特許 6563145 不死化汗腺筋上皮細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6563145

(24)【登録日】2019年8月2日

(45)【発行日】2019年8月21日

(54)【発明の名称】不死化汗腺筋上皮細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20190808BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20190808BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20190808BHJP

   C12N 15/37 20060101ALN20190808BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N5/074

   !C12N15/12

   !C12N15/37

【請求項の数】5

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2018-567964(P2018-567964)

(86)(22)【出願日】2018年8月7日

(86)【国際出願番号】JP2018029594

(87)【国際公開番号】WO2019031500

(87)【国際公開日】20190214

【審査請求日】2019年1月25日

(31)【優先権主張番号】特願2017-154503(P2017-154503)

(32)【優先日】2017年8月9日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】390011442

【氏名又は名称】株式会社マンダム

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100141472

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 善弘

(72)【発明者】

【氏名】早川 智久

(72)【発明者】

【氏名】倉田 隆一郎

(72)【発明者】

【氏名】藤田 郁尚

(72)【発明者】

【氏名】岡田 文裕

(72)【発明者】

【氏名】関口 清俊

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５０３１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 KURATA R. et al.，Cell Structure and Function, 2014, Vol.39, pp.101-112

【文献】 MIYOSHI H. et al.，Nature Protocols, 2013, Vol.8, No.12, pp.2471-2482

【文献】 KOO B.K. et al.，Nature Methods, 2012, Vol.9, No.1, pp.81-83

【文献】 KURATA R. et al.，PLoS One. 2017.06.21, Vol.12, No.6, #e0178709, pp.1-17，DOI: 10.1371/journal.pone.0178709

【文献】 YAO B. et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, Vol.479, No.4, pp.670-675

【文献】 BHISE N.S. et al.，Biomaterials, 2010, Vol.31, pp.8088-8096

【文献】 LI H. et al.，Cell and Tissue Research, 2013, Vol.354, pp.897-902

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

不死化遺伝子が導入された不死化汗腺筋上皮細胞であって、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現し、７回以上の継代後にスフィア形成能を有し、不死化遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ（ラージＴ）抗原遺伝子およびＳＶ４０ｔ（スモールｔ）抗原遺伝子であることを特徴とする不死化汗腺筋上皮細胞。

【請求項2】

ＡＴＰ１ａ１をさらに発現している請求項１に記載の不死化汗腺筋上皮細胞。

【請求項3】

不死化汗腺筋上皮細胞を製造する方法であって、
（Ｉ）汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、ウイルスベクターを用いる方法またはトランスフェクション法によって不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織または汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを用い、前記不死化遺伝子としてｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ（ラージＴ）抗原遺伝子およびＳＶ４０ｔ（スモールｔ）抗原遺伝子を用いる不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。

【請求項4】

前記工程（Ｉ）を行なう前に、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る工程をさらに含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として前記汗腺含有組織を用いる請求項３に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。

【請求項5】

前記工程（Ｉ）を行なう前に、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程をさらに含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として前記スフィアを用いる請求項３に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、不死化汗腺筋上皮細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、制汗剤、デオドラント剤などの外用剤、汗腺機能の改善剤などの開発などに有用な不死化汗腺筋上皮細胞およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

汗腺の機能不全および機能の異常亢進は、熱中症などの疾患、肌のベタつき、不快感などを引き起こすことがある。汗腺筋上皮細胞は、汗腺を構成する細胞の１つである。汗腺筋上皮細胞は、汗の分泌の際の汗腺の運動に関与している。また、汗腺筋上皮細胞は、汗腺の幹細胞であることが本発明者らによって報告されている（例えば、非特許文献１参照）。そこで、汗腺の機能不全および機能の異常亢進を改善する手段を開発するために、汗腺筋上皮細胞を汗腺の機能の評価などに用いることが考えられる。

【0003】

しかし、汗腺から単離された汗腺筋上皮細胞は、汗腺に存在する量が少なく、しかも継代培養が可能な回数が少ないことから、入手性および取り扱い性に劣るという欠点を有する。そこで、汗腺筋上皮細胞を不死化させて、長期間にわたる細胞増殖能を汗腺筋上皮細胞に付与することが望まれる。

【0004】

汗腺細胞を不死化させる方法として、培養容器に接着した状態で培養された汗腺細胞にシミアンウイルス４０（以下、「ＳＶ４０」という）を感染させる方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、前記方法は、汗腺細胞を生体環境と異なる環境下で培養するため、生体内における汗腺細胞と同様の機能および性質を有する不死化汗腺細胞を得難いという欠点を有する。一方、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養することが考えられる。しかし、本発明者らは、現時点では、浮遊状態の汗腺細胞に外来遺伝子を導入することができる技術を具体的に記載した文献を発見していない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】倉田 隆一郎ら、「ヒト皮膚からの汗腺筋上皮細胞の単離およびキャラクタリゼーション（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｗｅａｔ Ｇｌａｎｄ Ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ）」、セル・ストラクチャー・アンド・ファンクション（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、第３９巻、２０１４年発行、ｐｐ．１０１−１１２

【非特許文献2】キャサリン・エム・リー（ＣＡＴＨＥＲＩＮＥ Ｍ． ＬＥＥ）ら、「ＮＣＬ−ＳＧ３：経上皮イオン輸送能を有するヒトエクリン汗腺細胞株（ＮＣＬ−ＳＧ３： ａ ｈｕｍａｎ ｅｃｃｒｉｎｅ ｓｗｅａｔ ｇｌａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｈａｔ ｒｅｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第９２巻、１９８９年発行、ｐｐ．２４１−２４９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有し、当該機能および性質を有する細胞を長期間にわたって増殖させることができる不死化汗腺筋上皮細胞、ならびに当該不死化汗腺筋上皮細胞を高い製造効率で製造することができる不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、
（１）不死化遺伝子が導入された不死化汗腺筋上皮細胞であって、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現し、７回以上の継代後にスフィア形成能を有し、不死化遺伝子がｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ（ラージＴ）抗原遺伝子およびＳＶ４０ｔ（スモールｔ）抗原遺伝子であることを特徴とする不死化汗腺筋上皮細胞、
（２）ＡＴＰ１ａ１をさらに発現している前記（１）に記載の不死化汗腺筋上皮細胞、
（３）不死化汗腺筋上皮細胞を製造する方法であって、
（Ｉ）汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、ウイルスベクターを用いる方法またはトランスフェクション法によって不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織または汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを用い、前記不死化遺伝子としてｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０Ｔ（ラージＴ）抗原遺伝子およびＳＶ４０ｔ（スモールｔ）抗原遺伝子を用いる不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法、
（４）前記工程（Ｉ）を行なう前に、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去して汗腺含有組織を得る工程をさらに含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として前記汗腺含有組織を用いる前記（３）に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法、ならびに
（５）前記工程（Ｉ）を行なう前に、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程をさらに含み、前記工程（Ｉ）において、前記細胞構造体として前記スフィアを用いる前記（３）に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法
に関する。

【発明の効果】

【0008】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞によれば、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有し、当該機能および性質を有する細胞を長期間にわたって増殖させることができるという優れた効果が奏される。また、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法によれば、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を高い製造効率で製造することができるという優れた効果が奏される。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】（Ａ）は参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアの蛍光顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞の蛍光顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアの位相差顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真、（Ｄ）は参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞の共焦点顕微鏡観察の結果を示す図面代用写真である。

【図2】（Ａ）は試験例２（１）において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例２（１）において、比較例１で得られた解離汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。

【図3】（Ａ）は細胞の種類とパンサイトケラチン発現量との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）は細胞の種類とα−ＳＭＡ発現量との関係を調べた結果を示すグラフである。

【図4】（Ａ）は試験例３において、実施例２で得られたウイルス感染組織に含まれる汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例３において、比較例１で得られた解離汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を示す図面代用写真である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、前記したように、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現し、少なくとも５回の継代後にスフィア形成能を有していることを特徴とする。

【0011】

本明細書において、「不死化」とは、少なくとも５回の継代後に細胞がスフィア形成能を有していることをいう。また、「汗腺から単離された汗腺筋上皮細胞」とは、汗腺から分離され、初代培養が行なわれた汗腺筋上皮細胞（以下、「初代汗腺筋上皮細胞」ともいう）をいう。

【0012】

α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンは、生体内における汗腺筋上皮細胞のマーカーである。α−平滑筋アクチンは、汗腺収縮を引き起こすという汗腺筋上皮細胞の機能の発現に関与する。またパンサイトケラチンは、汗腺筋上皮細胞の細胞骨格を形成している。本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現しているため、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有する。さらに、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、少なくとも５回の継代後にスフィア形成能を有しているので、初代汗腺筋上皮細胞と比べて、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有する細胞を長期間にわたって増殖させることができる。

【0013】

初代汗腺筋上皮細胞は、４回目の継代より前にスフィア形成能を失う。これに対し、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、少なくとも５回、好ましくは７回以上、より好ましくは９回以上、さらに好ましくは１８回以上、より一層好ましくは１００回以上の継代後であっても、スフィア形成能を有している。したがって、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、初代汗腺筋上皮細胞と比べて、より長期間にわたって細胞増殖能を維持する。

【0014】

「生体内における汗腺筋上皮細胞の機能と同様の機能」としては、例えば、汗の分泌の際の汗腺の収縮運動などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。「生体内における汗腺筋上皮細胞の性質と同様の性質」としては、例えば、汗腺管腔細胞などへの分化能、自己複製能、α−平滑筋アクチン発現陽性、パンサイトケラチン発現陽性、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼのαサブユニット（ＡＴＰ１ａ１）発現陽性などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0015】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、ＡＴＰ１ａ１をさらに発現していることが好ましい。ＡＴＰ１ａ１は、汗腺以外の器官由来の筋上皮細胞（例えば、乳腺の筋上皮細胞など）では発現していないことから、汗腺細胞のマーカーである。したがって、ＡＴＰ１ａ１を発現する本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、汗腺以外の器官由来の筋上皮細胞と区別化することができる。

【0016】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有することから、例えば、被験物質が有する汗腺筋上皮細胞の分化調節作用の評価方法に用いられることが期待される。かかる評価方法は、例えば、
（Ａ）本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養して細胞培養物を得るステップ、
（Ｂ）本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養して細胞培養物を得るステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞培養物（Ａ）における分化マーカーの発現プロファイルと前記ステップ（Ｂ）で得られた細胞培養物（Ｂ）における分化マーカーの発現プロファイルとを調べ、前記細胞培養物（Ａ）における分化マーカーの発現プロファイルと前記細胞培養物（Ｂ）における分化マーカーの発現プロファイルとの違いに基づき、前記被験物質が有する汗腺筋上皮細胞の分化調節作用を評価するステップ
を含む。本評価方法により、被験物質が汗腺筋上皮細胞の分化を促進する作用を有することが確認された場合、当該被験物質は、例えば、汗腺筋上皮細胞の機能の異常亢進に起因する状態の改善に用いられることが期待される。また、本評価方法により、被験物質が汗腺筋上皮細胞の分化を抑制する作用を有することが確認された場合、当該被験物質は、例えば、汗腺筋上皮細胞の機能不全に起因する状態の改善に用いられることが期待される。

【0017】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞は、例えば、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入することなどによって製造することができる。

【0018】

本発明の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法は、
（Ｉ）汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含むことを特徴とする（以下、「本発明の方法」ともいう）。

【0019】

本発明の方法によれば、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入するという操作が採られているので、不死化遺伝子を高い導入効率で汗腺筋上皮細胞に導入することができる。したがって、本発明の方法によれば、高い製造効率で不死化汗腺筋上皮細胞を製造することができる。

【0020】

工程（Ｉ）では、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る。

【0021】

細胞構造体は、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているものであれば、他の汗腺細胞などを含有していてもよい。他の汗腺細胞としては、例えば、汗腺管腔細胞、汗腺分泌細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。細胞構造体としては、例えば、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0022】

汗腺含有組織は、皮膚組織のうち汗腺を含有する部分の組織である。汗腺含有組織に含まれる汗腺の表層は、汗腺筋上皮細胞によって覆われている。また、汗腺においては、表層から内部に向かって、より分化が進んだ汗腺細胞が存在している。汗腺含有組織は、例えば、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去することなどによって分離することができる。細胞構造体として汗腺含有組織を用いる場合、本発明の方法は、工程（Ｉ）を行なう前に、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る工程をさらに含めることができる。

【0023】

汗腺含有組織の製造方法としては、例えば、
（ａ１）採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する工程、および
（ａ２）工程（ａ１）で得られた組織片から膠原繊維などを除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る工程
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0024】

採取された皮膚組織としては、例えば、外科手術の際に生じた余剰皮膚などから取得され、生きている状態の皮膚組織などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。採取された皮膚組織は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、新鮮な組織であることが好ましい。採取された皮膚組織が冷蔵保存された組織である場合、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、切除後４８時間以内の組織であることが好ましい。なお、本明細書において、「生きている状態の皮膚組織」とは、生体内における本来の生物学的活性および本来の動きと同様の生物学的活性および動きを示す状態の皮膚組織をいう。皮膚組織の供給源としては、例えば、ヒトなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0025】

工程（ａ１）では、採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する。工程（ａ１）では、汗腺を視認しながら容易に汗腺を含む組織片を分離することができることから、皮膚組織をニュートラルレッドなどの染色試薬で染色して汗腺を可視化することが好ましい。皮膚組織を染色した場合、染色試薬による汗腺への影響を低減させる観点および微生物などのコンタミネーションを低減させる観点から、皮膚組織から分離された組織片を洗浄することが好ましい。

【0026】

つぎに、工程（ａ２）では、工程（ａ１）で得られた組織片から膠原繊維などを除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る。工程（ａ２）では、例えば、ディスパーゼ、コラゲナーゼなどの酵素、物理的な切除手段などを用いて組織片から膠原繊維を除去することができる。工程（ａ２）では、他の表皮付属器官の混入を防ぐ観点から、毛包、皮脂腺などを組織片からさらに除去することが好ましい。

【0027】

スフィアは、汗腺細胞の凝集塊である。スフィアは、汗腺筋上皮細胞からなる表面層を有する。スフィアにおいては、表面層から内部に向かって、より分化が進んだ汗腺細胞が存在している。スフィアは、例えば、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養することなどによって製造することができる。細胞構造体としてスフィアを用いる場合、本発明の方法は、工程（Ｉ）を行なう前に、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程をさらに含めることができる。

【0028】

スフィアの製造方法としては、例えば、
（ｂ１）採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する工程、
（ｂ２）工程（ｂ１）で得られた組織片から解離状態の汗腺細胞を得る工程、および
（ｂ３）工程（ｂ２）で得られた汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0029】

工程（ｂ１）では、採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する。工程（ｂ１）における組織片の採取は、汗腺含有組織の製造方法の工程（ａ１）における組織片の採取と同様の方法によって行なうことができる。

【0030】

つぎに、工程（ｂ２）では、工程（ｂ１）で得られた組織片から解離状態の汗腺細胞を得る。工程（ｂ２）では、細胞解離用試薬を組織片に作用させることなどによって組織片から汗腺細胞を解離させることにより、解離状態の汗腺細胞を得ることができる。細胞解離用試薬としては、例えば、サーモリシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシンなどの酵素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0031】

つぎに、工程（ｂ３）では、工程（ｂ２）で得られた解離状態の汗腺細胞をスフィア形成用培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる。スフィア形成用培地としては、例えば、上皮増殖因子と塩基性線維芽細胞増殖因子と細胞培養用人工基底膜マトリックスと無血清培地とを含有する培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。スフィア形成用培地が上皮増殖因子を含有する培地である場合、スフィア形成用培地における上皮増殖因子の含有率は、皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、皮膚組織の供給源の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。皮膚組織の供給源がヒトである場合、スフィア形成用培地における上皮増殖因子の含有率は、通常、細胞を適度に増殖させるとともに適度に分化させる観点から、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上であり、細胞の過度の増殖および分化を抑制する観点から、好ましくは１μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。スフィア形成用培地が塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する培地である場合、スフィア形成用培地における塩基性線維芽細胞増殖因子の含有率は、皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、皮膚組織の供給源の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。皮膚組織の供給源がヒトである場合、スフィア形成用培地における塩基性線維芽細胞増殖因子の含有率は、通常、細胞を適度に増殖させるとともに細胞の過度の分化を抑制する観点から、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上であり、細胞の過度の増殖を抑制するとともに細胞を適度に分化させる観点から、好ましくは１μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。無血清培地としては、例えば、ステム・セル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製の商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭａｍｍｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉｕｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名：Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0032】

汗腺細胞の培養条件は、皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、皮膚組織の供給源の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。汗腺細胞の培養条件は、例えば、培養温度、培養時間、培地のｐＨ、培養雰囲気における二酸化炭素濃度などを含む。皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養温度は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは３５℃以上、より好ましくは３６．５℃以上であり、前記と同様に生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは３８℃以下、より好ましくは３７．５℃以下である。具体的には、前記培養温度は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、通常、好ましくは３５〜３８℃、より好ましくは３６．５〜３７．５℃である。また、皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養時間は、培養温度などによって異なるので一概に決定することができないことから、培養温度などに応じて適宜決定することが好ましい。培養時間は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは６０時間以上、より好ましくは１４４時間以上であり、前記と同様に生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは６７２時間以下、より好ましくは１６８時間以下である。具体的には、前記培養時間は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、通常、好ましくは６０〜６７２時間、より好ましくは１４４〜１６８時間である。さらに、皮膚組織の供給源がヒトである場合、培地のｐＨは、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは６．８以上、より好ましくは７．０以上であり、前記と同様に生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは７．６以下、より好ましくは７．４以下である。具体的には、前記ｐＨは、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、通常、好ましくは６．８〜７．６、より好ましくは７．０〜７．４である。培養雰囲気における二酸化炭素濃度は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは４体積％以上、より好ましくは５体積％以上であり、前記と同様に生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは１０体積％以下、より好ましくは７体積％以下である。具体的には、前記二酸化炭素濃度は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、通常、好ましくは４〜１０体積％、より好ましくは５〜７体積％である。「汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態」は、汗腺細胞の培養に用いられる培養容器の壁面に当該汗腺細胞が接触していない状態であればよく、特に限定されるものではない。培養容器は、汗腺細胞が接着するのを抑制する物質を内面に有する容器であってもよい。

【0033】

工程（Ｉ）において、汗腺筋上皮細胞への不死化遺伝子の導入は、細胞構造体を培地中に浮遊させた状態に培養しながら行なわれる。「細胞構造体を培地中に浮遊させた状態」は、細胞構造体の培養に用いられる容器の内面に当該細胞構造体が接触していない状態であればよく、特に限定されるものではない。細胞構造体の培養に用いられる容器は、細胞構造体が接着するのを抑制する物質を内面に有する容器であってもよい。細胞構造体を浮遊させた状態で培養するための培地（以下、「浮遊培養用培地」ともいう）は、汗腺筋上皮細胞を生存させる栄養成分を含有する培地であれば、血清などの遺伝子導入を阻害する成分の含有量が少ない培地であってもよく、当該成分を含んでいない培地であってもよい。浮遊培養用培地は、低血清培地または無血清培地に栄養成分を補った培地であってもよく、商業的に容易に入手可能な培地であってもよい。栄養成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子（例えば、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナートなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。浮遊培養用培地における栄養成分の含有率は、低血清培地または無血清培地の種類、栄養成分の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、低血清培地または無血清培地の種類、栄養成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。これらの栄養成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。無血清培地としては、例えば、ステム・セル・テクノロジーズ社製の商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭａｍｍｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉｕｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名：Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製の商品名：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。低血清培地は、前記無血清培地に血清が添加された培地を用いることができる。低血清培地の血清濃度は、生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは０．０１体積％以上、より好ましくは０．１体積％以上であり、前記と同様に生体内における汗腺筋上皮細胞の機能および性質をより良好に維持する観点から、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．１体積％以下である。具体的には、前記血清濃度は、好ましくは０．１〜０．５体積％、より好ましくは０．０１〜０．１体積％である。

【0034】

汗腺筋上皮細胞への不死化遺伝子の導入方法としては、例えば、ウイルスベクターを用いる方法、トランスフェクション法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの方法のなかでは、簡便な操作で高い遺伝子導入効率が得られることから、ウイルスベクターを用いる方法が好ましい。したがって、前記工程（Ｉ）において、ウイルスベクターを介して不死化遺伝子を前記汗腺筋上皮細胞に導入することが好ましい。

【0035】

ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのウイルスベクターのなかでは、汗腺筋上皮細胞に対する高い遺伝子導入効率を有し、不死化遺伝子の安定導入を行なうことができることから、レンチウイルスベクターが好ましい。不死化遺伝子としては、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子、ＳＶ４０ｔ（スモールｔ）抗原遺伝子、ＳＶ４０Ｔ（ラージＴ）抗原遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子、パピローマウイルスのＥ６遺伝子、パピローマウイルスのＥ７遺伝子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの不死化遺伝子は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。これらの不死化遺伝子のなかでは、汗腺筋上皮細胞に対する高い遺伝子導入効率が得られることから、ｈＴＥＲＴ遺伝子とＳＶ４０ｔ抗原遺伝子とＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子とを併用することが好ましい。

【0036】

工程（Ｉ）において、ウイルスベクターを用いる方法によって不死化遺伝子を汗腺筋上皮細胞に導入する場合、不死化遺伝子が組み込まれたウイルスベクターがパッケージングされた組換ウイルス粒子を汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体に感染させることにより、不死化遺伝子を汗腺筋上皮細胞に導入することができる。組換ウイルス粒子は、例えば、ウイルスベクターに不死化遺伝子が組み込まれた組換ウイルスベクターとウイルスのパッケージングに必要な遺伝子を保持するベクターとをコトランスフェクション用細胞にコトランスフェクションし、組換ウイルス粒子を回収する方法などによって調製することができる。組換ウイルス粒子は、商業的に容易に入手可能な組換ウイルス粒子であってもよい。胞構造体への不死化遺伝子の導入は、遺伝子導入補助剤の存在下で組換ウイルス粒子を細胞構造体に接触させて感染させることによって行なうことができる。コトランスフェクション用細胞としては、例えば、２９３Ｔ細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。遺伝子導入補助剤としては、例えば、ポリブレン、プロタミンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0037】

細胞構造体と組換ウイルス粒子との接触方法としては、例えば、浮遊した状態の細胞構造体を含むウイルス感染用培地に組換ウイルス粒子を添加する方法、細胞構造体と組換ウイルス粒子を含むウイルス感染用培地とを混合する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ウイルス感染用培地としては、例えば、前記無血清培地にヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子、組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、グルタミン酸、非必須アミノ酸などを補った培地、商業的に容易に入手可能な培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0038】

細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を用いる場合、前記汗腺含有組織と組換ウイルス粒子との混合物１００μＬあたりの当該汗腺含有組織に含まれる汗腺の数は、遺伝子導入効率を向上させて製造効率を向上させる観点から、好ましくは１個以上、より好ましくは４個以上であり、前記と同様に遺伝子導入効率を向上させて製造効率を向上させる観点から、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下である。具体的には、前記混合物１００μＬあたりの当該汗腺含有組織に含まれる汗腺の数は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは４〜１０個である。また、細胞構造体として前記汗腺含有組織を用いる場合、感染ウイルス粒子数と汗腺数との比（感染ウイルス粒子数／汗腺数）は、好ましくは１×１０^２〜１×１０^１０である。

【0039】

細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを用いる場合、前記スフィアと組換ウイルス粒子との混合物１００μＬあたりの前記スフィアの数は、遺伝子導入効率を向上させて製造効率を向上させる観点から、好ましくは１個以上、より好ましくは４個以上であり、前記と同様に遺伝子導入効率を向上させて製造効率を向上させる観点から、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下である。具体的には、前記混合物１００μＬあたりの前記スフィアの数は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは４〜１０個である。また、細胞構造体として前記スフィアを用いる場合、感染ウイルス粒子数とスフィア数との比（感染ウイルス数／スフィア数）は、好ましくは１×１０^２〜１×１０^１０である。

【0040】

つぎに、工程（ＩＩ）では、前記工程（Ｉ）で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る。

【0041】

工程（ＩＩ）に用いられる培地は、工程（Ｉ）に用いられる浮遊培養用培地と同様である。工程（ＩＩ）における遺伝子導入体の培養条件は、スフィアの製造方法における汗腺細胞の培養条件と同様である。

【0042】

細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を用いた場合、工程（Ｉ）で得られる遺伝子導入体は、汗腺以外の組織などを含むことから、遺伝子導入体から不死化汗腺筋上皮細胞を単離する工程をさらに行なうことができる。遺伝子導入体からの不死化汗腺筋上皮細胞の単離は、例えば、細胞解離用試薬を遺伝子導入体に作用させること、力学的刺激を遺伝子導入体に付与すること、細胞解離用試薬と力学的刺激とを併用することなどによって行なうことができる。細胞解離用試薬は、前記スフィアの製造方法の工程（ｂ２）に用いられる細胞解離用試薬と同様である。力学的刺激としては、ピペッティングによる刺激などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0043】

遺伝子導入体が不死化汗腺筋上皮細胞以外の細胞を含む場合、本発明の方法は、工程（ＩＩ）の後に、不死化汗腺筋上皮細胞を単離する工程をさらに含めることができる。不死化汗腺筋上皮細胞の単離方法としては、例えば、汗腺筋上皮細胞特異的マーカーを指標に利用する細胞ソーティングなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

【0044】

本発明の方法で得られた不死化汗腺筋上皮細胞は、汗腺筋上皮細胞の特徴(i)〜(iii)：(i)α−平滑筋アクチン発現陽性、
(ii)パンサイトケラチン発現陽性およびＡＴＰ１ａ１発現陽性を示すこと、および
(iii)５回以上の継代後にスフィア形成能を有すること
を調べることによって同定することができる。α−平滑筋アクチン、パンサイトケラチンおよびＡＴＰ１ａ１それぞれの発現の有無は、例えば、蛍光免疫細胞染色法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法などによって確認することができる。スフィア形成能は、前述のスフィアの製造方法と同様の方法によって確認することができる。

【0045】

以上説明したように、本発明の不死化筋上皮細胞によれば、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有し、当該機能および性質を有する細胞を長期間にわたって増殖させることができる。また、本発明の不死化筋上皮細胞の製造方法によれば、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を高い製造効率で得ることができる。したがって、本発明の不死化筋上皮細胞および本発明の不死化筋上皮細胞の製造方法は、制汗剤、デオドラント剤などの外用剤、汗腺機能の改善剤などの開発などに用いられることが期待されるものである。

【実施例】

【0046】

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。以下において、各略語および各用語の意味は、以下のとおりである。
＜略語および用語の説明＞
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質
ＧＦＰ組換ウイルス：ＧＦＰ遺伝子を保持する組換レンチウイルス
ｈＴＥＲＴ組換ウイルス：ｈＴＥＲＴ遺伝子を保持する組換レンチウイルス
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＳＶ４０Ｔｔ組換ウイルス：ＳＶ４０ｔ抗原遺伝子およびＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を保持する組換レンチウイルス
α−ＳＭＡ： α−平滑筋アクチン

【0047】

製造例１
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭａｍｍｏＣｕｌｔ ＨｕｍａｎＭｅｄｉｕｍ〕に、ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子、組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリンおよびペニシリン／ストレプトマイシン混合液〔ペニシリン濃度１００００ユニット／ｍＬ、ストレプトマイシン濃度１００００μｇ／ｍＬ〕をそれぞれの濃度が１０．５μｇ／ｍＬ（ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート）、１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト上皮増殖因子）、１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子）、４μｇ／ｍＬ（ヘパリン）および１００μｇ／ｍＬ（ペニシリン／ストレプトマイシン混合液）となるように添加して培地（Ｉ）を得た。

【0048】

製造例２
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭａｍｍｏＣｕｌｔ ＨｕｍａｎＭｅｄｉｕｍ〕に、ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子、組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリンおよびペニシリン／ストレプトマイシン混合液および細胞培養用人工基底膜マトリックス〔コーニング・インコーポレーティッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）製、商品名：Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ〕をそれぞれの濃度が１０．５μｇ／ｍＬ（ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート）、１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト上皮増殖因子）、１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子）、４μｇ／ｍＬ（ヘパリン）、１００μｇ／ｍＬ（ペニシリン／ストレプトマイシン混合液）および２体積％（細胞培養用人工基底膜マトリックス）となるように添加して培地（ＩＩ）を得た。

【0049】

製造例３
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＭａｍｍｏＣｕｌｔ ＨｕｍａｎＭｅｄｉｕｍ〕に、ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子および組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をそれぞれの濃度が１０．５μｇ／ｍＬ（ヒドロコルチゾン−２１−ヘミスクシナート）、１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト上皮増殖因子）および１０ｎｇ／ｍＬ（組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子）となるように添加して培地（ＩＩＩ）を得た。ポリブレンをその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように培地（ＩＩＩ）に添加してウイルス感染用培地を得た。

【0050】

製造例４
トリプシン溶液〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名：２．５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ （１０×）、ｎｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ〕、ダルベッコＰＢＳ〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名：ＤＰＢＳ、ｎｏ ｃａｌｃｉｕｍ、ｎｏ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ〕、およびＥＤＴＡ溶液〔ニッポンジーン社製、商品名：０．５Ｍ ＥＤＴＡ〕を混合することで、０．５質量％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を得た。

【0051】

製造例５
粉末状のディスパーゼ〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名：Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ，ｐｏｗｄｅｒ〕をダルベッコＰＢＳ〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名：ＤＰＢＳ，ｎｏ ｃａｌｃｉｕｍ，ｎｏ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ〕に溶解させることで、５Ｕ／ｍＬディスパーゼ液を得た。

【0052】

参考例１
（１）解離状態の汗腺細胞の製造
皮膚組織として、生体（６８歳のヒト）から切除後すぐに４℃で冷蔵保存され、切除後４８時間以内の眼瞼の皮膚組織を用いた。皮膚組織を１０μＭニュートラルレッド（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ）含有ＰＢＳに浸すことにより、前記皮膚組織中の汗腺にニュートラルレッドを取り込ませた。つぎに、光学顕微鏡下でピンセットとハサミとを用い、前記皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離した。分離された組織片を１５ｍＬ容量チューブ中の無菌ＰＢＳ内に集めた。前記組織片を含有するＰＢＳを軽く振とうさせた後、当該ＰＢＳを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。

【0053】

製造例１で得られた培地（Ｉ）１０ｍＬを前記チューブ中の前記組織片と混合した。つぎに、コラゲナーゼＩＩをその濃度が６００Ｕ／ｍＬとなるように前記チューブ中の培地（Ｉ）に添加した。その後、前記チューブ中の前記組織片をローテーターで回転させながら３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートすることにより、前記組織片から膠原繊維を除去した。

【0054】

インキュベーション開始時から４時間経過後、前記チューブ中の培地（Ｉ）および膠原繊維除去後の組織片を直径１０ｃｍのディッシュに移した。光学顕微鏡下でピペットを用い、前記ディッシュ上の前記組織片を採取した。採取された組織片を１５ｍＬ容量チューブ中の無菌ＰＢＳ内に集めた。前記組織片を含有するＰＢＳを軽く振とうさせた後、当該ＰＢＳを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。

【0055】

洗浄後の組織片と、製造例４で得られた０．５質量％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍＬとを１５ｍＬ容量チューブ中で混合した。ピペットを用い、前記チューブ中の汗腺を３分間撹拌することにより、汗腺を構成する汗腺細胞を互いに解離させ、解離状態の汗腺細胞（以下、「解離汗腺細胞」ともいう）を得た。

【0056】

（２）スフィア培養
前記（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞と２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬとを混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して当該混合液から上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例５で得られた５Ｕ／ｍＬディスパーゼ液１ｍＬを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ：４０μｍ、コーニング社製、商品名：Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）４０μｍセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。

【0057】

２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬを前記チューブ中の解離汗腺細胞の浮遊液と混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して当該混合液から上清を除去し、細胞含有液を得た。細胞含有液の一部と血球計算盤とを用い、細胞含有液の細胞数を算出した。解離汗腺細胞の濃度が１×１０³〜７×１０³個／ｍＬとなるように前記チューブに製造例２で得られた培地（ＩＩ）を添加し、解離汗腺細胞を含有する混合液を得た。得られた混合液を低接着プレート〔コーニング社製、商品名：超低接着プレート２４ウェル〕に入れた。前記プレート中の培地（ＩＩ）に浮遊させた状態で前記解離汗腺細胞を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートした。

【0058】

培養開始後、スフィアが形成された時点で、前記スフィアを１５ｍＬ容量チューブに移した。前記スフィアを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して液体成分を除去した。つぎに、細胞回収用溶液（コーニング社製、商品名：セルリカバリーソリューション）１ｍＬを前記チューブ中のスフィアと混合し、スフィア含有液を得た。その後、得られたスフィア含有液が入ったチューブを氷上で１〜２時間静置した。

【0059】

（３）ウイルス感染
ＧＦＰ組換ウイルス粒子溶液〔アプライド・バイオロジカル・マテリアルズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）社製、商品名：ＧＦＰ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ、ＧＦＰ組換ウイルス粒子濃度：１×１０⁶Ｕ／ｍＬ〕をポリエチレングリコール沈殿法にしたがって濃縮した。得られた濃縮物を前記ウイルス感染用培地でＧＦＰ組換ウイルス粒子濃度が１×１０⁸Ｕ／ｍＬになるように希釈することにより、ＧＦＰ組換ウイルス希釈液を得た。

【0060】

前記（２）「スフィア培養」で得られたスフィア含有液とＰＢＳ９ｍＬとを混合した。つぎに、得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後のスフィア４〜１０個と製造例３で得られたウイルス感染用培地９０μＬとを混合した。得られた混合液に前記ＧＦＰ組換ウイルス希釈液１０μＬを添加し、スフィア−ウイルス混合液を得た。前記スフィア−ウイルス混合液を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートしてスフィアを構成する汗腺細胞に組換ウイルスを感染させることにより、スフィアを構成する細胞にＧＦＰ遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から２４時間経過後、ウイルス感染汗腺スフィアを回収した。

【0061】

参考例２
参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞とＰＢＳ９ｍＬとを混合した。つぎに、得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後の解離汗腺細胞５×１０²〜１×１０⁵個と製造例３で得られたウイルス感染用培地９０μＬとを混合した。得られた混合液に、前記ＧＦＰ組換ウイルス希釈液１０μＬを添加し、スフィア−ウイルス混合液を得た。前記スフィア−ウイルス混合液を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートして解離汗腺細胞に組換ウイルスを感染させることにより、解離汗腺細胞にＧＦＰ遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から２４時間経過後、ウイルス感染汗腺細胞を回収した。

【0062】

試験例１
参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアおよび参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞におけるＧＦＰに基づく蛍光を蛍光顕微鏡下に観察した。また、参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアおよび参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞を共焦点顕微鏡下に観察した。

【0063】

参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアにおけるＧＦＰに基づく蛍光を蛍光顕微鏡下に観察した結果を図１（Ａ）、参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞におけるＧＦＰに基づく蛍光を蛍光顕微鏡下に観察した結果を図１（Ｂ）、参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを共焦点顕微鏡下に観察した結果を図１（Ｃ）、参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞を共焦点顕微鏡下に観察した結果を図１（Ｄ）に示す。図中、スケールバーは１５３μｍを示す。また、図１（Ａ）における矢頭はウイルス感染汗腺スフィア、図１（Ｂ）における矢頭はウイルス感染汗腺細胞を示す。

【0064】

図１（Ａ）および（Ｃ）に示された結果から、参考例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアでは、表面に存在する細胞全体にＧＦＰが発現していることがわかる。これに対し、参考例２で得られたウイルス感染汗腺細胞は、ＧＦＰを発現している細胞がほとんど存在していないことがわかる。これらの結果から、培地中にスフィアを浮遊させた状態で当該スフィアに含まれる汗腺細胞にウイルスを感染させることにより、解離した状態の汗腺細胞にウイルスを感染させる場合と比べ、高い効率で遺伝子を汗腺細胞に導入することができることがわかる。

【0065】

実施例１
参考例１の（２）「スフィア培養」で得られたスフィア含有液とＰＢＳ９ｍＬとを混合した。つぎに、得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後のスフィア４〜１０個と製造例３で得られたウイルス感染用培地１００μＬとを混合した。得られた混合液に、ｈＴＥＲＴ組換ウイルス粒子溶液〔アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製の商品名：Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ組換ウイルス粒子濃度：１×１０⁹Ｕ／ｍＬ〕０．５μＬとＳＶ４０Ｔｔ組換ウイルス粒子溶液〔アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製の商品名：Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ、ＳＶ４０Ｔｔ組換ウイルス粒子濃度：１×１０⁹Ｕ／ｍＬ〕０．５μＬとを添加し、スフィア−ウイルス混合液を得た。前記スフィア−ウイルス混合液を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートしてスフィアを構成する汗腺細胞に組換レンチウイルスを感染させることにより、スフィアを構成する細胞に不死化遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から２４時間経過後、ウイルス感染汗腺スフィアを回収した。

【0066】

比較例１
参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」および（２）の「スフィア培養」と同様の操作を行なうことにより、スフィアを得た。

【0067】

試験例２
（１）スフィア継代培養
以下の（１−１）および（１−２）を行なうことを「１回の継代培養」と定義した。

【0068】

（１−１）解離汗腺細胞の製造
実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアと、製造例４で得られた０．５質量％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍＬとを１５ｍＬ容量チューブ中で混合した。ピペットを用い、前記チューブ中の汗腺を３分間撹拌することにより、汗腺を構成する汗腺細胞を互いに解離させ、解離汗腺細胞を得た。

【0069】

また、前記において、実施例で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに比較例１で得られたスフィアを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。

【0070】

（１−２）スフィア培養
前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞と、２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬとを混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例５で得られた５Ｕ／ｍＬディスパーゼ液１ｍＬを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ：４０μｍ、コーニング製、商品名：Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）４０μｍセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。

【0071】

２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬを前記チューブ中の解離汗腺細胞の浮遊液と混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。つぎに、解離汗腺細胞の濃度が２．３×１０³〜２．７×１０³個／ｍＬとなるように前記チューブに製造例２で得られた培地（ＩＩ）を添加し、解離汗腺細胞を含有する混合液を得た。得られた混合液を低接着プレート〔コーニング社製、商品名：超低接着プレート２４ウェル〕に入れた。前記プレート中の培地（ＩＩ）に浮遊させた状態で前記解離汗腺細胞を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートした。

【0072】

培養開始後、スフィアが形成された時点で、前記スフィアを１５ｍＬ容量チューブに移した。前記スフィアを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して液体成分を除去した。つぎに、細胞回収用溶液（コーニング社製、商品名：セルリカバリーソリューション）１ｍＬを前記チューブ中のスフィアと混合し、スフィア含有液を得た。その後、得られたスフィア含有液が入ったチューブを氷上で１〜２時間静置した。

【0073】

（１−３）スフィア形成能の評価
前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」および（１−２）「スフィア培養」からなる一連の操作を繰り返し、前記（１−２）「スフィア培養」におけるスフィアの形成の有無に基づき、スフィア形成能を調べた。

【0074】

実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を図２（Ａ）、比較例１で得られた解離汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を図２（Ｂ）に示す。図中、矢頭は、スフィアを示す。

【0075】

図２に示された結果から、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる汗腺細胞は、９回の継代後であってもスフィア形成能を有していることがわかる。これに対し、比較例１で得られた解離汗腺細胞は、４回の継代後にスフィア形成能を有していないことがわかる。

【0076】

なお、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる汗腺細胞は、２０回以上継代した場合であってもスフィアを形成することが確認された。

【0077】

以上の結果から、培地中にスフィアを浮遊させた状態で当該スフィアに含まれる汗腺細胞に、不死化遺伝子を有するレンチウイルスを感染させることにより、不死化汗腺細胞が得られることがわかる。

【0078】

（２）不死化汗腺細胞の同定
抗パンサイトケラチン抗体、抗パンサイトケラチン抗体に対する蛍光標識二次抗体、抗α−ＳＭＡ抗体および当該抗α−ＳＭＡ抗体に対する蛍光標識二次抗体を用いて前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞および比較例１で得られた解離汗腺細胞の蛍光免疫染色を行なった。つぎに、免疫染色後の解離汗腺細胞におけるパンサイトケラチンに基づく蛍光の強度〔以下、「蛍光強度Ａ」という〕およびα−ＳＭＡに基づく蛍光の強度〔以下、「蛍光強度Ｂ」という〕を測定した。

【0079】

つぎに、評価対象の細胞における蛍光強度Ａから比較例１で得られた解離汗腺細胞における蛍光強度Ａを減ずることにより、評価対象の細胞におけるパンサイトケラチン発現量を算出した。また、評価対象の細胞における蛍光強度Ｂから比較例１で得られた解離汗腺細胞における蛍光強度Ｂを減ずることにより、評価対象の細胞におけるα−ＳＭＡ発現量を求めた。

【0080】

細胞の種類とパンサイトケラチン発現量との関係を調べた結果を図３（Ａ）、細胞の種類とα−ＳＭＡ発現量との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）中、レーン１は実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺細胞におけるパンサイトケラチン発現量、レーン２は比較例１で得られた解離汗腺細胞におけるパンサイトケラチン発現量を示す。図３（Ｂ）中、レーン１は実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺細胞におけるα−ＳＭＡ発現量、レーン２は比較例１で得られた解離汗腺細胞におけるα−ＳＭＡ発現量を示す。

【0081】

図３（Ａ）および（Ｂ）に示された結果から、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺細胞（レーン１参照）は、筋上皮細胞マーカーであるパンサイトケラチンおよびα−ＳＭＡの両方を発現していることがわかる。これらの結果から、前記不死化汗腺細胞は、不死化汗腺筋上皮細胞であることがわかる。したがって、培地中にスフィアを浮遊させた状態で当該スフィアに含まれる汗腺細胞にウイルスを感染させることにより、不死化汗腺筋上皮細胞が得られることがわかる。

【0082】

（３）不死化汗腺筋上皮細胞における汗腺細胞マーカーの発現の検討
前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡをその濃度が１μｇ／μＬとなるようにＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーの精製水〔ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名：ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ〕を添加した。逆転写キット〔ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名：Ｑｕａｔｉｔｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕を用い、前記全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し測定試料を得た。

【0083】

得られた測定試料を鋳型とし、ＰＣＲ用キット〔東洋紡（株）製、商品名：ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ〕とリアルタイムＰＣＲ装置〔アプライド・バイオ・システムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）製、商品名：ＶｉｉＡ７〕と、ＡＴＰ１ａ１遺伝子を増幅するためのプライマー対とを用い、ＡＴＰ１ａ１遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とするヌクレオチド合成量が閾値に達するまでのサイクル数（以下、「Ｃｔ_A値」という）を測定した。また、前記において、ＡＴＰ１ａ１遺伝子を増幅するためのプライマー対を用いる代わりに対照遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのプライマー対を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、対照遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とするヌクレオチド合成量が閾値に達するまでのサイクル数（以下、「Ｃｔ_B値」という）を測定した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法におけるサーマルプロファイルは、９５℃で１分間の処理後、９５℃で５秒間の変性と５５℃で１０秒間のアニーリングと７２℃２０秒間の伸長とを１サイクルとする４０サイクルの反応である。

【0084】

Ｃｔ_A値およびＣｔ_B値を用い、式（Ｉ）：

【0085】

【数1】

【0086】

にしたがい、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺筋上皮細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の発現値を求めた。

【0087】

また、前記において、前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに対照細胞としてＡＴＰ１ａ１遺伝子を発現していない皮膚表皮細胞を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、対照細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の発現値を求めた。

【0088】

不死化汗腺筋上皮細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の発現値から対照細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の発現値を減じることにより、不死化汗腺筋上皮細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の補正発現値を求めた。つぎに、前記補正発現値に基づき、以下の評価基準に従って、不死化汗腺筋上皮細胞がＡＴＰ１ａ１遺伝子を発現しているかどうかを評価した。
＜評価基準＞
「不死化汗腺筋上皮細胞がＡＴＰ１ａ１遺伝子を発現している」
・・・補正発現値が「正の値」である。
「不死化汗腺筋上皮細胞がＡＴＰ１ａ１遺伝子を発現していない」
・・・補正発現値が「０」または「負の値」である。

【0089】

その結果、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺筋上皮細胞におけるＡＴＰ１ａ１遺伝子の発現値が正の値であったことから、不死化汗腺筋上皮細胞がＡＴＰ１ａ１遺伝子を発現していることがわかった。ＡＴＰ１ａ１は、汗腺筋上皮細胞マーカーの１つである。したがって、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる不死化汗腺筋上皮細胞は、汗腺筋上皮細胞マーカーを発現していることがわかる。

【0090】

実施例２
（１）汗腺含有組織の製造
皮膚組織として、生体（４１歳のヒト）から切除後すぐに４℃で冷蔵保存され、切除後４８時間以内の眼瞼の皮膚組織を用いた。皮膚組織を１０μＭニュートラルレッド含有ＰＢＳに浸すことにより、前記皮膚組織中の汗腺にニュートラルレッドを取り込ませた。つぎに、光学顕微鏡下でピンセットとハサミとを用い、前記皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離した。分離された組織片を１５ｍＬ容量チューブ中の無菌ＰＢＳ内に集めた。前記組織片を含有するＰＢＳを軽く振とうさせた後、当該ＰＢＳを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。

【0091】

製造例１で得られた培地（Ｉ）１０ｍＬを前記チューブ中の前記組織片と混合した。つぎに、コラゲナーゼＩＩをその濃度が６００Ｕ／ｍＬとなるように前記チューブ中の培地（Ｉ）に添加した。その後、前記チューブ中の前記組織片をローテーターで回転させながら３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートすることにより、前記組織片から膠原繊維を除去した。

【0092】

インキュベーション開始時から４時間経過後、前記チューブ中の培地（Ｉ）および膠原繊維除去後の組織片を直径１０ｃｍのディッシュに移した。光学顕微鏡下でピペットを用い、前記ディッシュ上の前記組織片を採取した。採取された組織片を１５ｍＬ容量チューブ中の無菌ＰＢＳ内に集めた。前記組織片を含有するＰＢＳを軽く振とうさせた後、当該ＰＢＳを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。

【0093】

洗浄後の組織片と培地（Ｉ）１０ｍＬとを１５ｍＬ容量チューブ中で混合した。得られた混合液にディスパーゼをその濃度が１Ｕ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合液を直径１０ｃｍのディッシュに移した後、前記混合液を静置状態で３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートした。インキュベーション開始時から８時間経過後、前記混合液に２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液１０ｍＬを添加して混合液を希釈して酵素反応を停止させた。

【0094】

光学顕微鏡下でピペットを用い、前記ディッシュ上の汗腺を含む組織片を採取した。採取された組織片を１５ｍＬ容量チューブ中の無菌ＰＢＳ内に集めた。前記組織片を含むＰＢＳを軽く振とうさせた後、当該ＰＢＳを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、汗腺含有組織を得た。

【0095】

（２）ウイルス感染
ｈＴＥＲＴ組換ウイルス粒子溶液とＳＶ４０Ｔｔ組換ウイルス粒子溶液とを前記ウイルス感染用培地でｈＴＥＲＴ組換ウイルス粒子濃度が１×１０⁸Ｕ／ｍＬおよびＳＶ４０Ｔｔ組換ウイルス粒子濃度が１×１０⁸Ｕ／ｍＬとなるように希釈して不死化遺伝子含有組換ウイルス希釈液を得た。

【0096】

前記（１）「汗腺含有組織の製造」で得られた汗腺含有組織とＰＢＳ９ｍＬとを混合した。つぎに、得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後の４〜１０個の汗腺を含有する汗腺含有組織と製造例３で得られたウイルス感染用培地１００μＬとを混合した。得られた混合液に前記不死化遺伝子含有組換ウイルス希釈液２μＬを添加し、組織−ウイルス混合液を得た。前記組織−ウイルス混合液を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートして汗腺を構成する汗腺細胞に組換レンチウイルスを感染させた。さらに、ウイルス感染開始から３０分〜１２時間ごとに前記不死化遺伝子含有組換ウイルス希釈液２μＬを添加して前記汗腺含有組織に含まれる汗腺細胞に組換ウイルスを感染させることにより、汗腺細胞に不死化遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から３３時間経過後、ウイルス感染組織を回収した。

【0097】

試験例３
試験例２の（１）「スフィア継代培養」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例２で得られたウイルス感染組織を用いたことを除き、試験例２の（１）「スフィア継代培養」と同様の操作を行ない、スフィア継代培養を行なった。

【0098】

実施例２で得られたウイルス感染組織に含まれる汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を図４（Ａ）、比較例１で得られた解離汗腺細胞のスフィア形成能と継代数との関係を調べた結果を図４（Ｂ）に示す。図中、矢頭は、スフィアを示す。

【0099】

図４に示された結果から、実施例２で得られたウイルス感染組織に含まれる汗腺細胞は、７回目の継代培養後においてもスフィアを形成することができるのに対し、比較例１で得られた解離汗腺細胞は、４回目の継代培養後にスフィアを形成することができないことがわかる。

【0100】

なお、実施例２で得られたウイルス感染組織に含まれる汗腺細胞は、１２回以上継代した場合であってもスフィアを形成することが確認された。また、実施例２で得られたウイルス感染組織に含まれる汗腺細胞におけるパンサイトケラチンおよびα−ＳＭＡの発現の有無を調べたところ、パンサイトケラチンおよびα−ＳＭＡが発現していることが確認された。

【0101】

以上の結果から、培地中に汗腺含有組織を浮遊させた状態で当該汗腺含有組織に含まれる汗腺筋上皮細胞にウイルスを感染させることにより、不死化汗腺筋上皮細胞が得られることがわかる。

【0102】

参考例３〜７
（１）解離汗腺細胞の製造
参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」において、６８歳のヒトの眼瞼の皮膚組織を用いる代わりに２０歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（参考例３）、７１歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（参考例４）、７４歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（参考例５）、５１歳のヒトの腹部の皮膚組織（参考例６）または５５歳のヒトの腹部の皮膚組織（参考例７）を用いたことを除き、参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。

【0103】

（２）スフィア培養
参考例１の（２）「スフィア培養」において、参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに参考例３〜７の（１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた各解離汗腺細胞を用いたことを除き、参考例１の（２）「スフィア培養」と同様の操作を行ない、スフィア含有液を得た。

【0104】

実施例３〜７
実施例１において、参考例１の（２）「スフィア培養」で得られたスフィア含有液を用いる代わりに参考例３で得られたスフィア含有液（実施例３）、参考例４で得られたスフィア含有液（実施例４）、参考例５で得られたスフィア含有液（実施例５）、参考例６で得られたスフィア含有液（実施例６）または参考例７で得られたスフィア含有液（実施例７）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ウイルス感染汗腺スフィアを得た。

【0105】

比較例３〜７
参考例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」において、６８歳のヒトの眼瞼の皮膚組織を用いる代わりに２０歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（比較例３）、７１歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（比較例４）、７４歳のヒトの眼瞼の皮膚組織（比較例５）、５１歳のヒトの腹部の皮膚組織（比較例６）または５５歳のヒトの腹部の皮膚組織（比較例７）を用いたことを除き、比較例１の（１）「解離状態の汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。

【0106】

試験例４
試験例２の（１）「スフィア継代培養」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例３〜７で得られたウイルス感染組織を用いたことを除き、試験例２の（１）「スフィア継代培養」と同様の操作を行ない、スフィア継代培養を行なった。

【0107】

また、試験例２の（１）「スフィア継代培養」において、比較例１で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに比較例３〜７で得られた解離汗腺細胞を用いたことを除き、試験例２の（１）「スフィア継代培養」と同様の操作を行ない、スフィア継代培養を行なった。スフィア形成能を有する細胞の継代数を表１に示す。

【0108】

【表1】

【0109】

表１に示された結果から、実施例３〜７で得られたウイルス感染汗腺スフィアに含まれる汗腺細胞は、少なくとも１８回の継代後であってもスフィア形成能を有していることがわかる。これに対し、比較例３および５〜７で得られた解離汗腺細胞は、２回の継代後にスフィア形成能を失うことがわかる。また、比較例４で得られた解離汗腺細胞は、３回の継代後にスフィア形成能を失うことがわかる。

【0110】

これらの結果から、培地中にスフィアを浮遊させた状態で当該スフィアに含まれる汗腺細胞にウイルスを感染させることにより、皮膚組織の供給源の種類の如何を問わず、不死化汗腺細胞が得られることがわかる。

【0111】

実施例１および３〜７で用いられたスフィアならびに実施例２で用いられた汗腺含有組織は、いずれも、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している構造を有している。したがって、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を保持するウイルスを当該細胞構造体に感染させることにより、不死化遺伝子を筋上皮細胞に導入することができることがわかる。

【0112】

試験例５
（１）スフィア継代培養
以下の（１−１）および（１−２）を行なうことを「１回の継代培養」と定義した。

【0113】

（１−１）解離汗腺細胞の製造
試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例３〜７で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いたことを除き、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。

【0114】

（１−２）スフィア培養
前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞の一部（細胞数Ａの解離汗腺細胞）と、２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬとを混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例５で得られた５Ｕ／ｍＬディスパーゼ液１ｍＬを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ：４０μｍ、コーニング製、商品名：Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）４０μｍセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。

【0115】

２質量％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液９ｍＬを前記チューブ中の解離汗腺細胞の浮遊液と混合した。得られた混合液を３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して上清を除去した。

【0116】

つぎに、得られた解離汗腺細胞を製造例２で得られた培地（ＩＩ）に２．５×１０³個／ｍＬになるように添加し、解離汗腺細胞を含有する混合液を得た。得られた混合液を低接着プレート〔コーニング社製、商品名：超低接着プレート２４ウェル〕に入れた。前記プレート中の培地（ＩＩ）に浮遊させた状態で前記解離汗腺細胞を３７℃の５体積％二酸化炭素雰囲気中でインキュベートした。

【0117】

培養開始後、スフィアが形成された時点で、前記スフィアを１５ｍＬ容量チューブに移した。前記スフィアを３５０×ｇおよび４℃で５分間の遠心分離に供して液体成分を除去した。つぎに、細胞回収用溶液（コーニング社製、商品名：セルリカバリーソリューション）１ｍＬを前記チューブ中のスフィアと混合し、スフィア含有液を得た。その後、得られたスフィア含有液が入ったチューブを氷上で１〜２時間静置した。

【0118】

（１−３）細胞増殖能の評価
前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」および（１−２）「スフィア培養」からなる一連の操作をスフィア形成が停止するまで繰り返した。

【0119】

前記細胞数Ａと、継代数ｎ（ｎは正の整数を示す）のスフィア継代培養時に前記（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞の数（以下、「細胞数Ｂ」という）とを用い、式（ＩＩ）：
［各継代間での細胞増殖倍率（Ｋ_X）］＝［細胞数Ｂ］／［細胞数Ａ］
（ＩＩ）
にしたがい、各継代間での細胞増殖倍率（Ｋ_X）を求めた。各継代間での細胞増殖倍率（Ｋ_X）を用い、式（ＩＩＩ）にしたがい、
［総細胞増殖倍率］＝Ｋ_１×Ｋ_２・・・×Ｋ_X （ＩＩＩ）
（式中、Ｘは正の整数を示す）
にしたがい、実施例３〜７で得られたスフィアに含まれる汗腺細胞の総細胞増殖倍率を求めた。その結果を表２に示す。

【0120】

【表2】

【0121】

表２に示された結果から、実施例３〜７で得られたスフィアに含まれる不死化汗腺細胞の総細胞増殖倍率は、２．６×１０¹³倍以上であることがわかる。これに対し、不死化されていない汗腺細胞の総細胞増殖倍率は２．１倍以下であった。これらの結果から、実施例３〜７で得られたスフィアに含まれる不死化汗腺細胞の細胞増殖能は、不死化されていない汗腺細胞の細胞増殖能と比べて向上していることがわかる。

【0122】

試験例６
（１）解離汗腺細胞の製造
試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例３で得られたスフィア（実験番号１）、実施例４で得られたスフィア（実験番号２）または実施例５で得られたスフィア（実験番号３）を用いたことを除き、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。なお、前記において、実施例３で得られたスフィアとして継代数５回のスフィア、実施例４で得られたスフィアとして継代数８回のスフィア、実施例５で得られたスフィアとして継代数１４回のスフィアを用いた。

【0123】

（２）解離汗腺細胞の凍結保存
試験例６の（１）「解離完成細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を表３に示される濃度となるように凍結保存液〔タカラバイオ（株）製、商品名ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標） １ｐｌｕｓ〕１ｍＬに懸濁した。得られた懸濁液を−８０℃に保たれたフリーザで凍結させ、凍結細胞を得た。得られた凍結細胞を−８０℃に保たれたフリーザまたは液体窒素中で表３に示される期間保存した。その後、凍結物を解凍して実験番号１〜３の解凍細胞を得た。得られた解凍細胞の数を測定した。以下において、解凍細胞の数を細胞数Ｃとして用いた。

【0124】

【表3】

【0125】

（２）スフィア形成
試験例２の（１−２）「スフィア培養」において、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに試験例６の（２）「解離汗腺細胞の凍結保存」で得られた解凍細胞を用いたことを除き、試験例２の（１−２）「スフィア培養」と同様の操作を行ない、実験番号１〜３のスフィア含有液Ａを得た。

【0126】

（３）スフィア継代培養
以下の（３−１）および（３−２）を行なうことを「１回の継代培養」と定義した。

【0127】

（３−１）解離汗腺細胞の製造
試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに試験例６の（２）「スフィア形成」で得られたスフィア含有液Ａのうち、実験番号３のスフィア含有液Ａを用いたことを除き、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、実験番号３の解離汗腺細胞を得た。

【0128】

（３−２）スフィア培養
試験例２の（１−２）「スフィア培養」において、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに試験例６の（３−１）「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞（実験番号３）を用いたことを除き、試験例２の（１−２）「スフィア培養」と同様の操作を行ない、実験番号３のスフィア含有液Ｂを得た。

【0129】

（３−３）細胞増殖能の評価

【0130】

試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」において、実施例１で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実験番号１のスフィア含有液Ａに含まれるスフィア、実験番号２のスフィア含有液Ａに含まれるスフィアおよび実験番号３のスフィア含有液Ｂに含まれるスフィア（実験番号１〜３のスフィア）を用いたことを除き、試験例２の（１−１）「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、継代培養細胞を得た。得られた継代培養細胞の数（以下、「細胞数Ｄ」という）を測定した。

【0131】

つぎに、細胞数Ｃと細胞数Ｄとを用い、式（ＩＶ）：
［細胞増殖倍率］＝［細胞数Ｄ］／［細胞数Ｃ］ （ＩＶ）
にしたがい、実験番号１〜３のスフィアに含まれる不死化汗腺細胞を凍結保存したときの細胞増殖倍率を求めた。細胞増殖能の評価結果を表４に示す。表中、細胞増殖能およびスフィア形成能の評価基準は、以下のとおりである。
＜細胞増殖能の評価基準＞
＋：式（ＩＶ）にしたがって算出された細胞増殖率が１より大きい。
−：式（ＩＶ）にしたがって算出された細胞増殖率が１以下である。
＜スフィア形成能の評価基準＞
＋：光学顕微鏡下でスフィアの形成が確認される。
−：光学顕微鏡下でスフィアの形成が確認されない。

【0132】

【表4】

【0133】

表４に示された結果から、実験番号１〜３のスフィアに含まれる不死化汗腺細胞は、良好な細胞増殖能および良好なスフィア形成能を有することがわかる。これらの結果から、実験番号１〜３のスフィアに含まれる不死化汗腺細胞は、凍結保存をした場合であっても、細胞増殖能およびスフィア形成能に優れることから、保存安定性に優れることがわかる。

【0134】

以上説明したように、汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入することにより、不死化汗腺筋上皮細胞が得られることがわかる。また、前記操作を行なうことによって得られた不死化汗腺筋上皮細胞は、生体内における汗腺筋上皮細胞と同様の機能および性質を有し、当該機能および性質を有する細胞を長期間にわたって増殖させることができることがわかる。したがって、本発明の不死化汗腺筋上皮細胞および不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法は、制汗剤、デオドラント剤などの外用剤、汗腺機能の改善剤などの開発などに用いられることが期待されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】