特許 6571533 毛様体周縁部幹細胞の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6571533

(24)【登録日】2019年8月16日

(45)【発行日】2019年9月4日

(54)【発明の名称】毛様体周縁部幹細胞の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/079 20100101AFI20190826BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALI20190826BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20190826BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20190826BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190826BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20190826BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20190826BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20190826BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190826BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20190826BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/079

   C12N5/0797

   C12N5/074

   C12N5/0735

   C12N5/10

   C12Q1/02

   G01N33/15 Z

   A61K35/30

   A61P27/02

   A61P43/00 101

   A61L27/36 100

【請求項の数】15

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2015-557709(P2015-557709)

(86)(22)【出願日】2014年10月16日

(86)【国際出願番号】JP2014077603

(87)【国際公開番号】WO2015107738

(87)【国際公開日】20150723

【審査請求日】2017年8月18日

(31)【優先権主張番号】特願2014-6464(P2014-6464)

(32)【優先日】2014年1月17日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(72)【発明者】

【氏名】桑原 篤

(72)【発明者】

【氏名】笹井 芳樹

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１８３７７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−２４５００７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１７３２０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−１２８４７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１２８４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０７７４２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 CENTANIN L. et al.，Cell Stem Cell, 2011, Vol.9, pp.553-562

【文献】 YAKOUBI W.E. et al.，Stem Cells, 2012, Vol.30, pp.2784-2795

【文献】 Stem Cells, 2008, Vol.26, pp.3162-3171

【文献】 Developmental Biology, 2006, Vol.292, pp.265-276

【文献】 BAHRAMI S.B. et al.，Methods in Molecular Biology, 2012, Vol.916, pp.81-96

【文献】 HUANG X. et al.,，Current protocols in stem cell biology, 2010, Vol.14, pp.1F.10.1-14

【文献】 Stem Cells, 2007, Vol.25, pp.1560-1570

【文献】 Cell Stem Cell, 2012, Vol.10, pp.771-785

【文献】 Nature, 2011, Vol.472, pp.51-56, Supplementary Information

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程（１）または工程（１’）により毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を製造する工程：
（１）ヒト多能性幹細胞から分化誘導された網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程（ここで、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間は、無血清培地が用いられる場合に３日間から６日間であり、血清培地が用いられる場合に６日間から９日間である）；
（１’）ヒト多能性幹細胞から分化誘導された網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程（ここで、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間は、無血清培地が用いられる場合に３日間から６日間であり、血清培地が用いられる場合に６日間から９日間である）；
を含み、更に以下の工程（２）を含む、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法：
（２）工程（１）または工程（１’）により得られるヒト多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程。

【請求項2】

以下の工程（１）または工程（１’）により毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を製造する工程：
（１）ヒト多能性幹細胞から分化誘導された網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程（ここで、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間は、無血清培地が用いられる場合に３日間から６日間であり、血清培地が用いられる場合に６日間から９日間である）；
（１’）ヒト多能性幹細胞から分化誘導された網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程（ここで、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間は、無血清培地が用いられる場合に３日間から６日間であり、血清培地が用いられる場合に６日間から９日間である）；
を含み、更に以下の工程（２）を含む、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法：
（２）工程（１）または工程（１’）により得られるヒト多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞からstage specific embryonic antigen-1陽性細胞を分取する工程。

【請求項3】

工程（２）に続いて以下の工程（３）が行われる請求項１記載の方法：
（３）前記工程（２）で得られたレチノスフェアを分散させて得られた細胞からstage specific embryonic antigen-1陽性細胞を分取する工程。

【請求項4】

工程（２）に続いて以下の工程（３）が行われる請求項２記載の方法：
（３）前記工程（２）で分取された細胞を分散させて得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程。

【請求項5】

Stage specific embryonic antigen-1陽性細胞が、更にRax陽性である、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

Stage specific embryonic antigen-1陽性細胞が、色素沈着の無い細胞である、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

工程（２）における浮遊増殖培養が、FGFシグナル伝達経路作用物質及びEGFシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地中で行われる、請求項１又は３に記載の方法。

【請求項8】

工程（３）における浮遊増殖培養が、FGFシグナル伝達経路作用物質及びEGFシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地中で行われる、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記無血清培地又は血清培地がROCK阻害剤を更に含む、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

レチノスフェアが、色素沈着の無いレチノスフェアである、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により得られた毛様体周縁部幹細胞を、Notchシグナル阻害物質、レチノイド及びタウリンからなる群から選ばれる一以上の物質の存在下に培養する工程を含む、網膜層特異的神経細胞の製造方法。

【請求項12】

請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法により毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を製造し、製造された細胞を有効量含有するように移植用生体材料を調製する工程を含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤の製造方法。

【請求項13】

請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法により毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を製造し、製造された細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。

【請求項14】

ヒト多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞を含む細胞凝集体であって、SSEA-1陽性かつRax陽性である細胞を４０％以上含み、以下の（１）、（２）、（３）及び（４）の特徴を有する細胞凝集体：
（１）SSEA-1陽性である；
（２）Rax遺伝子陽性、Chx10遺伝子陽性、Rdh10遺伝子陽性及びOtx1遺伝子陽性である；
（３）Crx遺伝子陰性、及び、β3-tubulin(TuJ1)遺伝子陰性である；及び
（４）色素沈着がない。

【請求項15】

１細胞、又は、２〜１０細胞程度の少数の細胞に分散された状態にある、請求項１４に記載の細胞凝集体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、毛様体周縁部幹細胞の製造方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する組織幹細胞は、細胞移植治療や創薬スクリーニングなどへの応用が期待されている。
生体網膜の毛様体周縁部（Ciliary Marginal Zone、CMZ）は網膜組織の構造形成や維持に重要な働きをしていることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。毛様体周縁部には、視細胞等の網膜細胞への分化能を持つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）が存在する（例えば、非特許文献２参照）。毛様体周縁部の遺伝子マーカーとして例えばRdh10遺伝子（非特許文献３）及びOtx1遺伝子（非特許文献１）が知られている。
多能性幹細胞を浮遊培養することにより形成され得る、網膜組織を含む細胞凝集体を、更に特定の条件で培養すると、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体が得られる（例えば、特許文献１参照）。かかる「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」において、毛様体周縁部様構造体はProgress zoneとして機能し、当該毛様体周縁部様構造体に近接して、層構造を有し連続した神経網膜が高頻度に形成され得る。「Progress zone」とは、組織の一部分に限局して存在する未分化細胞の集合体であり、発生や再生の過程において持続的に増殖して組織全体の成長に寄与する性質、及びまたは、増殖因子等を分泌することにより周辺組織の成長に寄与する性質をもつ細胞の集合体である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】WO 2013/183774 A1

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】DEVELOPMENTAL DYNAMICS, Volume:239, Pages:2066-2077 (2010)

【非特許文献2】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume:101, Pages:15772-15777 (2004)

【非特許文献3】Development, Volume:136, Pages:1823-1833 (2009)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する組織幹細胞を高純度に効率的に製造するための方法の開発が切望されていた。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体に存在し、視細胞等の網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する細胞（以下、毛様体周縁部幹細胞又はCMZ幹細胞と記すこともある。）を製造する方法等を提供する。
具体的には、本発明は：
［１］以下の工程（１）もしくは工程（２）のいずれか又はこれら両工程を含む、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法（以下、本発明幹細胞製造方法１と記すこともある。）：
（１）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程；及び
（２）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞からstage specific embryonic antigen-1（以下、SSEA-1と記すこともある。）陽性細胞を分取する工程；
［２］上記工程（１）が行われる前項［１］記載の方法、ここで「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞である（以下、本発明幹細胞製造方法２と記すこともある。）；
［３］上記工程（２）が行われる前項［１］記載の方法、ここで「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞である（以下、本発明幹細胞製造方法３と記すこともある。）；
［４］上記工程（１）に続いて上記工程（２）が行われる前項［１］記載の方法、ここで工程（１）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞であり、工程（２）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、前記工程（１）で得られたレチノスフェアを分散させて得られた細胞である（以下、本発明幹細胞製造方法４と記すこともある。）；
［５］上記工程（２）に続いて上記工程（１）が行われる前項［１］記載の方法、ここで工程（２）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞であり、工程（１）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」は、前記工程（２）で分取された細胞を分散させて得られた細胞である（以下、本発明幹細胞製造方法５と記すこともある。）；
［６］SSEA-1陽性細胞が、更にRax陽性である、前項［１］、［３］、［４］又は［５］のいずれか一項に記載の方法；
［７］SSEA-1陽性細胞が、色素沈着の無い（non-pigmented）細胞である、前項［１］、［３］、［４］、［５］又は［６］のいずれか一項に記載の方法；
［８］工程（１）における浮遊増殖培養が、FGFシグナル伝達経路作用物質及びEGFシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地中で行われる、前項［１］、［２］、［４］又は［５］のいずれか一項に記載の方法；
［９］前記無血清培地又は血清培地がROCK阻害剤を更に含む、前項［８］に記載の方法；
［１０］レチノスフェアが、色素沈着の無い（non-pigmented）レチノスフェアである、前項［１］、［２］、［４］、［５］、［８］又は［９］のいずれか一項に記載の方法；
［１１］前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である前項［１］から［１０］のいずれか一項に記載の方法；
［１２］前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である前項［１］から［１１］のいずれか一項に記載の方法；
［１３］前項［１］から［１２］のいずれか一項に記載の方法により得られた毛様体周縁部幹細胞を、Notchシグナル阻害物質、レチノイド及びタウリンからなる群から選ばれる一以上の物質の存在下に培養する工程を含む、網膜層特異的神経細胞の製造方法；
［１４］前項［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤；
［１５］前項［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法により製造される、有効量の毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法；
［１６］網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前項［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞；
［１７］前項［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬；及び
［１８］前項［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法；
等を提供する。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、網膜層特異的神経細胞を含む網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する毛様体周縁部幹細胞を高純度に効率的に製造することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後３５日目）の位相差像（A）及びGFP蛍光像（B）（Rax）である。

【図2】図２は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後６０日目）の位相差像（A）及びGFP蛍光像（B）（Rax）である。

【図3】図３は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後６３日目）の凍結切片の染色像である。"A"がChx10陽性細胞の免疫染色像、"B"がOtx1陽性細胞の免疫染色像、"C"がRdh10陽性細胞の免疫染色像、"D"がCrx陽性細胞の免疫染色像、"E"がTuJ1陽性細胞の免疫染色像、"F"がSSEA-1陽性細胞の免疫染色像である。

【図4】図４は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後９０日目）から分離された神経網膜部又は毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞の蛍光顕微鏡像である。"A"（Rax）が神経網膜部(NR)のGFP蛍光像、"B"（SSEA1）が神経網膜部(NR)の抗SSEA-1抗体を用いた蛍光免疫染色像、"C"（Rax）が毛様体周縁部様構造体(CMZ)のGFP蛍光像、"D"（SSEA1）が毛様体周縁部様構造体(CMZ)の抗SSEA-1抗体を用いた蛍光免疫染色像である。

【図5】図５は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後９０日目）から分離された網膜色素上皮および毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞の蛍光顕微鏡像である。"A"（SSEA1）が抗SSEA-1抗体を用いた蛍光免疫染色像、"B"（Rax）がGFP蛍光像、"C"（Bright field）が明視野像である。

【図6】図６は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後６３日目）を分散させ、得られた細胞を浮遊増殖培養することにより形成されたレチノスフェアの蛍光顕微鏡像である。"A"及び"C"（Rax）がGFP蛍光像、"B"（Chx10）が抗Chx10抗体を用いた蛍光免疫染色像、"D"（SSEA1）が抗SSEA-1抗体を用いた蛍光免疫染色像である。

【図7】図７は、細胞凝集体（浮遊培養開始後７０日目）から分離された神経網膜部(NR)又は毛様体周縁部様構造体(CMZ)を分散させ、得られた細胞を浮遊増殖培養することにより形成されたレチノスフェアを解析した結果を示す図である。"A"及び"B"は、毛様体周縁部様構造体(CMZ)から形成されたレチノスフェアの蛍光顕微鏡像であり、"A"（BF）が明視野像、"B"（Rax）がGFP蛍光像である。"C"には一次レチノスフェアの形成数、"E"には二次レチノスフェアの形成数を示す。"D"には一次レチノスフェアの直径分布、"F"には二次レチノスフェアの直径分布を示す。

【図8】図８の"A"は、細胞凝集体（浮遊培養開始後６０日目）から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させ、得られた細胞懸濁液を蛍光標識されたSSEA-1抗体にて免疫染色し、セルソーターを用いてFACS解析した結果を示す図である。図８の"B"は上記細胞懸濁液から分取されたRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分（"A"のQ2に示される細胞を分取したFraction 1）を、図８の"C"は前記細胞懸濁液から分取されたRax陽性かつSSEA-1陰性の細胞画分（"A"のQ4に示される細胞を分取したFraction 2）を、それぞれFACS解析した結果を示す図である。

【図9】図９は、細胞凝集体（浮遊培養開始後６０日目）から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させ、得られた細胞懸濁液からRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分（SSEA1+）、及び、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞画分（SSEA1-）を分取し、分取された細胞画分をそれぞれ浮遊増殖培養することにより形成されたレチノスフェアを解析した結果を示す図である。"A"及び"B"は、Rax陽性かつSSEA1陽性の細胞画分(SSEA1+)から形成されたレチノスフェアの蛍光顕微鏡像であり、"A"（BF）が明視野像、"B"（Rax）がGFP蛍光像である。"C"にはレチノスフェアの形成数を示す。"D"には形成されたレチノスフェアの直径分布を示す。

【図10】図１０は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後９０日目）から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させ、得られた細胞を浮遊増殖培養することにより形成されたレチノスフェアから分化させて得られた細胞の蛍光顕微鏡像である。"A"及び"B"は一次レチノスフェアから分化させた細胞の画像を、"C"及び"D"は二次レチノスフェアから分化させた細胞の画像を示す。"A"及び"C"（Rax）はGFP蛍光像、"B"及び"D"（Crx）は抗Crx抗体を用いた蛍光免疫染色像である。

【図11】図１１は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後６０日目）から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させ、得られた細胞を浮遊増殖培養することにより形成された二次レチノスフェアから分化させて得られた細胞の蛍光顕微鏡像である。"A"（Calretinin）は抗Calretinin抗体を用いた蛍光免疫染色像、"B"（Rax）はGFP蛍光像、"C"（Pax6）は抗Pax6抗体を用いた蛍光免疫染色像、"D"（TuJ1）は抗TuJ1抗体を用いた蛍光免疫染色像である。

【図12】図１２は、毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体（浮遊培養開始後５４日目）から分離された毛様体周縁部様構造体からRax陽性かつSSEA1陽性細胞を分取した後これを浮遊増殖培養し、形成されたレチノスフェアを分化させて得られた細胞の蛍光顕微鏡像である。"A"（Crx）は抗Crx抗体を用いた蛍光免疫染色像、"B"及び"F"（Rax）はGFP蛍光像、"C"（Pax6）は抗Pax6抗体を用いた蛍光免疫染色像、"D"（TuJ1）は抗TuJ1抗体を用いた蛍光免疫染色像、"E"（Calretinin）は抗Calretinin抗体を用いた蛍光免疫染色像である。

【図13】図１３は、細胞凝集体（浮遊培養開始後７９日目）から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させ、得られた細胞懸濁液からSSEA-1陽性細胞画分及びSSEA-1陰性細胞画分を分取し、分画前の細胞懸濁液、並びに、分取された後のSSEA-1陽性細胞画分及びSSEA-1陰性細胞画分をそれぞれ浮遊増殖培養することにより形成されたレチノスフェアを解析した結果を示す図である。"A"及び"B"は、SSEA-1陽性細胞画分から形成されたレチノスフェアの蛍光顕微鏡像であり、"A"（BF）が明視野像、"B"（Rax）がGFP蛍光像である。"C"にはレチノスフェアの形成数を示す。"Unsorted"は分画前の細胞懸濁液から形成されたレチノスフェアの数、"SSEA1⁺"はSSEA-1陽性細胞画分から形成されたレチノスフェアの数、"SSEA1^-"はSSEA-1陰性細胞画分から形成されたレチノスフェアの数、をそれぞれ示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。

【0010】

本発明において「幹細胞」としては、例えば、複数の分化系譜の細胞に分化できる能力（多分化能）と、多分化能を維持して持続的に増殖できる能力（自己複製能）とを有する細胞であり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる細胞を挙げることができる。ここで「幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）若しくは組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）であり得るが、それらに限定されない。幹細胞由来の組織細胞は、組織再生が可能なことから分かるように、生体に近い正常な細胞に分化できることが知られている。

【0011】

本発明における「組織幹細胞」としては、組織に存在し、その組織を構成する複数の分化系譜の細胞に分化できる能力（多分化能）と自己複製能とを有する細胞を挙げることができる。「組織幹細胞」は、発生過程や、細胞死、損傷組織の再生において、新しい細胞を供給する役割を持つことが知られている。

【0012】

本発明における「多能性幹細胞」としては、例えば、インビトロにおいて培養することが可能で、且つ、生体を構成するすべての細胞（三胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉又は内胚葉由来の組織）に分化しうる能力（多能性(pluripotency)）を有する幹細胞を挙げることができる。胚性幹細胞（ES細胞）も「多能性幹細胞」に含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織幹細胞から得られる。体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も「多能性幹細胞」に含まれる。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作製することが可能である。人工多能性幹細胞の作製方法としては、例えば、Cell, 131(5) pp.861-872 (2007)、Cell, 126(4) pp.663-676 (2006)等に記載される方法を挙げることができる。

【0013】

本発明における「胚性幹細胞（ES細胞）」としては、例えば、自己複製能を有し、多分化能（特に、多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞を挙げることができる。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。

【0014】

本発明における「人工多能性幹細胞」としては、例えば、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞を挙げることができる。2006年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Cell, 131(5) pp.861-872 (2007); Science, 318(5858) pp.1917-1920 (2007); Nat. Biotechnol., 26(1) pp.101-106 (2008)）。

【0015】

多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞は独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、それぞれ入手可能である。
多能性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^TM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）を用いて培養することにより維持できる。例えば、マウス幹細胞は、牛胎児血清（fetal bovine serum, ＦＢＳ）、白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor, ＬＩＦ）を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。

【0016】

遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターを作製する。作製されたターゲッティングベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲッティングベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。

【0017】

標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲッティングベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。

【0018】

本発明における「凝集体」としては、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊を挙げることができ、本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれる。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の塊を形成させることをいう。幹細胞の凝集体を形成させる際には、分散した幹細胞を自然に凝集させてもよい。一定数の分散した幹細胞を迅速に凝集させることにより質的に均一な幹細胞の凝集体を形成させてもよい。例えば、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの大きい浮遊培養ディッシュに細胞を播種して自然に凝集するのを待つ方法、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することにより細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化マーカーおよび未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。

【0019】

本発明における「組織」としては、例えば、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体を挙げることができる。

【0020】

本発明における「網膜組織」としては、例えば、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、杆体細胞、錐体細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞（または神経節細胞）、これらの前駆細胞または網膜前駆細胞等の細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織等を挙げることができる。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかについては、公知の方法、例えば、分化マーカーおよび未分化マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認することができる。
本発明における「網膜組織」としては、例えば、網膜への分化に適した条件下で多能性幹細胞の凝集体を浮遊培養することにより当該細胞凝集体の表面に形成され得る、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含む上皮組織を挙げることもできる。

【0021】

本発明における「網膜層」としては、網膜を構成する各層を挙げることができ、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。

【0022】

本発明における「網膜層特異的神経細胞」としては、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を挙げることができる。具体的な網膜層特異的神経細胞としては、視細胞、杆体細胞、錐体細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞（または神経節細胞）、及び色素上皮細胞を挙げることができる。

【0023】

本発明における「網膜幹細胞（retinal stem cell）」としては、視細胞、杆体細胞、錐体細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞（または神経節細胞）、及び色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる能力と、自己複製能とを有する細胞を挙げることができる。

【0024】

本発明における「網膜前駆細胞(retinal progenitor cell)」としては、神経網膜及び網膜色素上皮を構成するいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞を挙げることができる。
「神経網膜前駆細胞（neural retinal progenitor）」としては、眼杯（optic cup）の内層となる運命の細胞であって、神経網膜を構成するいずれの成熟な細胞にも分化しうる前駆細胞を挙げることができる。

【0025】

網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲaｘ及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＣｈｘ１０、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないＮｋｘ２．１、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘなどが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０及びＬ７、節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、杆体細胞で発現するＮｒｌ、錐体細胞で発現するＲｘｒ−ｇａｍｍａなどが挙げられる。

【0026】

本発明における「毛様体周縁部（ciliary marginal zone；CMZ）」としては、例えば、生体網膜において網膜組織（具体的には、神経網膜）と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ciliary margin）または網膜縁（retinal margin）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞や分化細胞の供給や網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）及びＯｔｘ１遺伝子（陽性）を挙げることができる。

【0027】

本発明において用いられる「培地」は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製すればよい。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又は、これらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることができる培地を挙げることができる。

【0028】

本発明における「無血清培地」としては、例えば、無調整又は未精製の血清を含まない培地を挙げることができる。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、或いは、これらの均等物等を適宜含有するもの等を挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679等に記載される方法により調製すればよい。また血清代替物としては、市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^TM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）を挙げることができる。
浮遊培養で用いられる「無血清培地」は、例えば、脂肪酸、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、例えば、市販のＫＳＲを適量（例えば、約１％から約２０％）添加した無血清培地（GMEMもしくはDMEM培地に、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを添加した培地；又は、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に４５０μＭ １−モノチオグリセロールを添加した培地等）を好ましく挙げることができる。

【0029】

本発明における「血清培地」としては、例えば、無調整又は未精製の血清を含む培地を挙げることができる。当該培地は、脂肪酸、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
本発明において培地に添加される「血清」として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清等哺乳動物の血清等を挙げることができる。

【0030】

本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外来性（exogeneous）の物質Ｘが添加された培地または外来性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外来性の物質Ｘが添加されていない培地または外来性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外来性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（endogenous）の物質Ｘはこれに含まれない。
例えば、「FGFシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外来性のFGFシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外来性のFGFシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。「FGFシグナル経路阻害物質を含まない培地」とは、外来性のFGFシグナル経路阻害物質が添加されていない培地または外来性のFGFシグナル経路阻害物質を含まない培地である。

【0031】

本発明における「浮遊培養」としては、例えば、細胞凝集体を培地中において、細胞培養器に対して非接着性の条件下で行われる培養等を挙げることができる。
浮遊培養で用いられる培養器としては、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されない。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を挙げることができる。好ましい培養器としては、細胞非接着性の培養器を挙げることができる。
細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することがよい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、超親水処理）されたもの等を使用してもよい。

【0032】

本発明幹細胞製造方法１は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法であって、以下の工程（１）もしくは工程（２）のいずれか又はこれら両工程を含む：
（１）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程；及び
（２）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する工程。

【0033】

本発明における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞」は、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体に存在し、視細胞等の網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する細胞である。上記毛様体周縁部幹細胞は、SSEA-1陽性であり、さらに、Rax遺伝子陽性、Chx10遺伝子陽性、Rdh10遺伝子陽性、Otx1遺伝子陽性、Crx遺伝子陰性、及び、β3-tubulin(TuJ1)遺伝子陰性である。毛様体周縁部幹細胞は、色素沈着の無い（non-pigmented）細胞である。かかる毛様体周縁部幹細胞は、化学物質等の毒性や薬効の評価に使用するための試薬や、細胞治療等を目的とした試験や治療に使用するための材料として有用である。

【0034】

SSEA-1（stage specific embryonic antigen-1）は細胞に発現する抗原であり、CD15又はLewis X (LeX)とも呼ばれる。SSEA-1は、細胞表面に発現していることがある。
本発明における「SSEA-1陽性細胞」とは、SSEA-1の発現が検出される細胞である。

【0035】

多能性幹細胞としては、霊長類多能性幹細胞を挙げることができ、より具体的には、ヒト多能性幹細胞を挙げることができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞が挙げられる。

【0036】

本発明幹細胞製造方法１の工程（１）及び工程（２）で用いられる「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」は、例えば以下の方法で調製することができる：
毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造方法であって、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル経路作用物質及びFGFシグナル経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含む方法（以下、本細胞凝集体製造方法１と記すこともある。）。

【0037】

上記の本細胞凝集体製造方法１でスタート原料として用いられる「網膜組織を含む細胞凝集体」は、当該網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体である。前記「Chx10陽性細胞の存在割合」としては、好ましくは40％以上を挙げることができ、より好ましくは60％以上を挙げることができる。

【0038】

上記「網膜組織を含む細胞凝集体」は、例えば多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞、から調製することができる。
上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を調製する方法としては、具体的には、例えば下記（A）及び（B）の工程を含む方法を挙げることができる：
（A）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程；及び
（B）工程（A）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む細胞凝集体を得る工程。

【0039】

多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程（A）について説明する。

【0040】

工程（A）において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １−モノチオグリセロール及び１ｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を挙げることができる。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
工程（A）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
工程（A）における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０^３から約1×１０^５細胞、好ましくは約３×１０^３から約５×１０^４細胞、より好ましくは約５×１０^３から約３×１０^４細胞、最も好ましくは約１．２×１０^４細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して細胞凝集体を形成させる。
細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトES細胞の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に細胞凝集体を形成させる。この細胞凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。

【0041】

工程（A）で形成された細胞凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む細胞凝集体を得る工程（B）について説明する。

【0042】

工程（B）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １−モノチオグリセロール及び１ｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を挙げることができる。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
工程（B）で用いられる無血清培地は、工程（A）で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。工程（A）で用いた無血清培地をそのまま工程（B）に用いる場合、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。

【0043】

ソニック・ヘッジホッグ（以下、Ｓｈｈと記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、又はＳＡＧなどが挙げられる。

【0044】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰ蛋白、ＧＤＦ７等のＧＤＦ蛋白、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。ＢＭＰ２蛋白、ＢＭＰ４蛋白及びＢＭＰ７蛋白は例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＧＤＦ７蛋白は例えば和光純薬から入手可能である。
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１ｎＭから約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭから約１００ｎＭ、より好ましくは約１．５ｎＭの濃度となるように培地に添加する。

【0045】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（A）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目から１５日目までの間、より好ましくは１日目から９日目までの間、更に好ましくは６日目に培地に添加する。
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。これにより、培地に掛かる経費を抑えることができる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞におけるＲaｘ遺伝子の発現を検出することにより確認することができる。ＧＦＰ等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がＲaｘ遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を工程（A）で用いて形成された細胞凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（B）の実施態様の一つとして、工程（A）で形成された細胞凝集体を、Ｒaｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む細胞凝集体を得る工程、を挙げることができる。

【0046】

工程（B）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。

【0047】

網膜前駆細胞を含む細胞凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるＲaｘ又はＰＡＸ６を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。上記の（A）及び（B）の工程を含む方法により得られる「網膜前駆細胞を含む細胞凝集体」を、本細胞凝集体製造方法１において、スタート原料である「網膜組織を含む細胞凝集体」として用いることができる。

【0048】

本細胞凝集体製造方法１でスタート原料として用いられる「網膜組織を含む細胞凝集体」は、具体的には、例えば下記（C）、（D）及び(E)の工程を含む方法により調製することもできる：
（C）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程；
（D）工程(C)で形成された細胞凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する工程；及び
（E）工程(D)で培養された細胞凝集体を、血清培地中で浮遊培養する工程。

【0049】

工程(C)で使用するＷｎｔシグナル経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル経路阻害物質としては、例えば、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白、ＣＫＩ−７（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロ−イソキノリン−８−スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４−｛４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル｝ベンズアミド）、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ−２などが挙げられる。Ｗｎｔシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成する濃度であればよい。例えばＩＷＲ１ｅ等の通常のＷｎｔシグナル経路阻害物質の場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約１０μＭ、より好ましくは３μＭ前後の濃度で添加する。
Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、５日以内）に無血清培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは３日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後1８日目まで、より好ましくは１２日目まで浮遊培養する。

【0050】

工程(C)における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％前後である。
工程(C)における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。細胞凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０^３細胞から約５×１０^４細胞、好ましくは約３×１０^３細胞から約３×１０^４細胞、より好ましくは約５×１０^３細胞から約２×１０^４細胞、最も好ましくは９×１０^３細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して細胞凝集体を形成させる。
細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトES細胞の場合には、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内に細胞凝集体を形成させることが望ましい。この細胞凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。

【0051】

工程(D)で使用する基底膜標品としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばMatrigel^TM（ベクトン・ディッキンソン社製：以下、マトリゲルと記すこともある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
Matrigel^TMは、Engelbreth Holm Swarm (EHS)マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Matrigel^TMの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであり、これらに加えてTGF-β、線維芽細胞増殖因子(FGF)、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Matrigel^TMの「growth factor reduced (GFR)製品」は、通常のMatrigel^TMよりも増殖因子の濃度が低い。本発明では、GFR製品の使用が好ましい。
工程(D)における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばMatrigel^TMを用いる場合には、好ましくは培養液の１／２０から１／２００の容量、より好ましくは１／１００前後の容積を挙げることができる。基底膜標品は幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは浮遊培養開始後２日以内に無血清培地に添加される。

【0052】

工程(D)で用いられる無血清培地は、工程(C)で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
工程(C)で用いた無血清培地をそのまま工程(D)に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。

【0053】

工程(D)における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％前後である。

【0054】

工程(E)で用いられる血清培地は、工程(D)で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。
血清の添加は、浮遊培養開始後７日目以降、より好ましくは９日目以降、最も好ましくは１２日目に行う。血清濃度については、約１％から約３０％、好ましくは約３％から約２０％、より好ましくは１０％前後で添加する。

【0055】

工程(E)において、血清に加えてＳｈｈシグナル経路作用物質を添加することにより網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。
Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧなどが挙げられる。
工程(E)に用いられるＳｈｈシグナル経路作用物質の濃度は、例えばＳＡＧ等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約０．１ｎＭから約１０μＭ、好ましくは約１０ｎＭから約１μＭ、より好ましくは１００ｎＭ前後の濃度で添加する。

【0056】

このようにして培養された細胞凝集体において、網膜組織は、細胞凝集体の表面を覆うように存在する。網膜組織は、免疫染色法等により確認することができる。上記の（C）、(D)及び（E）の工程を含む方法により得られる細胞凝集体は、本細胞凝集体製造方法１において、スタート原料である「網膜組織を含む細胞凝集体」として用いることができる。

【0057】

上記の（A）及び（B）の工程を含む方法、又は、上記の（C）、(D)及び（E）の工程を含む方法により得られる細胞凝集体が、網膜組織を含むことは、以下のようにして確認することもできる。例えば、上記方法で得られた細胞凝集体を、血清培地中で浮遊培養する。浮遊培養で用いられる培養器としては、上述のものが挙げられる。浮遊培養における培養温度、ＣＯ_２濃度、Ｏ_２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０℃から約４０℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％である。Ｏ_２濃度は、例えば約２０％から約７０％である。培養時間は特に限定されないが、通常４８時間以上であり、好ましくは７日間以上である。
浮遊培養終了後、細胞凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製する。得られた凍結切片を免疫染色し、それぞれの分化系譜の網膜細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、等）の存在を確認する。得られた凍結切片を免疫染色し、網膜組織の層構造が形成されていることを確認してもよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞）がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて免疫染色することにより、層構造が形成されていることを確認することができる。

【0058】

上記のようにして調製された細胞凝集体に含まれる網膜組織における「Chx10陽性細胞の存在割合」は、例えば、以下のような方法により調べることができる。
（１）まず、「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片を作製する。
（２）次いで、Raxタンパク質の免疫染色を行う。Rax遺伝子を発現する細胞でGFP等の蛍光タンパク質が発現するように改変された遺伝子組換え細胞を用いた場合には、前記蛍光タンパク質の発現を、蛍光顕微鏡等を用いて観察する。得られた免疫染色像または蛍光顕微鏡像において、Rax遺伝子を発現する網膜組織領域を特定する。
（３）Rax遺伝子を発現する網膜組織領域が特定された凍結切片と同じ切片又は隣接する切片を試料として、DAPI等の核染色試薬を用いて核を染色する。そして、上記で特定されたRax遺伝子を発現する網膜組織領域の中において、染色された核の数を計測することにより、網膜組織領域の細胞数を測定する。
（４）Rax遺伝子を発現する網膜組織領域が特定された凍結切片と同じ切片又は隣接する切片を試料として、Chx10タンパク質の免疫染色を行う。上記で特定された網膜組織領域におけるChx10陽性細胞中の核の数を計測する。
（５）上記（３）及び（４）で計測された各々の核の数に基づいて、Chx10陽性細胞中の核の数を、上記で特定されたRax遺伝子を発現する網膜組織領域の核の数で除することにより、「Chx10陽性細胞の存在割合」を算出する。

【0059】

本細胞凝集体製造方法１においては、まず、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する。
ここで、好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｎ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。

【0060】

培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約３０℃から約４０℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約３７℃前後を挙げることができる。また、ＣＯ_２濃度としては、例えば、約１％から約１０％の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約５％前後を挙げることができる。

【0061】

上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるＷｎｔシグナル経路作用物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ）、Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３'−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）等を挙げることができる。
無血清培地又は血清培地に含まれるＷｎｔシグナル経路作用物質の濃度としては、ＣＨＩＲ９９０２１等の通常のＷｎｔシグナル経路作用物質の場合には、例えば、約０．１μＭから約１００μＭの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約１μＭから約３０μＭの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、３μＭ前後の濃度を挙げることができる。

【0062】

上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、ＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＳＵ−５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８）、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害物質（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤などが挙げられる。
無血清培地又は血清培地に含まれるＦＧＦシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＳＵ−５４０２の場合、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

【0063】

本細胞凝集体製造方法１において「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」するとは、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間の全部又はその一部に限り培養することを意味する。つまり、培養系内に存在する前記「網膜組織を含む細胞凝集体」が、RPE65遺伝子を実質的に発現しない細胞から構成されている期間の全部又はその一部（任意な期間）に限り培養すればよく、このような培養を採用することにより、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を得ることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」には、「RPE65遺伝子を発現する細胞が全く出現していない細胞凝集体」及び「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」が含まれる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」としては、当該細胞凝集体に含まれる網膜組織におけるRPE65陽性細胞の存在割合が約１％以下である細胞凝集体を挙げることができる。
このような特定な期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法又は生化学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を調べることができる。

【0064】

「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも減少し、30%から0％の範囲内になるまでの期間を挙げることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」としては、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が30%から0％の範囲内である細胞凝集体を挙げることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はＷｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、１４日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地（例えば、基礎培地にＮ２が添加された無血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、１０日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、３日間から６日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、１２日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、６日間から９日間を挙げることができる。

【0065】

次いで、上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する。
ここで、好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。
無血清培地としては、基礎培地にＮ２またはＫＳＲが添加された培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された培地を挙げることができ、より具体的には、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
前記無血清培地又は血清培地に、既知の増殖因子、増殖を促進する添加剤や化学物質等を添加してもよい。既知の増殖因子としては、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。増殖を促進する添加剤として、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｎ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＫＳＲ等を挙げることができる。増殖を促進する化学物質としては、レチノイド類（例えば、レチノイン酸）、タウリンを挙げることができる。

【0066】

好ましい培養時間としては、例えば、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも増加し、30%以上になるまで行う培養時間を挙げることができる。
培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約３０℃から約４０℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約３７℃前後を挙げることができる。また、ＣＯ_２濃度としては、例えば、約１％から約１０％の範囲を挙げることができ、好ましくは、例えば、約５％前後を挙げることができる。
「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を得られるまでの上記の培養日数は無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、１００日間以内を挙げることができる。前記培養日数として、好ましくは、例えば、２０日間から７０日間を挙げることができ、より好ましくは、例えば、３０日間から６０日間を挙げることができる。

【0067】

上述のようにして調製された「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」においては、毛様体周縁部様構造体にそれぞれ隣接して、網膜色素上皮と網膜組織（具体的には、神経網膜）とが同一の細胞凝集体内に存在している。当該構造については顕微鏡観察等で確認することが可能である。具体的には例えば、Ｒａｘ遺伝子座にＧＦＰ遺伝子がノックインされた多能性幹細胞（RAX::GFPノックイン細胞）から作製した細胞凝集体の場合、蛍光実体顕微鏡（例えば、オリンパス社製SZX16）を用いれば、RAX::GFP強陽性部分である神経網膜、透過光にて色素化が観察される上皮組織である網膜色素上皮、及び、神経網膜と網膜色素上皮の境界領域に位置する特徴的な構造を有する毛様体周縁部様構造体の存在を確認することができる。
上述のようにして調製された「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」においては、毛様体周縁部様構造体が、２つの神経網膜組織の間の領域に形成される、すなわち、神経網膜組織と毛様体周縁部様構造体ともう一つの神経網膜組織とが連続した組織が形成されることもある。この場合、毛様体周縁部様構造体の部分が隣接する神経網膜組織に比べて薄いという特徴から、顕微鏡観察等で毛様体周縁部様構造体の存在を確認することが可能である。

【0068】

本発明幹細胞製造方法１の工程（１）及び工程（２）で用いられる「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」は、例えば特許文献１に記載された以下の方法（以下、本細胞凝集体製造方法２と記すこともある。）により調製することもできる：
毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造方法であって、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含む方法。

【0069】

上記の本細胞凝集体製造方法２でスタート原料として用いられる「網膜組織を含む細胞凝集体」は、当該網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上である細胞凝集体である。前記「Chx10陽性細胞の存在割合」としては、好ましくは40％以上を挙げることができ、より好ましくは60％以上を挙げることができる。かかる「網膜組織を含む細胞凝集体」の調製方法としては、本細胞凝集体製造方法１のスタート原料の調製方法として前述した、（A）及び（B）の工程を含む方法、又は、（C）、(D)及び（E）の工程を含む方法を挙げることができる。

【0070】

本発明幹細胞製造方法１の工程（１）においては、上記のようにして調製された「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る。

【0071】

「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞としては、上記の「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を分散させて得られた細胞、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分取された細胞を分散させて得られた細胞を挙げることができる。かかる細胞を増殖因子等の存在下で低密度で浮遊培養すると、１細胞、又は、２から１０細胞程度の少数の細胞に由来する球状の細胞凝集塊、すなわちレチノスフェアが形成される。

【0072】

「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から、毛様体周縁部様構造体を分離する方法としては、例えば、顕微鏡下で微細ピンセットやメス等を用いて切り出す方法を挙げることができる。「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」に含まれる毛様体周縁部様構造体の存在は、例えば上述の方法により確認することができる。「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から毛様体周縁部様構造体を切り出して用いることにより、浮遊培養開始時の細胞における毛様体周縁部幹細胞の含量を高めることができる。

【0073】

「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から細胞を分取する方法としては、後述される工程（２）で行われるSSEA-1陽性細胞の分取方法を挙げることができる。

【0074】

細胞凝集体、毛様体周縁部様構造体又は細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ又はパパイン等の酵素類と、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤とを含む溶液を挙げることができる。好ましくは、トリプシン、パパイン又はコラゲナーゼ、より好ましくは、パパインが用いられる。パパインを含む市販の細胞分散液を用いることもできる。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＲＯＣＫ経路阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。
例えば、細胞凝集体、毛様体周縁部様構造体又は細胞を、パパインを含む細胞分散液で処理し、さらにピペッティングにより分散させる。

【0075】

上記のようにして分散された細胞の浮遊増殖培養に用いられる培地としては、神経細胞培養用添加物及び増殖因子を加えた無血清培地又は血清培地を挙げることができる。好ましくは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地を挙げることができる。
上記の培地にＲＯＣＫ経路阻害物質を加えると、レチノスフェアの形成効率を高めることができる。
上記の培地に、ヘパリンを加えても良い。ヘパリンは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の効果を高めることが知られている。
上記の浮遊増殖培養に用いられるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を用いる場合の濃度としては、例えば、約１ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの範囲を、好ましくは、約５ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲を、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ＨＢ−ＥＧＦを挙げることができる。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＥＧＦを用いる場合の濃度としては、例えば、約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲を、好ましくは、約５ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの範囲を、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
ＲＯＣＫ経路阻害物質とは、Ｒｈｏキナーゼにより媒介されるシグナルを阻害し得る物質である。ＲＯＣＫ経路阻害物質としては、例えば、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌが挙げられる。ＲＯＣＫ経路阻害物質は、例えばＹ−２７６３２の場合、約０．０１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１０μＭの濃度となるように添加する。

【0076】

工程（１）の浮遊増殖培養における播種細胞数としては、例えば約１×１０^２細胞/mlから約１×１０^６細胞/mlの範囲を、好ましくは、約１×１０^３細胞/mlから約５×１０^５細胞/mlの範囲を、より好ましくは約５×１０^３細胞/mlから約１×１０^５細胞/mlの範囲を挙げることができる。
上記の浮遊増殖培養に用いられる培養器材としては、平底の低接着性の培養器材が好ましい。

【0077】

このようにして形成されたレチノスフェアには、自己複製した毛様体周縁部幹細胞が含まれる。浮遊培養開始時の細胞に幹細胞が多く含まれていれば、形成されるレチノスフェアの数が多くなる。浮遊培養開始時の細胞に含まれる幹細胞の自己複製能が高ければ、形成されるレチノスフェアのサイズ（例えば、直径）が大きくなる。形成されたレチノスフェアは、適切な因子を作用させれば網膜層特異的神経細胞へと分化させることができる。

【0078】

本発明幹細胞製造方法１の工程（２）においては、上述のようにして調製された「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する。
「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞としては、上記の「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を分散させて得られた細胞、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体もしくは毛様体周縁部様構造体から形成されたレチノスフェアを分散させて得られた細胞を挙げることができる。かかる細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する。

【0079】

「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から毛様体周縁部様構造体を分離する方法は、上述された工程（１）のために実施される方法と同様に行うことができる。
上記細胞凝集体又は毛様体周縁部様構造体からレチノスフェアを形成させる方法としては、工程（１）に関して上述された細胞の浮遊増殖培養による方法を挙げることができる。
細胞凝集体、毛様体周縁部様構造体又はレチノスフェアを分散させる方法としては、工程（１）に関して上述された分散処理を挙げることができる。

【0080】

SSEA-1陽性細胞を分取する方法としては、フローサイトメーターを用いる方法又は磁気を用いる方法を挙げることができる。フローサイトメーターを用いる方法としては、例えば、SSEA-1陽性細胞を、蛍光標識された抗SSEA-1抗体を用いて標識し、フローサイトメーターにて選別し分取する方法を挙げることができる。磁気を用いた方法としては、例えば、SSEA-1陽性細胞を、磁力を帯びた抗SSEA-1抗体を用いて標識し、磁気細胞分離装置（MACS）にて選別し分取する方法を挙げることができる。
抗SSEA-1抗体としては、SSEA-1抗原を認識する抗体であればどのような抗体も使用できる。Chemicon社の抗SSEA-1抗体、BD社の抗SSEA-1抗体、ミルテニーバイオテク社の抗SSEA-1抗体等の市販の抗SSEA-1抗体を利用することもできる。
SSEA-1陽性細胞を分取する際には、SSEA-1陽性であることに加えて、Rax陽性であること、又は、色素化していないことも指標にして分取してもよい。
このようにして分取されたSSEA-1陽性細胞画分には、毛様体周縁部幹細胞が含まれる。分取されたSSEA-1陽性細胞画分は、適切な因子を作用させれば網膜層特異的神経細胞へと分化させることができる。

【0081】

本発明幹細胞製造方法２においては、本発明幹細胞製造方法１の工程（１）が行われる。本発明幹細胞製造方法２においては、「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞が用いられる。
すなわち、本発明幹細胞製造方法２は、
多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程を実施する、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法である。

【0082】

本発明幹細胞製造方法３においては、本発明幹細胞製造方法１の工程（２）が行われる。本発明幹細胞製造方法３においては、「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞が用いられる。
すなわち、本発明幹細胞製造方法３は、
多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する工程を実施する、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法である。

【0083】

本発明幹細胞製造方法４においては、本発明幹細胞製造方法１の工程（１）に続いて工程（２）が行われる。上記工程（１）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞が用いられる。上記工程（２）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、前記工程（１）で得られたレチノスフェアを分散させて得られた細胞が用いられる。
すなわち、本発明幹細胞製造方法４は、
（１）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたレチノスフェアを分散させて得られた細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する工程、を実施する、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法である。

【0084】

本発明幹細胞製造方法５においては、本発明幹細胞製造方法１の工程（２）に続いて工程（１）が行われる。上記工程（２）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞が用いられる。上記工程（１）における「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞」としては、前記工程（２）で分取された細胞から分散された細胞が用いられる。
すなわち、本発明幹細胞製造方法５は、
多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体、又は、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体、を分散させて得られた細胞からSSEA-1陽性細胞を分取する工程、及び
前記工程で分取された細胞から分散された細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程、を実施する、多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部幹細胞の製造方法である。

【0085】

本発明幹細胞製造方法１から５のいずれか（以下、本発明幹細胞製造方法と記すこともある。）により得られたレチノスフェア又はSSEA-1陽性細胞画分は、毛様体周縁部幹細胞を高い割合で含む細胞群として使用することができる。

【0086】

本発明幹細胞製造方法により得られた毛様体周縁部幹細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害物質、レチノイド及びタウリンからなる群から選ばれる一以上の物質の存在下に培養することにより、網膜層特異的神経細胞を製造することができる。
毛様体周縁部幹細胞としては、本発明幹細胞製造方法により得られたレチノスフェアに含まれる毛様体周縁部幹細胞、及び、本発明幹細胞製造方法により得られたSSEA-1陽性細胞画分に含まれる毛様体周縁部幹細胞が挙げられる。
例えば、上記レチノスフェア又は上記SSEA-1陽性細胞画分を神経分化に適した条件にて培養する。上記レチノスフェア又は上記SSEA-1陽性細胞画分を分散させて得られた細胞を同様に培養してもよい。
かかる培養に用いられる培地としては、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害物質、レチノイド及びタウリンからなる群から選ばれる一以上の物質を含む血清培地又は無血清培地を挙げることができる。例えば、上記レチノスフェア、上記SSEA-1陽性細胞画分、又はこれらを分散させて得られた細胞を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地中で一定期間培養した後、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害物質、レチノイド及びタウリンからなる群から選ばれる一以上の物質を含む血清培地又は無血清培地中で培養してもよい。これらの培地には、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の添加剤が適宜添加されていてもよい。
ここで「Ｎｏｔｃｈシグナル阻害物質」としては、Ｎｏｔｃｈシグナルの活性を阻害する物質であればよく、例えば、γ−セクレターゼ阻害物質、Ｎｏｔｃｈ受容体阻害物質、Ｄｌｌ阻害物質、及び、Ｈｅｓ阻害物質が挙げられる。前記γ−セクレターゼ阻害物質としては、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル）が挙げられる。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害物質としてＤＡＰＴを用いる場合は、例えば、約０．０１μＭから約１００μＭの濃度となるように添加する。
毛様体周縁部幹細胞の培養に用いられる培養器材としては、例えば、浮遊培養用器材、及び、接着培養用器材が挙げられる。接着培養する際の培養皿のコーティング材としては、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリオルニチン、ラミニン、エンタクチン、マトリゲル、又は、ゼラチンが挙げられる。
毛様体周縁部幹細胞は、例えば、３７℃、ＣＯ_２濃度が５％、酸素濃度が２０％から４０％にて培養される。
上記の培養により得られた細胞が網膜層特異的神経細胞を含むか否かは、例えば、細胞マーカーの発現を調べることにより確認することができる。

【0087】

本発明は、本発明の方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞の毒性や薬効の評価用試薬としての使用や、本発明の製造方法により製造される毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞の移植用生体材料としての使用等も含む。

【0088】

本発明の方法により製造された毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞は、網膜細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。本発明の方法により製造された毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞は、化学物質等の毒性や薬効の評価においても、光毒性、神経毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。例えば、本発明の方法により製造された毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することにより、該物質の毒性または薬効を評価する。

【0089】

本発明の方法により製造された毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞は、細胞損傷状態において、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ため等に用いる移植用生体材料として用いることができる。例えば、本発明の方法により製造された、有効量の毛様体周縁部幹細胞又は網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することにより、網膜組織の障害に基づく疾患を治療する。

【実施例】

【0090】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0091】

実施例１：多能性幹細胞からの毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造
RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6), 771-785）を「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(25), 9554-9559」及び「Nat. Biotech., 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％ ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｘ 非必須アミノ酸、８ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。
培養された上記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散させた。単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １−モノチオグリセロール、１ｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始後６日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加されていない上記培地に交換した。
このようにして調製された浮遊培養開始後１８日目の網膜組織を含む細胞凝集体を、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）及び５μＭ ＳＵ５４０２（ＦＧＦシグナル経路阻害物質）を含む無血清培地で６日間すなわち浮遊培養開始後２４日目まで培養した。その際に用いられた無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加された無血清培地であった。
得られた浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に１１日間すなわち浮遊培養開始後３５日目まで浮遊培養し、得られた細胞凝集体を蛍光顕微鏡で観察した。当該細胞凝集体（浮遊培養開始後３５日目）の位相差像（A）及びGFP蛍光像（B）を図１に示す。当該細胞凝集体には、Rax遺伝子発現陽性の神経網膜と色素沈着した網膜色素上皮が形成され、その境界部に毛様体周縁部様構造体（図中矢印）が形成されていることがわかった。

【0092】

実施例２：多能性幹細胞からの毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造
実施例１に記載された方法により調製された単一分散されたRAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０^３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ ＣＯ_２で浮遊培養した。その際に用いられた無血清培地は、Ｇ−ＭＥＭ培地に２０％ ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、２０μＭ Ｙ２７６３２及び３μＭ ＩＷＲ１ｅ（Ｗｎｔシグナル経路阻害物質）が添加された無血清培地であった。浮遊培養開始後２日目から容積あたり１／１００量のGFR Matrigel^TM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して浮遊培養した。浮遊培養開始後１２日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及び１００ｎＭ ＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル経路作用物質）を添加して、浮遊培養開始後１８日目まで浮遊培養した。
浮遊培養開始後１８日目の網膜組織を含む細胞凝集体を、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）を含む無血清培地で２日間すなわち浮遊培養開始後２０日目まで浮遊培養した。その際に用いられた無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加された無血清培地であった。
浮遊培養開始後２０日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に４０日間すなわち浮遊培養開始後６０日目まで浮遊培養し、得られた細胞凝集体を蛍光顕微鏡で観察した。当該細胞凝集体（浮遊培養開始後６０日目）の位相差像（A）及びGFP蛍光像（B）を図２に示す。当該細胞凝集体には、Rax遺伝子発現陽性の神経網膜と色素沈着した網膜色素上皮が形成され、その境界部に毛様体周縁部様構造体（図中矢印）が形成されていることがわかった。

【0093】

実施例３：多能性幹細胞からの毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体の製造及びマーカー発現の解析
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に３９日間すなわち浮遊培養開始後６３日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後６３日目の細胞凝集体を４％ パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を調製した。調製された凍結切片につき、神経網膜前駆細胞マーカーの１つであるChx10（図３A）、毛様体周縁部のマーカーの１つであるOtx1（図３B）、毛様体周縁部のマーカーの１つであるRdh10（図３C）、視細胞マーカーの１つであるCrx（図３D）、又は、神経節細胞を含む神経細胞のマーカーの１つであるTuJ1（図３E）の免疫染色を行った。当該細胞凝集体には、Chx10陽性（図３A）、Otx1陽性（図３B）及びRdh10陽性（図３C）の毛様体周縁部様構造体（図中矢印）が形成されていることがわかった。当該毛様体周縁部様構造体（図中矢印）は、Crx陰性（図３D）及びTuJ1陰性（図３E）であった。
浮遊培養開始後６３日目の細胞凝集体から調製された上記凍結切片につき、SSEA-1の免疫染色を行った。上記細胞凝集体の中で、毛様体周縁部様構造体に限局してSSEA-1が発現していることがわかった（図３F）。当該SSEA-1陽性細胞において色素沈着は認められなかった。
以上の結果から、浮遊培養開始後６３日目の上記細胞凝集体に含まれる毛様体周縁部様構造体には、Chx10陽性、Otx1陽性、Rdh10陽性、Crx陰性、TuJ1陰性及びSSEA-1陽性であり、色素沈着の無い細胞が存在することがわかった。

【0094】

実施例４：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体からの毛様体周縁部様構造体の分離
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に６６日間すなわち浮遊培養開始後９０日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後９０日目の細胞凝集体から、Rax陽性の神経網膜部、及び、神経網膜と網膜色素上皮の境界部に存在する毛様体周縁部様構造体を別々に、蛍光実体顕微鏡による観察下に、メスとピンセットを用いて切り出した。
得られた神経網膜部及び毛様体周縁部様構造体をそれぞれ、パパインを含む分散液（神経細胞分散液、住友ベークライト）を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。それぞれの細胞懸濁液を、細胞が生きたままの状態で、蛍光標識された抗SSEA-1抗体（Anti-SSEA1, Cy3 conjugated；Chemicon）にて免疫染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。発現したGFPの蛍光をRax遺伝子発現の指標とし、上記抗SSEA-1抗体のCy3の蛍光をSSEA-1発現の指標とした。結果を図４に示す。神経網膜部から調製された上記細胞懸濁液では、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞の割合がおよそ８０％、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞の割合はおよそ１０％、Rax陰性細胞がおよそ１０％であった（図４A、B）のに対し、毛様体周縁部様構造体から調製された上記細胞懸濁液では、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞の割合がおよそ３０％、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞の割合はおよそ５０％、Rax陰性細胞がおよそ２０％であった（図４C、D）。毛様体周縁部様構造体を細胞凝集体から切り出す操作により、前記細胞凝集体に含まれるRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を精製できることがわかった。

【0095】

実施例５：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体に含まれるRax陽性かつSSEA-1陽性細胞における色素沈着の解析
実施例４記載の方法により調製された浮遊培養開始後９０日目の細胞凝集体から、実施例４と同様の方法で、網膜色素上皮と毛様体周縁部様構造体とを一緒に、蛍光実体顕微鏡による観察下にメスとピンセットを用いて切り出した。
得られた網膜色素上皮および毛様体周縁部様構造体を、実施例４と同様の方法でパパインを含む分散液を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、細胞が生きたままの状態で、蛍光標識された抗SSEA-1抗体（Anti-SSEA1, Cy3 conjugated；Chemicon）にて免疫染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。結果を図５に示す。SSEA-1陽性（図５A、矢印）かつRax陽性の細胞（図５B、矢印）に、色素沈着は観察されなかった（図５C、矢印）。

【0096】

実施例６：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体からのレチノスフェア形成
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に３９日間すなわち浮遊培養開始後６３日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後６３日目の細胞凝集体を、実施例４と同様の方法によりパパインを含む分散液を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液に含まれる細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された無血清培地にて、１×１０^５細胞／ｍｌの細胞密度で１０日間浮遊培養した。その結果、球状の細胞凝集体（レチノスフェア）が形成された。浮遊培養開始後６３日目の上記細胞凝集体には、増殖能を有する細胞が含まれることがわかった。
得られたレチノスフェアを４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Rax遺伝子の発現をGFPの発現を指標として調べ、Chx10及びSSEA-1の発現を免疫染色で調べた。結果を図６に示す。前記レチノスフェアを形成する細胞の９０％程度がRax陽性（図６A）かつChx10陽性（図６B）の細胞、すなわち網膜前駆細胞マーカー及び神経網膜前駆細胞マーカーを発現する細胞であることがわかった。上記レチノスフェアは、Rax陽性（図６C）かつSSEA-1陽性（図６D）の細胞を４０％程度含んでいた。
上記の培養例において、上記細胞懸濁液に含まれる１から１０細胞程度の細胞を出発材料として、５０から５００細胞程度の細胞を含むレチノスフェアが形成された。よって、上記細胞懸濁液に含まれる１から１０細胞程度の細胞から、およそ２０から２００細胞程度のRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞が形成されたこととなる。毛様体周縁部様構造体を含む上記細胞凝集体から得られた細胞を浮遊増殖培養することにより、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を効率的に製造できることがわかった。

【0097】

実施例７：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体からのレチノスフェア形成
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に４６日間すなわち浮遊培養開始後７０日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後７０日目の細胞凝集体から、蛍光実体顕微鏡による観察下に、メスとピンセットを用いて、神経網膜部および毛様体周縁部様構造体を別々に切り出した。
得られた神経網膜部及び毛様体周縁部様構造体をそれぞれ、実施例４と同様の方法によりパパインを含む分散液を用いて分散して細胞懸濁液を調製した。それぞれの細胞懸濁液に含まれる細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された無血清培地にて、低接着処理された平底の９６ウェルディッシュ（Nunc社製）に１ウェルあたり１０００細胞ずつ（５×１０^３細胞/ml）播種し、３７℃で１０日間浮遊培養して、レチノスフェアを形成させた。形成されたレチノスフェアはRax陽性（図７B）で、色素沈着がない（図７A）ことがわかった。形成されたレチノスフェア（一次レチノスフェア）の数とサイズ（直径）を図７C及びDに示す。上記神経網膜部及び毛様体周縁部様構造体には、自己複製能を有する細胞が含まれることがわかった。神経網膜部から得られた細胞（NR）に比べ、毛様体周縁部様構造体から得られた細胞（CMZ）の方が、レチノスフェアの形成効率が高かった（図７C）。神経網膜部から得られた細胞（NR）に比べ、毛様体周縁部様構造体から得られた細胞（CMZ）の方が、形成されたレチノスフェアのサイズが大きいことがわかった（図７D）。毛様体周縁部様構造体から形成された上記レチノスフェアは、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を含んでいた。上記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体から得られた細胞を浮遊増殖培養することにより、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を効率的に製造できることがわかった。
神経網膜部を分散させて得られた細胞から形成された上記レチノスフェア、及び、毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞から形成された上記レチノスフェアからそれぞれ細胞懸濁液を調製し、実施例６記載の方法にて培養することにより、二次レチノスフェアを形成させた。形成されたレチノスフェアの数とサイズ（直径）を図７E及びFに示す。上記一次レチノスフェアには、自己複製能を有する細胞が含まれることがわかった。神経網膜部由来の細胞（NR）に比べ、毛様体周縁部様構造体由来の細胞（CMZ）の方が、二次レチノスフェアの形成効率が高かった（図７E）。神経網膜部から得られた細胞（NR）に比べ、毛様体周縁部様構造体から得られた細胞（CMZ）の方が、形成された二次レチノスフェアのサイズが大きいことがわかった（図７F）。毛様体周縁部様構造体由来の細胞から形成された上記二次レチノスフェアはRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を含んでいた。上記のようにレチノスフェア形成培養を繰り返すことにより、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を拡大培養できることがわかった。

【0098】

実施例８：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体からのSSEA-1陽性細胞の分取
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に３６日間すなわち浮遊培養開始後６０日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後６０日目の細胞凝集体から毛様体周縁部様構造体を切り出し、実施例４と同様の方法によりパパインを含む分散液を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、細胞が生きたままの状態で、蛍光標識された抗SSEA-1抗体（SSEA1-APC、BD社製）にて免疫染色し、セルソーター（ARIA2、BD社製)を用いてFACS解析した。結果を図８に示す。上記細胞懸濁液に含まれる細胞のうち５０％が、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞であることがわかった（図８A）。毛様体周縁部様構造体を含む上記細胞凝集体から、前記毛様体周縁部様構造体を切り出すことにより、純度５０％程度のRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を製造できることがわかった。
セルソーター（ARIA2、BD社製)を用いて上記細胞懸濁液から、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞（図８AのQ2）と、Rax陰性かつSSEA-1陽性の細胞（図８AのQ4）とが分画できた。Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分（Fraction 1）及びRax陰性かつSSEA-1陽性の細胞画分（Fraction 2）を分取しFACSにより解析した。Fraction 1に含まれる細胞のうち８７％がRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞であり（図８B）、Fraction 2に含まれる細胞のうち、８２％がRax陽性かつSSEA-1陰性の細胞である（図８C）ことがわかった。毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から前記毛様体周縁部様構造体を分取した後これを分散させ、得られた細胞懸濁液からSSEA-1陽性細胞を分取することにより、純度８７％程度のRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞を製造できることがわかった。

【0099】

実施例９：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体からのSSEA-1陽性細胞の分取と、分取された細胞からのレチノスフェア形成
実施例８記載の方法でセルソーターにて分取した、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分と、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞画分とをそれぞれ、実施例７記載の方法で培養することにより、レチノスフェアを形成させた。形成されたレチノスフェアは、Rax陽性であり（図９B）、色素沈着はなかった（図９A）。形成されたレチノスフェアの数とサイズ（直径）を図９C及びDに示す。Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分からは、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞画分と比べて、高効率でレチノスフェアが形成されることがわかった（図９C）。Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞からは、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞と比べて、形成されたレチノスフェアのサイズが大きいことがわかった（図９D）。さらに、Rax陽性かつSSEA-1陽性細胞から形成されたレチノスフェアには、Rax陽性かつSSEA-1陽性細胞が８０％以上含まれていることが確認された。上記方法により製造されたRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞には、Rax陽性かつSSEA-1陰性の細胞と比べて、自己複製能を有する細胞がより多く含まれること、当該Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞はレチノスフェア形成培養により拡大培養できることがわかった。

【0100】

実施例１０：ROCK阻害剤添加によるレチノスフェア製造効率の向上
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に３９日間すなわち浮遊培養開始後６３日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後６３日目の細胞凝集体を、実施例４と同様の方法によりパパインを含む分散液を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液に含まれる細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された無血清培地で、１０μＭ Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）存在下又は非存在下にて、１×１０^５細胞／ｍｌの細胞密度で１０日間浮遊培養した。その結果、球状の細胞凝集体（レチノスフェア）が形成された。このとき、Ｙ−２７６３２非存在下ではレチノスフェアが１３００個形成されたのに対し、Ｙ−２７６３２存在下ではレチノスフェアが１９７６個形成された。すなわち、ＲＯＣＫ阻害剤添加により、レチノスフェアの形成効率が上昇することがわかった。

【0101】

実施例１１：レチノスフェアからの視細胞の製造
実施例４記載の方法で調製された毛様体周縁部様構造体から、実施例７記載の方法にて一次レチノスフェア及び二次レチノスフェアを形成させた。得られた一次レチノスフェア及び二次レチノスフェアをそれぞれ、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンにてコートした細胞培養ディッシュ上に播種し、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された培地）にて４日間培養した後、血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、Ｂ２７、０．５μＭ レチノイン酸、１００μＭ タウリン及び１０μＭ ＤＡＰＴが添加された培地）にて、４０％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２、３７℃の条件で、１０日間培養した。得られた細胞を、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Rax遺伝子の発現を示すGFP蛍光像と視細胞マーカーの１つであるCrxに対する抗体を用いた免疫染色像を観察した。結果を図１０に示す。上記一次レチノスフェア及び二次レチノスフェアそれぞれから、Rax陽性（図１０A及びC）かつCrx陽性（図１０B及びD）の視細胞へと分化できることがわかった。

【0102】

実施例１２：レチノスフェアからのアマクリン細胞、神経節細胞の製造
実施例４記載の方法で調製された毛様体周縁部様構造体から、実施例７記載の方法にて一次レチノスフェア及び二次レチノスフェアを形成させた。得られた二次レチノスフェアをそれぞれ、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンにてコートした細胞培養ディッシュに播種し、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された培地）にて２日間培養した後、血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、Ｂ２７、０．５μＭ レチノイン酸、１００μＭ タウリン及び１０μＭ ＤＡＰＴが添加された培地）にて、４０％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２、３７℃の条件で、１０日間培養した。得られた細胞を、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Rax遺伝子の発現を示すGFP蛍光像（図１１B）、アマクリン細胞マーカーの１つであるCalretininに対する抗体を用いた免疫染色像（図１１A）、共陽性が神経節細胞のマーカーであるPax6及びTuJ1に対する抗体をそれぞれ用いた免疫染色像（図１１C及びD）を観察した。結果を図１１に示す。上記二次レチノスフェアから、Calretinin陽性のアマクリン細胞（図１１A、B）、及び、Pax6及びTuJ1陽性の神経節細胞（図１１C、D）へと分化できることがわかった。

【0103】

実施例１３：SSEA1陽性細胞から形成されたレチノスフェアからの、視細胞、アマクリン細胞、及び、神経節細胞の製造
実施例４記載の方法で調製された毛様体周縁部様構造体から、実施例８記載の方法でセルソーターにて分取したRax陽性かつSSEA-1陽性の細胞画分を、実施例７記載の方法で培養することにより、レチノスフェアを形成させた。得られたレチノスフェアをそれぞれ、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンにてコートした細胞培養ディッシュに播種し、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（５０倍希釈）が添加された培地）にて２日間培養した後、血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、Ｂ２７、０．５μＭ レチノイン酸、１００μＭ タウリン及び１０μＭ ＤＡＰＴが添加された培地）にて、４０％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２、３７℃の条件で、１０日間培養した。得られた細胞を、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Rax遺伝子の発現を示すGFP蛍光像（図１２B、F）、視細胞マーカーの１つであるCrx（図１２A）、アマクリン細胞マーカーの１つであるCalretinin（図１２E）、共陽性が神経節細胞のマーカーであるPax6及びTuJ1（図１２C、D）に対する抗体をそれぞれ用いた免疫染色像を観察した。結果を図１２に示す。上記レチノスフェアから、Rax陽性かつCrx陽性の視細胞（図１２A、B、矢印）、Calretinin陽性のアマクリン細胞（図１２E、F、矢印）、及び、Pax6及びTuJ1陽性の神経節細胞（図１２C、D、矢印）へと分化できることがわかった。

【0104】

実施例１４：毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体からのSSEA-1陽性細胞の分取と、分取された細胞からのレチノスフェア形成
実施例１に記載された方法により調製された浮遊培養開始後２４日目の細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル経路作用物質及びＦＧＦシグナル経路阻害物質を含まない血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ 牛胎児血清、１％ Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５μＭ レチノイン酸及び１００μＭ タウリンが添加された培地）で、４０％ Ｏ_２条件下で更に５５日間すなわち浮遊培養開始後７９日目まで浮遊培養した。得られた浮遊培養開始後７９日目の細胞凝集体から毛様体周縁部様構造体を切り出し、実施例４と同様の方法によりパパインを含む分散液を用いて分散させて細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液（Unsorted画分）を、細胞が生きたままの状態で、磁気ビーズ標識された抗SSEA-1抗体（ミルテニーバイオテク社製）にて免疫染色し、磁気細胞分離装置（MACS、ミルテニーバイオテク社製）を用いて、SSEA-1陽性細胞画分とSSEA-1陰性細胞画分を分取した。
得られたSSEA-1陽性細胞画分とSSEA-1陰性細胞画分を、実施例８記載の方法によりそれぞれFACS解析したところ、SSEA-1陽性細胞画分に含まれる細胞のうち６４％がSSEA-1陽性細胞であり、SSEA-1陰性細胞画分に含まれる細胞のうち５％がSSEA-1陽性細胞であることがわかった。毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から前記毛様体周縁部様構造体を分取した後これを分散させ、得られた細胞懸濁液からSSEA-1陽性細胞画分を分取することにより、純度６４％程度のSSEA-1陽性の細胞を製造できることがわかった。
前記Unsorted画分、SSEA-1陽性細胞画分、及び、SSEA-1陰性細胞画分を、実施例７記載の方法で培養することにより、レチノスフェアを形成させた。形成されたレチノスフェアは、Rax陽性であり（図１３B）、色素沈着はなかった（図１３A）。形成されたレチノスフェアの数を図１３Cに示す。Unsorted画分から形成されたレチノスフェアの数（図１３C、"Unsorted"）と比べて、SSEA-1陰性細胞画分から形成されたレチノスフェアの数（図１３C、"SSEA1^-"）が少なく、SSEA-1陽性細胞画分から形成されたレチノスフェアの数（図１３C、"SSEA1⁺"）が多いことがわかった。SSEA-1陽性細胞画分から形成されたレチノスフェアは、SSEA-1陰性細胞画分から形成されたレチノスフェアと比べて、サイズが大きいことがわかった。SSEA-1陽性細胞画分から形成されたレチノスフェアには、Rax陽性かつSSEA-1陽性の細胞が８０％以上含まれていることが確認された。
上記方法により製造されたSSEA-1陽性細胞画分には、SSEA-1陰性細胞画分と比べて、自己複製能を有する細胞がより多く含まれることがわかった。

【0105】

本出願は、2014年1月17日付で日本国に出願された特願2014-006464を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。

【産業上の利用可能性】

【0106】

本発明によれば、網膜細胞への分化能及び自己複製能を有する組織幹細胞を高純度に効率的に製造することが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】