特許 6472960 魚体内での他家組織の継代維持法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6472960

(24)【登録日】2019年2月1日

(45)【発行日】2019年2月20日

(54)【発明の名称】魚体内での他家組織の継代維持法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20190207BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20190207BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20190207BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20190207BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   A01K67/027

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

【請求項の数】6

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2014-163587(P2014-163587)

(22)【出願日】2014年8月11日

(65)【公開番号】特開2016-36320(P2016-36320A)

(43)【公開日】2016年3月22日

【審査請求日】2017年8月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】504202472

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】酒井 則良

(72)【発明者】

【氏名】河崎 敏広

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−０８３００８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tang Q et al，Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish，Nat Methods，２０１４年 ７月２０日，11・8，p. 821-824，Published Online

【文献】 Science，２００２年，Vol. 297，p. 99-102

【文献】 BMC Immunology，２００９年 ２月 ３日，10:8，doi:10.1186/1471-2172-10-8，ＵＲＬ，https://bmcimmunol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2172-10-8

【文献】 Cell Stem Cell，２００８年，Vol. 2，p. 183-189

【文献】 Zebrafish，２００９年，Vol. 6, No. 4，p. 339-346

【文献】 Proc. Nati. Acad. Sci. USA，１９９２年，Vol. 89，p. 4519-4523

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）

ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｒａｇ１遺伝子が機能しない、又はｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該成魚を移植傷口が修復するまで抗生物質存在下で飼育することを特徴とする他家組織の魚体内での継代維持法。

【請求項2】

魚が、ゼブラフィッシュである請求項１記載の継代維持法。

【請求項3】

他家組織が、魚の他家組織である請求項１又は２記載の継代維持法。

【請求項4】

他家組織が、他家腫瘍組織である請求項１又は２記載の継代維持法。

【請求項5】

ｒａｇ１遺伝子が機能しない、又はｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該成魚を移植傷口が修復するまで抗生物質存在下で飼育し、当該移植の前又は後に被検物質を投与し、当該他家組織に対する被検物質の作用を検出することを特徴とする当該他家組織に作用する薬物のスクリーニング法。

【請求項6】

ｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しないフィッシュ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、魚体内で腫瘍組織等の他家組織を継代維持する方法及びこれを用いた薬物のスクリーニング法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫拒絶反応を回避できる移植実験法の確立は、免疫学研究のみならず、様々な分野の生物学研究において非常に有用な手法である。既に哺乳類では成熟Ｔ細胞やＢ細胞が形成されず移植片を拒絶しないヌードマウスやｒａｇ１／ｒａｇ２ノックアウトマウスが作成され、様々な研究に用いられて来た。ゼブラフィッシュは大量飼育が容易で、稚魚期の魚体が透明であるというマウスとは異なる特徴を持ち、様々な遺伝学的手法が適用可能な事から近年注目を浴びているモデル脊椎動物である。すでに膨大な数の突然変異体やトランスジェニック個体が単離されており、この動物で免疫拒絶反応を回避できる細胞や器官の移植実験法が確立出来れば、免疫学研究や様々な器官形成の研究に有効な手法となり得る。水中で大量飼育が容易で、魚体が透明という特徴を活かすことでマウスと異なるアプローチが可能となり、新たな薬剤のスクリーニング系となる事も期待出来る。

【0003】

ゼブラフィッシュではこれまでにも免疫拒絶反応を回避できる細胞の移植法が報告されてきた。最も簡単な手法は初期発生中の胚に注入する方法である（非特許文献１〜３）。初期発生中の胚では免疫系が十分に確立されておらず免疫拒絶反応を回避することができるが、胚が小さいため細胞の注入は可能であるが器官単位の移植は非常に困難である。成長した魚体に細胞を移植する方法としては、免疫抑制剤（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）処理やγ線照射によって免疫系を抑制、破壊することによって移植片に対する免疫拒絶反応を回避する方法が報告されている（非特許文献４、５）。しかし、当然の事ながらこれらの方法では宿主の免疫系全体が抑制、破壊される事によって感染症等の病気に弱くなってしまい、宿主が死に易く安定した移植実験系とはいいがたい。また、組織適合性抗原が均一な近交系を用いて移植するという方法を本発明者は既に報告している（非特許文献６、７）。しかし、この方法では同じ近交系同士でなければ移植は成功しない。これまでに単離された突然変異体やトランスジェニック個体の殆どは近交系ではないため、これらの資源を活用する事が不可能であるという欠点を持っていた。

【0004】

マウスでは、ｒａｇ１ノックアウトマウスでは成熟Ｔ細胞やＢ細胞が形成されず移植片を拒絶しないが明らかにされている。ゼブラフィッシュにおいても、ｒａｇ１遺伝子が機能としないｒａｇ１突然変異体が単離されており、成熟Ｔ細胞やＢ細胞が形成されない事が報告されている（非特許文献８）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Haladi, et al., Angiogenesis 2006, 9: 139-151.

【非特許文献2】Nicoli, et al., Canser Res 2007, 67: 2927-2931.

【非特許文献3】Nicoli and Presta, Nat Protoc 2007, 2: 2918-2923.

【非特許文献4】Stoletov et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 104: 17406-17411.

【非特許文献5】Zon Li, Methods Mol Biol 2009, 568: 1-5.

【非特許文献6】Kawasaki et al., Biol Reprod 2010, 83: 533-539.

【非特許文献7】Shinya and Sakai, G3 2011, 1: 377-386.

【非特許文献8】Petrie-Hanson et al., BMC Immunol 2009, 10: 8.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、ｒａｇ１遺伝子が機能しないゼブラフィッシュに他家の組織を移植した場合に免疫拒絶反応がおこるかどうかは報告されていない。また、他の魚種においても報告はされていない。
従って、本発明の課題は、魚類において同種異系組織を移植しても免疫拒絶反応を生じず、稚魚本体、正常な器官や組織、腫瘍組織等を継代維持する方法及びこれを用いた薬物のスクリーニング方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで本発明者は、ｒａｇ１遺伝子が機能しないゼブラフィッシュに異系統のゼブラフィッシュ組織、腫瘍組織及び個体を皮下移植したところ、これらの組織が拒絶されずに生着し、これを継代維持できることを見出した。またさらにｒａｇ１遺伝子に加えて、魚体の色素形成に関わるａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子も機能しないゼブラフィッシュを作製し、当該ゼブラフィッシュの皮下に他の組織を移植したところ、魚体表面が透明になり、宿主を生かしたまま移植片の生着、成長等が簡便に検出できることも見出した。さらに、これらの遺伝子が機能しないゼブラフィッシュを用いれば、移植した組織、例えば腫瘍組織の増殖に影響を及ぼす薬物のスクリーニングが多量かつ簡便にできることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。

【0009】

〔１〕ｒａｇ１遺伝子が機能しない、又はｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植することを特徴とする他家組織の魚体内での継代維持法。
〔２〕魚が、ゼブラフィッシュである〔１〕記載の継代維持法。
〔３〕他家組織が、魚の他家組織である〔１〕又は〔２〕記載の継代維持法。
〔４〕他家組織が、他家腫瘍組織である〔１〕又は〔２〕記載の継代維持法。
〔５〕ｒａｇ１遺伝子が機能しない、又はｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該移植の前又は後に被検物質を投与し、当該他家組織に対する被検物質の作用を検出することを特徴とする当該他家組織に作用する薬物のスクリーニング法。
〔６〕ｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しないフィッシュ。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、ゼブラフィッシュのような大量飼育が容易な小型魚類に対して免疫拒絶反応を生じることなく、他家組織の移植が可能となった。また、ｒａｇ１、ａｌｂ１及びｒｏｙ遺伝子が機能しないゼブラフィッシュを用いれば、皮下に移植された組織の生着、成長などが容易に検出できる。また、本発明のスクリーニング法を用いれば、大量飼育により、多量の薬物の組織に対する作用を容易にスクリーニングすることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】組織（精巣断片）の移植方法の模式図を示す。

【図2】移植された組織の組織学的解析を示す。ＨＥはＨＥ染色を、ＢｒｄＵは抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫染色を示す。矢頭はＢｒｄＵを取り込んだＡ型精原細胞、矢印はＢ型精原細胞、および精母細胞を示す。

【図3】腫瘍化組織の皮下移植を示す。Ａ：腫瘍化精巣。Ｂ：移植に用いた腫瘍化精巣の断片。Ｃ：移植３ヶ月後の腫瘍化精巣。Ｄ，Ｅ：Ｂを移植した直後の宿主。Ｆ，Ｇ：移植３ヶ月後の宿主。

【図4】移植により増幅された腫瘍化組織の皮下移植による継代を示す。

【図5】移植した腫瘍化組織の組織切片像を示す。各図の左上の記号は、図４の継代を示す。矢印初期精原細胞、矢頭は精子、二重矢頭は精巣卵を示す。

【図6】Ａ：ゼブラフィッシュ生後３日の胚２個体の移植２ヶ月後。Ｂ−Ｄ：Ａの組織切片像を示す。

【図7】３日胚の移植２ヶ月後を示す。移植条件はＡ−Ｄの写真の上部に示す。この実験では、ｖａｓプロモーターによって生殖細胞でＥＧＦＰが発現するため生殖巣が緑色蛍光を発するトランスジェニック個体（ｖａｓ：：ＥＧＦＰ）の胚を移植に用いた。Ａ−Ｄ：移植組織の明視野での観察像。ａ−ｄ：緑色蛍光観察像を示す。Ａ’−ｄ’：赤色蛍光観察像を示す。胚はＥＧＦＰと関係の無い自家蛍光を持つため赤色蛍光を同時に観察し、ＥＧＦＰによる蛍光（矢印）と自家蛍光（矢頭）を区別した。ｃ”，ｄ”：移植組織中の精巣部分の組織切片像（ＨＥ染色）を示す。Ｅ：移植に用いた３日胚の胴体の切り出し方を示している。

【図8】ｖａｓ：：ＥＧＦＰトランスジェニック個体の６日胚の移植２ヶ月後を示す。移植条件はＡ−Ｄの写真の上部に示す。Ａ−Ｄ：移植組織の明視野での観察像。ａ−ｄ：緑色蛍光観察像を示す。矢印はＥＧＦＰの蛍光を示す。ｂの個体は自家蛍光が強くＥＧＦＰの蛍光と区別が付きにくいため、赤色蛍光観察（ｂ’）を行って自家蛍光（矢頭）を特定した。ａ”−ｄ”：移植組織中の精巣部分の組織切片像（ＨＥ染色）を示す。

【図9】Ａ：ｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない成魚皮下に、ｓｏｘ１７：ＥＧＦＰトランスジェニック個体由来の腫瘍化精巣断片を移植し１ヶ月後の宿主の明視野観察。ａ：Ａの緑色蛍光観察。矢印は移植された腫瘍化精巣を示す。ｓｏｘ１７：ＥＧＦＰトランスジェニック個体では精原細胞でＥＧＦＰが発現するため腫瘍化精巣を緑色蛍光でより明確に観察する事が出来る。Ｂ：Ａの宿主から取り出した腫瘍化精巣の明視野観察。ｂ：Ｂの緑色蛍光観察。Ｃ：移植する前の腫瘍化精巣断片の組織切片像。Ｄ：移植１ヶ月後の腫瘍化精巣（Ｂ）の組織切片像。矢印は初期精原細胞、矢頭は精子を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の継代維持法及びスクリーニング法に用いる魚は、（１）ｒａｇ１遺伝子が機能しない魚、又は（２）ｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない魚である。ここで、ｒａｇ１遺伝子が機能しない魚としては、非特許文献６に記載のｒａｇ１遺伝子が機能しないゼブラフィッシュが挙げられる。

【0013】

ｒａｇ１遺伝子、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない魚としては、後記実施例に示すように、本発明者が作製したゼブラフィッシュが挙げられる。この３種の遺伝子が機能しないようにするには、例えば、ｒａｇ１遺伝子が機能しない魚と、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が機能しない魚とを交配させ、３重遺伝子欠損魚を選択すればよい。

【0014】

本発明における魚としては、大量に飼育できる点から小型魚類が好ましく、小型の淡水魚がより好ましく、様々な遺伝子改変魚が作成されているゼブラフィッシュ又はメダカがさらに好ましく、世界中で広く使われているという意味においてゼブラフィッシュが特に好ましい。

【0015】

また、ｒａｇ１遺伝子等が機能しないためには、当該遺伝子全体が欠損している場合、当該遺伝子の一部が欠損して機能しない場合及び当該遺伝子が他の遺伝子に置換されている場合等が含まれる。

【0016】

本発明で移植に用いる他家組織としては、同種異系組織を用いることができる。本来は同種間であっても通常、遺伝情報が均一な近交系同士でない場合は免疫拒絶反応が生じて移植組織が生着しないので、同種異系の様々な遺伝子改変個体や、疾患個体の組織の移植に有用である。

【0017】

また、他家組織には、他家の正常組織及び他家の疾患組織が挙げられる。正常組織を移植する場合、例えば胚性致死のゼブラフィッシュ突然変異体を死ぬ前に移植する事によって、突然変異体の臓器を長期間に渡って調べる事も可能であり、種々の研究に用いることができる。また、疾患組織としては、腫瘍組織、自己免疫疾患組織等の治療が困難な疾患の組織を用いることができる。

【0018】

稚魚に移植する既存の方法とは異なり、成体宿主魚の皮下に収まる大きさの組織、器官を移植することが出来るため、ゼブラフィッシュの器官レベルを移植することができる。移植する組織を細胞単位にまで解離する必要がない点が既存の稚魚を用いる移植法に対する利点である。

【0019】

器官レベルで移植が可能という観点から、他家組織の移植は成長しきった成魚の皮下が望ましい。ゼブラフィッシュの稚魚は体長が数ミリと小さいため、移植に技術を要し、細胞レベルの移植が精一杯であり組織を移植することはほとんど不可能に近い。成魚とは、該当稚魚の成長魚であり、例えばゼブラフィッシュの場合、体長３cm以上又は生後６０日以降であるのが好ましい。皮下への移植は、本発明者が近交系間で移植する際に用いた手法に従い、麻酔した宿主の腹部の表皮を切り、その切り口から表皮と筋肉の間にピンセットを差し込んで移植するスペースを作り、組織を挿入すればよい。

【0020】

他家組織を移植した魚は、１０μｇ／ｍＬの抗生物質（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を含む０．４×ＰＢＳ中で暗所で４日間餌を与えずに飼育して傷口を修復させ、その後は通常と同様に飼育すればよい。本発明に用いるｒａｇ１遺伝子又はｒａｇ１、ａｌｂ１遺伝子及びｒｏｙ遺伝子が欠損した魚は、他家組織を移植しても免疫拒絶反応を生じることが少ないので、生育が良好である。
なお、ｒａｇ１、ａｌｂ１及びｒｏｙ遺伝子が機能しない魚を宿主とした場合には、体表面が透明となり、移植後の組織が生着、成長する様子が肉眼で観察可能である。

【0021】

このようにして魚に生着、成長した他家組織は、増殖するものであれば摘出して断片化し、他の同様な遺伝子が機能しない魚の皮下に移植すれば、当該他家組織を継代し維持・増幅することができる。

【0022】

本発明のスクリーニング法においては、他家組織の移植前又は後に、被検物質を前記魚に投与するか、移植組織を培養して培地中に被検物質を加えて取り込ませる事ができる。宿主への被検物質の投与手段としては、飼育水槽に投入して経口的、及び鰓や体表面から体内に浸透させて摂取させる方法、腹腔に注入する方法が採用できる。飼育水槽に所定の濃度になるように投入するのが簡便である。

【0023】

移植後の他家組織の生着、成長や縮小を検出すれば、被検物質の移植した組織に対する薬理作用をスクリーニングすることができる。対照として、被検物質を投与しなかった魚中の移植組織を用いればよい。例えば、移植する組織として腫瘍組織を用いれば、短期間に、大量の魚中の腫瘍組織に対する増殖抑制作用がスクリーニングできる。

【実施例】

【0024】

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

【0025】

実施例１（ｒａｇ１突然変異体における同種異系移植片の受容性）
まず最初にゼブラフィッシュｒａｇ１突然変異体（ｒａｇ１^-/-）において移植片に対する免疫拒絶反応がおこるか検討を行った。図１に示す様にＡＢ／Ｔｕ系統の精巣断片を各系統に移植した。すなわち、ＡＢ／Ｔｕ系統の精巣を約５分割し、ｒａｇ１^-/-、wild-type（IndiaもしくはTM系統）の雄の皮下に移植した。移植した宿主は１０μｇ／ｍＬの抗生物質（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を含む０．４×ＰＢＳ中で暗所で４日間餌を与えずに飼育して傷口を修復させ、その後は通常の飼育水中で４週間飼育した。移植片の解析は、移植片が回収された場合はブアン固定し組織切片を作成して観察した。その結果を表１に示す。各系統に移植されたＡＢ／Ｔｕ系統の精巣断片（同種異系）のうち、４週間後に移植片が拒絶反応によって消失せずに回収された数を示す。Ｒａｇ１突然変異体に移植された移植片の大部分は拒絶されずに生存し、その他の系統に移植された場合は全て拒絶された事が分かる。この結果は、ｒａｇ１突然変異体では少なくとも同種異系組織に対しては免疫拒絶反応をおこさない事を明らかに示している。

【0026】

【表1】

【0027】

この時、回収された移植断片をＢｒｄＵで３時間処理して組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色および抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫染色を行った。すなわち、Ｒａｇ１突然変異体に移植され、生き残った移植片をＢｒｄＵを添加したＬ−１５培地中で３時間培養し、ブアン個体を行って組織切片を作成した。ＢｒｄＵの標識、検出にはＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を使用した。結果を図２に示す。ＨＥ染色では精巣の組織構造に異常は見られず（図２ＨＥ）、様々なステージの生殖細胞の核でＢｒｄＵが検出された（図２ＢｒｄＵ）。ＢｒｄＵは増殖中の細胞ＤＮＡに取り込まれる性質を持っており、この物質を取り込んだ細胞は増殖活性を持っている事になる。魚類の精子形成では、生殖細胞の精子への分化と細胞分裂が密接に関与しているため、生殖細胞の増殖活性を調べる事で精子形成が行われているか調べることができる。そのためこの結果は、移植された精巣断片の組織構造が正常に維持され、精巣の主たる機能である精子形成も維持されていた事を明確に示している。これらの結果から、ｒａｇ１突然変異体は同種異系組織に対する拒絶反応を起こさず、移植された組織本来の構造や機能を維持する事が出来るという移植実験の宿主として理想的な特性を備えている事が明らかになった。

【0028】

実施例２（ｒａｇ１突然変異体を宿主に用いた腫瘍化精巣の維持・増幅）
ｒａｇ１突然変異体が腫瘍化組織の移植実験に使用可能か検討を行った。すなわち、腫瘍化精巣を取り出し（図３Ａ）、腫瘍化精巣は巨大でそのままでは移植困難なため移植可能なサイズに断片化した（図３Ｂ）。この断片をｒａｇ１突然変異体の雄に皮下移植した（図３Ｄ，Ｅ）。３ヶ月後には移植部分が大きく膨らみ（図３Ｆ，Ｇ）、元の腫瘍化精巣とほぼ同サイズにまで成長していた。ＢとＣは同じ倍率の写真であるため、移植により大きく成長する事が分かる。移植断片の成長は宿主の外見からも観察することができる（Ｄ−Ｇ，矢印）。これらの写真は図４のＢ系統の腫瘍化精巣を用いた時の写真である。この様に大きくなった移植片を取り出し、更に移植を行って継代を行いその結果を図４にまとめた。

【0029】

我々はこれまでに４つの腫瘍化精巣を得ており、この移植実験に使用した。次に成長した移植断片を再度断片化して再移植を行い、移植片の継代が可能か検討した。すなわち、４つの腫瘍化精巣を用いて皮下移植実験を行い、移植によって成長した移植断片を用いて継代を行った。図４中、各カラムの左側は移植実験を行った日付を示している。全ての移植断片は１ヶ月以内に外見から観察出来る程に成長するため、一ヶ月以内での成長した移植断片数をＧｒａｆｔ Ｇｒｏｗｔｈの項に、１ヶ月間生存していた宿主の数を１ ｍｏｎｔｈ ｓｕｒｖｉｖａｌの項に記載した。Ｒｅｓｔの項は現在まで生存している宿主の数を示す。Ａ系統のＡ３−１、Ａ３−２、Ａ４−１の移植実験では宿主が一ヶ月間生き残れない場合が多く、Ａ２−１の段階で移植片の悪性度が増加した事が示唆された。他の系統の移植実験では、飼育上の問題以外で宿主の死亡が続出することは見られなかった。
この実験に用いた４種の腫瘍化精巣は再度断片化して移植しても大きく成長し、１年以上の長期間に渡って維持できることが明らかとなった。

【0030】

図４に示した移植実験に用いた腫瘍化精巣断片の一部をブアン固定し、組織切片を作成してＨＥ染色を行った（図５）。図５中、写真左上の名前は図４に同名で示した各移植実験の時に用いた移植断片を示す。図４の結果から移植断片の悪性化が進んだと思われるＡ４−１の断片では精子形成細胞がほとんど無くなっており、組織が変性した事が分かる。Ａ系統の断片ではSmolowitz（Biol Bull 2002, 203: 265−２６６．）のセミノーマに関する報告にも記載されている様な精巣卵が観察される（図５Ａ、Ｃ、Ｄ、二重矢頭）。その他の断片ではＳｍｏｌｏｗｉｔの報告と様様に初期の精原細胞（矢印）が豊富に見られるが、精子（矢頭）は少ない。Ｄ系統の断片では他の腫瘍化精巣と違い初期の精原細胞しか観察されないが、Ｄ系統の腫瘍化精巣はＮＩ１６１突然変異体由来であり、ＮＩ１６１の表現形と合致している。
Ａ系統の腫瘍精巣では継代によって宿主が早期に死亡してしまう現象が見られ、図５に示す様にこの様なケースでは移植した断片の性質が変性している事が分かった。本来であれば腫瘍化精巣が発生した個体は長くは生きられないため、ここまで精巣が変性してしまうまえに死亡してしまう。宿主が早期に死亡してしまう事から、腫瘍化精巣が長期間生き続ける事によって、悪性度が高まったといえる。この事から、移植された腫瘍化精巣の性質は必ずしも完全に維持出来る訳ではなく、継代には注意が必要である事が分かった。一方、その他の３種の腫瘍化精巣では宿主が早期に死亡してしまう傾向は見られず、組織学的にも大きな差は今のところ見られないため、移植による腫瘍組織の変性はそう頻繁に起こるものではないものと思われる。また多くの場合、移植後の宿主の精巣が見つからない現象が見られたため、宿主の精巣と移植された腫瘍化精巣は拮抗することが示唆された。以上の結果から、ｒａｇ１突然変異体は腫瘍化組織の移植実験の宿主として十分に使用可能である事が示唆された。

【0031】

実施例３（ｒａｇ１突然変異体を用いた個体（胚）の移植）
これまでｒａｇ１突然変異体を宿主に用いる事によって、精巣および腫瘍化精巣の移植が可能である事が明らかとなった。次のステップとしてその他の組織も移植可能であるか検討を行った。その際、移植可能な大きさであり、かつ全ての種類の器官を備えている３日胚を用いて移植実験を行った。すなわち、形態形成がほぼ終了した３日胚２つをｒａｇ１突然変異体１個体に移植し、２ヶ月間飼育した。移植胚は融合していたが、宿主中で拒絶されず大きく成長し、眼球や拍動する心臓を観察する事が出来た（図６Ａ）。この胚をブアン固定し、組織切片を作成してＨＥ染色を行ったところ、眼球（図６Ｂ）、筋肉（図６Ｃ）、腸管（図６Ｄ）等が観察された。

【0032】

これらの結果から、ｒａｇ１突然変異体は精巣以外の組織の移植実験にも使用可能な事が分かった。
しかし、この時の移植胚では生殖巣を観察する事が出来なかった。移植精巣は宿主の精巣と拮抗する傾向がある事が把握出来ていたため、次にｄｅａｄ−ｅｎｄ遺伝子のノックダウンによって生殖細胞を除去したｒａｇ１突然変異体を用いて再度胚移植実験を行った。この実験では生殖細胞でＥＧＦＰ遺伝子を発現するｖａｓ：：ＥＧＦＰトランスジェニック個体の３日胚と６日胚を１匹丸ごと、および胴体のみの状態で移植した。

【0033】

すなわち、ｖａｓ：：ＥＧＦＰトランスジェニック個体の３日胚を１匹丸ごと、および胴体のみの状態で１匹の宿主（ｒａｇ１突然変異体）につき１つずつ同時に移植した。宿主は正常なｒａｇ１突然変異体と生殖細胞を欠失したｒａｇ１突然変異体を用い、移植後２ヶ月間飼育した。飼育後、移植胚を取り出してＥＧＦＰの蛍光を観察した。胚には自家蛍光（図７ａ、ｂ、ｃ、ｄ矢頭）があるため、赤色蛍光用のフィルターの観察も行いＥＧＦＰの蛍光と区別した（図７ａ’、ｂ’、ｃ’、ｄ’矢頭）。１匹丸ごとでの移植でも、胴体のみの移植でも宿主の生殖細胞が欠失している宿主を用いた場合ではＥＧＦＰの蛍光が観察され（図７ｃ、ｄ矢印）、組織切片の観察によって精巣組織が形成され精子形成が行われ精子が形成されている事が確認された（図７ｃ”、ｄ”ｓｐｅｒｍ）。また、生殖細胞を持つ正常な宿主では精巣は観察されなかった。図７Ｅの胚の写真は、移植胚の胴体の切り出し方を示している。

【0034】

ｖａｓ：：ＥＧＦＰトランスジェニック個体の６日胚を１匹丸ごと、および胴体のみの状態で１匹の宿主（ｒａｇ１突然変異体）につき１つずつ同時に移植した。宿主は正常なｒａｇ１突然変異体と生殖細胞を欠失したｒａｇ１突然変異体を用い、移植後２ヶ月間飼育した。飼育後、移植胚を取り出してＥＧＦＰの蛍光を観察したところ、６日胚を移植した場合では全ての移植胚でＥＧＦＰの蛍光が観察された（図８ａ、ｂ、ｃ、ｄ矢印）。これらの胚の組織切片の観察によって精巣組織が形成され精子が形成されている事が確認された（図８ａ”、ｂ”、ｃ”、ｄ”ｓｐｅｒｍ）。

【0035】

これらの結果から、ｒａｇ１突然変異体は様々な組織の移植に使用可能ではあるが、移植する組織が宿主の組織と拮抗する場合は注意が必要である事が分かった。

【0036】

実施例４（ａｌｂ；ｒｏｙ；ｒａｇ１三重突然変異体を用いた移植組織の可視化）
これまでの結果より、ゼフラフィッシュｒａｇ１突然変異体は少なくとも同種異系組織の移植実験に宿主として使用可能である事が示された。しかし、この突然変異体では正常に色素細胞が形成されるため、成体に組織を移植するとそのままでは移植片を観察出来ず、解析するには宿主を殺して移植片を取り出す必要がある。この点を改良するため、色素細胞が形成されないために成体でも魚体が透明になるａｌｂ；ｒｏｙ二重突然変異体とかけ合わせてａｌｂ；ｒｏｙ；ｒａｇ１三重突然変異体を作成した。この個体を宿主としてｓｏｘ１７：：ＥＧＦＰトランスジェニック個体由来の腫瘍化精巣断片３つを３個体に移植した。この移植片ではｓｏｘ１７プロモーターによって移植片内の多数を占める精原細胞でＥＧＦＰが発現するため、移植片をＥＧＦＰの蛍光により観察することができる。移植１ヶ月後に宿主を麻酔して生かしたまま観察したところ、移植片が観察され（図９Ａ、矢印）、蛍光観察ではさらに明瞭に移植片が観察された（図９ａ、矢印）。この結果はａｌｂ；ｒｏｙ；ｒａｇ１三重突然変異体を宿主に用いる事によって移植組織を生きたまま観察する事が可能になった事を示している。

【0037】

取り出した移植片（図９Ｂ、ｂ）を固定し組織切片を作成しＨＥ染色を行った。移植された腫瘍化精巣（図９Ｄ）では精子（矢頭）が少なく、大部分が初期精原細胞（矢印）で占められており、移植前の腫瘍化精巣（図９Ｃ）と同様な特徴が観察された（図９Ｃ、Ｄ）。この結果から、ａｌｂ；ｒｏｙ；ｒａｇ１三重突然変異体を宿主に用いても、ｒａｇ１突然変異体と同様に移植組織が維持される事がわかった。以上の結果から、ａｌｂ；ｒｏｙ；ｒａｇ１三重突然変異体を宿主に用いる事により移植片が維持され、宿主を生かしたまま継時的に観察していく事が可能になったといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】