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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6551886
(24)【登録日】2019年7月12日
(45)【発行日】2019年7月31日
(54)【発明の名称】自己免疫疾患の治療薬及び治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20190722BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20190722BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20190722BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20190722BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20190722BHJP
C12N 15/00 20060101ALN20190722BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P19/02
A61P25/00
A61P37/00
!C07K14/47ZNA
!C12N15/00
【請求項の数】1
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2015-547807(P2015-547807)
(86)(22)【出願日】2014年11月14日
(86)【国際出願番号】JP2014080195
(87)【国際公開番号】WO2015072544
(87)【国際公開日】20150521
【審査請求日】2017年11月6日
(31)【優先権主張番号】61/904,540
(32)【優先日】2013年11月15日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(74)【代理人】
【識別番号】100099025
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 浩志
(72)【発明者】
【氏名】岩倉 洋一郎
(72)【発明者】
【氏名】村山 正承
【審査官】
岩下 直人
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２００３／００４４８４２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
Inflammatory Bowel Diseases，２０１１年，Vol.17, No.12，p.2462-2471
【文献】
日本臨床免疫学会会誌，１９９７年，Vol.20, No.6，p.486-488
【文献】
Modern Physician，２０００年，Vol.20, No.1，p.35-38
【文献】
神経研究の進歩，２００６年，Vol.50, No.4，p.539-548
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ３７／００
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＴＲＰ３を含有する、関節リウマチ又は多発性硬化症の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ１ｑ／ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＣＴＲＰ３）を含有する、自己免疫疾患の治療薬に関する。【背景技術】
【0002】
関節リウマチ（ＲＡ）は、関節局所における炎症や関節の変形および骨破壊が特徴的な自己免疫疾患である。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１７などの炎症性サイトカインがＲＡの発生に重要な役割を果たし、これらのサイトカインに対する抗体及び阻害剤がＲＡの治療に使用されている。高力価の自己抗体がＲＡ患者の血清中に検出されるので、Ｂ細胞に対する抗体もＲＡの治療に有用である。これらのアプローチによってＲＡ治療の有効性が大いに改善された。しかしながら、これらの治療では効果が無い、またはこれらの治療の間に効果が無くなる患者もいるため、新しい治療法の開発が未だに待たれている。【0003】
発明者らは以前に２つのＲＡモデルを作製した。一方はＩ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）遺伝子導入（Ｔｇ）マウスであり、他方はＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）欠損（ＫＯ）マウスであり、両者とも自己免疫性関節炎を自然発症する。複数の遺伝子が自己免疫疾患の発生に関係するとされているので、発明者らはＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて新しい疾患関連遺伝子を探索した。発明者らは、ＲＡモデルマウスと野生型（ＷＴ）マウスとの間の網羅的遺伝子発現解析の結果として、野生型マウスと比較して両方のＲＡモデルで有意に発現変動していた５５４の遺伝子を同定した（N.Fujikado et al., Arthritis Res Ther 8 (2006) R100）。Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子はそれらの遺伝子のうちの１つであり、ＣＴＲＰ３（Ｃ１ｑ／ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３、ＣＯＲＳ−２６、カートデューシンおよびカートネクチンとも呼ばれる）をコードし、両方のモデルにおいてよく発現している。【0004】
ＣＴＲＰ３は短いＮ末端可変領域、コラーゲンドメインおよびＣ末端補体Ｃ１ｑドメインからなる可溶性分泌タンパク質である（R. Ghai et al., Immunobiology 212 (2007) pp253-266）。ＣＴＲＰ３はＣ１ｑ／ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＴＲＰ）ファミリーのメンバーに属し（L.Shapiro et al., Curr Biol 8 (1998) pp335-338）、ＴＮＦおよび補体Ｃ１ｑに似た結晶構造を有する（J.R. Dunkelberger et al., Cell Res 20 (2010) pp34-50）。補体Ｃ１ｑのＣ１ｑドメインが抗原結合ＩｇＭまたはＩｇＧの認識、およびＣ１ｑ受容体（Ｃ１ｑＲ）への結合に重要であり、また、アディポネクチンのＣ１ｑドメインがアディポネクチン受容体（ａｄｉｐｏＲ１およびａｄｉｐｏＲ２）への結合に重要であることが以前の報告により示された。ＣＴＲＰファミリーメンバーは宿主防御、炎症およびグルコース代謝に関与する（R. Ghai et al., Immunobiology 212 (2007) pp253-266）。ＣＴＲＰ３は増殖因子として同定され、軟骨形成前駆細胞と軟骨細胞の増殖を促進する（T. Maeda et al., J Cell Physiol 206 (2006) pp537-544.）。近年、ＣＴＲＰ３がインビトロでヒト脂肪細胞、単球および線維芽細胞からの炎症性サイトカインの分泌を減少させることが報告された（A. Kopp et al., Endocrinology 151 (2010) pp5267-5278、J. Weigert et al., FEBS Lett 579 (2005) pp5565-5570、C. Hofmann et al., Inflamm Bowel Dis 17 (2011) pp2462-2471）。【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、インビボでのＣＴＲＰ３の生理学的役割は未だに解明されずにきた。当然に、ＲＡ等の自己免疫疾患におけるＣＴＲＰ３の役割も不明であった。本発明の課題の１つは、新規な自己免疫疾患の治療薬を提供することである。【0006】
発明者らは、ＣＴＲＰ３をコードする遺伝子であるＣ１ｑｔｎｆ３をノックアウトしたマウス（Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウス）を作製し、自己免疫性関節炎発症におけるＣＴＲＰ３の影響を調べた。さらに、疾患モデル動物にＣＴＲＰ３を投与してその効果を確認した。【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の態様を含む。＜１＞ ＣＴＲＰ３を含有する、自己免疫疾患治療薬。
＜２＞ 前記自己免疫疾患が関節リウマチ又は多発性硬化症である、＜１＞に記載の自己免疫疾患治療薬。
＜３＞ ＣＴＲＰ３を含有する自己免疫疾患治療薬を、自己免疫疾患の治療を必要とする対象に投与すること、を含む自己免疫疾患を治療する方法。
＜４＞ 前記自己免疫疾患が関節リウマチ又は多発性硬化症である、＜３＞に記載の自己免疫疾患を治療する方法。
＜５＞ ＜１＞または＜２＞に記載の自己免疫疾患治療薬としてのＣＴＲＰ３の使用。
＜６＞ ＜１＞または＜２＞に記載の自己免疫疾患治療薬の製造におけるＣＴＲＰ３の使用。
＜７＞ Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子を欠損していることを特徴とする、関節リウマチ又は多発性硬化症のモデル動物。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、新規な自己免疫疾患の治療薬、新規な自己免疫疾患の治療方法、及び、新規な自己免疫疾患モデル動物などを提供することができる。【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスについて説明する図である。（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウス（Ｔｇ）、およびＩＬ−１Ｒａ ＫＯマウス（ＫＯ）の足首の関節におけるＣ１ｑｔｎｆ３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した（野生型：ｎ＝６、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇ：ｎ＝６、およびＩＬ−１Ｒａ ＫＯ：ｎ＝７）。平均値と標準誤差が示されている。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）マウスＣ１ｑｔｎｆ３遺伝子座（野生型アレル）、Ｃ１ｑｔｎｆ３ターゲティングコンストラクト（ターゲティングベクター）、および予想される変異Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子（ＭＴアレル）の構造。エクソンは黒色のボックスで表されている。ネガティブ選択のためにジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）がそのゲノム断片の５’末端に取り付けられた。ＳａｃＩＩ（Ｓ）を線状化のために使用した。（Ｃ）Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子座の相同組換えは、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）またはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）で消化されたゲノムでそれぞれ５’プローブ（上段）または３’プローブ（下段）を使用してサザンブロットハイブリダイゼーションにより調査された。（Ｄ）Ｃ１ｑｔｎｆ３転写物の欠如は図Ｂ中のプライマー（→←）を使用してＲＴ−ＰＣＲにより確認された。
【図2】Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスではコラーゲン誘導関節炎（Collagen-induced arthritis:ＣＩＡ）が悪化することを示す図である。（Ａ）はＣＩＡの発症率を示し、（Ｂ）は重症度を示す。これらのデータは２つの独立した実験から組み合わされた（野生型：ｎ＝１６およびＣ１ｑｔｎｆ３−／−：ｎ＝１７）。（Ｃ）は関節炎誘導後の４２日目における足首の関節の病理組織診断の結果を示す。代表的な組織診断のうちの１つが（Ｃ）に示されている。Ｈ＆Ｅ染色。脛骨、距骨および舟状骨がそれぞれＴｉｂ、Ｔａｌ、およびＮａｖと表されている。スケールバー：３００μｍ（左）、１００μｍ（中央）、および３０μｍ（右）。（Ｄ）は組織学的スコア（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝５）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。平均値と標準誤差が示されている。
【図3】Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて炎症が増大することを示す図である。（Ａ、Ｂ）関節炎誘導後の７日目における血漿中の補体Ｃ３ａレベル（Ａ）とＣ５ａレベル（Ｂ）をＥＬＩＳＡにより測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝６）。ここで、「関節炎誘導後の７日目」は、最初のＩＩＣの皮内注射を行った日を０日としたときの７日目を指す。（Ｃ）古典経路(ＣＰ)、レクチン経路(ＬＰ)および第二経路(ＡＰ)の補体活性化をＣ３ｂ沈着により測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝８）。類似の結果を有する別の独立した実験においてデータが再現された。平均値と標準誤差が示されている。（Ｄ）関節炎誘導後の４２日目における足首の関節におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６及びＩＬ−１０のメッセンジャーＲＮＡ発現を半定量的ＰＣＲにより測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝９）。（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌのＣＴＲＰ３が存在しない、または存在する状態でのＩＬ−１α（０〜１０ｐｇ／ｍｌ）刺激後の滑膜細胞からのＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡにより測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝３）。類似の結果を有する別の独立した実験において全てのデータが再現された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。平均値と標準誤差が示されている。
【図4-1】ＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）特異的抗体産生がＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて増強されたことを示す図である。（Ａ、Ｂ）関節炎誘導後の４２日目にＣＤ４特異的抗体、Ｂ２２０特異的抗体およびＣＤ１１ｃ特異的抗体を使用して鼠径部ＬＮにおいて数（Ａ）と細胞集団の割合（Ｂ）をフローサイトメトリーにより分析した（野生型：ｎ＝９、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：ｎ＝１１）。類似の結果が別の独立した実験において得られた。（Ｃ、Ｄ）関節炎誘導後の７日目に鼠径部ＬＮ細胞を取り出し、ＩＩＣ（０、１００、２００μｇ／ｍｌ）と共に培養した。次に、ＩＩＣ特異的増殖応答を［３Ｈ］ＴｄＲの取込みにより測定した（Ｃ）。培養上清におけるＩＦＮ−γの濃度を測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝４）（Ｄ）。類似の結果が別の独立した実験において得られた。
【図4-2】ＩＩＣ特異的抗体産生がＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて増強されたことを示す図である。（Ｅ）関節炎誘導後の４２日目において血清を採取し、ＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。２つの独立した実験のデータが組み合わされ、示されている（野生型：ｎ＝１６およびＣ１ｑｔｎｆ３−／−：ｎ＝１７）。（Ｆ）Ｂ細胞を抗ＩｇＭ Ａｂ（０〜１０μｇ／ｍｌ）およびＣＴＲＰ３（０、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した。次に、増殖応答を［３Ｈ］ＴｄＲの取込みにより測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：ｎ＝３）。（Ｇ）ＣＴＲＰ３（０〜５００ｎｇ／ｍｌ）が存在する状態でのＣ５ａ刺激（０〜１ｎｇ／ｍｌ）の後の好中球からのＩＬ−１β産生をＥＬＩＳＡにより測定した（野生型、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−：それぞれｎ＝３）。別の独立した実験において全てのデータが再現可能であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。平均値と標準誤差が示されている。
【図5】Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスでは実験的免疫性脳脊髄炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis：ＥＡＥ)が悪化することを示す図である。 （Ａ）はＥＡＥの発症率を示し、（Ｂ）は重症度を示す。これらのデータは２つの独立した実験から組み合わされた（野生型：ｎ＝１８およびＣ１ｑｔｎｆ３−／−：ｎ＝１８）。
【図6】ＣＴＲＰ３投与の治療効果を示す図である。（Ａ）は関節炎の発症率を示し、（Ｂ）は重症度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
ＣＴＲＰ３の受容体ならびにその受容体発現する細胞は未だに同定されていないため、ＣＴＲＰ３の正確な役割を解明することは困難であった。それにもかかわらず、発明者らは、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスを作製し、自己免疫性関節炎の発症に対するＣＴＲＰ３の効果を調査した。発明者らは自己免疫性関節炎のモデル動物にＣＴＲＰ３を投与し、自己免疫性関節炎の発症率及び重症度が改善することを見出し、ＣＴＲＰ３が自己免疫性関節炎の発症及び重症度を軽減することが明確に示された。ＣＴＲＰ３が、新たな機序により作用する関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患の治療のための医薬として有用であることを示している。【0011】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明の態様について説明する。
【0012】
自己免疫疾患は、自己の免疫系が、自己の細胞／組織を攻撃し細胞／組織の炎症及び損傷を引き起こす疾患である。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ループス）、クローン病や炎症性大腸炎等の炎症性腸疾患及びベーチェット病、等が挙げられる。本発明に係る自己免疫疾患治療薬又は自己免疫疾患の治療方法が適用される自己免疫疾患としては、関節リウマチ又は多発性硬化症であることが特に好ましい。【0013】
関節リウマチは自己免疫疾患であり、サイトカイン、ケモカイン、メタロプロテアーゼ等によって仲介される組織障害を引き起こす。関節リウマチでは、関節に炎症を起こし関節構造に進行性の破壊をしばしば生じる。【0014】
多発性硬化症（Ｍultiple Ｓclerosis：ＭＳ）は、脳、脊髄、視神経などに炎症が起こり、運動麻痺や感覚障害などの神経症状の悪化を繰り返す、中枢神経髄鞘抗原を標的にした自己免疫疾患である。ＭＳの治療にはリツキシマブが有効と報告されており、ＭＳの病態にはＢ細胞が関与すると考えられている。【0015】
ＣＴＲＰ３は、ヒトＣＴＲＰ３の場合２４６アミノ酸残基で構成され、その典型的なアミノ酸配列及び核酸配列は以下に示す通りである。ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋには、ヒトＣＴＲＰ３のアミノ酸配列として、アクセッション番号：ＡＡＩ１２９２６及びＱ９ＢＸＪ４など、ヒトＣＴＲＰ３をコードする核酸配列として、アクセッション番号：ＢＣ１１２９２５、ＥＵ３９９２３１、ＥＵ３９９２３２などが登録されている。ヒト以外の生物に由来するＣＴＲＰ３を用いてもよく、ヒト以外の生物のＣＴＲＰ３のアミノ酸配列及び遺伝子配列もＧｅｎｅｂａｎｋデータベースなどのデータベースもしくは既報の論文等から入手することができる。【0016】
＜ヒトＣＴＲＰ３のアミノ酸配列（配列番号１）＞ＭＬＷＲＱＬＩＹＷＱＬＬＡＬＦＦＬＰＦＣＬＣＱＤＥＹＭＥＳＰＱＴＧＧＬＰＰＤＣＳＫＣＣＨＧＤＹＳＦＲＧＹＱＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＩＰＧＮＨＧＮＮＧＮＮＧＡＴＧＨＥＧＡＫＧＥＫＧＤＫＧＤＬＧＰＲＧＥＲＧＱＨＧＰＫＧＥＫＧＹＰＧＩＰＰＥＬＱＩＡＦＭＡＳＬＡＴＨＦＳＮＱＮＳＧＩＩＦＳＳＶＥＴＮＩＧＮＦＦＤＶＭＴＧＲＦＧＡＰＶＳＧＶＹＦＦＴＦＳＭＭＫＨＥＤＶＥＥＶＹＶＹＬＭＨＮＧＮＴＶＦＳＭＹＳＹＥＭＫＧＫＳＤＴＳＳＮＨＡＶＬＫＬＡＫＧＤＥＶＷＬＲＭＧＮＧＡＬＨＧＤＨＱＲＦＳＴＦＡＧＦＬＬＦＥＴＫ
【0017】
＜ヒトＣＴＲＰ３の核酸配列（配列番号２）＞ＡＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＴＣＡＧＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＡＧＴＡＡ
【0018】
本発明の１つの態様は、ＣＴＲＰ３を含有する自己免疫疾患治療薬である。ＣＴＲＰ３の製造方法は特に制限はなく、既知のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に基づいて、例えば、遺伝子組換え法、合成法等により得てもよく、市販品を用いてもよい。【0019】
遺伝子組換え法によりＣＴＲＰ３を製造する場合、例えば、発現ベクターを用いて大腸菌、酵母などの微生物、植物細胞、昆虫細胞、又は動物細胞にＣＴＲＰ３をコードする遺伝子を導入しＣＴＲＰ３を発現させればよい。ヒトＣＴＲＰ３を製造する場合、立体構造の保持及び翻訳後修飾の観点から、哺乳動物細胞が特に好ましく用いられる。ＣＴＲＰ３の化学合成法による製造は、液相法、固相法、Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法等を単独であるいは組み合わせて行えばよい。市販品としては、例えば、組換えヒトＣＴＲＰ３（Ａｖｉｓｃｅｒａバイオサイエンス社、ＵＳＡ）が挙げられる。【0020】
ＣＴＲＰ３は、その生理学的機能が損なわれない範囲で、既知のアミノ酸配列に一部のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した変異型ＣＴＲＰ３であってもよく、既知のポリヌクレオチド配列に１以上の塩基が付加、置換又は欠失した変異型ＣＴＲＰ３であってもよい。ＣＴＲＰ３は、ＣＴＲＰ３の誘導体であってもよい。ＣＴＲＰ３の誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ＣＴＲＰ３の誘導体としては、例えば、ＣＴＲＰ３に、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤又は処理剤を結合したもの等が挙げられる。【0021】
本発明に係る自己免疫疾患治療薬の投与方法は特に限定されず、非経口投与及び経口投与のいずれであってもよい。非経口的に関節内注射、筋肉内注射、静脈内注射、又は皮下注射により投与する場合には、等張化剤として食塩、グルコース等の溶質を製剤用添加物として加えた無菌溶液を調製して投与することが好ましい。非経口投与に適した医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等が挙げられる。本発明に係る自己免疫疾患治療薬は、注射剤として関節内注射又は静脈内注射によって投与することが好ましいが、これらに限定はされない。注射剤に適した剤型としては、水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、凍結乾燥注射剤、粉末注射剤、充填済注射剤及びカートリッジ剤等が挙げられる。経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、エリキシル剤等が挙げられる。
【0022】
本発明に係る自己免疫疾患治療薬の投与量は、自己免疫疾患治療薬として有効な量であればよい。例えば、ＣＴＲＰ３の投与量として０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日とすればよい。投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することが好ましい。また、複数回投与してもよい。複数回投与する場合には、投与間隔は病態、症状等により適宜増減することが好ましい。【0023】
本発明に係る自己免疫疾患治療薬は、他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、ステロイド剤、高分子ヒアルロン、又は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と組み合わせて、合剤又はキットの形態としてもよい。【0024】
本発明に係る自己免疫疾患治療薬の製剤用添加物としては、例えば、水、生理食塩液、デキストロース又は類似の糖溶液等の液状媒体、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレンルリコール等のグリコール類；亜硫酸塩等の抗酸化剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調節剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等の局所麻酔剤；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の界面活性剤などが挙げられる。また、これらの他にも剤型に合わせて公知の添加物を含有することができる。【0025】
投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ等が挙げられる。投与対象となる動物種と、自己免疫疾患に含有されるＣＴＲＰ３が由来する動物種は一致することが望ましいが、限定はされない。例えば、投与対象がヒトである場合には、薬剤としての効果が高いこと及び免疫反応等の副作用が少ないという観点から、ヒトＣＴＲＰ３若しくはヒトＣＴＲＰ３に由来する変異型ＣＴＲＰ３、又はこれらの誘導体を用いることが好ましい。しかし、ヒトを対象とした自己免疫疾患治療薬に他の動物由来のＣＴＲＰ３を用いてもよい。【0026】
本発明の１つの態様は、ＣＴＲＰ３を含む薬剤を、自己免疫疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患を治療するための方法を包含する。投与対象となる動物種としては特に制限はなく、必要に応じて適宜選択すればよい。ヒトを投与対象としてもよいし、サルなどの霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット及びウサギなどの哺乳類、トリなどの鳥類を含む非ヒト動物を投与対象としてもよい。自己免疫疾患は、関節リウマチ又は多発性硬化症であることが好ましい。【0027】
本発明の１つの態様は、Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子を欠損していることを特徴とする、関節リウマリなどの自己免疫疾患のモデル動物を包含する。自己免疫疾患のモデル動物は、Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子をホモで欠損していてもヘテロで欠損していてもよいが、ホモで欠損していることが好ましい。対象となる動物種は特に限定されないが、マウス又はラットが好ましく用いられる。ＣＴＲＰ３と自己免疫疾患との関連は知られておらず、新たな自己免疫疾患モデル動物を提供することができる。特に、関節リウマチ又は多発性硬化症のモデル動物として適している。【0028】
Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子の配列は前述の通り公知である。Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子を欠損させたモデル動物を作製する方法は公知であり、既存の方法を使用することができる。例えば、胚性幹細胞のＣ１ｑｔｎｆ３遺伝子を相同組換え法により欠損させ、これをマウス胚盤胞に注入してキメラマウスを作成し、遺伝子を欠損した生殖細胞を有するキメラマウスの交配する方法、などを例示することができる。【実施例】
【0029】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に記載がない場合には、統計解析はスチューデントの両側ｔ検定により行われた。
【0030】
［実施例１］Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの作製発明者らは以前に、２つのＲＡモデルであるＨＴＬＶ−Ｉ ＴｇマウスとＩＬ−１Ｒａ ＫＯマウスのＤＮＡマイクロアレイを用いる網羅的遺伝子発現解析に基づいて、Ｃ１ｑｔｎｆ３を自己免疫関連遺伝子の候補として特定した。ｑＰＣＲ技術を用いてＲＡモデルマウス（ＨＴＬＶ−Ｉ Ｔｇマウス及びＩＬ−１Ｒａ ＫＯマウス）の関節局所におけるＣ１ｑｔｎｆ３の発現の亢進を確認した（図１Ａ）。Ｃ１ｑｔｎｆ３の発現は、ＨＴＬＶ−Ｉ ＴｇマウスＩｌ及びＩＬ−１Ｒａ−／−マウスの他に、Ｋ／ＢｘＮマウスの関節において非常に亢進されることが報告されている（参考文献２２）。Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスを作製し、ＣＩＡの発症におけるＣＴＲＰ３の影響を調べた。
【0031】
Ｃ１ｑｔｎｆ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６胚に由来するＥＧＲ−１０１ＥＳ細胞から単離した（参考文献１４）。ターゲティングベクターは、ｌｏｘＰ配列に挟み込まれたホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）１プロモーター下のネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｄ）を含む１．７ＫｂのＤＮＡ断片でＣ１ｑドメインをコードするＣ１ｑｔｎｆ３遺伝子のエクソン４を含む１７０ｂｐのゲノム断片を置き換えることによって構築された。ターゲティングされたＥＳクローンのネガティブ選択のためにＭＣ１プロモーター下のジフテリア毒素（ＤＴ）Ａ遺伝子をターゲティングベクターの３’末端にライゲーションした。そのターゲティングベクターを電気穿孔法によりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８耐性クローンを選択した（ナカライテスク株式会社、日本）。ＰＣＲとサザンブロッティング（図１Ｃ）により相同組換えＥＳクローンをスクリーニングした。ＰＣＲには次のプライマーを使用した：５’−ＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号３）、５’−ＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴ−３（配列番号４）。また、５’プローブは次のプライマーで増幅したＤＮＡ断片を使用した：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴ−３’ （配列番号５）、５’−ＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡ−３’ （配列番号６）。 ３’プローブとしては、次のプライマーで増幅したＤＮＡ断片を使用した：５’−ＧＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧ−３’ （配列番号７）、５’−ＴＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＴＴＧＡＧＧ−３’ （配列番号８）。ターゲティングされたＥＳクローンの核型分析の後に凝集法によりキメラマウスを作製した（参考文献１５）。次のＰＣＲプライマーを使用してＣ１ｑｔｎｆ３欠損マウスの遺伝型解析を実施した：プライマー１、５’‐ＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＣＡＣＡＧ‐３’（配列番号９）；プライマー２、５’‐ＧＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＧ‐３’（配列番号１０）；プライマー３、５’‐ＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴ‐３’（配列番号１１）。プライマー１と２は野生型アレル（３３６ｂｐ）を検出するために使用され、プライマー１と３は変異体アレル（１９５ｂｐ）を検出するために使用された。また、Ｃ１ｑｔｎｆ３転写物の欠如をＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１Ｄ）。Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスは稔性があり、予想されるメンデル比で産まれ、１年齢の前には明確な異常を示さなかった。【0032】
ＣＴＲＰ３が軟骨形成前駆細胞と軟骨細胞の増殖をインビトロで促進することが報告されており（参考文献１０、２３）、ＣＴＲＰ３が軟骨形成に関係することが示唆されている。また、下顎頭軟骨の発生における関与も示唆されている（参考文献２３）。しかしながら、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて明確な骨格異常は検出されなかった。また、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスは稔性があり、予想されるメンデル比で産まれ、明らかな骨格変形は全く無かった。アディポネクチンなどの他のＣＴＲＰファミリーメンバーも軟骨形成の調節に関与しているので（参考文献２４）、ＣＴＲＰ３欠損の効果が他のＣＴＲＰファミリーメンバーによって補償されている可能性はある。【0033】
［実施例２］Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の発症率及び重症度１．コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の誘導
自己免疫性関節炎の発生におけるＣＴＲＰ３の役割を評価するために、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスを用いてＣＩＡを実施した。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した１００μｌの２ｍｇ／ｍｌのＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）（シグマ社、米国）を用いてメスの野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスに免疫した。ＣＦＡは不完全フロイントアジュバント（サーモ・サイエンティフィック社、米国）と１．６５ｍｇ／ｍｌの加熱殺菌した結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社、米国）から成り、０日目に尾の基部近くの３か所に皮内注射された。２１日目にマウスに同量のＩＩＣ／ＣＦＡを以前の注射部位の近くの皮内にブースター注射した。
【0034】
２．コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の発生の臨床スコアによる評価肉眼による評価により関節炎の発生を判定した。それぞれの足における関節炎の発生を次のように等級付けした：０＝変化無し；１＝軽度の腫脹；２＝明確な関節の腫脹；３＝重度の関節の腫脹と強直性変化（個々のマウスについて最大で１２ポイント）（参考文献１９、２０）。ＣＩＡの発症率をカイ二乗検定により評価した。
図２Ａに示されているように、野生型マウスと比較してＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおける関節炎の発生率が上昇し、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの関節炎の臨床スコアが顕著に増加した（図２Ｂ）。臨床スコアはマン・ホイットニーのＵ検定により評価した。
【0035】
３．コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の発生の病理組織診断による評価エーテル麻酔下でマウスを殺処理し、病理組織診断のために後肢の足首の関節を取り出し、固定し、脱灰化し、パラフィン包埋した。距骨全体の２〜３μｍ厚の連続切片を矢状に作製し、光学顕微鏡法による検査のためにＨ＆Ｅで染色した。踵骨と足首の関節の前方と後方の滑膜組織を含んで病変を病理組織学的に評価した。各関節を０〜３の尺度で等級付けした。その等級付けでは０＝正常、１＝わずかな炎症細胞浸潤を有する肥厚化と滑膜表層の増殖、２＝第１等級の変化と滑膜下層組織における肉芽腫病変、および３＝第２等級の変化とパンヌス形成と骨破壊である。足首の関節の関節炎インデックスを各マウスの距骨、および脛骨と踵骨を含む周りの骨の等級の平均から推定した（参考文献２０）。
【0036】
最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目における野生型マウスの足首の関節の組織に軽度の病理的変化が認められた。対照的に、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの足首の関節の組織学的調査により、滑膜表層細胞の増殖、炎症性細胞の浸潤、およびパンヌス形成を伴う骨破壊を含む、野生型マウスと比較して重症の変化が認められた（図２Ｃおよび２Ｄ）。【0037】
ＣＩＡがＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて大いに増悪化されることが示された。これらの結果より、ＣＴＲＰ３がＣＩＡの発症を抑制することが示された。【0038】
［実施例３］ＣＴＲＰ３のＲＡにおける役割の解析１．補体系における役割
ＣＴＲＰ３は補体Ｃ１ｑドメインを有するので、補体系がＣＴＲＰ３機能に関与する可能性を調査した。最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後７日目におけるマウスから血漿を採取し、ＥＬＩＳＡにより補体活性産物Ｃ３ａおよびＣ５ａのレベルを測定した。血漿中のＣ３ａとＣ５ａレベルを、捕捉抗体被覆プレートとＣ３ａまたはＣ５ａに対する検出抗体（ＢＤファーミンジェン社、米国）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、メスのマウス（８〜１０週齢）に由来する１０ｍＭのＥＤＴＡでキレートした血漿を使用して測定した。その結果、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるＣ３ａとＣ５ａのレベルはＣ１ｑｔｎｆ３＋／＋マウスにおけるものと同様であることを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。
【0039】
さらに、インビトロ補体活性化アッセイにより、ＣＴＲＰ３の補体活性化への影響を調べた。プレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク）を古典的経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）および副経路（ＡＰ）の補体活性化のアッセイのためにそれぞれＯＶＡ／抗ＯＶＡ免疫複合体（ＯＶＡ：シグマ社、米国、および抗ＯＶＡ Ａｂ：ミリポア社、ドイツ）、５０μｇ／ｍｌのマンナン類（シグマ社、米国）、または２００μｇ／ｍｌのＬＰＳ（シグマ社、米国）で被覆した（参考文献１６、１７、１８）。オスのマウスから血清を得て、ＣＰ活性とＬＰ活性のアッセイのためにはＧＶＢ＋＋緩衝液で希釈し、ＡＰ活性のためにはＧＶＢ／Ｍｇ２＋ＥＧＴＡ緩衝液で希釈した。希釈したマウス血清（１０％）をプレート上に３７℃で１時間保温し、冷２０ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにより反応を停止させた。マウスＣ３に対するラットモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、英国）によりＣ３ｂの沈着を検出した。その結果、ＣＴＲＰ３欠損はインビトロでは補体活性化に影響しないことを発見した（図３Ｃ）。
【0040】
ＣＴＲＰファミリーの１つであるアディポネクチンはＣ１ｑの活性化による補体古典的経路の調節（参考文献２５）、および補体Ｈ因子との共同作業による副経路の調節（参考文献２６）に関与することが報告されている。よって、補体系の調節におけるＣＴＲＰファミリーメンバーの関与も示唆される。しかし、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて補体系の異常は検出されなかった。このことは、ＣＴＲＰ３が補体系の調節に関与していないことを示唆する。また、Ｃ３ａとＣ５ａのレベル及びインビトロ補体活性化アッセイの結果は、ＣＴＲＰ３が補体調節因子ではないことを示している。【0041】
２．サイトカイン産生における役割野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスへの最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目における関節局所でのサイトカインの発現を調査した。足首の関節におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６及びＩＬ−１０のメッセンジャーＲＮＡ発現を定法に従い半定量的ＰＣＲにより測定した。その結果、関節炎を生じた関節局所におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の発現量は、野生型マウスよりもＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて増加することが示された（図３Ｄ）。
【0042】
これらのサイトカインは、滑膜細胞から放出されることが知られているので、ＣＴＲＰ３欠損が滑膜細胞からの炎症性サイトカイン産生に影響するか調査した。初代滑膜細胞を野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの膝頭と足首の滑膜から回収し、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養した。９６ウェルプレート上で１ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＣＴＲＰ３（アディポバイオサイエンス社、米国）が存在しない、または存在する状態で１×１０４個の細胞をＩＬ−１α（０、１、５および１０ｐｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。次に、２４時間後の培養上清中のＩＬ−６レベルをマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオレジェンド社、米国）を用いて測定した。【0043】
その結果、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの滑膜細胞に由来するＩＬ−６は野生型マウスのものと同様であり、外来性のＣＴＲＰ３は滑膜細胞からのＩＬ−６の放出を抑制しないことが示された（図３Ｅ）。【0044】
これらの観察結果より、滑膜細胞ではなく、関節に浸潤した免疫細胞がＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおける炎症の抑制の原因であることが示唆される。ＣＴＲＰ３がヒト単球における炎症性サイトカインの放出を抑制することが報告されている（参考文献１２）。しかし、ＣＴＲＰ３は関節炎の関節の滑膜細胞のサイトカイン産生を抑制しなかった。
【0045】
３．ＩＩＣに対する免疫応答における役割滑膜表層と関節周囲領域へのＴ細胞とＢ細胞の浸潤はＲＡ患者ならびにＲＡモデルにおいて共通して観察される。そこで、最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目の野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの所属リンパ節から採取したリンパ節細胞の細胞組成をフローサイトメトリー解析で調べた。定法に従い、細胞をパシフィックブルー複合体化モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ複合体化モノクローナル抗体、およびＡＰＣ複合体化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した（参考文献２１）。マウスＣＤ３とＢ２２０に対するハムスターｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１）またはラットｍＡｂ（ＲＡ３−６Ｂ２）をバイオレジェンド社（米国）から、ＣＤ１１ｃに対するハムスターｍＡｂ（ＨＬ３）をＢＤファーミンジェン社（米国）から購入し、標準的な技術に従って細胞を染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトンディッキンソン社、米国）かＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリー・スター社、米国）により分析した。
【0046】
最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目において、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスのリンパ節（ＬＮ）では野生型マウスのリンパ節よりもＴ細胞及びＢ細胞が増加する。しかし、その細胞集団はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスと野生型マウスの間で同等であることを見いだした（図４−１Ａおよび図４−１Ｂ）。【0047】
続いて、ＩＩＣ特異的リンパ節（ＬＮ）細胞の増殖応答について調べた。ＩＩＣ免疫後７日目の野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの関節炎発症部位の所属リンパ節からＬＮ細胞を回収した。１００または２００μｇ／ｍｌの変性ＩＩＣが存在しない、または存在する状態でＬＮ細胞を７２時間培養し、続いて［３Ｈ］チミジン（０．２５μＣｉ／ｍｌ）（アマーシャム社、英国）を６時間取り込ませた。次に、細胞をマイクロ９６セル・ハーベスター（スカトロン社、ノルウェー）で回収し、放射活性をマイクロ・ベータ（ファルマシア・バイオテック社、米国）で測定した。７２時間後の増殖アッセイの培養上清中のＩＦＮ‐γレベルをマウスＩＦＮ−ガンマ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、米国）で測定した。
【0048】
その結果、復帰Ｔ細胞増殖応答はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスと野生型マウスの間で同等であることを見い出した（図４−１Ｃ）。ＩＩＣ再刺激後のＩＦＮ−γ産生もＣ１ｑｔｎｆ３−／−ＬＮ細胞培養物と野生型ＬＮ細胞培養物の間で同等であった（図４−１Ｄ）。これらの結果より、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるＴ細胞プライミングは正常であることが示唆される。【0049】
次に、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるＩＩＣ特異的ＩｇＧの産生を調べた。最初のＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目に血清を採取し、ＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は、２０μｇ／ｍｌのＩＩＣで被覆したプレートとアルカリホスファターゼ複合体化ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社、米国）を使用して、ＩＩＣ／ＣＦＡ免疫後４２日目のマウスに由来する血清におけるＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルを測定した。【0050】
その結果、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの血清中のＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルは野生型マウスのものよりも有意に高いことが示された（図４−２Ｅ）。【0051】
次に、Ｂ細胞増殖に対するＣＴＲＰ３の効果をインビトロで調査した。脾臓Ｂ細胞を抗マウスＢ２２０ミクロビーズにより、製造業者（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）の指示に従って精製した。Ｂ２２０＋細胞を抗マウスＩｇＭ Ｆ（ａｂ）’２断片（０、１、５および１０μｇ／ｍｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ社、米国）と共に７２時間培養し、続いて［３Ｈ］チミジン（０．２５μＣｉ／ｍｌ）（アマーシャム社、英国）を６時間取り込ませた。次に、回収した細胞における放射活性を測定した。【0052】
Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの血清中のＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルは野生型マウスのものよりも有意に高かった。ＩＩＣに対する抗体産生がＣＩＡの誘導後にＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおいて顕著に増大することが示された。しかし、抗ＩｇＭにより誘導されるＢ細胞増殖はＣ１ｑｔｎｆ３−／−Ｂ細胞と野生型Ｂ細胞の間で同等であり、ＣＴＲＰ３はインビトロではＢ細胞増殖を抑制しなかった（図４−Ｆ）。【0053】
ＩＩＣに対する抗体産生は関節炎の発生に重要であるため、Ｃ１ｑｔｎｆ３の欠損はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるＣＩＡ発症の原因であることが示唆される。しかし、Ｂ細胞増殖応答は抗ＩｇＭによる刺激後に正常であったので、Ｂ細胞に固有の機能も正常であった。また、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスのＴ細胞におけるＩＩＣに対するリコール増殖応答には全く異常が検出されなかった。【0054】
さらに、Ｃ１ｑｔｎｆ３が好中球において発現するので好中球活性化に対するＣＴＲＰ３の効果を調べた（図４−２Ｇ）。骨髄に由来する好中球をＣ５ａで刺激し、培養上清におけるＩＬ−１βレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。好中球を抗マウスＬｙ−６Ｇミクロビーズ（ミルテニーバイオテク社、ドイツ）により骨髄から精製した。好中球をＣ５ａ（０、０．１および１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、米国）と共に１時間培養した。次に、上清中のＩＬ−１βレベルをマウスＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオレジェンド社、米国）により測定した。【0055】
その結果、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−好中球のＩＬ−１β産生は野生型マウスのものと類似しており、ＣＴＲＰ３はインビトロでは好中球からのＩＬ−１βの放出を抑制しないことが示された（図４−２Ｇ）。補体成分Ｃ５ａによる好中球活性化後のサイトカイン産生は正常であり、ＣＴＲＰ３産生細胞の１つである好中球はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの関節における炎症の増加の原因ではないと考えられた。【0056】
以上の観察結果より、ＣＴＲＰ３は抗体産生を調節することにより自己免疫性関節炎の発生において重要な役割を果たすことが示唆される。Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスに見られるＴ細胞とＢ細胞の過剰増殖がＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおける抗体産生の上昇と関節炎の悪化の原因であると考えられる。【0057】
［実施例４］ＣＴＲＰ３の多発性硬化症における役割関節リウマチと同様に多発性硬化症も自己免疫疾患の１つであるため、多発性硬化症の誘導モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis；ＥＡＥ）を誘導したマウスを用いて、多発性硬化症におけるＣＴＲＰ３の影響を評価した。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した、ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）の一部分であるＭＯＧ３５−５５ ペプチド (ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ) （配列番号１２）（Scrun Japan社製）６００μｇを用いてメスの野生型マウス又はＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスに免疫した。ＣＦＡは不完全フロイントアジュバント（サーモ・サイエンティフィック社、米国）と５ｍｇ／ｍｌの加熱殺菌した結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社、米国）から成り、０日目に四肢近くの４か所に皮内注射された。２１日目にマウスに同量のエマルジョンを以前の注射部位の近くの皮内にブースター注射した。
【0058】
肉眼による評価によりＥＡＥの発症を判定した。重症度は以下の通りに等級付けした：０＝変化無し；０．５＝尾の軽度の麻痺；１＝尾の麻痺；２＝後ろ足の軽度の麻痺；２．５＝後ろ足（片足）の麻痺；３＝両後ろ足の麻痺；３．５＝両後ろ足の麻痺および前足の握力の低下；４＝全身の麻痺。等級が０．５以上のときにＥＡＥを発症したと判断した。ＥＡＥの発症率をカイ二乗検定により評価した（Nature protocols. 2006;1(4):1810-9）。図５Ａに示されているように、野生型マウスと比較してＣ１ｑｔｎｆ３−／−マウスにおけるＥＡＥの発症率が上昇し、Ｃ１ｑｔｎｆ３−／−マウスの重症度が顕著に増加した（図５Ｂ）。臨床スコアはマン・ホイットニーのＵ検定により評価した。これらの結果から、ＥＡＥ発症においてＣＴＲＰ３は抑制的に機能していることが示された。
【0059】
［実施例５］ＣＴＲＰ３の関節炎に対する効果ＤＢＡ／１Ｊマウス（メス、６〜８週齢、ｎ＝６）を、フロインド完全アジュバント（ディフコ社、ＵＳＡ）と共にエマルジョンとした、２ｍｇ／ｍＬのニワトリＩＩ型コラーゲン（シグマ社、ＵＳＡ）（ＩＩＣ／ＣＦＡ）を１００μl用いて、０日目に尾の基部近くの３か所に皮内注射して免疫した。２１日目に、マウスに同量のＩＩＣ／ＣＦＡを以前の注射部位の近くの皮内にブースター注射した。２８日目からそれぞれのマウスに、左膝関節の関節腔に３０μＬの組換えヒトＣＴＲＰ３（３００ｎｇ／日、Ａｖｉｓｃｅｒａバイオサイエンス社、ＵＳＡ）（配列番号１）を、右膝関節の関節腔に対照としてＰＢＳ、を１日１回注射した。
【0060】
ＤＢＡ／１Ｊマウスの関節炎の進行を、以下の基準に従って評価した。・関節炎の評価基準（臨床スコア）
０：変化なし。
１：紅斑及び軽微な腫脹が足根関節に認められた。
２：紅斑及び軽微な腫脹が足根関節から足指に広がっていた。
３：紅斑及び中等度の腫脹が中足骨関節から広がっていた。
４：紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び足指に広がっていたか、又は、四肢に強直があった。
【0061】
関節炎の評価スコアが１以上であったときに関節炎が発症したと判定した。関節炎の発生率を図６Ａに、関節炎の評価スコアの平均値及び標準誤差を図６Ｂに示した。関節炎の発生率はカイ二乗検定、臨床スコアはマン・ホイットニーのＵ検定を用いて統計解析を行った。ＣＴＲＰ３の投与によって、関節炎の発生率及び臨床スコアが減少した。ＣＴＲＰ３が自己免疫性関節炎の発生を軽減することが明確に示された。ＣＴＲＰ３がＲＡなどの自己免疫疾患の治療のための医薬として有用であることを示している。
【0062】
実施例５以外の実験では、８〜１０週齢の同性のＣ５７ＢＬ／６バックグランドマウスを使用した。マウスは、東京大学医科学研究所システム疾患モデル研究センターと東京理科大学生命医科学研究所の実験動物施設内で特定病原体除去条件の下に飼育された。全ての実験は動物実験委員会により承認され、動物実験倫理指針と遺伝子操作実験安全指針に従って実施された。【0063】
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【0064】
２０１３年１１月１５日に出願された米国仮特許出願６１／９０４，５４０の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本発明に係る例示的実施形態についての以上の記載は例示および説明の目的でされたものであり、網羅的であることあるいは発明を開示されている形態そのものに限定することを意図するものではない。明らかなことではあるが、多くの改変あるいは変更が当業者には自明である。上記実施形態は発明の原理及び実用的応用を最もうまく説明し、想定される特定の用途に適するような種々の実施形態や種々の改変と共に他の当業者が発明を理解できるようにするために選択され、記載された。本発明に係る範囲の範囲は以下の請求項およびその均等物によって規定されることが意図されている。
【配列表】
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