特許 6540032 分離材

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6540032

(24)【登録日】2019年6月21日

(45)【発行日】2019年7月10日

(54)【発明の名称】分離材

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/281 20060101AFI20190628BHJP

   B01J 20/285 20060101ALI20190628BHJP

   B01D 15/08 20060101ALI20190628BHJP

   B01J 20/24 20060101ALI20190628BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/26 L

   B01J20/285 M

   B01J20/281 X

   B01J20/281 G

   B01J20/285 N

   B01D15/08

   B01J20/24 C

【請求項の数】9

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-7778(P2015-7778)

(22)【出願日】2015年1月19日

(65)【公開番号】特開2016-131924(P2016-131924A)

(43)【公開日】2016年7月25日

【審査請求日】2017年11月30日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004455

【氏名又は名称】日立化成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100160897

【弁理士】

【氏名又は名称】古下 智也

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 優

(72)【発明者】

【氏名】東内 智子

(72)【発明者】

【氏名】河内 史彦

(72)【発明者】

【氏名】後藤 泰史

(72)【発明者】

【氏名】佛願 道男

【審査官】 星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−１６００５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２２８０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００７８１７２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０１９６１６４６（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２９６９４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０２６５６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特許第４３３５１６８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２０１３−５００２９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０２５３００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５３７９８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／００−２０／３４

Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
前記アミノ基を有する親水性ポリマが多糖類である、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。

【請求項2】

多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
前記アミノ基を有する親水性ポリマがキトサンである、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。

【請求項3】

前記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、請求項１又は２に記載の分離材。

【請求項4】

多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、
を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含み、
前記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、
生体高分子の分離又は精製に用いるための分離材。

【請求項5】

比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項6】

前記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が３〜１５％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項7】

前記交互積層膜が架橋されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項8】

前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜３００ｍｇの前記交互積層膜を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項9】

カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分離材に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には、多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体をタンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起こるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できない、という問題点がある。

【0003】

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないといった欠点を有する。特に架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

【0004】

親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、例えば、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点を有する。

【0005】

また、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。このゲルには吸着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。

【0006】

また、マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体ゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等に問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。

【0007】

また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５、特許文献６参照）。

【0008】

また、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子の合成が知られている（例えば、特許文献７参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第４９６５２８９号明細書

【特許文献2】米国特許第４３３５０１７号明細書

【特許文献3】米国特許第４３３６１６１号明細書

【特許文献4】米国特許第３９６６４８９号明細書

【特許文献5】特開平１−２５４２４７号公報

【特許文献6】米国特許第５１１４５７７号明細書

【特許文献7】特開２００９−２４４０６７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れるという全ての特性を充分なレベルで兼ね備えるものではない。

【0011】

本発明は、このような実情に鑑み、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記目的を達成するために鋭意検討した結果、本発明者らは、特定の多孔質ポリマ粒子と、特定の交互積層膜と、を備える、分離材を用いることによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0013】

すなわち、本発明は、下記［１］〜［１０］に記載の分離材を提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子と、上記多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜と、を備える、分離材。
［２］比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］に記載の分離材。
［３］上記多孔質ポリマ粒子が、モノマとして、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含む、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］上記多孔質ポリマ粒子における粒径の変動係数が３〜１５％である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］上記アミノ基を有する親水性ポリマが多糖類である、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］上記アミノ基を有する親水性ポリマがキトサンである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［７］上記ポリアニオンがアルギン酸ナトリウムである、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］上記交互積層膜が架橋されている、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］上記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜３００ｍｇの上記交互積層膜を備える、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材を提供することが可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。

【0016】

＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された交互積層膜と、を備える。

【0017】

（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成される。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系のビニルモノマを使用することができる。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

【0018】

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性に優れることから、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。

【0019】

上記多孔質ポリマ粒子は、モノマとして、ジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンを、モノマ全質量基準で５０質量％以上含むことが好ましく、６０質量％以上含むことがより好ましく、７０質量％以上含むことがさらに好ましい。ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性及び耐圧性により優れる傾向にある。

【0020】

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

【0021】

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これら多孔質化剤は、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。

【0022】

上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。

【0023】

また、溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、多孔質化することが可能となる。

【0024】

多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。

【0025】

これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、好ましくは純度が約４０％超、より好ましくは純度が約５０％超、さらに好ましくは純度が約７０％超のソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度が約４０％超、より好ましくは純度が約５０％超、さらに好ましくは純度が約７０％超のソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（好ましくは純度が約４０％超、より好ましくは純度が約５０％超、さらに好ましくは純度が約７０％超のジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（好ましくは純度が約４０％超、より好ましくは純度が約５０％超、さらに好ましくは純度が約７０％超のジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度が約４０％超、より好ましくは純度が約５０％超、さらに好ましくは純度が約７０％超のソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。

【0026】

これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しやすくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。

【0027】

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

【0028】

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。

【0029】

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。

【0030】

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

【0031】

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

【0032】

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

【0033】

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

【0034】

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

【0035】

多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。

【0036】

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

【0037】

モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

【0038】

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、さらに好ましくは５０μｍ以上である。

【0039】

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることがさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（日立製作所）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

【0040】

多孔質ポリマ粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

【0041】

多孔質ポリマ粒子の細孔容積は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、平均細孔径が０．１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の平均細孔径は、０．２μｍ以上０．６μｍ未満であることがより好ましい。平均細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、平均細孔径が０．６μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

【0042】

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。

【0043】

（交互積層膜）
本実施形態の交互積層膜は、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる。アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンを使用することによって、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となり、タンパク質吸着量が天然高分子を分離材として用いた場合と同等又はそれ以上となる。また、交互積層膜を架橋することによって、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。

【0044】

（アミノ基を有する親水性ポリマ）
アミノ基を有する親水性ポリマは、水に溶解又は膨潤することが可能な親水性を有し、水中でアミノ基がプロトン化されて正電荷を帯びるという特性を有するものが好適に使用される。アミノ基を有する親水性ポリマとしては、１分子中に２個以上のアミノ基を有する親水性ポリマが好ましい。また、アミノ基を有する親水性ポリマは水酸基を有することが好ましく、該水酸基の数は２個以上であることがより好ましい。

【0045】

アミノ基としては、（無置換の）アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。なお、アミノ基はプロトンが配位結合した−ＮＨ_３^＋であってもよい。

【0046】

アミノ基を有する親水性ポリマとしては、例えば、コラーゲン、ポリヒスチジン、アイオネン、キトサン、アミノ化セルロース等の塩基性多糖類；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンとの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体及び共重合体；ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリジビニルピリジン等の塩基性ビニルポリマ；並びにそれらの塩類（塩酸塩、酢酸塩等）、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリドなどが挙げられる。アミノ基を有する親水性ポリマは、多糖類であることが好ましく、キトサンであることがより好ましい。キトサンはキチンの脱アセチル化物であり、その脱アセチル化度としては、生体吸収性、水溶性がより優れることから、４０〜１００％の範囲内であることが好ましく、４５〜９０％の範囲内であることがより好ましく、５０〜８０％の範囲内であることがさらに好ましい。

【0047】

アミノ基を有する親水性ポリマは、重量平均分子量が１万〜２０万であることが好ましい。また、界面吸着能を向上させるために疎水基を導入した変性体も用いることができる。また、アミノ基を有する親水性ポリマの代わりに、１分子中に２個以上のアミノ基を有する低分子化合物を用いてもよい。１分子中に２個以上のアミノ基を有する低分子の化合物としては、例えば、低分子のジアミン、ポリアミンが挙げられる。具体的には、例えば、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘキサン等のジアミノアルカン類などの１分子中に２個のアミノ基を有する化合物、Ｎ−（リジル）−ジアミノエタン、Ｎ，Ｎ’−（ジリジル）−ジアミノエタン、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサン、Ｎ，Ｎ’−（ジリジル）−ジアミノヘキサン等のモノ又はジリジルアミノアルカン類などの１分子中に３〜４個のアミノ基を有する化合物、１分子中に５個以上のアミノ基を有する化合物を挙げられる。

【0048】

（アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液）
アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液の溶媒としては、アミノ基を有する親水性ポリマを溶解できるものであれば、任意の溶媒を用いることができるが、電荷量をより多くすることができるという観点から、水又は無機塩類の水溶液を用いることが好ましい。

【0049】

アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液は、アミノ基を有する親水性ポリマを溶媒に溶解させたものをそのまま用いることができる。ｐＨは、例えば、１．２〜６．６にすることができる。

【0050】

アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液には、２種類以上のポリマを併用してもよい。

【0051】

アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液の粘度は、０．１〜１０００ｍＰａ・ｓの範囲内であることが好ましく、０．５〜５００ｍＰａ・ｓの範囲内であることがより好ましく、１〜１００ｍＰａ・ｓの範囲内であることがさらに好ましい。本明細書において、粘度とは、株式会社エー・アンド・デー製音叉型振動式粘度計ＳＶ−１０を用い、サンプル量１０ｍＬ、２０℃で測定した値である。

【0052】

アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液中の濃度は、０．０１〜５．０質量％が好ましく、０．０２〜２．０質量％がより好ましく、０．０５〜１．０質量％がさらに好ましい。

【0053】

（ポリアニオン）
本明細書において、ポリアニオンとは、１分子中に２個以上のアニオン性基を有する化合物をいい、アニオン性基とは、アニオン基又はアニオンに誘導され得る基をいう。アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、カルボキシレート基、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基等が挙げられる。

【0054】

ポリアニオンとしては、アニオン性ポリマが好ましい。なお、本明細書において、アニオン性ポリマとは、１分子中に２個以上のアニオン性基を有するポリマをいう。アニオン性ポリマとしては、アニオン性基を有するモノマを重合させたものであることが好ましい。また、ポリアニオンは水酸基を有することが好ましく、該水酸基の数は２個以上であることがより好ましい。

【0055】

アニオン性ポリマとしては、水の存在下で上記アミノ基を有する親水性ポリマとゲル状のポリイオンコンプレックスを形成することができるものが好ましい。

【0056】

アニオン性ポリマは、水に溶解又は膨潤することが可能な親水性を有し、水中でアニオン性基のプロトンが脱離することにより負電荷を帯びるという特性を有するものが好適に使用される。アニオン性ポリマは、１分子中に２個以上のカルボキシ基又はカルボキシレート基を有するポリマであることが好ましい。

【0057】

アニオン性ポリマの具体例としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸；ペクチン、サクラン等のカルボキシ基、カルボキシレート基又は硫酸基等のアニオン性基を有する天然の酸性多糖類及びその誘導体；セルロース、デキストラン、デンプン等の天然ではカルボキシ基、カルボキシレート基又は硫酸基等のアニオン性基を有しない多糖類にアニオン性基を結合させて人工的に合成された酸性多糖類及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルキトサン、硫酸化セルロース及び硫酸化デキストラン並びにそれらの誘導体）；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、グルタミン酸とアスパラギン酸との共重合体等の酸性アミノ酸の単独重合体及び共重合体；ポリアクリル酸等の酸性ビニルポリマ；並びにそれらの塩（例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）が挙げられる。

【0058】

酸性多糖類の誘導体としては、例えば、水酸基の一部又は全部を、酢酸、硝酸、硫酸、リン酸等と反応させたもの；カルボキシ基又はカルボキシレート基の一部をエチレングリコール、プロピレングリコール等の低分子アルコールでエステル化した化合物が挙げられる。

【0059】

酸性多糖類の誘導体としては、具体的には、アルギン酸エチレングリコールエステル、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ヒアルロン酸エチレングリコールエステル、ヒアルロン酸プロピレングリコールエステル等が挙げられる。これらの誘導体におけるエステル化度は、特に制限されないが、４０〜８０％の範囲内であることが好ましく、４５〜８０％の範囲内であることがより好ましく、５０〜７０％の範囲内であることがさらに好ましい。上記誘導体におけるエステル化度が上記範囲内であると、カルボキシ基又はカルボキシレート基の割合がより適正なものとなり、上記のアミノ基を有する親水性ポリマとの間に形成されるポリイオンコンプレックスの機械的強度がより良好となる傾向にある。

【0060】

酸性多糖類の塩又は酸性多糖類の誘導体の塩としては、これらと１価の陽イオンとの塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；アンモニウム塩が挙げられる。

【0061】

アニオン性ポリマとして、アニオン性ポリマを架橋することによって得られる架橋ポリマを用いることもできる。架橋ポリマは、公知の方法によって得ることができる。架橋ポリマは、アニオン性ポリマがカルボキシ基又はカルボキシレート基を有する場合、アニオン性ポリマのカルボキシ基又はカルボキシレート基をジアミンと縮合反応させる方法によって得ることができる。

【0062】

アニオン性ポリマは、酸性多糖類若しくはその誘導体又はそれらの塩であることが好ましい。特に天然の多糖類であり、生体適合性に優れ、かつ入手が容易であることから、アルギン酸若しくはその誘導体（例えば、アルギン酸プロピレングリコールエステル等）又はそれらの塩（例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）が好ましく、アルギン酸ナトリウムであることがより好ましい。

【0063】

アニオン性ポリマの重量平均分子量は、特に制限されないが、重量平均分子量が大きくなるに従って、溶液の粘度が高くなり流延又は積層が困難となる傾向があること、及び生体吸収性が低下する傾向があることから、アニオン性ポリマの重量平均分子量は１，０００〜２０万の範囲内であることが好ましく、１０，０００〜１５万の範囲内であることがより好ましく、１０，０００〜１０万の範囲内であることがさらに好ましい。

【0064】

ポリアニオンとして、１分子中に２個以上のアニオン性基を有する低分子化合物を用いてもよい。１分子中に２個以上のアニオン性基を有する低分子の化合物としては、例えば、コハク酸、マロン酸等の１分子中に２個のカルボキシ基又はカルボキシレート基を有する化合物を挙げられる。

【0065】

（ポリアニオンを含む溶液）
ポリアニオンを含む溶液の溶媒としては、ポリアニオンを溶解できるものであれば、任意の溶媒を用いることができるが、ポリアニオンの電荷量をより多くすることができるため、水又は無機塩類の水溶液が適当である。

【0066】

ポリアニオンを含む溶液には、２種類以上のポリアニオンを併用してもよい。

【0067】

ポリアニオンを含む溶液の濃度は、０．０１〜５．０質量％が好ましく、０．０２〜２．０質量％がより好ましく、０．０５〜１．０質量％がさらに好ましい。

【0068】

ポリアニオンを含む溶液の粘度（２０℃）は、０．１〜１０００ｍＰａ・ｓの範囲内であることが好ましく、１〜５００ｍＰａ・ｓの範囲内であることがより好ましく、１０〜１００ｍＰａ・ｓの範囲内であることがさらに好ましい。

【0069】

ポリアニオンを含む溶液のｐＨは、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マロン酸、シュウ酸、リンゴ酸等の有機酸、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸を添加することで調整できる。

【0070】

アミノ基を有する親水性ポリマとポリアニオンの組合せは、水の共存下で混合した場合に、ポリイオンコンプレックスを形成し、ゲル化するものであれば、いずれの組合せでもよい。特にタンパク質の吸着量の観点から、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンは、少なくとも１種が多糖類であることが好ましい。

【0071】

多孔質ポリマ粒子の表面上に形成された、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンが交互に積層されてなる交互積層膜の積層数は、特に限定されないが、多孔質ポリマ粒子の細孔を閉塞させないために、例えば、アミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンのそれぞれが１〜１０層であることが好ましい。

【0072】

本実施形態の交互積層膜は、例えば、ＩＲ、ＮＭＲ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型２次イオン質量分析、Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ ＳＩＭＳ）等で観察することにより、確認することができる。交互積層膜は、多孔質ポリマ粒子表面に形成されるアミノ基を有する親水性ポリマからなる層と、ポリアニオンからなる層とが接触することで、交互に吸着して形成される。また、接触によって吸着が進行して表面電荷の反転が起こると、さらなる静電吸着は生じないため、形成される層の厚さを制御することができる。

【0073】

交互積層膜の製造方法としては、例えば、交互浸漬法が挙げられる。交互浸漬法では、アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液に多孔質ポリマ粒子を接触させて、多孔質ポリマ粒子の表面にアミノ基を有する親水性ポリマからなる層を最初に形成してもよく、ポリアニオンを含む溶液に多孔質ポリマ粒子を接触させて、多孔質ポリマ粒子の表面にポリアニオンからなる層を最初に形成してもよい。多孔質ポリマ粒子の表面が負に帯電している場合は前者のアミノ基を有する親水性ポリマからなる層を形成することが好ましく、多孔質ポリマ粒子の表面が正に帯電している場合は後者のポリアニオンからなる層を形成することが好ましい。アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液又はポリアニオンを含む溶液との接触は、２回以上に分けて行ってもよい。

【0074】

交互浸漬法においては、アミノ基を有する親水性ポリマを含む溶液又はポリアニオンを含む溶液との接触後、多孔質ポリマ粒子を洗浄することが好ましい。これにより、吸着面から余剰のポリマを除去することができる。

【0075】

洗浄に用いるリンス液としては、水、有機溶媒、又は水と水溶性の有機溶媒との混合溶媒が好ましい。水溶性の有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等が挙げられる。

【0076】

交互浸漬法によれば、表面電荷が反転する限り、膜の形成を継続することができる。そのため、通常のディップコート法よりも、交互浸漬法で形成した薄膜の膜厚均一性は高く、かつ膜厚制御性も高い傾向にある。

【0077】

交互浸漬法を用いて交互積層膜を形成する場合において、ポリアニオンを含む溶液は、効率よく交互積層できる観点から、ｐＨが１．６〜５．４であることが好ましい。ポリアニオンの溶解性により優れることから、１．８〜５．０の範囲内であることがより好ましく、２．０〜４．５の範囲内であることがさらに好ましく、２．５〜４．０の範囲内であることが特に好ましい。

【0078】

多孔質ポリマ粒子内へアミノ基を有する親水性ポリマ及びポリアニオンを含浸させるためには、上記溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置することが好ましい。含浸時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、通常数時間含浸すればポリマ濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。

【0079】

（架橋処理）
交互積層膜は、架橋剤等を用いて、架橋されていることが好ましい。分離材は、架橋処理することによって、３次元架橋網目構造を形成することができる。

【0080】

架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート、ジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などの水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、アミノ基を有する親水性ポリマとしてキトサンを使用する場合には、ジクロロオクタン等のジハライドも架橋剤として使用できる。

【0081】

架橋処理においては、通常触媒が用いられる。このような触媒としては、架橋剤の種類により異なるが、例えば、架橋剤がエピハロヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリ金属塩が有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の無機酸が有効である。

【0082】

また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、アミノ基を有する親水性ポリマ又はポリアニオンとして多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．０１〜１０モル倍の範囲であることが好ましく、０．１〜５モル倍であることがより好ましい。

【0083】

架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、アミノ基を有する親水性ポリマ又はポリアニオンとして多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、交互積層膜の多孔質ポリマ粒子からの剥離が進行しやすくなる傾向にある。また、架橋剤添加量が過剰で、交互積層膜との反応率が高い場合、アミノ基を有する親水性ポリマ又はポリアニオンの特性が損なわれる傾向にある。

【0084】

架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。架橋反応の温度条件は、３０〜９０℃であることが好ましい。架橋反応終了後、粒子をろ別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応のポリマ、架橋剤等を除去することによって、交互積層膜が架橋されている分離材を得ることができる。

【0085】

交互積層膜量は、熱分解の重量減少等で測定することができる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜３００ｍｇの交互積層膜を備えることが好ましい。

【0086】

（イオン交換基の導入）
架橋された交互積層膜を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。

【0087】

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

【0088】

イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。

【0089】

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。

【0090】

イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。

【0091】

イオン交換基として、強塩基性基の四級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。

【0092】

イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

【0093】

イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。

【0094】

一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

【0095】

本実施形態の分離材の吸湿度は、次の方法で吸湿度を測定する。乾燥分離材１ｇを恒温恒湿度試験槽（温度６０℃、湿度９０％）に１８時間放置した後、再度分離材の質量を測定することにより吸湿度を以下の式より算出する。
（吸湿後分離材質量−１）ｇ／１ｇ×１００＝吸湿度（質量％）

【0096】

本実施形態の分離材の吸湿度は１〜２０質量％であることが好ましく、１〜１０質量％であることがより好ましい。分離材の吸湿度が２０質量％以下であると、交互積層膜の厚みによる分離材の通液性が低下を抑制することができる。

【0097】

本実施形態の分離材の平均細孔径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料は、分離材約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

【0098】

分離材は、平均細孔径が０．１〜０．５μｍである細孔を有することが好ましく、０．２〜０．５μｍである細孔を有することが好ましい。平均細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、平均細孔径が０．５μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。

【0099】

分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。

【0100】

分離材の空隙率（ポロシティ）は、３０〜８０％であることが好ましく、４０〜７０％であることが好ましい。

【0101】

本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。

【0102】

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

【0103】

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の交互積層膜を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。

【0104】

本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。

【0105】

本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることが好ましい。

【0106】

本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーで使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。

【0107】

なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。

【実施例】

【0108】

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0109】

（実施例１）
＜多孔質ポリマ粒子１の合成＞
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名ＤＶＢ９６０）を１６ｇ、スパン８０を６ｇ、過酸化ベンゾイルを０．６４ｇ加え、ポリビニルアルコール（０．５ｗｔ％）水溶液を調製した。この水溶液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、上述の方法で平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を算出した。結果を表１に示す。

【0110】

＜交互積層膜の作製＞
アミノ基を有する親水性ポリマとしてキトサン水溶液（株式会社キミカ製：重量平均分子量９０，０００、粘度１２．５ｍＰａ・ｓ（２０℃）、濃度０．１質量％）を用いた。また、ポリアニオンとしてアルギン酸ナトリウム水溶液（株式会社キミカ製：重量平均分子量１００，０００、粘度６．７ｍＰａ・ｓ（２０℃）、濃度０．１質量％）、ｐＨ調整用の有機酸としてリンゴ酸（和光純薬工業株式会社製）を用いた。
キトサン水溶液としては、上記０．１質量％のキトサン水溶液をそのまま用いた。アルギン酸ナトリウム水溶液としては、０．１質量％アルギン酸ナトリウム水溶液１００質量部に対して、１質量％リンゴ酸水溶液１質量部を滴下したものを用いた。
（ア）キトサン水溶液中で多孔質ポリマ粒子１を３時間撹拌した後（多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１００ｍＬ）、リンス用の超純水（比抵抗１８ＭΩ・ｃｍ）中で１０分間撹拌した。（イ）アルギン酸ナトリウム水溶液に３時間浸漬した後（多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１００ｍＬ）、リンス用の超純水中で１０分間撹拌した。（ア）及び（イ）を順番に行うことを１サイクルとして、このサイクルを３回繰り返すことによって、交互積層膜を作製した。得られた粒子について、乾燥後、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）を測定したところ、窒素原子、酸素原子及びナトリウム原子が確認された。このことから、交互積層膜が形成されていることを確認した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子１ｇに対する交互積層膜の質量を測定した。結果を表２に示す。

【0111】

＜交互積層膜の架橋及びイオン交換基の導入＞
次いで、交互積層膜を架橋するとともに、イオン交換基を導入した。交互積層膜が形成された粒子１０ｇを分散させた０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３５０ｇにエピクロロヒドリンを５ｇ添加し、１２時間室温で撹拌した。その後、２質量％のドデシル硫酸ナトリウム熱水溶液で洗浄後、純水で洗浄し、水中で保管した。得られた分散液を遠心分離することにより、水を除去した。得られた粒子２０ｇを、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた水溶液１００ｍＬに分散させ、７０℃で１０分撹拌した。その水溶液に、７０℃に加温したＮａＯＨ水溶液（５Ｍ）１００ｍＬを添加し、１時間反応させた。反応終了後、生成物をろ取し、水／エタノール（体積比８／２）で２回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する（ＤＥＡＥ変性）分離材を得た。分離材の平均細孔径、比表面積及び空隙率（ポロシティ）を水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。
また、分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量の分離材を、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で攪拌した。その後、洗浄液として用いた水のｐＨが７以下となるまで洗浄を行った。洗浄した分離材を０．１Ｎの塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間攪拌させた。分離材をろ過で取り除いた後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することによって、分離材のイオン交換容量を測定した。結果を表２に示す。

【0112】

（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．５ｇを、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度より、分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。その後、分離材をろ別して洗浄し、１００ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに浸漬し、吸着させたＢＳＡを回収することによって、回収率を算出した。回収率が９５％以上であるものを「〇」、９０％以上９５％未満であるものを「△」、９０％未満であるものを「×」とした。結果を表３に示す。

【0113】

（カラム特性評価）
得られた分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度を測定した。結果を表２に示す。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、５カラム容量分の１Ｍ ＮａＣｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）

【0114】

（耐アルカリ性評価）
得られた分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が３％以下であるものを「○」、３％超２０％以下であるものを「△」、２０％超であるものを「×」とした。結果を表３に示す。

【0115】

（吸湿度）
吸湿度は、上述の方法で測定した。結果を表３に示す。

【0116】

（実施例２）
スパン８０の使用量を８ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子２を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子２を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0117】

（実施例３）
スパン８０の使用量を９ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子３を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子３を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0118】

（実施例４）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）を、ジビニルベンゼン（１４ｇ）及びオクタノール（２ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子４を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子４を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0119】

（実施例５）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）及びスパン８０（６ｇ）を、ジビニルベンゼン（１４ｇ）、オクタノール（５ｇ）及びスパン８０（３ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子５を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子５を、多孔質ポリマ粒子１と同様の方法で処理することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0120】

（比較例１）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）及びスパン８０（６ｇ）を、ジビニルベンゼン（４ｇ）、ジヒドロキシプロピルメタクリレート（８ｇ）及びスパン８０（４ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子６を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子６を、交互積層膜を形成せずにＤＥＡＥ変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0121】

（比較例２）
実施例１で得られた多孔質ポリマ粒子１をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0122】

（比較例３）
実施例１で得られた多孔質ポリマ粒子１をキトサン水溶液中で２４時間撹拌した後（多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１００ｍＬ）、リンス用の超純水（比抵抗１８ＭΩ・ｃｍ）中で１０分間撹拌し、キトサンの単層膜を作製した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子１ｇに対するキトサンの単層膜の質量を測定した。結果を表２に示す。その後、実施例１と同様にして、キトサンの単層膜を架橋し、ＤＥＡＥ変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0123】

（比較例４）
実施例１で得られた多孔質ポリマ粒子１をアルギン酸ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌した後（多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり１００ｍＬ）、リンス用の超純水（比抵抗１８ＭΩ・ｃｍ）中で１０分間撹拌し、アルギン酸ナトリウムの単層膜を作製した。また、熱重量分析により、多孔質ポリマ粒子１ｇに対するアルギン酸ナトリウムの単層膜の質量を測定した。結果を表２に示す。その後、実施例１と同様にして、アルギン酸ナトリウムの単層膜を架橋し、ＤＥＡＥ変性することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0124】

（比較例５）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ：ＧＥヘルスケア）を、多孔質ポリマ粒子７として使用した。また、多孔質ポリマ粒子７をそのまま分離材として用いた。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0125】

（比較例６）
ジビニルベンゼン（１６ｇ）及びスパン８０（６ｇ）を、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート（１１．２ｇ）、エチレングリコールジメタクリレート（４．８ｇ）、スパン８０（５ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子８を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子８（４ｇ）を、デキストラン（分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ及び水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた溶液６ｇに加えて、多孔質ポリマ粒子８の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、１質量％エチルセルローストルエン溶液１Ｌに加えて攪拌し、分散、懸濁せしめた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間攪拌して、多孔質ポリマ粒子８の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。分離材について、実施例１と同様の評価を行った。

【0126】

【表1】

【0127】

【表2】

【0128】

【表3】

【0129】

本願実施例１〜５は、比較例１〜６に比べて、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐アルカリ性及び耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れることが判明した。