特許 6486661 いもち病抵抗性を有するイネ及びその生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6486661

(24)【登録日】2019年3月1日

(45)【発行日】2019年3月20日

(54)【発明の名称】いもち病抵抗性を有するイネ及びその生産方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20190311BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20190311BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20190311BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20190311BHJP

【ＦＩ】

   A01H5/00 AZNA

   C12N15/113 130Z

   C12N15/55

   A01H1/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2014-234121(P2014-234121)

(22)【出願日】2014年11月19日

(65)【公開番号】特開2015-128417(P2015-128417A)

(43)【公開日】2015年7月16日

【審査請求日】2017年7月10日

(31)【優先権主張番号】特願2013-239247(P2013-239247)

(32)【優先日】2013年11月19日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2013-253167(P2013-253167)

(32)【優先日】2013年12月6日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度農林水産省、次世代農業プロジェクト、「作物に画期的な形質を付与する新しいゲノム育種技術の開発」委託事業に係わる、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(72)【発明者】

【氏名】高辻 博志

(72)【発明者】

【氏名】上野 宜久

(72)【発明者】

【氏名】吉田 理一郎

(72)【発明者】

【氏名】姜 昌杰

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１５７５８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Plant Cell，２００９年，Vol.21，pp.2884-2897

【文献】 Plant Cell，１９９８年，Vol.10，pp.849-857

【文献】 舘林 和夫, 他, “耐塩生・耐浸透圧性に関わる酵母の高浸透圧応答経路の制御機構”, [online], 2011.3, 公益財団法人ソルト・サイエンス研究財団 助成研究報告書, [2018.7.6 検索], インターネット<URL: http://www.saltscience.or.jp/general_research/2009/200907.pdf>

【文献】 Mol. Cell. Biol.，２００８年，Vol.28, No.7，pp.2481-2494

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｈ １／００−１７／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２であるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている、いもち病抵抗性を有するイネ。

【請求項2】

１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現の抑制が、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法による抑制である、請求項１に記載のイネ。

【請求項3】

１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性の抑制が、１又は複数の変異の導入による抑制である、請求項１に記載のイネ。

【請求項4】

１又は複数の変異が、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のタンパク質コード領域内における変異を少なくとも含む請求項３に記載のイネ。

【請求項5】

１又は複数の変異が、ＯｓＰＴＰ１の２５８番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、及び／又はＯｓＰＴＰ２の１６６番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、をコードする、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のコドンの変異を少なくとも含む、請求項３又は４に記載のイネ。

【請求項6】

ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２であるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性を抑制する、いもち病抵抗性を有するイネの生産方法。

【請求項7】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法によって行う請求項６に記載のイネの生産方法。

【請求項8】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性の抑制を、１又は複数の変異を導入することにより行う、請求項６に記載のイネの生産方法。

【請求項9】

請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法により生産されたイネの子孫又はクローンであって、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２であるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている、いもち病抵抗性を有するイネ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、病害抵抗性を有する植物及びその生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

植物の病害による被害は、環境条件により影響されることが多い。例えば、イネのいもち病などの病害による被害は、冷害年などイネが低温にさらされた時に拡大することが知られており、近年では１９９３年及び２００３年の冷害年に大きないもち病被害が発生した。また、いもち病の感染は、気温が低下する夜明け頃に起こりやすいことが知られている。これらは低温によってイネの抵抗性機構が弱められるためと考えられる。したがって、環境条件に左右されない、高い病害抵抗性を示す植物の開発は、農業における生産性向上のために有益である。

【0003】

サリチル酸（ＳＡ）シグナル伝達経路は、化学的抵抗性誘導剤により活性化され、イネのいもち病等の病害に対する防御においては中心的な役割を果たすことが知られている（非特許文献１及び２）。転写因子ＷＲＫＹ４５は、このプロセスにおいて不可欠な役割を果たし、ＷＲＫＹ４５を過剰発現させることで植物の病害抵抗性を向上させることができる（非特許文献１及び２）。特許文献１には、ＷＲＫＹ４５遺伝子とプロモーター遺伝子の組み合わせを利用して、病害抵抗性と農業形質が両立する単子葉植物を作出できることが記載されている。

【0004】

しかし、ＳＡシグナル伝達経路を介した病害抵抗性の向上効果は、低温条件下におけるアブシジン酸（ＡＢＡ）シグナル伝達の活性化により阻害されるが、そのメカニズムは不明である（非特許文献３及び４）。

【0005】

一方、イネのＭＡＰキナーゼの一つであるＯｓＭＰＫ６は、ＳＡに応答して活性化し、ＷＲＫＹ４５タンパク質をリン酸化することが知られている（非特許文献５）。一般にＭＡＰキナーゼは、ＴＥＹシグネチャー配列内のトレオニン（Ｔｈｒ）及びチロシン（Ｔｙｒ）残基における二重リン酸化（ｄｕａｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）がその活性化において不可欠であるが、ＯｓＭＰＫ６は２２５−２２７位にＴＥＹシグネチャー配列を有している（非特許文献６）。

【0006】

非特許文献７には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素（ＰＴＰアーゼ）ＡｔＰＴＰ１がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化チロシン残基を脱リン酸化すること、ＡｔＰＴＰ１並びにタンパク質中のリン酸化トレオニン残基若しくはリン酸化セリン残基及びリン酸化チロシン残基の双方を脱リン酸化する活性を有するタンパク質脱リン酸酵素であるＭＫＰ１の両者が機能欠損することによって病害抵抗性が高まることが記載されている。

【0007】

典型的なタンパク質チロシン脱リン酸化酵素であるヒトＰＴＰ１Ｂに関するこれまでの研究は、ヒトＰＴＰ１Ｂが他のタンパク質中のリン酸化チロシン残基に結合した後、前記リン酸化チロシン残基のリン酸基がヒトＰＴＰ１Ｂの２１５番目のシステイン残基に転移する結果、該他のタンパク質中のリン酸化チロシン残基が脱リン酸化されることを示している（非特許文献８）。このリン酸基の転移にとって上記システイン残基中のチオール基の存在が必須である。また、リン酸化チロシン残基から前記システイン残基へのリン酸基の転移をヒトＰＴＰ１Ｂ中の１８１番目のアスパラギン残基が一般ルイス塩基として促進することが示されている（非特許文献９）。Ｆｌｉｎｔら（非特許文献１０）はヒトＰＴＰ１Ｂの変異体解析の結果から、ＰＴＰ１Ｂの２１５番目のシステイン残基又は１８１番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体酵素の酵素活性がほとんど消失することを見出している。Ｘｕら（非特許文献１１）は、この知見に基づき、シロイヌナズナのタンパク質チロシン脱リン酸化酵素であるＡｔＰＴＰ１の変異体解析を行い、ヒトＰＴＰ１Ｂにおける２１５番目のシステイン残基に相当するＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基又はヒトＰＴＰ１Ｂにおける１８１番目のアスパラギン酸残基に相当するＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体ＡｔＰＴＰ１の酵素活性が消失することを報告している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１２／１２１０９３号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９，２０６４（２００７）

【非特許文献2】Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎt Ｐａｔｈｏｌ．１３，８３（２０１２）

【非特許文献3】Ａ．Ｒｏｂｅｒｔ−Ｓｅｉｌａｎｉａｎｔｚ，Ｍ．Ｇｒａｎｔ，Ｊ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．４９，３１７（２０１１).

【非特許文献4】Ｍ．Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．９，４３６（２００６）

【非特許文献5】Ｙ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ．８，ｅ２４５１０（２０１３）

【非特許文献6】Ｎ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．Ｍａｌｌｅｒ，Ｎ．Ｋ．Ｔｏｎｋｓ，Ｔ．Ｗ．Ｓｔｕｒｇｉｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４３，６５１（１９９０）

【非特許文献7】Ｓ．Ｂａｒｔｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１，２８８４（２００９）

【非特許文献8】Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，１３９７−１４０４（１９９４）

【非特許文献9】Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，１７５４−１７５８（１９９５）

【非特許文献10】Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，１６８０−１６８５（１９９７）

【非特許文献11】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０，８４９−８５７（１９９８）

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

特許文献１では、病害抵抗性を低温下など過酷な環境条件においても維持及び向上させることには着目していない。また、非特許文献１〜１１には、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素が様々な植物で病害抵抗性の維持又は向上にかかわっていること、特に、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素が、低温等の環境条件は左右されない病害抵抗性の維持又は向上にかかわっていることは、記載されていない。

【0011】

本発明の目的は、高い病害抵抗性を有する植物、特に、環境条件に左右されない高い病害抵抗性を有する植物、及び、高い病害抵抗性、特に、環境条件に左右されない高い病害抵抗性を植物に付与するための技術を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は以下の発明を提供する。
〔１〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている、病害抵抗性を有する植物。
〔２〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現の抑制が、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法による抑制である、上記〔１〕に記載の植物。
〔３〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性の抑制が、１又は複数の変異の導入による抑制である、上記〔１〕に記載の植物。
〔４〕１又は複数の変異が、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のタンパク質コード領域内における変異を少なくとも含む上記〔３〕に記載の植物。
〔５〕１又は複数の変異が、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素に含まれるアミノ酸残基であって、ＯｓＰＴＰ１の２５８番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、及び／又はＯｓＰＴＰ２の１６６番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、をコードする、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のコドンの変異を少なくとも含む、上記〔３〕又は〔４〕に記載の植物。
〔６〕単子葉植物である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の植物。
〔７〕イネである、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の植物。
〔８〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性を抑制する、病害抵抗性を有する植物の生産方法。
〔９〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現の抑制を、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法によって行う上記〔８〕に記載の植物の生産方法。
〔１０〕１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性の抑制を、１又は複数の変異を導入することにより行う、上記〔８〕に記載の植物の生産方法。
〔１１〕上記〔８〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法により生産された植物の子孫又はクローンであって、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている、病害抵抗性を有する植物。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、植物に対し、高い病害抵抗性を付与することができる。本発明の一態様によりもたらされる病害抵抗性植物は、冷害時にも顕著な病害抵抗性を示し、そのために従来の植物を栽培する際と比較して、低温時においても抵抗性誘導剤の効果を持続させることができる。よって、本発明は、イネをはじめとする植物生産性向上を図ることができ、植物が関与する農業、食品産業等の分野において有用である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、サリチル酸経路のモデルを示す図である。

【図2】図２は、サリチル酸（ＳＡ）処理後又は未処理の、野生型（ＷＴ）イネカルス、ｏｓｍｐｋ６遺伝子変異型イネカルス、及び野生型（ＷＴ）イネ葉を用いた、抗ｐＴＥｐＹ抗体（上段）、抗ＯｓＭＰＫ６（中段）及び抗ＰＥＰＣ抗体（下段）によるイムノブロットアッセイの結果を示す図である。図２中の矢じりはＯｓＭＰＫ６のバンドを、＊及び＊＊はＯｓＭＰＫ６以外の他のＭＡＰキナーゼのバンドを、それぞれ示す。

【図3】図３は、変異型Ｋ９６Ｒ及び変異型Ｋ９６Ｒ／Ｔ２２５Ａ／Ｙ２２７ＤのＭＢＰ標識ＯｓＭＰＫ６を用いたリン酸化アッセイの結果（上段）並びにローディングコントロールとしてのクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の結果（下段）を示す図である。図３中、矢じりはＭＢＰ−ＯｓＭＰＫ６のバンド、＊はＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２Ｄのバンドをそれぞれ示す。

【図4】図４は、野生型（ＷＴ）、変異型Ｔ２２５Ａ及び変異型Ｙ２２７ＤのＭＢＰ標識ＯｓＭＰＫ６（ＭＢＰ-ＭＰＫ６）を用いたリン酸化アッセイの結果（上段）並びにローディングコントロールとしてのクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色（下段）の結果を示す図である。

【図5】図５は、デキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）又はｍｏｃｋ処理後のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ形質転換イネ（系統♯３及び♯１４）の抽出液を用いた、抗ｐＴＥｐＹ抗体（上段）、抗ＯｓＭＰＫ６抗体（下段）によるイムノブロットアッセイにおける経時的な変化を示す図である。

【図6】図６は、デキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）又はｍｏｃｋ処理後のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ形質転換イネ（系統♯３及び♯１４）における、ＷＲＫＹ４５転写レベル（ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：３回の測定値の平均及び標準偏差）の経時的な変化を示す図である。

【図7】図７は、デキサメタゾン処理又は未処理Ｍ．ｏｒｙｚａｅを接種したＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ（系統♯３及び♯１４）における葉身あたりの病斑数（ｎ＝１２生物学的反復：平均及び標準偏差）を示す図である。図７中、＊は、Ｐ＜０．１で有意差あり（スチューデントｔ検定）を示す。

【図8】図８は、デキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）及び／又はアブシジン酸（ＡＢＡ）処理後のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄイネ（系統♯３）における、ＭＫＫ１０−２Ｄ転写レベル、ＷＲＫＹ４５転写レベル、抗ｐＴＥｐＹ抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗リン酸化チロシン（ｐＹ）抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗リン酸化トレオニン（ｐＴ）抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗ＯｓＭＰＫ６抗体によるイムノブロットアッセイの結果それぞれを示す図であり、これらを上から順に示す。矢じりはＯｓＭＰＫ６の位置を示す。

【図9】図９は、デキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）及び／又はアブシジン酸（ＡＢＡ）処理後のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ植物（系統♯３及び♯１４）における、ＭＫＫ１０−２Ｄ転写レベル（ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：３回の測定値の平均及び標準偏差；上段）、ＷＲＫＹ４５転写レベル（ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：３回の測定値の平均及び標準偏差；下段）の結果の経時的変化を示す図である。

【図10】図１０は、デキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）及び／又はアブシジン酸（ＡＢＡ）処理後のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ植物（系統♯１４）における、抗ｐＴＥｐＹ抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗リン酸化チロシン（ｐＹ）抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗リン酸化トレオニン（ｐＴ）抗体によるイムノブロットアッセイの結果、抗ＯｓＭＰＫ６抗体によるイムノブロットアッセイの結果それぞれを示す図であり、これらを上から順に示す。矢じりはＯｓＭＰＫ６の位置を示す。

【図11】図１１は、Ｂａｙ１１−７０８２又はバナジン酸と、サリチル酸（ＳＡ）とアブシジン酸（ＡＢＡ：１００μＭ）とで処理した野生型イネにおける、ＷＲＫＹ４５転写レベル（ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：６回以上の生物学的反復の平均及び標準偏差）を示す図である。図１１中、＊＊＊は、有意差あり（Ｐ＜０．０１：スチューデントｔ検定）を示す。

【図12】図１２は、Ｂａｙ１１−７０８２又はバナジン酸と、サリチル酸（ＳＡ）とアブシジン酸（ＡＢＡ）とで処理した野生型イネにおける、ＷＲＫＹ４５転写レベル（ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：平均及び標準偏差）を示す図である。図１２中、＊は、Ｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊は、Ｐ＜０．００１で有意差あり（スチューデントｔ検定）を示す。

【図13】図１３は、ＯｓＰＴＰ１とＯｓＰＴＰ２遺伝子を同時にＲＮＡｉ法でノックダウンするためのコンストラクトＰＴＰ−ｗｋｄの構成を模式的に示す図である。

【図14】図１４は、ＯｓＰＴＰ１、ＯｓＰＴＰ２及びＡｔＰＴＰ１のアラインメントを示す図である。図１４中、ボックスは保持されているアミノ酸配列を、＊は触媒に不可欠のＣｙｓ残基を示す。

【図15】図１５は、ＡＢＡ処理下におけるＳＡ処理後のＷＴ植物及びＰＴＰ−ｗｋｄ植物における、抗ｐＴＥｐＹ抗体及び抗ＯｓＭＰＫ６抗体による各イムノブロットアッセイの結果を示す図である。

【図16】図１６は、野生型ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びＭＢＰ−ＰＴＰ２（ＷＴ）、並びに変異型ＭＰＢ−ＰＴＰ１（ＣＳ）及びＭＰＢ−ＰＴＰ２（ＣＳ）のリン酸化アッセイ（ＭＢＰ−ＭＰＫ６）の結果（上段）、ローディングコントロールとしてのクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の結果（中段）、及びＭＢＰ−ＷＲＫＹ４５のリン酸化アッセイ（ＭＢＰ−ＷＲＫＹ４５）の結果を示す図である。

【図17】図１７は、サリチル酸（ＳＡ）とアブシジン酸（ＡＢＡ）とで処理した野生型イネ（ＷＴ）及びＯｓＰＴＰ１／２ノックダウンイネ（ＰＴＰ−ｗｋｄ）における、ＷＲＫＹ４５転写レベル（上段）、ＯｓＰＴＰ１転写レベル（中段）及びＯｓＰＴＰ２転写レベル（下段）（それぞれ、ユビキチン転写レベルに対する相対レベル：３回の技術的反復の平均及び標準偏差）を示す図である。

【図18】図１８は、ＢＴＨ及び／又はＡＢＡ処理若しくは未処理のＷＴ、ＷＲＫＹ４５−過剰発現植物（Ｗ４５−ｏｘ）及びＰＴＰ−ｗｋｄ植物にＭ．Ｏｒｙｚａｅを接種した後、接種葉におけるＭ．ｏｒｙｚａｅ ２８Ｓ ｒＤＮＡの定量値を示すグラフである。それぞれ通常温度（３０℃）又は低温処理（１５℃）したイネの葉身を用いた。図１８中、＊はＰ＜０．１、＊＊は、Ｐ＜０．０５で有意差あり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００５で有意差あり（スチューデントｔ検定）をそれぞれ示す。

【図19】図１９は、植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のｃＤＮＡ配列から推定したタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。各配列の左側にｃＤＮＡが由来する植物種を示す。植物種は以下のとおりであり、かっこ内は各ｃＤＮＡデータのＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示す。Ａ ｔｈａｌｉａｎａ：シロイヌナズナ（ＡＴ１Ｇ７１８６０）、Ｇ ｍａｘ：ダイズ（ＡＪ００６３０８）、Ｐ ｓａｔｉｖｕｍ：エンドウ（ＡＪ００５５８９）、Ｐ ｖｕｌｇａｒｉｓ：インゲン（ＡＹ６０３９６５）、Ｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ：トマト（ＢＴ０１４２６４）、Ｏ ｓａｔｉｖａ ＰＴＰ１：イネ（ＡＫ１０６４４８）、Ｏ ｓａｔｉｖａ ＰＴＰ２：イネ（ＡＫ２４３００６）、Ｔ ａｅｓｔｉｖｕｍ １：コムギ（ＢＴ００９３１９）、Ｔ ａｅｓｔｉｖｕｍ ２：コムギ（ＢＴ００９６３６）、Ｚ ｍａｙｓ １：トウモロコシ（ＢＴ０４１１４５）、Ｚ ｍａｙｓ ２：トウモロコシ（ＢＴ０６５３６５）、Ｐ ａｍａｂｉｌｉｓ：コチョウラン（ＧＵ１１９９０１）。 アミノ酸配列中のアミノ酸残基は一文字記号で示す。アミノ酸配列中の「−」は、アミノ酸配列間の相同性を最大化するために挿入されたギャップを示す。Ｔ ａｅｓｔｉｖｕｍ １、Ｔ ａｅｓｔｉｖｕｍ ２、及びＺ ｍａｙｓ ２に由来するｃＤＮＡは翻訳開始コドンを含まない不完全ｃＤＮＡであり、図には各ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質部分のアミノ酸配列を示す。

【図20】図２０は、ＢＴＨ処理及び／又は２５０ｍＭ ＮａＣｌ処理又は未処理の各イネ系統（野生型イネ（日本晴；ＮＢ）とＰＴＰ−ｋｄイネ（♯３及び♯１１）にＭ．ｏｒｙｚａｅを接種した後の、いもち病抵抗性（接種葉におけるＭ．ｏｒｙｚａｅ ２８Ｓ ｒＤＮＡのユビキチン転写レベルに対する相対値）を示すグラフである。図中の結果は、３回以上の繰り返し実験の各実験結果を統計処理して算出した平均値及び標準偏差である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の植物は、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている病害抵抗性を有する植物である。

【0016】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素（プロテインチロシンフォスファターゼ、ＰＴＰアーゼ）は、リン酸化されたチロシン残基を脱リン酸化する酵素である。本発明者らが後段の実施例に示すとおり、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素は、植物における病害抵抗性の発現にかかわっている。

【0017】

図１は、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のサリチル酸経路を模式的に示した図である。サリチル酸経路においては、ＭＡＰキナーゼ（ＯｓＭＰＫ６）の活性化に伴い、ＷＲＫＹ４５がリン酸化され、自己制御によって更に発現が誘導されて病害抵抗性発現に至る。本発明者らが後段の実施例で示すとおり、低温条件（例えば１５℃以下）等の場合に、アブシジン酸（ＡＢＡ）を介してタンパク質チロシン脱リン酸化酵素（ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２）の機能発現誘導が起こり、これによりＯｓＭＰＫ６が脱リン酸化されて不活性化する。そのため、ＯｓＭＰＫ６より下流の情報伝達が停止し、言い換えればＷＲＫＹ４５に依存した病害に対する防御が起こらず、病害抵抗性が発現しない。後段の実施例に示すとおり、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素は、サリチル酸経路中のＭＡＰキナーゼ（ＯｓＭＰＫ６）を脱リン酸化して不活性化する。そのため、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性を抑制することにより、植物に病害抵抗性を与える又は高めることができる。

【0018】

本明細書において、アミノ酸残基は、３文字記号（例えば、Ｔｙｒはチロシン残基を表す）、又は１文字記号（例えば、Ｙはチロシン残基を表す）で表されることがある。

【0019】

本発明においてＯｓＰＴＰ１は、その変異体、誘導体、バリアント又はホモログを含み、以下の（Ａ１）〜（Ｃ１）を意味する：
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質；及び、
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質。

【0020】

本発明においてＯｓＰＴＰ２は、その変異体、誘導体、バリアント又はホモログを含み、以下の（Ａ２）〜（Ｃ２）を意味する：
（Ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質；及び、
（Ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質。

【0021】

配列番号１及び２のアミノ酸配列は、それぞれイネのＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２のアミノ酸配列である。よって、（Ｂ１）及び（Ｃ１）は（Ａ１）の変異体、誘導体、バリアント又はホモログを意図しており、（Ｂ２）及び（Ｃ２）は、（Ａ２）の変異体、誘導体、バリアント又はホモログを意図している。

【0022】

（Ｂ１）及び（Ｂ２）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよいアミノ酸残基数は、例えば５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内であり、好ましくは５個以内であり、より好ましくは４個以内であり、更に好ましくは３個以内であり、更により好ましくは２個以内であり、とりわけ好ましくは１個である。

【0023】

（Ｂ１）及び（Ｂ２）において、変異後のアミノ酸残基においては、変異前のアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。アミノ酸を側鎖の性質により分類すると、以下のとおりである：疎水性アミノ酸（アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）等）；親水性アミノ酸（アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）等）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）等）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）等）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）等）；カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）等）；酸含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；β位分岐側鎖を有するアミノ酸（トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）等）；及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）等）。

【0024】

（Ｃ１）及び（Ｃ２）において、アミノ酸配列の同一性は、アミノ酸配列全体又は機能発現に必要な領域で７０％以上であり、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０；５８７３，１９９３）等のアルゴリズムを用いて決定でき、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）を利用しても決定できる。ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を決定する際のパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３が例示される。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を決定する際に用いるパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２が例示される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いればよい。

【0025】

イネ以外の植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡとして、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＹ６０３９６５）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＪ００５５８９）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＪ００６３０８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＦ０５５６３５）、コチョウラン（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＧＵ１１９９０１）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＢＴ００９３１９及びＢＴ００９６３６）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＢＴ０４１１４５及びＢＴ０６５３６５）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＢＴ０１４２６４）が例示される。これらのｃＤＮＡでコードされるタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２のアミノ酸配列と高い相同性を有することから、これらのｃＤＮＡでコードされるタンパク質は、ＯｓＰＴＰ１あるいはＯｓＰＴＰ２の同祖タンパク質（Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であると考えられる（図１９）。本発明においてタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子とは、上記の植物種におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素及びそれらの同祖タンパク質をコードする遺伝子である。

【0026】

本発明において発現又は活性が抑制されるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子は、通常、内在性の（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子である。すなわち、その植物が本来有するタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子である。その植物の内在性タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子が１種である場合には、その発現又は活性が抑制されていればよい。その植物が２種以上の内在性該酵素遺伝子を有する場合には、そのうちの１種以上の発現又は活性が抑制されていればよく、全部の発現が抑制されていてもよいが、そのうちの２種以上の発現又は活性が抑制されていることが好ましい。また、植物細胞が有する１種の内在性タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の対立遺伝子（アレル）のうち、少なくとも一つのアレルの発現又は活性が抑制されていればよく、両方のアレルの発現又は活性が抑制されていることが好ましい。更に、本発明の目的に反しない限り、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子以外の遺伝子の発現及び活性が同時に抑制されていてもよい。

【0027】

本発明が対象とする植物の種類は、特に限定されず、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素を本来有する植物であればよい。植物は双子葉植物及び単子葉植物のいずれでもよく、イネ属植物（イネなど）、インゲンマメ属植物（インゲンマメなど）、エンドウ属植物（エンドウなど）、ダイズ属植物（ダイズなど）、シロイヌナズナ属植物（シロイヌナズナなど）、コチョウラン属植物（コチョウランなど）、ナス属植物（トマトなど）、オオムギ属植物（オオムギなど）、コムギ属植物（コムギなど）、トウモロコシ属植物（トウモロコシなど）、アキノノゲシ属（レタスなど）、ネギ属（ネギなど）、ホウレンソウ属（ホウレンソウなど）、ダイコン属（ダイコンなど）、アブラナ属（ハクサイ、キャベツ、ブロッコリ、カリフラワー、カブなど）、ソラマメ属（ソラマメなど）、ミツバ属（ミツバなど）、キュウリ属（キュウリ、メロンなど）、スイカ属（スイカなど）、カボチャ属（カボチャなど）が例示される。このうち、単子葉植物が好ましく、イネ属植物がより好ましく、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）がより好ましい。

【0028】

イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）は、ジャポニカ種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、インディカ種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）及びジャバニカ種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｖａｎｉｃａ）のいずれでもよい。イネは粳米でももち米でもよい。また、イネの品種、粳米ともち米との別などについても特に問わない。

【0029】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されているとは、例えば、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子が発現しないこと、通常の植物と比較して該遺伝子の発現量が低いこと、該遺伝子産物の活性が低下していることが例示される。

【0030】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現が抑制されているか否かは、本発明に係る植物における当該遺伝子のｍＲＮＡの量又は翻訳産物（タンパク質チロシン脱リン酸化酵素）の量がコントロール植物における当該遺伝子のｍＲＮＡの量又は翻訳産物の量と比較して減少しているか否かを調べることによって決定することができる。コントロール植物とは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されていない植物であり、通常は、人為的な抑制処理が加えられていない植物である。例えば、イネ（品種：日本晴）に変異を導入してなる病害抵抗性を有する植物において、コントロール植物は、変異導入前のイネ（日本晴）である。

【0031】

例えば、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現がＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法により抑制されている場合には、実施例６に記載の方法により、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現が抑制されている植物及びコントロール植物の対応する部位（例えば、葉）からそれぞれ全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、これらを鋳型とし適当なプライマーＤＮＡを用いた定量ＰＣＲ法を行うことにより、両者におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｍＲＮＡの量を比較することができる。また、試料とした全ＲＮＡの量を標準化するために、例えば、試料中の内在性ユビキチン遺伝子ｍＲＮＡの量を同様に測定して、両者におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｍＲＮＡとユビキチン遺伝子ｍＲＮＡの量比を決定し、この量比を両者におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｍＲＮＡの量的比較の指標とすることが好ましい。植物においてタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現が抑制されているというためには、当該植物における当該遺伝子ｍＲＮＡの量又は翻訳産物の量がコントロール植物における当該遺伝子ｍＲＮＡの量又は翻訳産物の量と比較して５０％から０％の範囲であればよく、当該範囲が３０％から０％であることが好ましく、当該範囲が１０％から０％であることがより好ましい。

【0032】

植物におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の翻訳産物の量を調べる方法としては、翻訳産物に特異的な抗体を用いたイムノブロットアッセイ、イライザアッセイ等が例示され、イムノブロット法がより好ましい。

【0033】

変異が導入されたタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子によってコードされたタンパク質チロシン脱リン酸化酵素の活性が抑制されているか否かは、非特許文献１１に記載の方法に準じて調べることができる。

【0034】

すなわち、ＯｓＰＴＰ１遺伝子に導入された変異について調べる場合を例示すると、以下のとおりである。配列番号３の塩基配列の１番目から９８７番目の配列をｐＭＡＬ−ｃ５ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のポリリンカーサイトに挿入して、ＯｓＰＴＰ１とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ））を発現するベクターｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（ＷＴ）を作製する。当業者によく知られた方法で、このベクター中のＯｓＰＴＰ１をコードする配列に目的とする変異（塩基置換、欠失等）を導入する。その結果、目的とする変異に起因するアミノ酸配列上の変異を有するＯｓＰＴＰ１とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ１（変異））を発現するこのベクターｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（変異）が得られる。ｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（変異）でそれぞれ形質転換した大腸菌体から当業者によく知られた方法で可溶性抽出物を得る。当該抽出物からアミロースレジンカラムを用いてＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びＭＢＰ−ＰＴＰ１（変異）をそれぞれ精製する。

【0035】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素の基質として³²Ｐ標識したカゼイン又はミエリン塩基性タンパク質を以下のように調製する。カゼイン又はミエリン塩基性タンパク質（５０マイクログラム）、³²Ｐ標識−γ−ＡＴＰ（５０マイクロキュリー）及びヒトｃ−Ｓｒｃ（２５ユニット、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製）を１００マイクロリットルの反応液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、 ０．０５ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、２５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）₂）中で３０℃、１時間反応させる。反応液を逆層カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ−１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）にロードし、カラムを０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄した後、³²Ｐ標識されたカゼイン又はミエリン塩基性タンパク質をアセトニトリルで溶出する。溶出されたタンパク質を凍結乾燥しリン酸バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、２ｍＭ ジチオスレイトール）に溶解し低温保存する。

【0036】

上記ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びＭＢＰ−ＰＴＰ１（変異）の脱リン酸化酵素活性を、³²Ｐ標識された基質タンパク質からの³²Ｐの放出を測定することによって決定する。ＭＢＰ―ＰＴＰ１（ＷＴ）又はＭＢＰ−ＰＴＰ１（変異）（５ｎｇ／ｍｌ）を含む１００マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ジチオスレイトール）に³²Ｐ標識された基質タンパク質（２ｘ１０⁴ｃｐｍ）を加え、３０℃で保温する。一定時間毎に反応液に２倍量の２５％トリフルオロ酢酸を加えて反応を止める。反応液を遠心分離して上清中の³²Ｐのカウントをシンチレーションカウンターで測定する。上清中の³²Ｐの放射活性を反応時間に対してプロットする。上清中の³²Ｐの放射活性が反応時間に比例して増加する範囲、例えば、反応開始から０分後まで、反応開始から２０分後まで、又は反応開始から３０分後までにおける上清中の³²Ｐの放射活性の増加速度から脱リン酸化反応速度を決定することができる。

【0037】

変異が導入されたタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性が抑制されたというためには、当該変異が導入されたタンパク質チロシン脱リン酸化酵素部分を含む融合タンパク質（例えば、ＭＢＰ−ＰＴＰ１（変異））による上記の方法で測定された脱リン酸化反応速度が野生型融合タンパク質（たとえば、ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ））による脱リン酸化反応速度と比較して０％から５０％の範囲であればよく、当該範囲が０％から２０％であることが好ましく、当該範囲が０％から１０％であることがより好ましく、当該範囲が０％から５％であることが更により好ましい。また、変異が導入されたタンパク質チロシン脱リン酸化酵素部分を含む融合タンパク質の酵素活性が実質的に失われていることがとりわけ好ましい。

【0038】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子とは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を意味する。本明細書中において遺伝子とは、通常、内在性の（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）遺伝子である。また、本明細書中において遺伝子とは、ポリヌクレオチド、すなわちヌクレオチドの重合体を意味する場合がある。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）又はＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）であってもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡは、特に断らない限り、２本鎖及び１本鎖のいずれでもよい。１本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡは、特に断らない限り、コード鎖（センス鎖）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖）でもよい。ポリヌクレオチドは、化学的に合成されたポリヌクレオチドであってもよい。化学的な合成方法としては、市販のポリヌクレオチド改変キット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を利用する方法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する方法が例示される。

【0039】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ１の場合、チロシン脱リン酸化酵素遺伝子としては以下の（ａ１）〜（ｅ１）が例示される：
（ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ１）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号３の塩基配列のうち１〜９８７番目の塩基配列を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ１）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号３の塩基配列のうち１〜９８７番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチド又はそのプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

【0040】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ２の場合、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子としては以下の（ａ２）〜（ｅ２）が例示される：
（ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号４の塩基配列のうち１〜７１４番目の塩基配列を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ２）配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は配列番号４の塩基配列のうち１〜７１４番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチド又はそのプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

【0041】

配列番号１及び２のアミノ酸配列は、それぞれイネのＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２のアミノ酸配列である。配列番号３の塩基配列のうち１〜９８７番目の塩基配列、及び配列番号４の塩基配列のうち１〜７１４番目の塩基配列は、それぞれイネのＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２をコードする領域の塩基配列である。よって、（ｂ１）、（ｃ１）、及び（ｅ１）は、（ａ１）の変異体、誘導体、バリアント又はホモログを意図しており、（ｂ２）、（ｃ２）、及び（ｅ２）は、（ａ２）の変異体、誘導体、バリアント又はホモログを意図している。

【0042】

（ｂ１）及び（ｂ２）における、欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよいアミノ酸残基の数、種類については前述のとおりである。（ｃ１）及び（ｃ２）における、アミノ酸配列の同一性についても前述のとおりである。

【0043】

（ｄ１）及び（ｅ１）並びに（ｄ２）及び（ｅ２）において各遺伝子を構成するコドンは、対応するアミノ酸をコードするコドンであればよい。

【0044】

（ｅ１）及び（ｅ２）において、ストリンジェントな条件とは、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件を言う。換言すれば、相同性が高い拡散同士、例えば、完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件とも言える。ストリンジェントな条件としては、以下の条件が挙げられる：６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズする条件；及び、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズする条件。当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１０ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等の文献を参照すれば、このような遺伝子を容易に取得できる。ポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ法等の方法により決定され得る。また、先述のＢＬＡＳＴ等のアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムを用いて塩基配列の同一性を解析できる。

【0045】

病害抵抗性とは、病害に対し抵抗性（抵抗力、耐性）を有すること、病害に対する抵抗性がコントロール植物より低下しにくいこと、病害における症状が生じないこと、病害における症状が生じにくいこと、病原体の増殖を阻害すること、などを意味する。本発明において病害抵抗性は、低温下（例えば１５℃以下）で植物を生育した場合の病害抵抗性を意味することが好ましく、低温下かつプラントアクチベーターの存在下で植物を生育した場合に植物に接種された病原体の増殖を阻害することを意味することがより好ましい。

【0046】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性の抑制は、通常は人為的な方法で行われる。遺伝子の発現を抑制する方法としては、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の転写の抑制、転写されたｍＲＮＡの翻訳の抑制が例示される。

【0047】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、以下が例示される：ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法、プロモーター、エンハンサー等の転写を調節する配列の挿入、削除又は変更；及び、転写を抑制するタンパク質又は化合物の遺伝子への結合。これらの方法のうち、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法が好ましい。

【0048】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法としては、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法、リボザイム法が例示される。本発明においては、これらの方法のうち、ＲＮＡｉ法が好ましい。

【0049】

ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）法では、２本鎖ＲＮＡを植物細胞に導入してＲＮＡ干渉を生じさせ、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のｍＲＮＡを分解させる。

【0050】

２本鎖ＲＮＡは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に相補的なｍＲＮＡを分解させることのできる２本鎖ＲＮＡであればよく、生体内又は細胞内でチロシン脱リン酸化酵素活性をコードする遺伝子に相補的なｍＲＮＡに結合可能なｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を発生させることができる２本鎖ＲＮＡが好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子がＯｓＰＴＰ１遺伝子である場合、２本鎖ＲＮＡは、例えば、上記の（ａ１）〜（ｅ１）から選ばれる１つのうちの一部（例えば連続した１０塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、１００塩基以上、２００塩基以上の領域）を含む塩基配列とその相補配列を含む２本鎖ＲＮＡが好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子がＯｓＰＴＰ２遺伝子である場合、２本鎖ＤＮＡは、例えば、上記の（ａ２）〜（ｅ２）から選ばれる１つのうちの一部の塩基配列とその相補配列を含む２本鎖ＲＮＡが好ましい。

【0051】

２本鎖ＲＮＡの長さの上限は通常１５塩基以上、例えば、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上である。２本鎖ＤＮＡの長さの下限は通常５００塩基以下、例えば４５０塩基以下、４００塩基以下、好ましくは３５０塩基以下、より好ましくは３００塩基以下である。

【0052】

２本鎖ＲＮＡは一部に１本鎖構造を有する遺伝子コンストラクト（カセット）でもよい。例えば、２本鎖を構成する配列との間にトリミング配列（ＧＵＳリンカー等）が配置され、トリミング配列が各鎖をつなぐ形であってもよい。また、２本鎖のそれぞれにプロモーター（ユビキチンプロモーター等）、ターミネーター（ＮＯＳ等）が連結されていてもよい。

【0053】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に対応する２本鎖ＲＮＡの製造方法としては、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を用いた鋳型ＤＮＡの両鎖同時転写による方法、市販のキットを利用する方法が例示される。

【0054】

ＲＮＡｉ法では、通常、ＲＮＡｉベクターを用いる。ＲＮＡｉベクターは、２本鎖ＤＮＡを細胞内に導入でき細胞内でｓｉＲＮＡを発生することができるものであればよく、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡの３’非翻訳配列（ｕｔｒ）の逆反復配列を含むＲＮＡを細胞内で発現させることが可能なベクター（例えば図１３のベクター）が好ましい。ＲＮＡｉベクターは市販品を用いてもよい。

【0055】

ＲＮＡｉベクターの植物細胞への導入法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法が例示される。

【0056】

アンチセンス法では、アンチセンスヌクレオチドを植物細胞内に導入して、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素をコードする遺伝子のｍＲＮＡを分解させる。

【0057】

アンチセンスヌクレオチドは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子（センス配列）の少なくとも一部に相補的なＲＮＡ配列を含んでいればよい。アンチセンスヌクレオチドは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のコード領域に相補的な塩基配列の少なくとも一部（例えば連続した１０塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、１００塩基以上、２００塩基以上の領域）を含むことが好ましく、コード領域の全部を含むことがより好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ１である場合には、前述した（ａ１）〜（ｅ１）のコード領域に相補的な塩基配列の少なくとも一部を含むことが好ましく、コード領域の全部を含むことがより好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ２である場合には、前述した（ａ２）〜（ｅ２）のコード領域に相補的な塩基配列の少なくとも一部（例えば連続した１０塩基以上、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、１００塩基以上、２００塩基以上の領域）を含むことが好ましく、コード領域の全部を含むことがより好ましい。また、アンチセンスヌクレオチドは、上記例示した塩基配列に対する同一性が例えば７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上である塩基配列を含む。

【0058】

アンチセンスヌクレオチドの長さは、５塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましい。上限は５０００塩基以下が好ましく、２５００塩基以下がより好ましく、５００塩基以下が更に好ましい。アンチセンスヌクレオチドの調製方法は特に限定されず、市販のキットを用いて設計、調製してもよい。

【0059】

アンチセンス法では、アンチセンスヌクレオチドを導入するための発現カセットを用いてもよい。発現カセットは、例えば、アンチセンスヌクレオチド（ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ、及び必要に応じて付加配列（プロモーター配列及びターミネーター配列）を含む。発現カセットを植物細胞内に導入する方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ベクター及びアグロバクテリウムを介して導入する方法が例示される。

【0060】

リボザイム法では、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の転写産物を切断するリボザイムを導入する。リボザイムは、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断できるように設計することができる。リボザイムの植物細胞への導入にあたり、必要に応じて、プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター等）、細胞内でのトリミングのためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させてもよい。これにより、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すことができる。

【0061】

共抑制法では、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の塩基配列と同一又は類似する塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入して共抑制により転写等を抑制する。導入するポリヌクレオチドは、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子、その変異体、誘導体、バリアント又はホモログが挙げられる。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ１である場合には、前述した（ａ１）〜（ｅ１）が好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ２である場合には、前述した（ａ２）〜（ｅ２）が好ましい。

【0062】

ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化法（ＲｄＤＭ法）とは、遺伝子の発現を活性化する機能を有するプロモーター配列若しくはエンハンサー配列又はそれらの一部の配列と同一の配列を有する２本鎖ＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを細胞内に導入することにより、該プロモーター配列若しくはエンハンサー配列におけるＤＮＡメチル化を誘導し、その結果該プロモーター配列若しくはエンハンサー配列に特異的に結合し得る転写活性化タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の該配列への結合を抑制することによって遺伝子の発現を抑制する方法である（Ｍｅｔｔｅ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９、５１９４−５２０１（２０００）；Ｍａｔｚｋｅ，Ｍ． ＆ Ｂｉｒｃｈｌｅ Ｊ．ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６，２４−３５（２００５））。プロモーター配列又はエンハンサー配列にＤＮＡメチル化を導入する方法としては、それらの配列又はその一部の配列（通常、数百（約２００〜３００）塩基の配列）の逆反復配列（通常、間に数百塩基のスペーサー配列を含む）を含むＲＮＡを発現させるベクターを用いて形質転換体を作製する、又は上記逆反復配列ＲＮＡを一過的に発現させる方法が例示される。

【0063】

通常、内在性遺伝子のタンパク質コード領域の５’端からその上流約１０００塩基までの領域に、プロモーター活性を有する配列が含まれている。従って、一例として、ＲｄＤＭ法によりＯｓＰＴＰ１遺伝子又はＯｓＰＴＰ２遺伝子の上記プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を誘導しこれらの遺伝子の発現を抑制する方法としては、これらの遺伝子のタンパク質コード領域の５’端からその上流約１０００塩基までの配列（例えば、配列番号５の１〜１０００番目及び配列番号６の１〜９８３番目の塩基配列）又はその一部の配列を含む逆反復ＲＮＡを細胞内に導入する方法が挙げられる。前記逆反復ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターは、ＲＮＡｉベクターの場合と同様の方法で作製することができる。各植物種のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列が開示されている。従って、当業者であれば当業者に良く知られた方法を用いて、それらの配列又はその一部の配列をプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること、あるいはｃＤＮＡの塩基配列を元にして作製したＰＣＲプライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型としたインバースＰＣＲを行うことによりそれぞれの植物種のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子を得て、その塩基配列を決定することによりそれぞれの遺伝子のプロモーター配列を得ることができる。そのような配列を用いたＲｄＤＭ法によりそれぞれの植物におけるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現を抑制することができる。

【0064】

ＲｄＤＭ法により誘導されたＤＮＡメチル化は、ＤＮＡメチル化を誘導する２本鎖ＲＮＡ又はそれを発現する２本鎖ＲＮＡ発現ベクターが植物体に存在しなくとも維持され後代の植物体に伝達する（Ｍｅｔｔｅ，Ｍ．Ｆ．ら Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９、５１９４−５２０１（２０００）；Ｍａｔｚｋｅ，Ｍ． ＆ Ｂｉｒｃｈｌｅｒ Ｊ．ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６，２４−３５（２００５））。従ってＲｄＤＭ法によりタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現が抑制された植物体を野生型の植物体と交配させ、ＲｄＤＭ法によりタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現が抑制された植物体由来のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の対立遺伝子（アレル）を有し、ＲｄＤＭ法に用いた逆反復ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターをゲノム内に含まない植物体を得ることにより、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現は抑制されているが、外来性遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅｓ）を含まない植物体を得ることができる。

【0065】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現を抑制する方法は、ＲＮＡｉ法、アンチセンス法、共抑制法又はＲｄＤＭ法であることが好ましく、ＲＮＡｉ法又はＲｄＤＭ法であることがより好ましい。

【0066】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性を抑制する方法としては、以下の方法が例示される：タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に１又は複数の変異を導入する方法；該遺伝子産物、すなわちタンパク質チロシン脱リン酸化酵素に結合する化合物（タンパク質、アミノ酸等）を作用させる方法、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換する方法が例示される。

【0067】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子への変異導入としては、該遺伝子を構成する塩基の置換、欠失、挿入及び付加からなる群より選ばれる１以上の変化が例示される。塩基の置換、欠失、挿入及び付加の導入方法としては、高エネルギーの電磁波（放射線、紫外線等）照射、変異原性化学物質（ニトロソ化合物（例えば、ニトロソグアニジン）、塩基類似化合物（例えば、ＢｒｄＵ化合物）、アルキル化剤（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）、多環芳香族炭化水素（例えば、ベンゾピレン、クリセン）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、臭化エチジウム）、ＤＮＡ架橋剤（例えば、シスプラチン、マイトマイシンＣ）、活性酸素）による処理によってゲノムＤＮＡにランダム変異を導入する方法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）（特表２０１２−５１４９７６号公報、特表２０１３−５１３３８９号公報）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（特許第４３５０９０７号公報、特許第４５５５２９２号公報）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｊｉｎｅｋら、Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｍａｌｉら、ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３））に例示される部位特異的ＤＮＡ分解酵素を用いて部位特異的に変異を導入する方法、トランスポゾンの導入による方法が例示され、高エネルギー照射等によるランダム変異導入法又は部位特異的ＤＮＡ分解酵素を用いた方法が好ましい。

【0068】

部位特異的突然変異による方法において、変異（例えば置換）導入部位は、変異導入後に遺伝子がコードするタンパク質チロシン脱リン酸化酵素の活性が抑制される部位であればよく、変異導入後に遺伝子がコードするタンパク質チロシン脱リン酸化酵素の活性が消失する部位であることがより好ましい。このような変異の部位としてはタンパク質コード領域内の部位、ＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基に相当するシステイン残基及び／又は、ＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸残基に相当するアスパラギン残基を少なくとも含む部位が例示される。導入される変異の数は１以上であればよい。上限は通常、例えば５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内であり、好ましくは５個以内であり、より好ましくは４個以内であり、更に好ましくは３個以内であり、更により好ましくは２個以内であり、とりわけ好ましくは１個である。導入される変異としては、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異が例示され、このうち、フレームシフト変異又はナンセンス変異が好ましい。

【0069】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に変異を導入することによってタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性が抑制された植物を作製するための好ましい方法として以下の方法が例示できる。しかし、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に変異を導入することによって内在性タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性が抑制された植物を作製するための方法はこれらに限定されない。なお、以下本明細書において、植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素における、ＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基に相当するシステイン残基及びＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸残基に相当するアスパラギン酸残基をそれぞれ「酵素活性に関与するシステイン残基」及び「酵素活性に関与するアスパラギン酸残基」と呼ぶことがある：
（１）植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子における、酵素活性に関与するシステイン残基又は酵素活性に関与するアスパラギン酸残基をコードする配列（コドン）を少なくとも含むＤＮＡ配列を欠失させることによって、該内在性タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性が大幅に抑制された植物体を作製することができる；
（２）植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に対して、該遺伝子中の酵素活性に関与するシステイン残基又は酵素活性に関与するアスパラギン酸残基をコードする配列（コドン）における塩基置換であって、塩基置換の結果タンパク質においてアミノ酸置換が生じることとなるような変異を導入することによって、該遺伝子の活性が大幅に抑制された植物体を作製することができる；
（３）植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に対して、遺伝子のタンパク質コード領域内における変異であって、遺伝子によってコードされるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ末端から酵素活性に関与するシステイン残基までのアミノ酸配列をコードする領域におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異を導入することによって、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性が大幅に抑制された植物体を作製することができる；
（４）多くの植物種のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ酸配列は高い相同性を有しており、酵素活性に関与するシステイン残基又は酵素活性に関与するアスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基も当該酵素の酵素活性にとって重要であることが推測される。従って、それらのアミノ酸残基の置換又は欠失を生じさせることとなる変異によってもタンパク質チロシン脱リン酸化酵素の活性を抑制することができる。
上記（１）乃至（３）の方法により、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素に含まれるアミノ酸残基であって、ＯｓＰＴＰ１の２５８番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、及び／又はＯｓＰＴＰ２の１６６番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、をコードする、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のコドンの変異を導入することができる。

【0070】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の目的とする部位における変異は、例えば、ＴＡＬＥＮ（特表２０１２−５１４９７６号公報、特表２０１３−５１３３８９号公報）、Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）（Ｊｉｎｅｋら、Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｍａｌｉら、ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３））、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（特許第４３５０９０７号公報、特許第４５５５２９２号公報）で例示される部位特異的ＤＮＡ分解酵素を植物細胞内に導入し、それらの部位特異的ＤＮＡ分解酵素によってタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子内の目的とする位置にＤＮＡの二重鎖切断を起こさせることによって導入することができる。該二重鎖切断が修復される結果、比較的高い確率で該切断部位又はその近傍で塩基置換、塩基の欠失又は塩基の挿入が起こるからである。

【0071】

ＴＡＬＥＮは、Ｎ末端側から核移行シグナル配列、通常１４から２０塩基の長さの塩基配列を有するＤＮＡに配列特異的に結合するｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｐｅａｔｓ（ＴＡＬＥリピート）と呼ばれる領域、及び制限酵素Ｆｏｋ１に由来するＤＮＡ分解酵素領域からなるタンパク質である。通常、変異を導入しようとする目的部位の両側のゲノム配列中に第一の認識配列及び第二の認識配列を設定する。第一の認識配列及び第二の認識配列の長さは通常それぞれ１４塩基から２０塩基である。また第一の認識配列と第二の認識配列との間の距離は通常１４から１８塩基である。第一の認識配列及び第二の認識配列にそれぞれ特異的に結合する活性を有する第一及び第二のＴＡＬＥＮをともに植物細胞内に導入することにより、第一のＴＡＬＥＮ及び第二のＴＡＬＥＮがそれぞれ第一の認識配列及び第二の認識配列に特異的に結合し、その結果第一の認識配列と第二の認識配列の間でＤＮＡの二重鎖切断が起こる。これにより前記部位に塩基置換、塩基の欠失又は挿入を導入することができる（特表２０１２−５１４９７６号公報；特表２０１３−５１３３８９号公報；Ｗｅｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４０、２８１−２８９（２０１３）； Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １６１、２０−２７（２０１３））。第一及び第二の認識配列は基本的に配列上の制限なく設定することができるので、ＴＡＬＥＮによってゲノムＤＮＡ上の任意の位置でＤＮＡの二重鎖切断を起こすことが可能である。通常、ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ切断は、ＴＡＬＥＮが有する高い配列特異性のためゲノムＤＮＡ中の一カ所のみで起こる。また、設定された第一又は第二の認識配列に特異的に結合する活性を有するＴＡＬＥリピートは公知の方法（特表２０１２−５１４９７６号公報；特表２０１３−５１３３８９号公報）に基づいて設計することができ、当業者であれば当該設計されたＴＡＬＥリピートを有するＴＡＬＥＮを発現するベクターを当業者によく知られた技術を用いて作製することができる。現在、日本においては和光純薬工業株式会社及びライフテクノロジーズジャパン株式会社その他がＴＡＬＥＮの製造受託サービスを提供しており、これらの企業に第一の及び第二の認識配列にそれぞれ特異的に結合する第一及び第二のＴＡＬＥＮの作製を委託することもできる。

【0072】

ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮと同様に特定の配列を有するＤＮＡに特異的に結合する活性を有するジンクフィンガー領域と呼ばれる領域及び制限酵素Ｆｏｋ１に由来するＤＮＡ分解酵素領域を含むタンパク質である（特許第４３５０９０７号公報、特許第４５５５２９２号公報）。ＴＡＬＥＮの場合と同様に、通常は第一の認識配列に特異的に結合する第一のジンクフィンガーヌクレアーゼ及び第二の認識配列に特異的に結合する活性を有する第二のジンクフィンガーヌクレアーゼをともに植物細胞に導入することによってゲノムＤＮＡ上の目的とする部位に変異を導入することができる。

【0073】

ＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーを植物細胞に導入するための方法としては、通常はこれらのタンパク質を植物細胞内で発現する発現ベクターで植物細胞を形質転換する方法が用いられるが、これらタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ又はこれらタンパク質自体を細胞に注入することによりＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーを植物細胞に導入することも可能である。

【0074】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いる方法とは、通常、ゲノムＤＮＡ上の変異を導入しようとする位置の５’側に２０塩基の長さの配列を設定し、この配列に相補的な配列を有するガイドＲＮＡを発現する発現ベクター及びバクテリア由来のＤＮＡ分解酵素であるＣａｓ９に核移行シグナルを付加したタンパク質を発現する発現ベクターをともに植物細胞内に導入することによって、ガイドＲＮＡとＣａｓ９との複合体を上記認識配列に特異的に結合させることにより、上記認識配列の３’端付近にＤＮＡ二重鎖切断を起こさせる方法である（Ｊｉｎｅｋら、Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）；Ｍａｌｉら、ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３））。この方法によりＴＡＬＥＮを用いた場合と同様にゲノムＤＮＡの切断部位付近に変異が導入される。

【0075】

従って、例えば、ＴＡＬＥＮ等の部位特異的ＤＮＡ分解酵素を用いて植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に対して、該遺伝子のタンパク質コード領域内における変異であって、該遺伝子によってコードされるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ末端から酵素活性に関与するシステイン残基までのアミノ酸配列をコードする領域におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異を導入するためには、ゲノムＤＮＡ上の該遺伝子によってコードされるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ末端から酵素活性に関与するシステイン残基までのアミノ酸配列をコードする領域内でＤＮＡが部位特異的に切断されるように設計されたＴＡＬＥＮを植物細胞又は植物体に導入した後に、ＤＮＡ切断の修復の際に生じた切断部位又はその近傍での塩基置換、塩基の欠失又は挿入の結果であるナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する植物細胞又は植物体を選抜すればよい。

【0076】

これまでに、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）についてＴＡＬＥＮを用いた内在性遺伝子の改変が報告されている（Ｃｈｅｎ Ｋ．ら、ＴＡＬＥＮｓ：Ｃｕｓｔａｍｉｚａｂｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｓｃｉｓｓｏｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４０，２７１−２７９（２０１３））。これまでに、シロイヌナズナ、ダイズ、タバコ、トウモロコシについてジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた内在性遺伝子の改変が報告されている。（シロイヌナズナ及びダイズについては、Ｓａｎｄｅｒ Ｊ．ら、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７−６９（２０１１）；タバコについては、Ｍａｅｄｅｒ Ｍ．ら、Ｒａｐｉｄ “ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ” ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｕｓｔａｍｉｚｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ３１、２９４−３０１（２００８）；トウモロコシについては、Ｓｈｕｋｌａ，Ｖ．ら、Ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒｏｐ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚｅａ ｍａｙｓ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４５９，４３７−４４１（２００９））。従って、本発明においてＴＡＬＥＮを利用する場合、これらの文献に記載の条件を適用してもよい。

【0077】

また、ゲノム上の特定の部位、例えば、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子内の特定の部位、に変異を有する植物を得る方法として、高エネルギー電磁波の照射又は変異原性物質処理により植物のゲノムＤＮＡにランダム変異を導入した後に、当該特定の部位に変異を有する植物個体を選抜する方法が挙げられる。当該特定の部位に変異を有する植物個体を選抜するためには、まず、突然変異誘起処理を受けた複数の植物個体から当業者によく知られた方法に従ってそれぞれのゲノムＤＮＡを抽出し、それを鋳型として当該特定の部位の配列を含むＤＮＡをＰＣＲで増幅する。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡにおける変異の有無は、例えば、それら増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定することによって調べることができる。あるいは、セロリ由来のＣｅｌＩヌクレアーゼを用いたＴＩＬＬＩＮＧ法（特許第４２１３２１４号公報）によって変異を迅速に検出することができる。

【0078】

これまでに、シロイヌナズナ、エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、カンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、メロン、ダイズ、オオムギ、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、イネ、トマト、ソルガム、コムギ等において、ランダム変異を導入された植物体集団の作製及びそれらについてのＴＩＬＬＩＮＧ法を用いた変異体選抜が行われており、その結果内在性遺伝子に変異を有する多くの変異体植物が得られている（Ｋｕｒｏｗａｋａ，Ｍ．ら、ＴＩＬＬＩＮＧ−ａ ｓｈｏｒｔｃｕｔ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５２，３７１−３９０（２０１１））。

【0079】

このようにして得られた、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に変異を有する植物と野生型植物とを交配して、その後代植物であってタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に変異を有する植物を選抜しそれを更に野生型植物と交配することを繰り返すことによって、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子に変異を有するがそれ以外のゲノム領域のＤＮＡ配列が野生型植物由来である植物を作製することができる。

【0080】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ１の場合には、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から２５８番目、中でも２２８〜２５８番目に含まれる１以上の残基（例えば、２２８番目、２３４番目、２５８番目の残基）に変異が導入されることが好ましい。また、少なくとも２２８番目のアスパラギン酸残基及び／又は２５８番目のシステイン残基に変異が導入されることが好ましく、少なくとも２５８番目のシステイン残基に変異が導入されることがより好ましく、少なくとも２２８番目のアスパラギン酸残基及び／又は２５８番目のシステイン残基が他の残基（例えばそれぞれ、アスパラギン酸残基、セリン残基）に置換されることがより好ましく、少なくとも２５８番目のシステイン残基が他の残基（例えば、セリン残基）に置換されることが更により好ましい。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ２の場合には、配列番号２のアミノ酸配列の１番目〜１６６番目、中でも１３６〜１６６番目に含まれる１以上の残基に変異（例えば、１３６番目、１６６番目の残基）が導入されることが好ましい。また、少なくとも１３６番目のアスパラギン酸残基及び／又は１６６番目のシステイン残基に変異が導入されることが好ましく、１６６番目のシステイン残基に変異が導入されることがより好ましく、少なくとも１３６番目のアスパラギン酸残基及び／又は１６６番目のシステイン残基が他の残基（例えば、それぞれアラニン残基、セリン残基）に置換されることがより好ましく、１６６番目のシステイン残基が他の残基（例えば、セリン残基）に置換されることが更により好ましい。なお、上記記載にて好ましい変異導入部位のＣ末端を配列番号２の１６６番目としているのは、ＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン（ＯｓＰＴＰ１では２５８番目）を変異させると活性が失われることに基づいている。同様に変異導入部位のＣ末端を配列番号２の１３６番目としているのは、ＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸（ＯｓＰＴＰ１では２２８番目）に対応していることに基づいている。

【0081】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素がＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２以外の酵素であっても、その酵素に含まれるアミノ酸残基であって、ＯｓＰＴＰ１の２５８番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、及び／又はＯｓＰＴＰ２の１６６番目のシステイン残基に相当するシステイン残基、をコードする、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のコドンの変異（例えば、それぞれセリン残基への変異）を少なくとも含む変異が導入されることも好ましい。また、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の、タンパク質コード領域のアミノ末端からＯｓＰＴＰ１の２５８番目のシステイン残基及び／又はＯｓＰＴＰ２の１６６番目のシステイン残基に相当するシステイン残基までをコードする領域内における変異が導入されることが好ましい。

【0082】

タンパク質チロシン脱リン酸化酵素に結合する化合物としては、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素に特異的に結合する化合物が例示され、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、該抗体の一部（例えば、可変領域）が好ましい。

【0083】

プラントアクチベーターは、植物の免疫力を高め、耐病性を向上させる物質を意味する。本発明においてプラントアクチベーターは、ＭＡＰキナーゼの活性化にかかわるものが好ましく、ＭＡＰキナーゼ６の活性化にかかわるものがより好ましく、サリチル酸と共にＭＡＰキナーゼキナーゼを活性化することにより間接的にＭＡＰキナーゼ６の活性化にかかわるもの及びサリチル酸経路を活性化することによりサリチル酸の活性化によるＭＡＰキナーゼキナーゼの活性化を介して間接的にＭＡＰキナーゼ６の活性化にかかわるものがより好ましい。このようなプラントアクチベーターとしては、ベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）、プロベナゾール（ＰＢＺ）、バリダマイシンＡ（ＶＭＡ）、バリドキシルアミンＡ（ＶＡＡ）、チアジニル、イソチアニルが例示される。

【0084】

病害の原因因子は特に限定されないが、原因因子としては、糸状菌、細菌、ウイルスが例示される。糸状菌としては、藻菌（鞭毛菌、接合菌等）、不完全菌、子のう菌、担子菌等が例示される。糸状菌類の病害における病態としては、黒色の粒（菌核（菌糸の塊））形成、病斑形成、茎葉の腐敗、立ち枯れ、コブ形成が挙げられる。イネにおける糸状菌類の病害としては、いもち病、褐色米病、褐色菌核病、黄化萎縮病、褐色葉枯れ病、シナモン色かび病、小球菌核病、墨黒穂病、赤色菌核病が例示される。細菌類の病害としては、輪郭が黄色く変色しやや不鮮明な病斑の形成、茎葉の腐敗、立ち枯れ、がんしゅ状の腫瘍形成が例示される。イネにおける細菌による病害としては、べと病、褐条病、白葉枯病、内穎褐変病、もみ枯細菌病、苗立枯細菌病が例示される。ウイルスによる病害としては、モザイク症状（花又は葉に発生する淡い斑模様）、奇形化（萎縮、変形等）、小さい褐色の壊疽反転、生育阻害（株全体の黄色化及び小型化）が例示される。イネにおけるウイルスによる病害としては、黒条萎縮病、トランジトリーイエローイング病、わい化病が例示される。

【0085】

本発明において対象となる病害は、糸状菌による病害及び細菌による病害が好ましく、いもち病、べと病、うどんこ病、さび病がより好ましく、いもち病がより好ましい。本発明において対象となる病害は、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。

【0086】

本発明の病害抵抗性植物は、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性の抑制処理がなされた植物自体（第１世代）であってもよいが、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている限り、その第２世代以降の子孫であってもよい。

【0087】

本発明の植物は、その植物体全体であってもよいし、一部又は加工品であってもよい。植物の一部としては、器官（例えば、根、茎、葉、花、種子、果実）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、毛状根）、細胞、細胞の一部（例えば、プロトプラスト）、培養細胞及び組織（例えば、カルス、苗条原基、シュート、多芽体）が例示される。植物の加工品は、通常は食用の加工品及び飼料用の加工品であり、種子の加工品であることが好ましい。コメの加工品としては、炊飯米、お粥、炒飯、米粉、白玉粉、菓子（せんべい、あられ、クッキー等）、酒、酢、油、米ぬかが例示される。

【0088】

本発明によれば、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性抑制剤を有効成分として含む病害抵抗性付与組成物が提供される。これにより、植物に病害抵抗性を効率的に付与することができる。タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性抑制剤の成分は、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は機能を抑制できればよく、特に限定されないが、ＲＮＡ干渉を起こす核酸（タンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はこれを含む２本鎖ＲＮＡ）、変異導入用キット、リボザイム、アンチセンスヌクレオチド等のヌクレオチド、抗体等のタンパク質が例示され、ｓｉＲＮＡが好ましい。病害抵抗性付与組成物において、有効成分以外の成分は特に限定されず、例えば、上記発現又は活性抑制剤が植物においてその機能を発揮するための担体（基剤）が挙げられ、具体的には、保存剤、安定剤、賦形剤、緩衝剤、溶媒、着色剤、結合剤が例示される。

【0089】

本発明によれば、植物に含まれる１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性を抑制することにより、植物に病害抵抗性を付与することができる。該酵素遺伝子の発現又は活性を抑制する方法は、通常は人為的な方法であり、その例及び好ましい例については、先述した通りである。

【0090】

本発明においては、植物に含まれる１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は機能を抑制することにより、病害抵抗性を有する植物を生産することができる。本発明の生産方法においては、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性を抑制する処理を行った植物細胞（例えば、カルス）又は植物組織を得ること、該植物細胞から植物体を再生させる方法が例示される。該酵素遺伝子の発現又は活性を抑制する処理は、通常は人為的な処理であり、その例及び好ましい例は、遺伝子の発現又は活性を抑制する方法について前述したとおりである。

【0091】

本発明において、病害抵抗性を有する植物の育成条件は、特に限定されないので、通常の植物の育成と同様とすればよいが、プラントアクチベーター処理を行うことが好ましい。これにより、サリチル酸経路におけるＷＲＫＹ４５の転写が促進され、病害抵抗性を向上させることができる。また、温度条件が低温であることが好ましい。本発明の病害抵抗性植物は、通常の植物で生じるような、サリチル酸経路における低温等の環境条件に起因するＭＡＰキナーゼ活性化阻害が抑制されているため、本発明の目的が十分に発揮されるためである。本発明によれば、上記生産方法又は育成方法により、植物自体だけでなくその子孫又はクローンを得ることができ、その子孫及びクローンも、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されている、病害抵抗性を有する植物として利用することができる。

【0092】

本発明においては、植物に含まれている１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が抑制されているか否かを判定することにより、病害抵抗性植物を選抜することができる。すなわち、サンプルである植物中において、１種以上のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現又は活性が、コントロール植物と比較して抑制されている場合にはその植物を病害抵抗性を有する植物として選抜することができる。これにより、病害抵抗性を有する植物を容易に選抜でき、農業生産を効率化することができる。

【実施例】

【0093】

本発明を実施例により具体的に説明する。実施例において用いた材料及び手法の説明は、後段にまとめて記載した。

【0094】

実施例１〔ＭＡＰキナーゼによるサリチル酸経路の調節〕
イネにおいて、イネＭＡＰキナーゼ６（ＯｓＭＰＫ６）のリン酸化がサリチル酸（ＳＡ）シグナル伝達に介在することを、以下の試験にて確認した。

【0095】

（１Ａ）イネにおける内在性ＯｓＭＰＫ６のＳＡ応答性リン酸化を解明するため、以下の試験を行った。イネカルス及び葉を１ｍＭ ＳＡで処理し、２箇所リン酸化された（ｄｏｕｂｌｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ＴＥＹモチーフを有するタンパク質及びＯｓＭＰＫ６を有するタンパク質が、それぞれ抗ｐＴＥｐＹ抗体及び抗ＯｓＭＰＫ６抗体により検出された。抗ｐＴＥｐＹ抗体はリン酸化に特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、二重リン酸化された（ｄｕａｌｌｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ）ＴＥＹシグネチャー配列を認識する。

【0096】

複数のバンドのうちの１つ（図２の矢じり）はＯｓＭＰＫ６を表していた。その理由は、ｏｓｍｐｋ６遺伝子変異体ではそのバンドが見られず、また抗ＯｓＭＰＫ６抗体がそれと同じ移動度（電気泳動において）のバンドを検出するためである。（１Ａ）の結果は、ＳＡがＯｓＭＰＫ６のリン酸化を誘導することを示している。

【0097】

図２においてより早く移動したバンド（図２の＊及び＊＊）は、別の二重リン酸化ＭＡＰＫと推定され、このバンドはｏｓｍｐｋ６遺伝子変異カルスに存在していた。このことは、ＯｓＭＰＫ６の喪失を補填するメカニズムを示唆している。

【0098】

（１Ｂ）イネのＭＡＰＫキナーゼ類の１種であるイネＭＡＰキナーゼキナーゼ１０−２（ＯｓＭＫＫ１０−２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＯｓＭＰＫ６をリン酸化し活性化する。そこで、ＯｓＭＫＫ１０−２がＯｓＭＰＫ６のどのサイトをリン酸化するのかを調べた。

【0099】

マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）標識ＯｓＭＰＫ６（ＭＢＰ−ＭＰＫ６）を有するＷＴ、ＭＢＰ−ＭＰＫ６のキナーゼ活性喪失型（ｋｉｎａｓｅ ｄｅａｄ ｆｏｒｍ）を有する変異型Ｋ９６Ｒ、他の変異型Ｙ２２７Ｄ及びＴ２２５Ａ、並びに３つの変異を有する変異型Ｋ９６Ｒ／Ｙ２２７Ｄ／Ｔ２２５Ａを調製し、それぞれをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ標識ＯｓＭＫＫ１０−２（ＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２Ｄ）の構成的活性化型（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）で処理して、それぞれのリン酸化の有無を確認した。Ｋ９６Ｒは、ＭＢＰ−ＭＰＫ６のＬｙｓ⁹⁶がＡｒｇに置換されている変異型である。Ｙ２２７Ｄ及びＴ２２５Ａは、それぞれ、ＭＢＰ−ＭＰＫ６のＴｈｒ²²⁵及びＴｙｒ²²⁷がそれぞれＡｓｐに置換されている変異型である。Ｋ９６Ｒ／Ｙ２２７Ｄ／Ｔ２２５Ａは、ＭＢＰ−ＭＰＫ６のＬｙｓ⁹⁶がＡｒｇに、Ｔｈｒ²²⁵がＡｓｐに、Ｔｙｒ²²⁷がＡｓｐに置換されている変異型である。

【0100】

その結果、ＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２Ｄの構成的活性化型は、ＭＢＰ−ＭＰＫ６（ＷＴ）、Ｋ９６Ｒ、Ｙ２２７Ｄ及びＴ２２５Ａをリン酸化したが（図３及び４）、Ｔｈｒ²²⁵及びＴｙｒ²²⁷の両方が置換されている変異型Ｋ９６Ｒ／Ｙ２２７Ｄ／Ｔ２２５Ａをリン酸化しなかった（図３）。（１Ｂ）の結果は、ＯｓＭＫＫ１０−２がＯｓＭＰＫ６中のＴＥＹシグネチャーを二重リン酸化するが、その他のサイトをリン酸化してはいないことを示している。

【0101】

（１Ｃ）ＯｓＭＫＫ１０−２Ｄが、ＴＥＹモチーフをリン酸化するか否かを確認するため、以下の試験を行った。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）によりＯｓＭＫＫ１０−２Ｄが誘導され得る遺伝子導入植物（ＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ）を作出した。ＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄの２つの独立した系統（♯３及び♯１４）をそれぞれＤｅｘで処理し、抗ｐＴＥｐＹ抗体及び抗ＯｓＭＰＫ６抗体によるイムノブロットによりそれぞれのタンパク質を特定した。図５において「ｍｏｃｋ」は、Ｄｅｘ処理を行わない他は同様の処理を行った植物からの抽出液での結果を示した。葉において、リン酸化されたＯｓＭＰＫ６タンパク質の量は、Ｄｅｘ処理の間増加した（図５）。

【0102】

（１Ｄ）続いて、ＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ植物（系統♯３及び♯１４）をＤｅｘ処理又はｍｏｃｋ処理し、ＷＲＫＹ４５転写レベルのユビキチン転写レベルに対する相対レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した。ＷＲＫＹ４５の転写レベルは、リン酸化されたＯｓＭＰＫ６タンパク質の量に並行して増加した（図６）。なお、２つの独立した実験において同じ結果が得られた。

【0103】

（１Ｃ）及び（１Ｄ）の結果は、ＯｓＭＫＫ１０−２Ｄは、ＴＥＹモチーフをリン酸化しＯｓＭＰＫ６を活性化するとともに、ＷＲＫＹ４５を活性化することを示している。

【0104】

（１Ｅ）Ｄｅｘ前処理済みの又はＤｅｘ前処理を行わないＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ植物に、Ｍ．ｏｒｙｚａｅを接種した。その結果、Ｄｅｘ処理ＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄ植物は、コントロール植物よりも強いいもち病抵抗性を示した（図７）。（１Ｅ）の結果は、ＯｓＭＫＫ１０−２Ｄ発現がいもち病抵抗性を誘導することを示している。

【0105】

ＯｓＭＰＫ６はＷＲＫＹ４５をリン酸化することから、（１Ａ）〜（１Ｅ）の結果は、ＯｓＭＫＫ１０−２ＤによるＯｓＭＰＫ６のリン酸化／活性化がＳＡ経路の活性化を模倣して同等の効果を有することを示唆し、ＷＲＫＹ４５依存性防御応答の活性化を導くことを示している。

【0106】

実施例２〔タンパク質チロシン脱リン酸化酵素によるサリチル酸経路の調節〕
アブシジン酸（ＡＢＡ）に対する応答において、タンパク質チロシン脱リン酸化酵素１（ＯｓＰＴＰ１）及びタンパク質チロシン脱リン酸化酵素２（ＯｓＰＴＰ２）がＯｓＭＰＫ６を脱リン酸化することを以下の試験にて確認した。

【0107】

（２Ａ）ＯｓＭＰＫ６のリン酸化におけるＡＢＡの影響を検証するため、１０μＭ ＡＢＡの前処理を行った又は未処理のＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄイネ植物体（系統♯３）を１０μＭ Ｄｅｘで処理した。ＭＫＫ１０−２ＤとＷＲＫＹ４５の転写レベル（ユビキチンの転写レベルに対する相対値）をＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。ＯｓＭＰＫ６のリン酸化状態におけるＡＢＡの効果を更に調べるため、Ｔｈｒ及びＴｙｒのリン酸化を、それぞれのリン酸化されたアミノ酸に対する特異抗体（抗リン酸化Ｔｈｒ抗体及び抗リン酸化Ｔｙｒ抗体）をそれぞれ用いて、分析した。

【0108】

二重リン酸化はＡＢＡの存在下でほとんど消滅し、同時にＷＲＫＹ４５の転写レベルも減少した（図８〜１０）。このことは、ＡＢＡがＳＡ応答性ＯｓＭＰＫ６リン酸化に拮抗することを示唆している。また、リン酸化チロシン残基は減少するがリン酸化トレオニン残基は減少しないことが分かった（図８及び図１０）。

【0109】

（２Ａ）の結果より、ＡＢＡ処理によりＯｓＭＫＫ１０−２Ｄ誘導性ＷＲＫＹ４５転写とＴＥＹリン酸化が減少することが明らかである。

【0110】

（２Ｂ）ＷＴイネ植物を、５０μＭ Ｂａｙ１１−７０８２の存在下又は非存在下で、又は２ｍＭ バナジン酸の存在下又は非存在下で、１ｍＭ ＳＡと３０又は１００μＭ ＡＢＡとで処理した。

【0111】

ＰＴＰアーゼインヒビターであるバナジン酸とＢａｙ１１−７０８２（Ｎ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｇ．Ｂｅｎｃｚｅ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｋ．Ｔｏｎｋｓ，ＦＥＢＳ Ｊ，（２０１３）．参照）は、ＷＲＫＹ４５発現のＡＢＡ応答性抑制を打ち消した（図１１及び１２）。（２Ｂ）の結果は、ＡＢＡ処理によるＯｓＭＫＫ１０−２Ｄ誘導性ＷＲＫＹ４５転写抑制にＰＴＰアーゼがかかわっていることを示唆している。

【0112】

（２Ａ）〜（２Ｂ）の結果を総合すると、ＰＴＰアーゼによるＯｓＭＰＫ６のチロシン脱リン酸化が、ＡＢＡによるＳＡシグナル伝達の抑制にかかわっていることを示唆している。

【0113】

実施例３〔ＲＮＡ干渉によるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の発現抑制〕
ＡＢＡにより誘導されるＷＲＫＹ４５防御応答の抑制が、ＯｓＰＴＰ１／２のＲＮＡによるノックダウンにより緩和されるかどうかを調べた。

【0114】

（２Ｃ）イネゲノムは、２つの推定されるＰＴＰａｓｅであるＯｓＰＴＰ１（Ｒｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＡＰ Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）におけるＯｓ１２ｇ０１７４８００、ＭＳＵ Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ａｎａｌｙｓｅｓ＿ｓｅａｒｃｈ＿ｌｏｃｕｓ．ｓｈｔｍｌ）におけるＬＯＣ＿Ｏｓ１２ｇ０７５９０）及びＯｓＰＴＰ２（ＬＯＣ＿Ｏｓ１１ｇ０７８５０．１）をコードする。ＡＢＡが引き起こすＯｓＭＰＫ６の脱リン酸化におけるそれらの機能を調べるため、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２の両遺伝子がＲＮＡ干渉によりノックダウン（ＯｓＰＴＰ１／２ダブルノックダウン）されている遺伝子導入イネを作製すべく、以下の条件にて遺伝子コンストラクトＰＴＰ−ｗｋｄを作製した（図１３）。ＯｓＰＴＰ１遺伝子の３’非翻訳領域のＤＮＡ配列をｕ７ プライマー（５’−ＣＡＣＣＣＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＧＡ−３’：配列番号７）及びｕ８プライマー（５’−ＡＡＡＴＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＣＣＧＴ−３’：配列番号８）、ＯｓＰＴＰ２遺伝子の３’非翻訳領域のＤＮＡ配列を、ｕ９プライマー（５’−ＴＴＡＧＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＧＴ−３’：配列番号９）及びｕ１０プライマー（５’−ＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１０）を用いて、それぞれＰＣＲ増幅した。次に、これら二つの反応生成物を混合し、ｕ７及びｕ１０プライマーを用いて更にＰＣＲ増幅してＯｓＰＴＰ１遺伝子とＯｓＰＴＰ２遺伝子の３’非翻訳領域が融合したＤＮＡ断片を得た後、これらをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯを経てｐＡＮＤＡ ｖｅｃｔｏｒに挿入した（Ｍｉｋｉ，Ｄ．＆ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｓｉｍｐｌｅ ＲＮＡｉ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５，４９０−４９５（２００４））。作製したコンストラクトは、アグロバクテリウムを介してイネに形質転換した（Ｔｏｋｉ，Ｓ．，Ｈａｒａ，Ｎ．，Ｏｎｏ，Ｋ．，Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｈ．，Ｔａｇｉｒｉ，Ａ．，Ｏｋａ，Ｓ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ｈ．Ｅａｒｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｌｏｗｓ ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．４７，９６９−９７６（２００６））。

【0115】

（２Ｄ）ＰＴＰノックダウンがＡＢＡによるＳＡ誘導性ＯｓＭＰＫ６ＴＥＹリン酸化抑制に拮抗するかどうかを確認するため、以下の試験を行った。ＷＴイネ及びＯｓＰＴＰ１／ＰＴＰ２ダブルノックダウンイネ（ＰＴＰ−ｗｋｄイネ）を１００μＭ ＡＢＡの存在下又は非存在下で１ｍＭ ＳＡ処理し、ＯｓＭＰＫ６のリン酸化を経時的に免疫検出した。ＡＢＡ非存在下において、ＷＴイネではＯｓＭＰＫ６のＴＥＹリン酸化レベルがＳＡ処理後上昇していった。一方、ＰＴＰ−ｗｋｄイネにおけるＯｓＭＰＫ６のＴＥＹリン酸化レベルは、ＳＡ処理前からＷＴイネより高く、ＳＡ処理後も維持されていた。ＡＢＡの存在下においては、ＷＴイネではＳＡ処理後もＯｓＭＰＫ６のＴＥＹリン酸化レベルが増加しなかったのに対し、ＰＴＰ−ｗｋｄイネでは、ＳＡ処理後、顕著に増加していった（図１５）。

【0116】

実施例４〔変異導入によるタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子の活性抑制〕
ＯｓＰＴＰ１／２への変異導入により、ＯｓＭＰＫ６のチロシン脱リン酸化活性が失われるかどうかを調べた。

【0117】

配列番号３の塩基配列の１から９８７番目の塩基配列からなるＤＮＡ及び配列番号４の塩基配列の１から７１４番目の塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれｐＭＡＬ−ｃ５ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びｐＭＡＬ−ＰＴＰ２（ＷＴ）を作製した。ｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（ＷＴ）は、マルトース結合タンパク質のＣ端側にＯｓＰＴＰ１の全長が融合した融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ））を発現し、ｐＭＡＬ−ＰＴＰ２（ＷＴ）は、マルトース結合タンパク質のＣ端側にＯｓＰＴＰ２の全長が融合した融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ２（ＷＴ））を発現する。ｐＭＡＬ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びｐＭＡＬ−ＰＴＰ２（ＷＴ）から、ＣｙｓからＳｅｒへの置換を含むＯｓＰＴＰ１とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ１ＣＳ））及びＣｙｓからＳｅｒへの置換を含むＯｓＰＴＰ２とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質（ＭＢＰ−ＰＴＰ２ＣＳ）をそれぞれ発現する発現ベクター、ｐＭＡＬ−ＰＴＰ１ＣＳ及びｐＭＡＬ−ＰＴＰ２ＣＳを、後段の条件によりＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のマニュアルに準じて作製した。試験管内におけるＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）、ＭＢＰ−ＰＴＰ２（ＷＴ）又はそれらの変異型（ＭＢＰ−ＰＴＰ１ＣＳ及びＭＢＰ−ＰＴＰ２ＣＳ）によるＭＢＰ−ＭＰＫ６及びＭＢＰ−ＷＲＫＹ４５のリン酸化活性を、それぞれのタンパク質への³²Ｐ−結合により観察した。ＭＢＰ−ＰＴＰ１ＣＳにおいては、ＯｓＰＴＰ１の２５８番目のＣｙｓに変異が導入されている。ＭＢＰ−ＰＴＰ２ＣＳにおいては、ＯｓＰＴＰ２の１６６番目のＣｙｓに変異が導入されている。

【0118】

ＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２Ｄによりリン酸化されるＭＢＰ−ＭＰＫ６の量は、ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）又はＭＢＰ−ＰＴＰ２（ＷＴ）の存在下においてマルトース結合タンパク質の存在下と較べて顕著に減少したことが示された（図１６）。

【0119】

アラビドプシスのＰＴＰ１（ＡｔＰＴＰ１）において、特定のＣｙｓ残基が活性に不可欠である。ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）及びＭＢＰ−ＰＴＰ２（ＷＴ）において、上記ＡｔＰＴＰ１のＣｙｓに対応するＣｙｓ残基（ＯｓＰＴＰ１の２５８番目及びＯｓＰＴＰ２の１６６番目、図１４）をＳｅｒに置換した変異体（ＭＢＰ−ＰＴＰ１ＣＳ又はＭＢＰ−ＰＴＰ２ＣＳ）の存在下でＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２ＤによるＭＢＰ−ＭＰＫ６のリン酸化アッセイを行うと、リン酸化ＭＢＰ−ＭＰＫ６が減少しないことから（図１６のＭＢＰ−ＰＴＰ１ＣＳ及びＭＢＰ−ＰＴＰ２ＣＳ）、これらのＣｙｓ残基がＭＢＰ−ＰＴＰ１及びＭＢＰ−ＰＴＰ２の脱リン酸化酵素活性に必須であることが示された。例えば、ＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）の有する脱リン酸化酵素活性は当該融合タンパク質のＯｓＰＴＰ１部分の活性を表すものであり、当該融合タンパク質のマルトース結合タンパク質部分はＭＢＰ−ＰＴＰ１（ＷＴ）が有する脱リン酸化酵素活性に影響しないと考えられることから、以上の結果により、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２はＯｓＭＰＫ６を脱リン酸化する活性を有し、その活性にとって２５８番目（ＯｓＰＴＰ１）及び１６６番目（ＯｓＰＴＰ２）のＣｙｓ残基がそれぞれ必須であることが示された。

【0120】

更に、二分子蛍光相補性アッセイの結果、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２がイネ細胞のＯｓＭＰＫ６とイネ細胞内で相互作用することが分かった。

【0121】

本実施例の結果は、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２がＯｓＭＰＫ６を脱リン酸化する活性を有し、ＲＮＡ干渉によりＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２の発現を抑制することにより、ＡＢＡによるＯｓＭＰＫ６の脱リン酸化を阻害して、ＡＢＡによるＷＲＫＹ４５依存性防御応答の低下を阻止することができることを示している。

【0122】

また、ＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基に相当するシステイン残基及び２３４番目のアスパラギン酸残基に相当するアスパラギン酸残基は、シロイヌナズナ、イネだけでなくダイズ、エンドウ、インゲン、トマト、コムギ、トウモロコシのタンパク質チロシン脱リン酸化酵素のアミノ酸配列において完全に保存されていることから、上記システイン残基及び上記アスパラギン酸残基が植物のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素において保存されていることが示唆される（図１９）。実施例４の結果とこれらの知見をあわせると、多くの植物種のタンパク質チロシン脱リン酸化酵素における、ＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基に相当するシステイン残基及びＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸残基に相当するアスパラギン酸残基が当該酵素の脱リン酸化酵素活性にとって必須であり、従って、これらの酵素においてＡｔＰＴＰ１の２６５番目のシステイン残基に相当するシステイン残基若しくはＡｔＰＴＰ１の２３４番目のアスパラギン酸残基に相当するアスパラギン酸残基を欠失した変異体又は該システイン残基若しくは該アスパラギン酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体の脱リン酸化酵素活性が野生型酵素の活性と比べて大幅に低下するか又はほとんど消失することを強く示唆している。

【0123】

実施例５〔ＰＴＰノックダウンによる調節の特異性〕
ＳＡによるＷＲＫＹ４５発現誘導のＡＢＡによる抑制に対し、ＯｓＰＴＰ１／２のノックダウンがどのように影響しているかを以下の試験により調べた。

【0124】

ＷＴ及びＰＴＰ−ｗｋｄを１ｍＭ ＳＡ及び０又は３０μＭ ＡＢＡで処理した後、葉から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ｑＰＣＲにより、ＷＲＫＹ４５、ＯｓＰＴＰ１及びＯｓＰＴＰ２の各転写レベル（ユビキチンのそれに対する相対レベル）を調査した。

【0125】

ＷＴ植物では、ＳＡ及びＡＢＡで処理した場合、ＳＡのみで処理した場合と較べてＷＲＫＹ４５転写レベルが顕著に減少していたのに対し、ＰＴＰ−ｗｋｄ植物においては、ＳＡ及びＡＢＡで処理した場合、ＳＡのみで処理した場合に対するＷＲＫＹ４５転写レベルの減少の程度が小さかった（図１７）。この結果は、ＰＴＰ−ｗｋｄ植物においては、ＳＡによるＷＲＫＹ４５発現誘導のＡＢＡによる抑制が軽減されていることを示している。

【0126】

実施例６〔いもち病に対する抵抗性〕
ベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）は、イネを含む様々な植物での防御応答を活性化するプラントアクチベーターの一種である（Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９，２０６４（２００７）．、Ｙ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｂｅｈａｖ．８，ｅ２４５１０（２０１３）．及びＪ．Ｇｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８，６２９（１９９６）．参照）。そこで、様々な条件下イネにおけるＢＴＨ−誘導性いもち病抵抗性へのタンパク質チロシン脱リン酸化酵素遺伝子ノックダウンの効果を調べた。

【0127】

ＷＴイネ（品種：日本晴）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）、ＰＴＰ−ｗｋｄイネ、及びＷＲＫＹ４５−過剰発現イネ（Ｗ４５−ｏｘ）を実験材料とした。Ｗ４５−ｏｘは、Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９，２０６４（２００７）に記載の条件にて作製した。それぞれを温室内の土壌（Ｂｏｎｓｏｌ Ｎｏ．２；住友化学株式会社）に播種後、１月半育成した。育成温度は３０℃／２６℃（昼／夜）であり、相対湿度（ＲＨ）は約６０％とした。

【0128】

各植物体から葉身を切り出し、後述の薬剤溶液１０ｍｌが入った５０ｍｌファルコンチューブへ入れ、サージカルテープ（スリーエム；ｃａｔ＃ ３５３０−１）で封をした。

【0129】

薬剤溶液は、１０μＭ ＢＴＨを含有する０．１×ＭＳ塩溶液、１０μＭ ＢＴＨ、１０μＭ ＡＢＡ及び１００μＭ フルリドンを含有する０．１×ＭＳ塩溶液、又は０．１×ＭＳ塩溶液（Ｍｏｃｋ）とした。以降、ファルコンチューブ内のイネ葉身を以下のように処理した。

【0130】

常温（３０℃）条件：イネ葉身と各薬剤溶液のいずれかを入れた５０ｍｌチューブをグロースチャンバー（明期：３０℃にて１４時間、暗期：２６℃にて１０時間；６０％相対湿度）内に１日間置いた。前記薬剤溶液を除去し、イネ葉身に、いもち病菌を接種した。いもち病菌Ｍ．ｏｒｙｚａｅ〔Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ〕（ｒａｃｅ００３）の培養とイネ植物への菌接種は、参考文献６の記載に概ね従い実施した。具体的には、いもち病菌の分生子を０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０に、濃度１５０，０００胞子／ｍｌとなるように懸濁し、イネの葉に噴霧した。前記５０ｍｌチューブに前記薬剤溶液１０ｍｌを加えサージカルテープで封をし、２４℃の接種箱（暗所）で１日間置いた。前記薬剤溶液を除き０．１×ＭＳ塩溶液１０ｍｌを入れ、その後更にグロースチャンバー（明期：３０℃にて１４時間、暗期：２６℃にて１０時間；６０％相対湿度）内に５日間置いた後、イネ葉身からＤＮＡを抽出した。

【0131】

低温（１５℃）条件：イネ葉身と各薬剤溶液のいずれかを入れた５０ｍｌチューブをグロースチャンバー（明期：１５℃にて１４時間、暗期：９℃にて１０時間；６０％相対湿度）内に２日間置いた。前記薬剤溶液を除去し、イネ葉身に上記の条件でいもち病菌を接種した。前記５０ｍｌチューブに前記薬剤溶液１０ｍｌを加えサージカルテープで封をし、２４℃の接種箱（暗所）で１日間置いた。前記５０ｍｌチューブをグロースチャンバー（明期：１５℃にて１４時間、暗期：９℃にて１０時間；６０％相対湿度）内に更に３日間置いた。前記薬剤溶液を除き０．１×ＭＳ塩溶液を入れ、更にグロースチャンバー（明期：３０℃にて１４時間、暗期：２６℃にて１０時間；６０％相対湿度）内に５日間置いた後、イネ葉身からＤＮＡを抽出した。

【0132】

それぞれの条件で抽出したＤＮＡを用いて、Ｍ．ｏｒｙｚａｅ ２８Ｓ ｒＤＮＡの定量を行った。参考文献１３に概ね従い、ｑＰＣＲにより定量することにより、いもち病の進行を評価した。各病害抵抗性アッセイは３回以上繰り返して実施した。

【0133】

３０℃において、ＢＴＨはＷＴイネに強いいもち病抵抗性を誘導した。一方、ＰＴＰノックダウンは、ＢＴＨ前処理有り及びなしのいずれの場合もいもち病抵抗性に影響しなかった（図１８）。ＷＴイネにおいて、ＡＢＡの共処理は、ＢＴＨ誘導性いもち病抵抗性を強く阻害した（図１８）。しかし、ＰＴＰ−ｗｋｄイネにおいては、このＡＢＡの効果が劇的に弱まり、ＷＲＫＹ４５を過剰発現するイネ植物とほぼ同程度の強いいもち病抵抗性を示した（図１８）。これらの結果は、ＳＡシグナル伝達に対するＡＢＡの拮抗作用を媒介するＰＴＰアーゼの役割と一致する。また、Ｍ．ｏｒｙｚａｅ接種の前後の期間に１５℃の低温処理をした場合、ＷＴイネ植物は、ＢＴＨ存在下でもいもち病菌への高い罹病性を示した（図１８）。一方、同様に低温処理したＰＴＰ−ｗｋｄイネにおいては、ＢＴＨによってＷＲＫＹ４５過剰発現イネと同レベルの強いいもち病抵抗性が誘導された。これらの結果全てに基づき、ＰＴＰアーゼは、低温によって誘発されたＡＢＡシグナル伝達を受けてＯｓＭＰＫ６を脱リン酸化して不活性化し、これによってＷＲＫＹ４５依存性ＳＡ経路防御応答に対するＡＢＡシグナルの拮抗作用を媒介すると考える。

【0134】

〔植物及び生育条件〕
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）は、温室内の土壌（Ｂｏｎｓｏｌ Ｎｏ．２；住友化学株式会社）で生育された。生育中の温度は３０℃／６０℃（昼／夜）であり、相対湿度（ＲＨ）は約６０％とした。

【0135】

〔プラスミドの構築〕
部位特異的突然変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、その説明書に従い実施した。ＧＶＧ−ＭＫＫ１０−２Ｄを得るには、ＯｓＭＫＫ１０−２Ｄ ｃＤＮＡ（参考文献１参照）をｐＩＮＤＥＸベクター（参考文献２参照）中にサブクローニングした。ＰＴＰ−ｗｋｄを得るには、ＯｓＰＴＰ１遺伝子及びＯｓＰＴＰ２遺伝子の３’非翻訳領域をそれぞれＰＣＲ増幅した。ＯｓＰＴＰ１遺伝子の３’非翻訳領域の増幅に用いたプライマーは、ｕ７プライマー（５’−ＣＡＣＣＣＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＧＡ−３’：配列番号７）及びｕ８プライマー（５’−ＡＡＡＴＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＣＣＧＴ−３’：配列番号８）であった。ＯｓＰＴＰ２遺伝子の３’非翻訳領域の増幅に用いたプライマーは、ｕ９プライマー（５’−ＴＴＡＧＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＧＴ−３’：配列番号９）とｕ１０プライマー（５’−ＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１０）であった。次に、ｕ７プライマー、ｕ１０プライマー及び上記第一段階反応の反応産物を用いて、第二段階のオーバーラップＰＣＲを実施した。この反応で増幅された融合遺伝子をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、続いてｐＡＮＤＡベクター（参考文献３参照）内に導入した。

【0136】

〔イネの形質転換〕
イネカルスを、参考文献４及び５の記載に従い、アグロバクテリウムによる形質転換に供した。ハイグロマイシン耐性の選抜により、形質転換カルスから植物を再生させた。

【0137】

〔タンパク質又はＲＮＡ分析のための葉の化学処理〕
葉の化学処理は、参考文献６の記載に概ね従い実施した。四葉期のイネから採取した葉身を長さ約０．５ｃｍの断片に切断し、０．００２％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７中に調整された化学物質を含む溶液中に沈めた。葉断片は、一定の時間、３０℃で明所にてインキュベートした。アブシジン酸（ＡＢＡ）は、サリチル酸（ＳＡ）又はデキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理の１時間前に投与した。ＰＴＰアーゼインヒビターはＡＢＡ投与の更に１時間前に投与した。ＳＡの処理量は１ｍＭであった。

【0138】

〔イムノブロットアッセイ〕
タンパク質に含まれる二重リン酸化されたＴＥＹモチーフとＯｓＭＰＫ６を、イムノブロットアッセイにより特定した。

【0139】

イムノブロットアッセイは、参考文献７の記載に概ね従い実施した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ １及び２（Ｓｉｇｍａ）、並びに１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５でタンパク質を抽出した。遠心分離の後、上清（タンパク質６〜２０μｇを含む）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後のブロッティングに供した。免疫測定は、ＳＮＡＰｉｄ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて、その説明書に従い実施した。以下の抗体を使用した：
抗ｐＴＥｐＹ抗体：Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ＃ Ｖ８０３１，１／１，５００希釈；
抗ＯｓＭＰＫ６抗体：Ｋｉｓｈｉ−Ｋａｂｏｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（参考文献８参照），１／１，５００希釈；
抗ＰＥＰＣ抗体：Ｕｅｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（参考文献９参照），１／３０，０００希釈；
抗ｐＹ抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃｌｏｎｅ ４Ｇ１０ ｐｌａｔｉｎｕｍ，１／１，５００希釈；
抗ｐＴ抗体：Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａｎｔｉ−ｐＴ１８３ ＭＡＰＫ ｐＡｂ（Ｒａｂｂｉｔ）， １／４，０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ；及び
抗ＷＲＫＹ４５抗体：Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（参考文献７参照），１／３００希釈。

【0140】

〔ＲＴ−ｑＰＣＲ〕
既述のとおりに薬剤処理されたイネの葉から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（東洋紡株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成した。参考文献１０の記載に従い、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ株式会社）を用いたＴｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ ＴＰ８００ ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）にて、定量ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ｑＰＣＲに用いたプライマーの配列を、表１に示す。

【0141】

【表1】

【0142】

〔ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリン酸化及び脱リン酸化アッセイ〕
リン酸化及び脱リン酸化アッセイは、一部変更を加えたが参考文献８及び１１の記載に従い実施した。ＧＳＴ−ＭＫＫ１０−２Ｄ及びＭＢＰ−ＭＰＫ６（野生型又は変異型）は、０．５ｍＭ ＡＴＰ及び３７ｋＢｑ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを含む反応緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ）中で、２５℃で２０分間インキュベートした。脱リン酸化アッセイを行うには、上記反応液にＭＢＰ−ＰＴＰ１及びＭＢＰ−ＰＴＰ２を添加し、反応混合物を更に２０分間インキュベートした。ＷＲＫＹ４５リン酸化活性アッセイを行うには、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを含まないほかは上記と同様の反応混合物を２０分間プレインキュベートし、ＭＢＰ−ＷＲＫＹ４５及び３７ｋＢｑ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰの添加により反応を開始した。混合物を更に２０分間インキュベートし、続いてＬａｅｍｍｌｉ’ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加後沸騰させて、反応を終了した後、反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ローディングコントロールとして、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を実施した。

【0143】

〔二分子蛍光相補性（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）アッセイ〕
二分子蛍光相補性アッセイを参考文献１２の記載に従い実施した。

【0144】

実施例７〔高塩処理後におけるいもち病抵抗性〕
ＷＴイネ「ＮＢ」（品種：日本晴）及びＯｓＰＴＰ１／２ダブルノックダウンイネ（ＰＴＰ−ｗｋｄイネ）を、温室内の土壌（ボンソルＮｏ．２；住友化学株式会社）にそれぞれ播種後３０日目まで育成した。育成温度は３０℃／２６℃（昼／夜）であり、相対湿度（ＲＨ）は約６０％とした。これらのイネ植物体を、２５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で４日間処理した。各植物体から展開葉の葉身を外し、後述の薬剤溶液のいずれか１０ｍｌが入った５０ｍｌファルコンチューブに入れ、サージカルテープで封をした。薬剤溶液は、１０μＭ ＢＴＨを含有する０．１×ＭＳ塩溶液又は０．１×ＭＳ塩溶液（Ｍｏｃｋ）とした。

【0145】

上記５０ｍｌファルコンチューブに入れた葉身に、実施例６に記載の方法に概ね従っていもち病菌を接種した後、各イネ葉身からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は、公知の方法に従った（新版 植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社、１９９７）。それぞれの処理を行ったイネ葉身から抽出したＤＮＡを用いて、Ｍ．ｏｒｙｚａｅ ２８Ｓ ｒＤＮＡの定量を行った。参考文献１３に概ね従い、ｑＰＣＲを用いて定量することにより、いもち病への抵抗性を評価した。各病害抵抗性アッセイは３回以上の実験を繰り返し行い、平均値及び標準偏差をグラフにして図２０に示した。

【0146】

その結果、ＮＢにおいては、高塩処理を行わないＢＴＨ存在下で強い病害抵抗性がみられるところ、高塩処理を行うとＢＴＨの存在下でも病害抵抗性が弱まった。これに対し、ＰＴＰ−ｗｋｄイネでは、高塩処理下でもＢＴＨ存在下で強い病害抵抗性が維持された（図２０）。この結果は、本発明により、過酷な環境条件下でも高い病害抵抗性を植物に付与できることを示している。

【0147】

〔参考文献リスト〕
１．Ｙ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌ．Ｂｅｈａｖ．８，ｅ２４５１０（２０１３）．
２．Ｐ．Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋ，Ｒ．ｄｅ Ｋａｍ，Ｊ．Ｈｏｇｅ，Ａ．Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐｌａｎｔａ ２１３，３７０（２００１）．
３．Ｄ．Ｍｉｋｉ，Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５，４９０（２００４）．
４．Ｔ．Ｆｕｓｅ，Ｔ．Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．Ｙａｎｏ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８，２１９（２００１）．
５．Ｙ．Ｈｉｅｉ，Ｓ．Ｏｈｔａ，Ｔ．Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，２７１（１９９４）．
６．Ｃ．−Ｊ．Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２３，７９１（２０１０）．
７．Ａ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．７３，３０２（２０１３）．
８．Ｍ．Ｋｉｓｈｉ−Ｋａｂｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．６３，５９９（２０１０）．
９．Ｙ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２１，１７（２０００）．
１０．Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９，２０６４（２００７）．
１１．Ｙ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２，１３０１（２０００）．
１２．Ｈ．Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，９５７７（２０１３）．
１３．Ｍ．Ｑｉ，Ｙ．Ｎ．Ｙａｎｇ，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９２，８７０（２００２）．

【配列表フリーテキスト】

【0148】

配列番号１：ＯｓＰＴＰ１のアミノ酸配列
配列番号２：ＯｓＰＴＰ２のアミノ酸配列
配列番号３：ＯｓＰＴＰ１のｃＤＮＡの塩基配列
１− ９８７：コーディング配列（終止コドン含む）
９８８−１２４３：３’−ＵＴＲ（ＲＮＡｉベクターに使用し得る配列）
配列番号４：ＯｓＰＴＰ２のｃＤＮＡの塩基配列
１−７１４：コーディング配列（終止コドン含む）
７１５−９８９：３’−ＵＴＲ（ＲＮＡｉベクターに使用し得る配列）
配列番号５：ＯｓＰＴＰ１のゲノムＤＮＡの塩基配列
１−１０００：ＲｄＤＭ対象領域
１００１−１３６８：第１エクソン（翻訳開始点１１７２）
１３６９−２６８９：第１イントロン
２６９０−２７７８：第２エクソン
２７７９−２８９３：第２イントロン
２８９４−２９７８：第３エクソン
２９７９−３０７３：第３イントロン
３０７４−３２０８：第４エクソン
３２０９−４５５６：第４イントロン
４５５７−４６８３：第５エクソン
４６８４−５１７１：第５イントロン
５１７２−５３１４：第６エクソン
５３１５−５３９１：第６イントロン
５３９２−５５３３：第７エクソン
５５３４−５８１６：第７イントロン
５８１７−５９０２：第８エクソン（終止コドン５８８６）
５９０３−６０１５：第８イントロン
６０１６− ：第９エクソン
配列番号６：ＯｓＰＴＰ２のゲノムＤＮＡの塩基配列
１− ９８３：ＲｄＤＭ対象領域
９８４−１１０９：第１エクソン
１１１０−３４０８：第１イントロン
３４０９−３４９７：第２エクソン
３４９８−４０８１：第２イントロン
４０８２−４１７２：第３エクソン（翻訳開始点４１６６）
４１７３−４２６２：第３イントロン
４２６３−４３４５：第４エクソン
４３４６−４４９５：第４イントロン
４４９６−４６３６：第５エクソン
４６３７−５９０２：第５イントロン
５９０３−６０２８：第６エクソン
６０２９−７５２８：第６イントロン
７５２９−７８９５：第７エクソン
７８９６−８３２３：第７イントロン
８３２４− ：第８エクソン（終止コドン８３９５）
配列番号７：ｕ７ プライマー
配列番号８：ｕ８ プライマー
配列番号９：ｕ９ プライマー
配列番号１０：ｕ１０ プライマー
配列番号１１：Ｂｌａｓｔ１ プライマー
配列番号１２：Ｂｌａｓｔ２ プライマー
配列番号１３：Ｗ６２ｋｄＲＴ１Ｆ プライマー
配列番号１４：Ｗ６２ｋｄＲＴ１Ｒ プライマー
配列番号１５：Ｗ４５ＲＴＦ４ プライマー
配列番号１６：Ｗ４５ＲＴＲ４ プライマー
配列番号１７：Ｒｕｂｉｑ１ ＲＴ Ｆ１ プライマー
配列番号１８：Ｒｕｂｉｑ１ ＲＴ Ｒ１ プライマー
配列番号１９：ｕ１９３−ＰＴＰ１ｒｅａｌ プライマー
配列番号２０：ｕ１９４−ＰＴＰ１ｒｅａｌ プライマー
配列番号２１：ｕ１９５−ＰＴＰ２ｒｅａｌ プライマー
配列番号２２：ｕ１９６−ＰＴＰ２ｒｅａｌ プライマー
配列番号２３：Ｓａｌｔ−ｒｔＦ プライマー
配列番号２４：Ｓａｌｔ−ｒｔＲ プライマー
配列番号２５：ＮＰＲ１−ＵＴＲＴ−Ｆ１ プライマー
配列番号２６：ＮＰＲ１−ＵＴＲＴ−Ｒ１ プライマー
配列番号２７：Ｔ３Ａ ２＋ プライマー
配列番号２８：Ｔ３Ａ ２− プライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]