特許 6589327 組換え水素酸化細菌とそれを用いたタンパク質製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6589327

(24)【登録日】2019年9月27日

(45)【発行日】2019年10月16日

(54)【発明の名称】組換え水素酸化細菌とそれを用いたタンパク質製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20191007BHJP

   C12N 15/74 20060101ALI20191007BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20191007BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20191007BHJP

   C07K 14/735 20060101ALN20191007BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N15/74 Z

   C12N1/21

   C12P21/02 C

   !C07K14/735

【請求項の数】5

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2015-66420(P2015-66420)

(22)【出願日】2015年3月27日

(65)【公開番号】特開2016-185088(P2016-185088A)

(43)【公開日】2016年10月27日

【審査請求日】2018年2月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】丸山 高廣

(72)【発明者】

【氏名】半澤 敏

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−１６３３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０９７８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２２５６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０５３８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１６６９５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

輸送タンパク質遺伝子、切断リンカー遺伝子および目的タンパク質遺伝子を、この順に同一のプラスミド上に含むプラスミドを水素酸化細菌に導入して得られる、前記輸送タンパク質が配列番号８に記載の配列からなるポリペプチドである、タンパク質を発現可能な水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６。

【請求項2】

輸送タンパク質遺伝子が配列番号１０に記載の配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６。

【請求項3】

目的タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、請求項１または２に記載の水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６。

【請求項4】

請求項１から３のいずれかに記載の水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６を培養し、輸送タンパク質遺伝子、切断リンカー遺伝子および目的タンパク質遺伝子をこの順に含む遺伝子を発現させ、輸送タンパク質、切断リンカータンパク質および目的タンパク質を共発現させることで、前記水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６外へ目的タンパク質を分泌発現させる方法。

【請求項5】

配列番号１０に記載の配列からなるポリヌクレオチド、切断リンカー遺伝子および目的タンパク質遺伝子をこの順に同一プラスミド上に含む、水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６外へ目的タンパク質を分泌発現させるためのプラスミド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的タンパク質遺伝子を導入することで前記タンパク質を培養液中に分泌発現可能な水素酸化細菌、およびそれを用いた前記タンパク質の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、微生物や細胞を用いたタンパク質の生産研究が盛んである。特に、分子量が大きく、かつ複雑な構造を有したタンパク質を含むバイオ医薬品は、低分子医薬品と比べ標的分子に対する高い特異性と親和性を有することから、従来の医薬品では対応できなかった疾患に対応しうる医薬として将来需要が増大することが予測される。

【0003】

バイオ医薬品に用いられるタンパク質を工業的に生産する場合、主に遺伝子組み換え技術や細胞培養技術を用いて生産され、その多くは大腸菌を宿主とした生産系を利用している。しかしながら大腸菌を宿主とした従来の生産系では、培養の際、培養液中に酵母エキス、ペプトン、アミノ酸、ビタミンなどの高価な原料を用いる必要がある上、目的タンパク質の生産量が低いため、製造コストが高くなるという問題点がある。また前記生産系の多くは目的タンパク質を大腸菌内に発現させており、大腸菌体内から目的タンパク質を抽出する操作が必要である。さらに生産した目的タンパク質が大腸菌体内由来のタンパク質分解酵素で分解され純度が低下する問題や、形成した封入体のリフォールディングによる精製コストの上昇の問題もある。

【0004】

酵母や枯草菌を宿主として用いた生産系は、目的タンパク質を培養液中に分泌発現させることが可能である。しかしながら大腸菌を宿主とした系と同様、酵母エキスなどの高価な原料を用いる必要がある。また宿主由来のタンパク質分解酵素による目的タンパク質の分解や、培養液中に含まれる窒素源由来の副生産物による精製コストの上昇の問題もあった。

【0005】

大腸菌、酵母、枯草菌以外に物質生産において有効と考えられる宿主のひとつとして、水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａが知られている。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａは窒素、リン、酸素などが供給制限となるような条件下で大量のＰＨＢ（ポリヒドロキシ酪酸）を蓄積することが報告されており、従属栄養条件下の高密度培養ではＰＨＢを含む菌体収量は２８１ｇ／Ｌにまで達することが確認されている（非特許文献１）。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａは水素酸化によるエネルギーで炭素固定を行なう独立栄養条件でも増殖できるほか、無機塩と糖のみを原料とした培養でも高密度培養が可能であることが知られている。これまで、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを宿主とした物質生産は、前述したＰＨＢのほかにも、２−メチルクエン酸（非特許文献２）、２−ＨＩＢＡ（ヒドロキシイソブチル酸）（非特許文献３）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸（非特許文献４）、シアノフィシン（非特許文献５）などの例が報告されている。また無機塩とグルコースのみの原料からタンパク質である有機リン分解酵素を大量生産した例も報告されている（非特許文献６および７）。

【0006】

また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａは膜タンパク質・分泌タンパク質の種類・数が豊富であることが知られており、これらの中から目的タンパク質の分泌発現に有効な輸送タンパク質をスクリーニングして目的タンパク質と共発現することで、目的タンパク質を培養液中に分泌生産した例が知られている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特願２０１４−０４８５７７

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｒｙｕ，ＨＷ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（１９９７）５５，２８−３２

【非特許文献2】Ｅｗｅｒｉｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２００６）８，５８７−６０２

【非特許文献3】Ｈｏｅｆｅｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１０）８８，４７７−４８４

【非特許文献4】Ｓｈｉｒａｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２００６）１０２，５２９−５３４

【非特許文献5】Ｄｉｎｉｚ，ＳＣ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２００６）９３，６９８−７１７

【非特許文献6】Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２００３）５５，１１４−１２０

【非特許文献7】Ｂａｒｎａｒｄ，ＧＣ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，（２００４）３８，２６４−２７１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａに代表されるＲａｌｓｔｏｎｉａ属の細菌はもともと温泉や土壌など様々な環境に生息している微生物であり、独立栄養条件で増殖できるなど、その環境適応性から物質の取り込みに関わる機能が発達していることが示唆されてきた。実際、芳香族化合物の取り込みや分解を行うＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４、重金属アンチポーターによる重金属排出能を持つＲａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ ＣＨ３４、多数の細胞外毒素を放出する機構を持つＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、細胞外ＰＨＢデポリメラーゼを持つＲａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉなどの様々な種が存在し、細胞膜上の物質輸送に関するタンパク質が多様性に富んでいることが明らかとなっている。また、ゲノム情報解析の結果では、ゲノム中のタンパク質遺伝子のうち１２％が物質の輸送に関わるものであり、大腸菌の９％と比べ多く、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ属の細菌における膜輸送タンパク質の多様性を裏付ける結果となっている。

【0010】

このように大腸菌など既存の組換え微生物よりも膜輸送タンパク質が豊富であることから、膜輸送タンパク質をキャリアとして利用し、目的タンパク質の分泌発現を行う為の宿主として、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属の水素酸化細菌は有望であると考えられる。これまで、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属の水素酸化細菌のゲノムからスクリーニングされた、目的タンパク質の分泌発現に有効な輸送タンパク質遺伝子としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子が挙げられる。この事例では、Ｈ１６＿Ａ２８２０遺伝子とＦｃ結合性タンパク質遺伝子の融合遺伝子を水素酸化細菌へと導入し、輸送タンパク質と目的タンパク質を共発現することで、Ｆｃ結合性タンパク質を培養液中に分泌生産することが可能である。しかしながらこれまでの報告では、菌体が生産する目的タンパク総量のうち約４割弱は菌体内に残ってしまい、培養液中へ分泌される目的タンパク量は高々６割強に過ぎなかった（培養液中への分泌比率７割未満）。そのため、培養液のみからの抽出・精製プロセス構築において、菌体内に残存する目的タンパク質がロス分となってしまうという問題点があった。

【0011】

そこで本発明の目的は、目的タンパク質遺伝子を導入した水素酸化細菌において、菌体が生産する前記目的タンパク質の７割以上を菌体外へ分泌発現可能（培養液中への分泌比率７割以上）な水素酸化細菌、および前記水素酸化細菌を用いた目的タンパク質の製造方法を提供することにある。本発明では、より目的タンパク質の分泌比率に優れた、高性能な輸送タンパク質を選別し用いることで、分泌比率７割以上の、培養液への生産効率が向上しなおかつ高純度な目的タンパク質の微生物発現が可能となる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、目的タンパク質遺伝子を導入した水素酸化細菌において、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ｂ０２７１遺伝子を輸送タンパク質遺伝子として導入し、前記水素酸化細菌により前記目的タンパク質と前記輸送タンパク質とを共発現させることで、菌体が生産する目的タンパク質総量のうち７割以上を培養液中（水素酸化細菌外）に効率よく分泌発現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0013】

すなわち本発明は以下の態様を包含する。
（１）目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を水素酸化細菌に導入して得られる、前記輸送タンパク質が配列番号１０に記載の配列からなるポリペプチドであるタンパク質を発現可能な水素酸化細菌。
（２）輸送タンパク質遺伝子が配列番号８に記載の配列からなるポリヌクレオチドである、（１）に記載の水素酸化細菌。
（３）水素酸化細菌がＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌である、（１）または（２）に記載の水素酸化細菌。
（４）目的タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、（１）から（３）のいずれかに記載の水素酸化細菌。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の水素酸化細菌を培養し、目的タンパク質および輸送タンパク質を共発現させることで、前記水素酸化細菌外へ目的タンパク質を分泌発現させる方法。
（６）配列番号１０に記載の配列からなるポリペプチドをコードするポヌクレオチドを含む、水素酸化細菌外へ目的タンパク質を分泌発現させるためのプラスミド。

【0014】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0015】

本発明において、宿主として用いる水素酸化細菌は特に限定はないものの、独立栄養条件下で増殖でき、かつ物質の取り込みに関わる機能が発達しているＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌が好ましく、その中でもＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａは多様な環境適応性を持ち、かつ物質輸送に関わるタンパク質の機能や数が豊富である点で、特に好ましい水素酸化細菌といえる。

【0016】

本発明は、水素酸化細菌を宿主として目的タンパク質を発現させる際に、目的タンパク質遺伝子に加えて輸送タンパク質遺伝子も水素酸化細菌に導入することを特徴としている。輸送タンパク質は、水素酸化細菌が有する分泌性タンパク質または膜タンパク質の中から、目的タンパク質との共発現により当該目的タンパク質を培養液中に放出する機能を持つタンパク質を適宜選択すればよいが、親水性の高いタンパク質や分子量４０ｋＤａ以下のタンパク質を選択すると好ましい。なお輸送タンパク質の全長が４０ｋＤａ以上の場合は、親水性の高い領域のみを利用し４０ｋＤａ以下の輸送タンパク質として発現させればよい。

【0017】

輸送タンパク質の一例としては、染色体２由来のＨ１６＿Ｂ０２７１のＮ末端領域（配列番号８）があげられる。本発明においては、分泌比率が最大で６割強を示す性能を有する輸送タンパク質遺伝子であるＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子に変え、より目的タンパク質を高効率で分泌可能な輸送タンパク質、すなわちＨ１６＿Ｂ０２７１遺伝子を見出し利用することで、既存法を超える７割以上の分泌比率を有する目的タンパク質の培養液中への分泌発現系を完成するに至った。ここで、分泌比率とは、菌体が菌体内および菌体外に生産する目的タンパク質総量のうち、菌体外（培養液中）に分泌する目的タンパク質の割合を指す。

【0018】

水素酸化細菌に導入する輸送タンパク質遺伝子は、前記輸送タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製後適当な方法で連結して得てもよいし、前記輸送タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換後人工的に合成して得てもよい。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。輸送タンパク質遺伝子の一例としては、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる輸送タンパク質（Ｈ１６＿Ｂ０２７１のＮ末端側領域）をコードするポリヌクレオチドである配列番号１０に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。

【0019】

本発明において目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を導入する際、ペリプラズム中または外膜中に存在する宿主由来のプロテアーゼにより自動的に切断される適当な切断リンカーを介して連結し、目的タンパク質と輸送タンパク質との融合タンパク質として共発現させると好ましい。このようにすることで、発現した目的タンパク質と輸送タンパク質の融合タンパク質がペリプラズムに輸送された後プロテアーゼにより切断されることで、他の特別な処理を行なうことなく自動的に培養液中に分泌されるからである。ここで用いる切断リンカーは、宿主由来のプロテアーゼで切断されるものであれば特に限定はなく、例えば大腸菌のｐｅｌＢやＰａｕｃｉｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅｉの細胞外ＰＨＢ分解酵素のシグナル配列であるｐｒｅＰｈａＺ１が例示できる。また本発明において目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を導入する際、（目的タンパク質遺伝子−（好ましくは切断リンカー）−輸送タンパク質遺伝子）の融合タンパク遺伝子の上流にファジンプロモーターを導入するとさらに好ましい。ファジンプロモーターはＰＨＢ（ポリヒドロキシ酪酸）顆粒の表面を覆うタンパク質であるファジン生産のプロモーターであり、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの中で強力なプロモーターとして知られている。またファジンプロモーターは、培養液中の窒素源やリン源の枯渇により活性化するため、大腸菌発現系などで用いられるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）などの高価な誘導剤の添加なしにタンパク質の高発現が可能となる。

【0020】

本発明の水素酸化細菌を作製する際、目的タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子の水素酸化細菌への導入方法としては、主に広域宿主ベクターを用いた発現方法と自殺ベクターを用いたゲノム組換え法がある。水素酸化細菌としてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを用いた場合、広域宿主ベクターとしてはｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１が、自殺ベクターとしてはｐＪＱ２００ｍｐ１８、ｐＮＨＧ１、ｐＬＯ１が、それぞれ例示できる。なお広域宿主ベクターと自殺ベクターを併用して遺伝子導入を行なってもよい。

【0021】

本発明の水素酸化細菌は、大腸菌の発現系などと比べ、無機塩などの安価な原料からタンパク質の生産が可能である。例えば、大腸菌の培養で通常用いられる酵母エキスやペプトンなどの有機窒素原料を、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩などの無機窒素原料で置き換えることが可能である。また炭素源としては、グルコン酸やフルクトースの代わりに二酸化炭素や炭酸塩などの無機窒炭素原料で置き換えることが可能である。このような夾雑タンパク質のない無機塩原料の使用および目的タンパク質の培養液中への分泌発現により、培養工程のみで培養上清中に高純度なタンパク質を得ることが出来、一般のタンパク質精製における煩雑な工程を簡素化できる。

【0022】

本発明の水素酸化細菌を用いて分泌発現可能な目的タンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモンなどのヒト由来タンパク質、およびそれらの受容体タンパク質があげられる。なお本発明の水素酸化細菌を用いて分泌発現させる目的タンパク質は、完全体であってもよいし、目的タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるポリペプチドであってもよいし、さらに目的タンパク質を構成するアミノ酸の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。以降、本発明の水素酸化細菌を用いて分泌発現可能な目的タンパク質のうち、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。

【0023】

本明細書においてＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該Ｆｃ結合性タンパク質の一例として、
（Ｉ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ＩＩ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質や、
（ＩＩＩ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ＩＶ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。

【0024】

前記（ＩＩ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報や特開２０１４−０２７９１６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。前記（ＩＶ）の具体例としては、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１３−２０２２４５号）があげられる。
（１）配列番号１２の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１２の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１２の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１２の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１２の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１２の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１２の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１２の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１２の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１２の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１２の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１２の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１２の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１２の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１２の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１２の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１２の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１２の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１２の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１２の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１２の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１２の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１２の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１２の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１２の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１２の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１２の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１２の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１２の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１２の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１２の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１２の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１２の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１２の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１２の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１２の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１２の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１２の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１２の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１２の１９２番目のグルタミンがリジンに置換

【発明の効果】

【0025】

本発明は、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の水素酸化細菌は、目的タンパク質遺伝子および輸送効率に優れた新規な輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ｂ０２７１遺伝子を導入し、前記目的タンパク質と前記輸送タンパク質とを共発現させることで、これまで困難であった、菌体が生産する目的タンパク質総量の７割以上の培養液中への分泌発現を可能とする。
（２）本発明の水素酸化細菌を用いた目的タンパク質の製造方法は、従来の分泌発現方法よりもタンパク質製造のコストを抑えることができる。これまでの水素酸化細菌を宿主とした目的タンパク質の培養液中への分泌発現方法では、菌体が生産する目的タンパク質総量の４割弱が培養液中に放出されず菌体内に残存してしまい、培養液中の目的タンパク質生産量低下や精製時の回収率低下の要因になっていた。一方本発明では、より輸送効率に優れた新規な輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ｂ０２７１遺伝子を利用することで、培養液中への生産性および精製時の回収効率が高い微生物生産プロセスを可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子と輸送タンパク質遺伝子とを導入した水素酸化細菌による、試験管培養におけるＦｃ結合性タンパク質の生産性および培養液中への分泌性を評価・比較した結果を示す図である。黒は培養液中へ分泌発現した量、白は菌体内に発現した量である。

【実施例】

【0027】

以下、タンパク質としてＦｃ結合性タンパク質を、水素酸化細菌としてＲａｌｓｔｏｎｉａ属の菌を、それぞれ用いたときの実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。

【0028】

実施例１ 発現ベクターの作製
下記（ａ）から（ｃ）に示すプラスミド（発現ベクター）を作製した。
（ａ）ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ａ２９３５遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子、およびターミネーター遺伝子を導入したプラスミド
（ａ−１）ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ａ２９３５遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子、ターミネーター遺伝子の順番に連結した遺伝子（配列番号１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したものを、人工遺伝子合成により作製した（Ｇｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社 人工遺伝子合成受託サービス、ｐＵＣ５７はＧｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社提供の人工遺伝子挿入用標準ベクター）。なお配列番号１中、７番目から４４４番目の領域がファジンプロモーター（配列番号２）に、４５１番目から６８４番目の領域がＨ１６＿Ａ２９３５遺伝子（配列番号３）に、６９１番目から７９８番目までの領域が切断リンカー遺伝子（配列番号４）に、８０５番目から１６４１番目までがＦｃ結合性タンパク質遺伝子（配列番号５）に、１６４８番目から１７５８番目までの領域がターミネーター遺伝子（配列番号６）に、それぞれ相当する。またファジンプロモーターはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のプロモーターを、切断リンカーはＰａｕｃｉｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅｉの細胞外ＰＨＢ分解酵素のシグナル配列であるＰｒｅｐｈａＺ１を、それぞれ用い、Ｈ１６＿Ａ２９３５遺伝子、切断リンカー遺伝子およびＦｃ結合性タンパク質遺伝子はＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株におけるコドンに最適化したヌクレオチド配列となっている。以下、当該プラスミドをＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＵＣ５７と記載する。

【0029】

（ａ−２）作製したＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＵＣ５７で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＵＣ５７を抽出した。
（ａ−３）市販の広域宿主ベクターであるｐＢＢＲ１ＭＣＳ２で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体の培養物からプラスミド精製キットでｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を調製した。
（ａ−４）得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をＡｐａＩとＸｂａＩで消化し、アガロース電気泳動後、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲル抽出キットにより精製した。
（ａ−５）（ａ−２）で調製したＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＵＣ５７をＡｐａＩとＸｂａＩで制限酵素消化し、アガロース電気泳動後、得られた約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル抽出キットにより精製した。
（ａ−６）（ａ−４）で得られたＤＮＡ断片と（ａ−５）で得られたＤＮＡ断片とを、１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行ない、得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（ａ−７）形質転換後の溶液を、カナマイシン２０μｇ／ｍＬとグルコース１％（ｗ／ｖ）とを含むＬＢ平板培養液（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、バクトアガロース１５ｇ／Ｌ）に撒き、目的クローンを選定した。
（ａ−８）選定した複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認した。

【0030】

以上の方法で、プラスミドＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＵＣ５７のＡｐａＩ／ＸｂａＩ断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＡｐａＩ／ＸｂａＩ部位に挿入したプラスミドである、Ａ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。なおＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２は、ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ａ２９３５遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子およびターミネーター遺伝子が、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺに対し、正方向に挿入されたプラスミドである。またＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２で大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して得られた形質転換体を、以下、Ａ２９３５−ＦｃＲ／ＪＭ１０９とする。

【0031】

（ｂ）ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ａ２８２０遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子およびターミネーター遺伝子を導入したプラスミド
（ｂ−１）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ａ２８２０をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株に適したコドンで変換して得られたヌクレオチド配列（配列番号９の７番目から３３０番目の領域）を含むポリヌクレオチド（配列番号９）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミドＡ２８２０／ｐＵＣ５７を人工遺伝子合成により作製した（Ｇｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社 人工遺伝子合成受託サービス）。
（ｂ−２）作製したＡ２８２０／ｐＵＣ５７で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体の培養物からプラスミドＡ２８２０／ｐＵＣ５７を抽出した。
（ｂ−３）（ａ）で作製したＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで制限酵素消化し、アガロース電気泳動後、得られた約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル抽出キットにより精製した。
（ｂ−４）（ｂ−２）で調製したＡ２８２０／ｐＵＣ５７をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで制限酵素消化し、アガロース電気泳動後、得られた約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル抽出キットにより精製した。
（ｂ−５）（ｂ−３）で得られたＤＮＡ断片と（ｂ−４）で得られたＤＮＡ断片とを、１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行ない、得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（ｂ−６）形質転換後の溶液を、カナマイシン２０μｇ／ｍＬとグルコース１％（ｗ／ｖ）とを含むＬＢ平板培養液に撒き、目的クローンを選定した。
（ｂ−７）選定した複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認した。

【0032】

以上の方法で、プラスミドＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２中のＨ１６＿Ａ２９３５遺伝子をＨ１６＿Ａ２８２０遺伝子に置き換えたプラスミドである、Ａ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。なおＡ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２は、ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ａ２８２０遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子およびターミネーター遺伝子が、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺに対し、正方向に挿入されたプラスミドである。

【0033】

（ｃ）ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子、およびターミネーター遺伝子を導入したプラスミド
（ｃ−１）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域タンパク質遺伝子をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株に適したコドンで変換して得られたヌクレオチド配列（配列番号１０の７番目から５１９番目の領域）を含むポリヌクレオチド（配列番号１０）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミドＢ０２７１Ｎ／ｐＵＣ５７を人工遺伝子合成により作製した（Ｇｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社 人工遺伝子合成受託サービス）。
（ｃ−２）作製したＢ０２７１Ｎ／ｐＵＣ５７で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体の培養物からプラスミドＢ０２７１Ｎ／ｐＵＣ５７を抽出した。
（ｃ−３）（ａ）で作製したＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで制限酵素消化し、アガロース電気泳動後、得られた約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル抽出キットにより精製した。
（ｃ−４）（ｃ−２）で調製したＢ０２７１Ｎ／ｐＵＣ５７をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで制限酵素消化し、アガロース電気泳動後、得られた約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲル抽出キットにより精製した。
（ｃ−５）（ｃ−３）で得られたＤＮＡ断片と（ｃ−４）で得られたＤＮＡ断片とを、１６℃でライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ、東洋紡社製）を行ない、得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（ｃ−６）形質転換後の溶液を、カナマイシン２０μｇ／ｍＬとグルコース１％（ｗ／ｖ）とを含むＬＢ平板培養液に撒き、目的クローンを選定した。
（ｃ−７）選定した複数のコロニーを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンを確認した。

【0034】

以上の方法で、プラスミドＡ２９３５−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２中のＨ１６＿Ａ２９３５遺伝子をＨ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子に置き換えたプラスミドである、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を得た。なおＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２は、ファジンプロモーター、（Ｈ１６＿Ｂ０２７１Ｎ末端領域遺伝子−切断リンカー遺伝子−Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子）の融合遺伝子およびターミネーター遺伝子が、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺに対し、正方向に挿入されたプラスミドである。

【0035】

実施例２ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ形質転換体の作製
以下の方法により、実施例１（ｂ）で作製したＡ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、実施例１（ｃ）で作製したＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、およびＦｃ結合性タンパク質遺伝子を含まないネガティブコントロールとして、市販のｐＢＢＲ１ＭＣＳ２プラスミドで、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換した。
（１）Ａ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ２で、接合性大腸菌Ｓ１７−１を形質転換した。
（２）形質転換後の溶液を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ平板培養液に撒き、目的クローンを選定した。
（３）選定した大腸菌Ｓ１７−１株形質転換体を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）培養液中、３７℃で一晩培養を行なった。
（４）市販のＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株（ＡＴＣＣ １７６９９）またはａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ ５４１）をそれぞれ抗生物質を含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培養液（Ｄｉｆｃｏ社製 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ、８ｇ／Ｌ）中で３０℃で一晩培養した。
（５）（４）で培養した菌体を遠心して濃縮し、６００ｎｍでの菌の濁度を測定後、（３）で培養した各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体と菌体濁度１：１の比で混合し、抗生物質を含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈプレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ８ｇ／Ｌ、バクトアガロース１５ｇ／Ｌ）に撒き３０℃で一晩培養した。なおコントロールとして、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株またはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ＿４株のみを、抗生物質を含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈプレートで３０℃で一晩培養した。
（６）プレート表面の菌体をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培養液に懸濁させ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培養液で１／１０００に希釈した後、カナマイシン６００μｇ／ｍＬを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈプレートに塗布し、３０℃で２日から３日培養した。コントロールである、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株またはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ＿４株のみを培養したプレートからはコロニーは０から数個しか出現しなかった。一方、大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体とＲａｌｓｔｏｎｉａ属の株とを接合し得られた混合菌体を塗布したプレートからは、それぞれ数十〜数百個のコロニーが得られた。
（７）得られた接合菌体の各クローンを培養してプラスミド抽出を行ない、様々な制限酵素による切断パターンの分析により、目的のプラスミドが伝達されたことを確認した。

【0036】

以上の方法で、
Ａ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（実施例１（ｂ）で作製したプラスミド）をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株に接合伝達した株であるＡ２８２０−ＦｃＲ／Ｈ１６株、
Ａ２８２０−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（実施例１（ｂ）で作製したプラスミド）をＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＡ２８２０−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株、
Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（実施例１（ｃ）で作製したプラスミド）をＨ１６株に接合伝達した株であるＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／Ｈ１６株、
Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（実施例１（ｃ）で作製したプラスミド）をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＢ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株、
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（市販プラスミド）をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株に接合伝達した株であるＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、および
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（市販プラスミド）をＰＨＢ＿４株に接合伝達した株であるＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株、
を得ることができた（以下、菌株を上記の名称で記載する）。

【0037】

実施例３ 試験管培養におけるＦｃ結合性タンパク質の生産性評価
実施例２で作製した水素酸化細菌を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質の分泌発現性を評価した。
（１）実施例２で作製した、Ａ２８２０−ＦｃＲ／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株、ＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株、ＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株を、それぞれカナマイシン３００μｇ／ｍＬを含む３ｍｌの２×ＹＴ（バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）培養液を用いて試験管で前培養した（３０℃、１８０ｒｐｍ、一晩）。
（２）（１）の前培養液を、それぞれグルコン酸ナトリウム４％（ｗ／ｖ）およびカナマイシン３００μｇ／ｍＬを含む３ｍｌの２×ＹＴ培養液へ１５０μＬ植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで３日間培養を行なった。
（３）菌体を１ｍＬずつマイクロチューブに採取し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで上清と菌体ペレットを分離した。上清は別のマイクロチューブにそれぞれ５００μＬ分取し、６０％（ｖ／ｖ）グリセロール水溶液を５００μＬ加えて保存した。一方上清を除いた菌体ペレットは、タンパク抽出試薬１ｍＬ（リゾチーム０．２ｍｇ／ｍＬ、エチレンジアミン四酢酸１ｍＭ、フッ化フェニルメチルスルホニル１ｍＭ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ １２５Ｕ／ｍＬを含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）タンパク質抽出試薬）を加えることで菌体内のタンパク質を抽出した。
（４）上清中と菌体中のＦｃ結合性タンパク質量を以下に示すＥＬＩＳＡ法で測定した。
（４−１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）にガンマグロブリン製剤１０μｇ／ｍＬ（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（４−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＴｗｅｅｎ ２０を除いたＴＢＳ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））を２００μＬずつ添加し、４℃で１８時間以上静置することでブロッキング操作を施した。
（４−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、保存した培養上清または菌体抽出物の希釈系列を各ウェルに１００μＬ添加し、固定化したガンマグロブリンと反応させた（３０℃、１時間）。
（４−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、１次抗体ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲ１／ＣＤ６４抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＭＡＢ１２５７１）０．１μＬ／ｍＬを各ウェルに１００μＬ添加して反応させた（３０℃、１時間）。
（４−５）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、２次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ ＨＲＰ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製 Ａ９０−２１６Ｐ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４−６）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに５０μＬずつ添加し発色反応させた。
（４−７）発色後、１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0038】

結果を図１に示す。ネガティブコントロール（Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子を導入しない組換え微生物）である、ＢＢＲ１ＭＣＳ２／Ｈ１６株およびＢＢＲ１ＭＣＳ２／ＰＨＢ＿４株はいずれもＦｃ結合性タンパク質を生産しなかった。一方Ｆｃ結合性タンパク質遺伝子および輸送タンパク質遺伝子を水素酸化細菌に導入した菌株である、Ａ２８２０−ＦｃＲ／Ｈ１６株、Ａ２８２０−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／Ｈ１６株、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／ＰＨＢ＿４株は、Ｆｃ結合性タンパク質をそれぞれ１４ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１８ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ生産し、そのうち培養液中への分泌比率はそれぞれ６４％、６％、７７％、２７％であった。このように、輸送タンパク質遺伝子をＨ１６＿Ａ２８２０からＨ１６＿Ｂ０２７１に変えることで、宿主としてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株、ＰＨＢ＿４株のいずれを用いた場合でも分泌比率の向上が認められた。特に、Ｂ０２７１Ｎ−ＦｃＲ／Ｈ１６株の培養では、これまでの報告で一番良好な生産性・分泌比率を示した株であるＡ２８２０−ＦｃＲ／Ｈ１６株を生産性・分泌比率共に上回る結果を得ることができた。

【0039】

このことから、より高性能な輸送タンパク質遺伝子であるＨ１６＿Ｂ０２７１を目的タンパク質遺伝子と共に水素酸化細菌に導入し、前記目的タンパク質および前記輸送タンパク質を共発現することで、目的タンパク質の生産性を向上し、なおかつ培養液中への分泌比率も向上することがわかる。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]