酸としては、検出対象の核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡなどが挙げられる。核酸であると、特定の塩基配列を有する核酸が、ウェルの壁面などに付着することを防ぐことができる。
【0058】
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミドなどが挙げられる。
【0059】
−−その他の材料−−その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
【0060】
［細胞を分散する方法］細胞を分散する方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式がより好ましい。メディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミネーションとして混入することがある。
【0061】
［細胞のスクリーニング方法］細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
【0062】
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から特定の配列を有する核酸の数を推定することが好ましい。細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。
核酸の数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数を求めることを意味する。
【0063】
計数対象が細胞数ではなく特定のＤＮＡ配列が何個入っているかであってもよい。通常は、特定のＤＮＡ配列は細胞１個につき１つの領域が入っているものを選択する、あるいは遺伝子組み換えにより導入するため、特定のＤＮＡ配列の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすために細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる特定の核酸数に対する期待値及びその不確かさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。
算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
【0064】
図５は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図５に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的なＤＮＡ数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定数を算出することが可能である。また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、特定の核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
【0065】
推定する核酸の数は、不確かさを算出することが好ましい。不確かさを算出することにより、これらの数値に基づき不確かさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率などを用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
【0066】
＜＜液滴着弾工程＞＞液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりデバイスのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。
順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。
着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
【0067】
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」とも称することがある）を好適に用いることができる。
【0068】
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本発明では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
【0069】
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【0070】
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明のプレート生成方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【0071】
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図６Ａ〜図６Ｃに示す。図６Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液室１１ａ、細胞懸濁液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。
電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図６Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。
ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図６Ｃに示した構成などが挙げられる。図６Ｃは、図６Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図６Ｃの吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。
図６Ｃの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。
【0072】
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向に電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
【0073】
図７Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図７Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図７Ａは、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図７Ｂは、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
【0074】
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
【0075】
本発明において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図８Ａ〜図８Ｃは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
図８Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形することによって、液室１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図８Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。
最後に、図８Ｃに示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
【0076】
検査デバイスの製造方法では、ウェルが形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、凹部に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
【0077】
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたものを用いることが可能である。プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
【0078】
図９は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置４００の一例を示す概略図である。図９に示すように、液滴を着弾させるための分注装置４００は、液滴形成装置４０１と、プレート７００と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
【0079】
分注装置４００において、プレート７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。プレート７００には液滴形成装置４０１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着滴する複数のウェル７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドとそれぞれのウェル７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置４０１の吐出ヘッドからそれぞれのウェル７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【0080】
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【0081】
吐出する液滴としては、ウェル内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴をウェル内に着弾させることが好ましい。複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。
複数の水準としては、ウェル内に特定の核酸を有する複数の細胞が所定の濃度勾配を有することが好ましい。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
【0082】
プレートとしては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴のウェルプレートなどを用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。特に核酸の量を定量的に評価するリアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の評価に用いるプレートを作成する際には、複数水準の数の核酸が分注されたものを用いることが好ましい。例えば、細胞（又は核酸）が、おおよそ１個、２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個の７水準で分注したプレートを作製することが考えられる。このようなプレートを用いることによって、リアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の定量性、線形性、評価下限値などを調べることが可能である。
【0083】
＜＜細胞数計数工程＞＞細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
計数とは、数を数えることを意味する。
【0084】
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【0085】
液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴がプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
【0086】
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出方法などが挙げられる。
【0087】
−光学的に検出する方法−図１０、図１４、及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。
図１０は、液滴形成装置４０１の一例を示す模式図である。図１４、及び図１５は、液滴形成装置４０１Ａ、４０１Ｂの他の一例を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置４０１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
【0088】
図１０では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））を生産するための遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。光を照射とは、光をあてることを意味する。
【0089】
吐出ヘッド１０は、液室１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
【0090】
液室１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子などが挙げられる。
【0091】
メンブレン１２は、液室１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【0092】
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
【0093】
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
【0094】
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【0095】
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【0096】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【0097】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【0098】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【0099】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【0100】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【0101】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【0102】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【0103】
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１１〜図１６を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置４０１の動作について説明する。
【0104】
図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１２は、図１０の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１１は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【0105】
図１１に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【0106】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置４０１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置４０１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【0107】
図１２に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【0108】
図１２及び図１３を参照しながら、液滴形成装置４０１の細胞数（粒子数）計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【0109】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【0110】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【0111】
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【0112】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【0113】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【0114】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【0115】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。
【0116】
染色細胞において、蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類、アゾ類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0117】
このように、液滴形成装置４０１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【0118】
つまり、液滴形成装置４０１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【0119】
図１４は、図１０の液滴形成装置４０１の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置４０１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0120】
このように、液滴形成装置４０１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【0121】
例えば、ノズル１１１と着滴対象物を近づけた際に、図１０のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置４０１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１４のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
【0122】
図１４に示すように、受光素子６０のレイアウトを変更することにより、液滴３１０が着滴する着滴対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【0123】
図２２は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図２２に示すように、液滴形成装置４０１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0124】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【0125】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【0126】
図１６Ａ及び図１６Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１６Ａに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１６Ｂに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【0127】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【0128】
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１７を参照して、より詳しく説明する。
【0129】
図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１７に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴=１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、粒子数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【0130】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１６Ａの網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【0131】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。このように、液滴形成装置４０１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【0132】
図１８は、図１０の液滴形成装置４０１の他の変形例を示す模式図である。図１８に示すように、液滴形成装置４０１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置４０１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【0133】
液滴吐出手段１０Ｃは、液室１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液室１１Ｃは、液室１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
【0134】
メンブレン１２Ｃは、液室１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【0135】
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【0136】
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【0137】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば、日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【0138】
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
【0139】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【0140】
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
【0141】
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【0142】
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【0143】
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【0144】
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液室１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液室１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液室１１Ｃの内部に均一に分散する。
【0145】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液室１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
【0146】
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり、及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
【0147】
また、液滴形成装置４０１Ｃにおいて、液室１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置４０１Ｃでは、液室１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【0148】
即ち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液室１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液室１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【0149】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液室１１Ｃの上方に移動させてもよい。
【0150】
−電気的又は磁気的な検出する方法−電気的又は磁気的な検出する方法としては、図１９に示すように、液室１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’としてプレート７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標登録）が利用可能である。
【0151】
［吐出前に細胞を観測する処理］吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法などが挙げられる。図２０はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図２０では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図２１に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２１では、吐出前において、ノズル部近傍のレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図２０に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２１は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
【0152】
［着弾後の細胞をカウントする処理］着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェルを蛍光顕微鏡などにより観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Ｓａｎｇｊｕｎ ｅｔ ａｌ．,ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ６（３），ｅ１７４５５などに記載されている。
【0153】
液滴の吐出前及び着弾後に、細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があるが、生成するプレートの種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することがもっとも好ましい。吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（及び吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。また、着弾後のプレート上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的なウェルを使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個など多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び粒子数（細胞数）計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
【0154】
また、受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｐｕｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤなど二次元センサを用いることも可能である。１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個又は０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布に従うと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式（１）で表される。図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ ・・・ 式（１）
【0155】
二値的な検出で細胞計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
【0156】
＜＜不確かさ算出工程＞＞不確かさ算出工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞計数工程などそれぞれの工程における不確かさを算出する工程である。
当該不確かさの算出は、細胞懸濁液生成工程における不確かさと同様に算出することができる。
なお、不確かさの算出タイミングは、細胞計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞計数工程などの各工程の最後に算出し、細胞計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での不確かさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【0157】
＜＜出力工程＞＞出力工程は、ウェル内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて粒子数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、粒子数計数手段にて当該ウェルに含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【0158】
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各ウェルの細胞数又は核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値、外部の記憶部に出力する。出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【0159】
＜＜記録工程＞＞記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
【0160】
＜＜核酸抽出工程＞＞核酸抽出工程は、ウェル内の細胞から核酸を抽出する工程である。
抽出とは、細胞膜や細胞壁などを破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。
【0161】
細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃〜１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。このとき界面活性剤を添加し熱処理することが好ましい。
【0162】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性・失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【0163】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【0164】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｏｔｉｔｏｎ Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【0165】
界面活性剤の含有量としては、ウェル中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にＤＮＡ抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーなどの方式などが挙げられる。これらの中でも、抽出ＤＮＡのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
【0166】
＜＜その他の工程＞＞その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素失活工程などが挙げられる。
【0167】
−酵素失活工程−酵素失活工程は、酵素を失活させる工程である。
酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素などが挙げられる。
酵素を失活させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
【0168】
本発明の検査デバイスは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、装置校正や検量線作成、検査装置の精度管理などに好適に用いることができる。検査デバイスとしては、感染症に対して実施する場合は公定法や通知法などに定められている方法に適用することができる、
【実施例】
【0169】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0170】
＜検査デバイスの作製＞以下のようにして、検査デバイスを作製した。
−遺伝子組換え酵母−
出芽酵母ｗ３０３−１ａ（ＡＴＣＣ社製、ＡＴＣＣ４００１４０８）を１コピーの特定核酸配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。特定核酸配列は濃厚核酸試料 ＤＮＡ６００−Ｇ（国立研究開発法人産業技術総合研究所製、ＮＭＩＪ ＣＲＭ ６２０５−ａ、配列番号１参照）とし、選択マーカーとしたＵＲＡ３とがタンデムに並ぶように作出したプラスミドとして、キャリア細胞のＢＡＲ１領域を対象に相同組換えによって１コピーの特定核酸配列を酵母ゲノムＤＮＡに導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
【0171】
−培養及び細胞周期制御−５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（タカラバイオ株式会社製、ＣＬＮ−６３０４０９）で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、１４１９０−１４４、以下、「ＤＰＢＳ」と称する）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したα１−Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔａｔｅ ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔ６９０１−５ＭＧ、以下、「αファクター」という）を９００μＬ添加した。
次に、バイオシェイカー（タイテック株式会社製、ＢＲ−２３ＦＨ）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得た。同調細胞の細胞周期の確認は、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（装置名：Ｓ７０２０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて染色し、フローサイトメーター（装置名：ＳＨ８００Ｚ、ソニー株式会社製）を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長４８８ｎｍで、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した。Ｇ１期の割合は９９．５％、Ｇ２期の割合は０．５％であった。
【0172】
−固定化−同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（アズワン株式会社製、ＶＩＯ−５０Ｒ）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（株式会社日立製作所製、Ｆ１６ＲＮ）を用いて、回転速度：３０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２−０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
【0173】
−染色−固定化済み酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（ワトソン株式会社製、１３１−９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＯＣＲＩＳ社製、２００−４４９−４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。得られたペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（和光純薬工業株式会社製、０５４−０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳ（１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得た。
【0174】
−分散−染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ヤマト科学株式会社製、ＬＵＨ１５０）を用いて、出力：３０％、１０秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳを１ｍＬ添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計２回実施し、再度ＤＰＢＳ１ｍＬに懸濁して酵母懸濁インクを得た。
【0175】
−分注及び細胞計測−以下のようにして、液滴中の酵母菌の数を計数（カウント）して、各ウェルに１細胞ずつ吐出して細胞数が既知のプレートを作製した。具体的には、図１５に示す液滴形成装置を用いて、９６プレート（商品名：ＭｉｃｒｏＡｍｐ ９６−ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド（社内製）を用いて１０Ｈｚにて酵母懸濁インクを順次吐出した。
吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ（東京インスツルメンツ株式会社製、ｓＣＭＯＳ ｐｃｏ．ｅｄｇｅ）を用いて撮影した。光源としてはＹＡＧレーザー（スペクトラ・フィジックス社製、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ）を用い、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｊを用いて画像処理して細胞数を計数し、１細胞数の既知プレートを作製した。
【0176】
−核酸抽出−Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） Ｂｕｆｆｅｒを用いてＣｏｌＥ１ ＤＮＡ（和光純薬工業株式会社製、３１２−００４３４）を５ｎｇ／μＬとなるようにＣｏｌＥ１／ＴＥを調製し、ＣｏｌＥ１／ＴＥを用いてＺｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｒ） １００Ｔ（ナカライテスク株式会社製、０７６６５−５５）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を調製した。
作製した細胞数既知プレートの各ウェルにＺｙｍｏｌｙａｓｅ溶液を４μＬ添加し、３７．２℃にて３０分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解（核酸抽出）後、９５℃で２分間熱処理して、参照デバイスを作製した。
【0177】
次に、細胞数既知プレートから得られる結果の信頼性を考慮するために、１細胞数既知プレートを製造し、１細胞数における不確かさを算出する。なお、特定コピー数毎に以下に示す方法を用いることにより、様々なコピー数における不確かさを算出することができる。
【0178】
−不確かさの算出−本実施例では、不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の増幅可能な試薬のコピー数、ウェル内の細胞数、コンタミネーションを用いた。
液滴中の細胞数は、吐出手段より吐出された液滴の画像を解析し計数した液滴中の細胞数と、吐出手段で吐出した液滴をスライドガラスに着弾させ着弾した液滴毎に顕微鏡観察し得られた細胞数とを用いた。
細胞中の核酸コピー数（細胞周期）は、細胞周期のＧ１期に該当する細胞の割合（９９．５％）、Ｇ２期に該当する細胞の割合（０．５％）とを用いて算出した。
ウェル内の細胞数は、吐出した液滴がウェル内に着弾する数を計数したが、９６サンプルの計数においてすべての液滴がウェル内に着弾していたため、ウェル内の細胞数の要因は不確かさの計算から除外した。
コンタミネーションは、インクのろ液４μＬをリアルタイムＰＣＲで細胞中の増幅可能な試薬以外の核酸がインク液中に混入していないか３回の試行を行い確認した。その結果、３回すべてにおいて検出下限値となったため、コンタミネーションの要因についても不確かさの掲載から除外した。
不確かさは各要因の測定値から標準偏差を求め、感度係数を乗じて測定量の単位に統一した標準不確かさを平方和法により合成標準不確かさを求める。合成標準不確かさでは、正規分布の約６８％の範囲の値しか含まれないため、合成標準不確かさを２倍した拡張不確かさとすることにより正規分布の約９５％の範囲を考慮した不確かさを得ることができる。下記表１のバジェットシートに結果を示す。
【0179】
【表1】
【0180】
表１中、「記号」とは、不確かさの要因に対応付けた任意の記号を意味する。表１中、「値（±）」とは、平均値の実験標準偏差であり、算出した実験標準偏差をデータの数の平方根の値で除したものである。
表１中、「確率分布」とは、不確かさの要因がもつ確率分布であり、Ａタイプの不確かさ評価の場合には空欄とし、Ｂタイプの不確かさ評価には、正規分布又は矩形分布のいずれかを記入する。本実施例においてはＡタイプの不確かさ評価のみを行っているため、確率分布の欄は空欄となっている。
表１中、「除数」とは、それぞれ要因から得られる不確かさを正規化する数を意味する。
表１中、「標準不確かさ」とは「値（±）」を「除数」で除した値である。
表１中、「感度係数」とは、測定量の単位に統一するために用いられる値を意味する。
【0181】
以上の結果から、得られた拡張不確かさを測定のばらつきの指標として、ウェル毎のデータとして記憶させることで、実験で使用する者が不確かさの指標をウェル毎の測定結果の信頼性の判断基準として用いることができる。上記の信頼性の判断基準を用いることにより、分析検査の性能評価を高精度に行うことができる。
【0182】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。＜１＞ 少なくとも１つのウェルを有し、
少なくとも１つの前記ウェル内の増幅可能な試薬の絶対数及び前記増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報を有することを特徴とする検査デバイスである。
＜２＞ 前記増幅可能な試薬が担体に内包されている前記＜１＞に記載の検査デバイスである。
＜３＞ 前記増幅可能な試薬が核酸である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜４＞ 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜５＞ 前記核酸の長さが２０以上１０，０００以下の塩基長である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜５＞ 前記核酸が自然界には存在しない非天然の塩基配列を有する前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜７＞ 前記核酸のＧＣ含有率が前記特定の塩基配列の３０％以上７０％以下である前記＜３＞から＜６＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜８＞ 前記不確かさの情報が、前記細胞をデバイスに配置する手段、前記細胞の細胞周期、前記ウェル内に配置された細胞数、及び前記ウェル内のコンタミネーションの少なくともいずれかである前記＜４＞から＜７＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜９＞ 前記増幅可能な試薬の絶対数及び前記増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報を識別可能な識別手段を有する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜１０＞ 前記細胞が酵母である前記＜４＞から＜９＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜１１＞ 前記ウェル内に、プライマー及び増幅試薬の少なくともいずれかを有する前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜１２＞ 前記ウェルが複数であって、
前記各ウェル内の核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさを各ウェル毎の情報として有する前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜１３＞ 前記ウェルが保持される基材と、前記基材の前記ウェルを密閉可能な密閉手段を有し、前記識別手段は、前記密閉手段と前記基材との間に配置される前記＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の検査デバイスである。
＜１４＞ 核酸を増幅可能なＰＣＲ装置の評価に用いられるデバイスであって、
少なくとも１つのウェルを有し、
少なくとも１つの前記ウェル内の核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさと関連付けられた情報を有するデバイスである。
＜１５＞ 前記デバイスによる核酸増幅の結果と、前記関連付けられた情報を用いて前記核酸の絶対数及び前記核酸の絶対数の不確かさと、前記ＰＣＲ装置の管理に用いる前記＜１４＞に記載のデバイスである。
【0183】
前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の検査デバイス、及び前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載のデバイスは、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【0184】
１ 検査デバイス２ 基材
３ ウェル
４ 増幅可能な試薬
５ 密閉部材
【先行技術文献】
【特許文献】
【0185】
【特許文献1】特開２０１４−３３６５８号公報
【特許文献2】特開２０１５−１９５７３５号公報
【要約】 （修正有）
【課題】核酸増幅技術を含む遺伝子検査に基づく分析検査の性能評価を行うことができる検査デバイスを提供する。【解決手段】検査デバイス１は、少なくとも１つのウェル３を有し、少なくとも１つのウェル内の増幅可能な試薬４の絶対数及び増幅可能な試薬の絶対数の不確かさの情報を有する。増幅可能な試薬が担体粒子に内包されている態様などが好ましく、増幅可能な試薬が核酸である態様などがさらに好ましい。核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた態様などが、特に好ましい。
【選択図】図２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]