特許 6602886 ゲムシタビンリポソーム組成物を含む腫瘍治療剤およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6602886

(24)【登録日】2019年10月18日

(45)【発行日】2019年11月6日

(54)【発明の名称】ゲムシタビンリポソーム組成物を含む腫瘍治療剤およびキット

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7068 20060101AFI20191028BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20191028BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191028BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20191028BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20191028BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20191028BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7068

   A61K31/337

   A61P35/00

   A61K9/127

   A61K47/24

   A61K47/28

【請求項の数】6

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2017-548769(P2017-548769)

(86)(22)【出願日】2016年11月1日

(86)【国際出願番号】JP2016082415

(87)【国際公開番号】WO2017078008

(87)【国際公開日】20170511

【審査請求日】2018年4月23日

(31)【優先権主張番号】特願2015-215768(P2015-215768)

(32)【優先日】2015年11月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】306037311

【氏名又は名称】富士フイルム株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】北橋 宗

(72)【発明者】

【氏名】美馬 伸治

(72)【発明者】

【氏名】松本 健

(72)【発明者】

【氏名】関口 貴宏

(72)【発明者】

【氏名】森 幹永

【審査官】 磯部 洋一郎

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／００５７５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３６２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２６５６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１４１０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２４９７９５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０２１０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１１０５５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Cell Oncol., 2013, Vol.36, p.449-457

【文献】 COSCO Donato et al, Liposomes as multicompartmental carriers for multidrug delivery in anticancer chemotherapy, Drug Delivery and Translational Research, 2011, Vol.1, 66-75

【文献】 LIBOIRON D. Barry et al, Nanoscale delivery systems for combination chemotherapy, Drug Delivery in Oncology, 2012, Vol.2, 1013-1050

【文献】 VON HOFF D. Daniel et al, Increased Survival in Pancreatic Cancer with nab-Paclitaxel plus Gemcitabine, N Engl J Med., 2013, Vol.369(18), 1691-1703

【文献】 上野秀樹ら, 切除不能膵癌（転移性,局所進行）に対する化学療法, 医学のあゆみ, Vol.252(8), 2015.02.21, 887-892

【文献】 COSCO Donato et al, In vivo activity of gemcitabine-loaded PEGylated small unilamellar liposomes against pancreatic cancer, Cancer Chemother Pharmacol, 2009, Vol.64, 1009-1020

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７０６８

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ３１／３３７

Ａ６１Ｋ ４７／２４

Ａ６１Ｋ ４７／２８

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とナブパクリタキセルとを組み合わせてなる腫瘍治療剤であって、リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍であり、リポソームを構成する脂質が水素添加大豆ホスファチジルコリンを含む、腫瘍治療剤。

【請求項2】

リポソームがシングルラメラである請求項１に記載の腫瘍治療剤。

【請求項3】

血漿中におけるリポソーム組成物からのゲムシタビンまたはその塩の放出速度が１０質量％／２４ｈｒ〜７０質量％／２４ｈｒである、請求項１又は２に記載の腫瘍治療剤。

【請求項4】

リポソームを構成する脂質がさらに１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍治療剤。

【請求項5】

リポソームの平均粒子径が２ｎｍ〜２００ｎｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍治療剤。

【請求項6】

リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物およびナブパクリタキセルを含むキットであって、リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍であり、リポソームを構成する脂質が水素添加大豆ホスファチジルコリンを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤とを組み合わせてなる腫瘍治療剤ならびにリポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物およびタキサン系抗腫瘍剤を含む腫瘍治療用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍の化学療法において、ゲムシタビンは有用な薬剤として使用されている。しかし、ゲムシタビン単剤での腫瘍に対する奏効率は１０％と低く、また癌患者の生存期間は短いことが知られている（生存期間中央値６．７ヶ月）（非特許文献１）。

【0003】

また、悪性腫瘍の化学療法において、パクリタキセルやナブパクリタキセルなどのタキサン系抗腫瘍剤も有用な薬剤として使用されている。しかし、タキサン系抗腫瘍剤単剤での腫瘍に対する奏効率は１０〜２５％と低く、また癌患者の生存期間は短いことが知られている（生存期間１２〜１５ヶ月）（非特許文献２）。

【0004】

臨床の場では、各抗腫瘍剤の腫瘍に対する感受性の違いを補い、薬効を増強すること等を目的として、多剤併用療法が行われている。例えば、ゲムシタビンとアブラキサンとの併用、ゲムシタビンとパクリタキセルとの併用、ゲムシタビンとナブパクリタキセルとの併用等が知られている。しかし、ゲムシタビンとパクリタキセルとの併用での乳癌患者に対する奏効率は４１．４％、生存期間中央値は１８．６ヶ月である（非特許文献３）。また、ゲムシタビンとナブパクリタキセルとの併用での膵臓癌患者に対する奏効率は２３％、生存期間中央値は８．５ヶ月である（非特許文献１）。

【0005】

リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、薬物送達システムのキャリヤーとしての応用が検討されてきた。リポソーム内に薬物を封入することにより、その薬物の血中安定性および生体内分布を変化させて標的組織への到達性を向上できることが知られている（非特許文献４）。また、粒子径１００〜２００ｎｍのリポソームは癌組織に集積しやすいことが知られている（非特許文献５）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】The New England Journal of Medicine, 2013, 369(18), 1691-1703

【非特許文献2】Journal of Clinical Oncology, 2005, 23(31), 7794-7803

【非特許文献3】Journal of Clinical Oncology, 2008, 26(24), 3950-3957

【非特許文献4】Journal of Liposome Reserch, 1994, 4, 667-687

【非特許文献5】Drug Delivery System, 1999, 14, 433-447

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ゲムシタビン単剤での抗腫瘍効果が低い原因の一つとして、ゲムシタビンの血中滞留時間の短さが挙げられる。ゲムシタビンは時間依存的に強い薬効を示すが、血中滞留時間が２０分と短いことから、十分な抗腫瘍効果を発揮できていない。また、ゲムシタビン単剤での抗腫瘍効果が低い他の原因として、ゲムシタビンの腫瘍組織に対する選択性の低さが挙げられる。抗腫瘍剤を投与した場合、血中から速く消失したり、標的以外の臓器に分布することがあり、必ずしも効果的に腫瘍組織に集積するとは限らない。このため抗腫瘍剤の多くは、腫瘍組織に対する抗腫瘍作用を十分に発揮できず、また、しばしば望ましくない正常組織への作用（副作用）を伴い、重篤な毒性を引き起こしている。
タキサン系抗腫瘍剤単剤での抗腫瘍効果が低い原因の一つとして、腫瘍ごとのタキサン感受性が大きく異なり、治療患者の奏効率が上がらないことが挙げられる。そのため、タキサン系抗腫瘍剤に加えて、メカニズムが異なる抗腫瘍剤との併用が必要である。
また、非特許文献３および非特許文献１に記載されている併用療法についても、治療効果として十分に高いとは言えない。
本発明の課題は、上市されているゲムシタビン、タキサン系抗腫瘍剤およびそれらの併用療法と比較して、抗腫瘍効果に優れた腫瘍治療剤および腫瘍治療用キットを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意検討した結果、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤とを併用することにより、抗腫瘍効果を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、下記を提供する。

【0010】

（１）リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤とを組み合わせてなる腫瘍治療剤。
（２）タキサン系抗腫瘍剤がパクリタキセルもしくはその塩またはナブパクリタキセルである、（１）に記載の腫瘍治療剤。
（３）タキサン系抗腫瘍剤がナブパクリタキセルである、（１）または（２）に記載の腫瘍治療剤。
（４）リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍である、（１）〜（３）のいずれか一に記載の腫瘍治療剤。
（５）リポソームがシングルラメラである（１）〜（４）のいずれか一に記載の腫瘍治療剤。
（６）血漿中におけるリポソーム組成物からのゲムシタビンまたはその塩の放出速度が１０質量％／２４ｈｒ〜７０質量％／２４ｈｒである、（１）〜（５）のいずれか一に記載の腫瘍治療剤。
（７）リポソームを構成する脂質が水素添加大豆ホスファチジルコリン、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、およびコレステロールを含む、（１）〜（６）のいずれか一に記載の腫瘍治療剤。
（８）リポソームの平均粒子径が２ｎｍ〜２００ｎｍである、（１）〜（７）のいずれか一に記載の腫瘍治療剤。
（９）リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物およびタキサン系抗腫瘍剤を含む腫瘍治療用キット。

【0011】

また、本発明は、下記を提供する。
（１０）タキサン系抗腫瘍剤から選択される１以上の抗腫瘍剤と組み合わせて併用投与されるように用いられることを特徴とする、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物を含む抗腫瘍効果増強剤。
（１１）タキサン系抗腫瘍剤がパクリタキセルもしくはその塩またはナブパクリタキセルである、（１０）に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１２）タキサン系抗腫瘍剤がナブパクリタキセルである、（１０）または（１１）に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１３）リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍である、（１０）〜（１２）のいずれか一に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１４）リポソームがシングルラメラである、（１０）〜（１３）のいずれか一に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１５）血漿中におけるリポソーム組成物からのゲムシタビンまたはその塩の放出速度が１０質量％／２４ｈｒ〜７０質量％／２４ｈｒである、（１０）〜（１４）のいずれか一に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１６）リポソームを構成する脂質が水素添加大豆ホスファチジルコリン、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、およびコレステロールを含む、（１０）〜（１５）のいずれか一に記載の抗腫瘍効果増強剤。
（１７）リポソームの平均粒子径が２ｎｍ〜２００ｎｍである、（１０）〜（１６）のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果増強剤。

【0012】

さらに、本発明は、下記を提供する。
（１８）リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物を併用治療に用いる場合の治療有効用量、および、タキサン系抗腫瘍剤を併用治療に用いる場合の治療有効用量を組み合わせて、対象に投与することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
（１９）リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物を併用治療に用いる場合の治療有効用量、および、タキサン系抗腫瘍剤を併用治療に用いる場合の治療有効用量を、同時に、別々に、連続して、あるいは間隔をあけて、対象に投与することを特徴とする、腫瘍の治療方法。

【0013】

さらに、本発明は、下記を提供する。
（２０）リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤から選択される１以上の抗腫瘍剤とを組み合わせてなる腫瘍治療剤を製造するための、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物の使用。
（２１）タキサン系抗腫瘍剤から選択される１以上の抗腫瘍剤と組み合わせて併用投与されるように用いられることを特徴とする、腫瘍治療のための、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物。

【発明の効果】

【0014】

本発明の腫瘍治療剤および腫瘍治療用キットは、ゲムシタビン単剤、タキサン系抗腫瘍剤単剤またはゲムシタビンとタキサン系抗腫瘍剤との併用と比較して、優れた腫瘍退縮および腫瘍増大遅延効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】Ｃａｐａｎ−１皮下移植担がんモデルマウスでの腫瘍体積の推移を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

【0017】

「放出」とは、リポソームに内包された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出ることを意味する。
「放出速度」とは、単位時間あたりに、リポソームに内包された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出る量を意味する。
「血中滞留性」とは、リポソーム組成物を投与した対象において、リポソームに内包された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
「リポソームの平均粒子径」とは、リポソーム組成物中に存在するリポソームの体積平均粒子径を意味する。本発明のリポソーム組成物中に含まれるリポソームの平均粒子径は動的光散乱法を用いて測定する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。
「対象」とは、その予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、その予防若しくは治療を必要とするヒトである。
「腫瘍」としては、例えば、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫および尿路上皮癌等が挙げられる。

【0018】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0019】

（タキサン系抗腫瘍剤）
タキサン系抗腫瘍剤としては、タキサン環またはその類縁構造を有する化合物を有効成分とする医薬組成物が挙げられる。
タキサン系抗腫瘍剤としては、具体的には、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル等ならびにそれらの塩または誘導体が挙げられる。
塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
パクリタキセルの誘導体としては、例えば、ナブパクリタキセル（アルブミン結合パクリタキセル）等が挙げられる。
タキサン系抗腫瘍剤としては、パクリタキセルもしくはその塩またはナブパクリタキセルが好ましく、ナブパクリタキセルがより好ましい。

【0020】

タキサン系抗腫瘍剤は、通常、製剤化に使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤および吸収促進剤などの添加剤を含んでいてもよい。

【0021】

タキサン系抗腫瘍剤の投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内または膀胱内注射する方法、経口投与、経皮投与および坐剤などの方法が挙げられる。投与量および投与回数は、例えば、成人に対しては、経口または非経口（例えば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日あたり例えば、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与することができる。剤形の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤および注射剤が挙げられる。

【0022】

（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラまたはユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性および安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。

【0023】

リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相および膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。

【0024】

リポソームの平均粒子径は特に限定されないが、好ましくは２ｎｍ〜２００ｎｍであり、より好ましくは５ｎｍ〜１５０ｎｍであり、さらに好ましくは５ｎｍ〜１２０ｎｍであり、最も好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍである。

【0025】

リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。

【0026】

リポソームの脂質二重層を構成する成分は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質として、脂質としては、例えば、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類およびそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種または複数種の成分から構成されてよい。

【0027】

リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。これらのなかでも、水素添加大豆ホスファチジルコリン等の水素添加されたリン脂質またはスフィンゴミエリンが好ましく、水素添加大豆ホスファチジルコリンがより好ましい。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。

【0028】

リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、例えば、リン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。

【0029】

脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。

【0030】

コレステロール類としては、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが挙げられる。平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。

【0031】

リポソームにおいて、コレステロール類の添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。一般には、リポソームにおいて、コレステロール類の量は、脂質成分の合計（総脂質）ｍｏｌ中、通常５０ｍｏｌ％程度までの量で含むことが望ましいとされている。しかし、内水相の浸透圧が高いリポソームにおいて、コレステロール類の量の最適な範囲は知られていなかった。
本発明に係るリポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率は１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％であり、好ましくは１５ｍｏｌ％〜２５ｍｏｌ％、より好ましくは１７ｍｏｌ％〜２１ｍｏｌ％である。リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率を１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％とすることにより、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。

【0032】

リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。

【0033】

本発明に係るリポソームには、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類およびそれらの誘導体として、リン脂質、リン脂質以外の脂質またはコレステロール類を親水性高分子で修飾することが好ましい。

【0034】

親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましい。汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がさらに好ましい。

【0035】

ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、５００ダルトン〜１０、０００ダルトンであり、好ましくは１、０００ダルトン〜７、０００ダルトンであり、より好ましくは２、０００ダルトン〜５、０００ダルトンである。

【0036】

本発明に係るリポソームでは、リポソームに含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ＰＥＧ修飾脂質）を用いることが好ましい。ＰＥＧ修飾脂質としては、例えば、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。これらのＰＥＧ修飾脂質は、全脂質量に対して０．３〜５０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％含有するように添加すればよい。

【0037】

本発明に係るリポソームでは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（リポソームに含まれる主たる脂質）、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（主たる脂質と併用する脂質）、およびコレステロールの脂質の組合せが好ましい。

【0038】

本発明に係るリポソームでは、アニオンポリマー（ポリアニオン）を含まないことが好ましい。

【0039】

（薬物）
本発明に係るリポソームは、薬物として少なくともゲムシタビンまたはその塩を内包する。
ゲムシタビンの塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
ゲムシタビンの塩としては、塩酸塩が好ましい。
ゲムシタビンの含有量は、リポソーム組成物に対して０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。

【0040】

（溶解状態で内包した薬物）
本発明に係るリポソームに内包された薬物（ゲムシタビンまたはその塩）は、リポソームの内水相に溶解状態で存在している。ここで、溶解状態とは、リポソームの体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで薬物結晶が観察されない、またはＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合、リポソームに内包された薬物の大部分が溶解し、溶解状態で内包されたものとみなす。この場合、脂質膜が作る物理化学的な環境による溶解促進、または一部薬物が脂質膜に取り込み等が起きていると推測する。

【0041】

（リポソーム組成物）
本発明に係るリポソーム組成物は、ゲムシタビンまたはその塩を内包するリポソームおよびそのリポソームを分散する水溶液を含むことができる。

【0042】

本発明に係るリポソームは、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して、好ましくは２倍〜８倍であり、より好ましくは２．５倍〜６倍であり、さらに好ましくは３倍〜５倍である。内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍であるように設定することで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立することができる。

【0043】

リポソーム組成物には、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えることができる。リポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。

【0044】

等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。

【0045】

安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。

【0046】

酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。

【0047】

ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウム等が挙げられる。

【0048】

リポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。

【0049】

特に、本発明に係るリポソーム組成物は、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウムまたは塩酸等を含有することが好ましい。

【0050】

リポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。

【0051】

リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。

【0052】

（放出速度）
本発明に係るリポソーム組成物において、薬物（ゲムシタビンまたはその塩）の放出速度は１０質量％／２４ｈｒ〜７０質量％／２４ｈｒが好ましく、２０質量％／２４ｈｒ〜６０質量％／２４ｈｒがより好ましく、２０質量％／２４ｈｒ〜５０質量％／２４ｈｒがさらに好ましい。

【0053】

放出速度は、温度に依存するため、定温条件で測定することが好ましい。例えば、ヒトの場合、温度は特に限定されることはないが、体温（３５℃〜３８℃）の範囲内で測定することが好ましい。

【0054】

薬物（ゲムシタビンまたはその塩）の放出速度が１５質量％／２４ｈｒ未満であると、充分な体内での曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多く、また、場合によっては薬物を含むリポソームが不要に長い時間体内に残留することで、皮膚等の本来分布しにくい組織に集積することで予想外の毒性が発現する場合がある。また、７０質量％／２４ｈｒより大きいと、単位時間あたりの曝露する薬物量が多くなるため、最高血中濃度が高くなることで毒性が大きくなり、また、漏出した薬物が腫瘍部以外の組織に分布あるいは速やかな代謝を受け血中滞留性が低下するために好ましくない。

【0055】

薬物の放出速度の測定方法は、特に限定されないが、対象となる哺乳動物、モデル系等に投与した後、哺乳動物またはモデル系から、血液または血漿等を単位時間毎に採取して、必要に応じて前処理等を行う。そして、目的の薬物を液体高速クロマトグラフ、マススペクトル等の方法によって測定することができる。

【0056】

（リポソーム組成物の製造方法）
本発明に係るリポソーム組成物は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包させる薬物ローディング工程、および
リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する浸透圧調整工程
を含む方法により製造することができる。
リポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程、無菌ろ過、無菌充填等の他の工程を含んでもよい。

【0057】

（乳化工程）
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。

【0058】

撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、薬物をローディングしない状態のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。

【0059】

本発明では、撹拌の速度および時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性および安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ〜３５ｍ／ｓｅｃのせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ〜３０ｍ／ｓｅｃのせん断を与えることがより好ましい。

【0060】

乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶剤を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。

【0061】

リポソームを製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃〜７０℃とすることが好ましい。

【0062】

（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、およびシクロヘキサン等の有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤をまったく用いないことがより好ましい。

【0063】

水溶性有機溶媒は、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。

【0064】

エステル系有機溶媒は、有機酸およびアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチルおよびプロピオン酸メチル等が挙げられ、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチルであることがより好ましい。

【0065】

水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合比率は、例えば、質量比で、９０：１０〜３０：７０とすることができ、好ましくは８０：２０〜４０：６０であり、より好ましくは８０：２０〜７０：３０である。水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水または緩衝液等の水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば、１〜３０質量％の範囲で加えることができる。混合溶媒のｐＨは、例えば、３〜１０とすることができ、４〜９であることが好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬剤等の生理活性物質等を含んでいてもよい。

【0066】

水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、例えば、質量比で、８０：２０〜７０：３０とすることができる。

【0067】

脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、４０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌとすることができ、１００ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。

【0068】

（水相）
水相とは、外水相および内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、リポソームの脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等があげられる。水相のｐＨは、例えば、５〜９とすることができ、７〜８であることが好ましい。リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳともいう）およびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。

【0069】

乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、または濃度もしくは浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過または凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。

【0070】

（エクストリュージョン処理）
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液およびフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。

【0071】

（蒸発工程）
リポソーム組成物の製造方法においては、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、および油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。

【0072】

蒸発工程における有機溶剤を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
有機溶剤を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶剤を蒸発させる工程の開始後から３０分以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。

【0073】

（薬物ローディング工程）
薬物ローディング工程では、リポソームに薬物（ゲムシタビンまたはその塩）を内包させる場合、水和・膨潤させる水性媒体に薬物を溶解し、相転移温度以上の加熱、超音波処理またはエクストルージョン等の方法により薬物をリポソームの内水相に内包させることができる。また、脂質乳化時の水相に薬物を溶解させ内水相に内包させることもできる。

【0074】

（浸透圧調整工程）
浸透圧調整工程とは、リポソームの内水相および外水相の浸透圧を調整する工程を意味する。リポソームの内水相および外水相の浸透圧を調整することにより、放出速度を制御することができる。浸透圧調整工程としては、特に限定されないが、透析等が挙げられる。本発明の製造方法では、核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させる工程および浸透圧調整工程を同時に行うことが、生産効率の観点から好ましい。

【0075】

薬物ローディング工程後に得られた液は、外水相と内水相の溶質が均一化されており、そのときの浸透圧を、完成するリポソームの内水相の浸透圧と定義できる。ただし、その後の外水相の透析による置換・浸透圧調整工程において、加熱操作は脂質の相転移以下に抑える等により内水相の溶質が充分に保持されている場合に限る。また外水相の浸透圧は、最終的な透析工程に用いる透析液の浸透圧で定義できる。ただし、透析液にて充分に置換できた場合に限る。また、リポソーム組成物の完成液について、遠心分離または限外ろ過を利用し、外水相の溶質の組成濃度と内水相の溶質の組成濃度を定量し、その組成液の浸透圧を計測することでも、内水相および外水相の浸透圧を得ることができる。
リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整することが好ましく、２．５倍〜６倍に調整することがより好ましく、３倍〜５倍に調整することがさらに好ましい。

【0076】

浸透圧の計測は第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定法に従えばよい。具体的には水の凝固点（氷点）降下度測定により、オスモル濃度を求めることができる。また、水の凝固点降下度は溶質モル濃度で定義されるものであり、溶質モル濃度からもオスモル濃度を求めることができる。

【0077】

外水相の浸透圧は、投与に際して重要な影響を生体に及ぼす。体液の浸透圧から大きく離れる場合は、各組織での水分の移動を原因とした溶血や痛みが発生する。したがって、外水相の浸透圧は、好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは体液と等張である。

【0078】

（無菌ろ過）
リポソーム組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。

【0079】

リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０℃〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５℃〜３０℃程度で製造されることが好ましい。

【0080】

（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソーム組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。

【0081】

（腫瘍治療剤）
本発明の腫瘍治療剤は、通常、製剤化に使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤および吸収促進剤などの添加剤を含んでいてもよい。

【0082】

本発明の腫瘍治療剤は、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物およびタキサン系抗腫瘍剤を含んだ１剤型の製剤であっても、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤との２剤型の製剤であってもよい。好ましくは、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤とを別個の製剤とする２剤型の製剤である。
リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物とタキサン系抗腫瘍剤とが別個の製剤からなる腫瘍治療剤を用いる場合には、各製剤は、同時に、別々に、連続して、あるいは間隔をあけて対象に投与することができる。

【0083】

本発明の腫瘍治療剤の投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内または膀胱内注射する方法、経口投与、経皮投与および坐剤などの方法が挙げられる。
リポソーム組成物の投与経路としては、非経口投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。
タキサン系抗腫瘍剤の投与経路としては、経口投与が好ましい。
本発明の腫瘍治療剤においては、例えば、リポソームにゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物を非経口投与し、タキサン系抗腫瘍剤を経口投与することができる。

【0084】

リポソーム組成物に含まれるゲムシタビンまたはその塩の投与量および投与回数は、１日あたり、１〜４ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与することができる。例えば、注射剤では、ヒト（患者；体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり６０ｍｇ〜２４０ｍｇ、好ましくは１２０ｍｇ〜２４０ｍｇ、より好ましくは１８０ｍｇ〜２４０ｍｇを静脈注射により投与するのが好ましい。しかし、これらの投与量および投与回数に制限されるものではない。
タキサン系抗腫瘍剤の投与量および投与回数は、例えば、成人に対しては、１日あたり、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与することができる。

【0085】

本発明の腫瘍治療剤の剤形の例としては、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤および注射剤等が挙げられる。

【0086】

本発明の腫瘍治療剤を有効に使用できる腫瘍は、癌腫および肉腫であれば特に限定されないが、例えば、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌および頭頚部扁平上皮癌が挙げられ、膵臓癌が好ましい。

【0087】

（キット）
本発明のキットは、（ａ）ゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物および（ｂ）タキサン系抗腫瘍剤の組み合わせからなるキットである。
本発明のキットでは、（ａ）ゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物および（ｂ）タキサン系抗腫瘍剤は各々公知の各種の製剤形態とすることができ、その製剤形態に応じて、通常用いられる各種の容器に収容される。
本発明のキットでは、（ａ）ゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物および（ｂ）タキサン系抗腫瘍剤は各々別の容器に収容されてもよいし、混合されて同じ容器に収容されてもよい。（ａ）ゲムシタビンまたはその塩を内包したリポソーム組成物および（ｂ）タキサン系抗腫瘍剤が各々別の容器に収容されていることが好ましい。

【0088】

（抗腫瘍効果増強剤）
本発明の抗腫瘍効果増強剤は、通常、製剤化に使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤および吸収促進剤などの添加剤を含んでいてもよい。

【0089】

本発明の抗腫瘍効果増強剤は、タキサン系抗腫瘍剤と同時に、別々に、連続して、あるいは間隔をあけて対象に投与することができる。

【0090】

本発明の抗腫瘍効果増強剤の投与経路としては、非経口投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。

【0091】

本発明の抗腫瘍効果増強剤に含まれるゲムシタビンまたはその塩の投与量および投与回数は、１日あたり、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与することができる。例えば、注射剤では、ヒト（患者；体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり６０〜２４０ｍｇ、好ましくは１２０ｍｇ〜２４０ｍｇ、より好ましくは１８０ｍｇ〜２４０ｍｇを静脈注射により投与するのが好ましい。しかし、本発明の抗腫瘍効果増強剤はこれらの投与量および投与回数に制限されるものではない。

【0092】

本発明の抗腫瘍効果増強剤を有効に使用できる腫瘍は、タキサン系抗腫瘍剤が用いられている癌腫および肉腫であれば特に限定されないが、例えば、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫および尿路上皮癌等が挙げられ、膵臓癌が好ましい。

【実施例】

【0093】

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されるものではない。
平均粒子径は、試料を１×ＰＢＳ（ニッポンジーン社製）で１０００倍質量に希釈し、ナノトラックＵＰＡ−ＵＴ（日機装社製）を用い、動的光散乱法で体積平均粒子径を測定した。
腫瘍体積は、腫瘍長径（ａ）および短径（ｂ）をノギスで測定し、以下の式で算出した。
式：（ａ×ｂ²）×０.５（式中、“ａ”は長径であり、“ｂ”は短径である。）

【0094】

（参考例１）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧともいう）を７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６．６ｇ、２．０ｇ、４．３ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝３／１）４０５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。

【0095】

ｂ）水相の調製
４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７８）を調製し水相とした。

【0096】

ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機にて、周速２０ｍ／ｓ、１３０００ｒｐｍにて３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤と水とを蒸発させ、乳化前の容積に対して約１／１０の体積になるまで濃縮し、薬物未内包リポソームを得た。このときの平均粒子径は６８．０ｎｍであった。

【0097】

ｄ）薬物未内包リポソームのバッチ混合
上記ｃ）で調製した薬物未内包リポソーム２バッチを混合した。

【0098】

ｅ）薬物内包リポソームの調製
薬物として、ゲムシタビン塩酸塩を用いた。ゲムシタビン塩酸塩はＴＥＶＡ社から購入した。塩化ナトリウム８１．６３ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２９．０１ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．２９ｇを注射用水９４８ｇで溶解し、ＰＢＳとした。二つの容器にそれぞれゲムシタビン塩酸塩１２．９８ｇ、ＰＢＳ５４．０１ｇ、日局注射用水７５．７４ｇ、８Ｍ水酸化ナトリウム２．７１ｍＬを混合し、薬物溶液とした。それぞれの薬物溶液に、薬物未封入リポソーム１４１．４ｍＬ、８Ｍ水酸化ナトリウム２．７１ｍＬを加え、混合した。この液の浸透圧は１０３９ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧となる。次にこの液を７０℃で１０分間加熱した後４０℃まで冷却し、１０１６ｍＭスクロース／３７ｍＭヒスチジン溶液で希釈した。希釈後、一つにまとめ、薬物ローディング液とした。透析によるリポソーム組成物の完成透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程により、ゲムシタビン塩酸塩濃度０．８１ｍｇ／ｍＬ、平均粒子径７４．９ｎｍ、内水相浸透圧１０３９ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．６倍のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率は１９．３ｍｏｌ％であった。
なお、浸透圧は、溶質モル濃度から算出した。

【0099】

（参考例２）
血漿中の放出速度の測定
リポソーム組成物５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、２４時間の時点で１００μＬ採取した。続いて、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ、ミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分、４℃の条件で遠心ろ過を行った。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、放出速度を次の式により算出した。
式：放出速度（％／２４ｈｒ）＝（インキュベーション２４時間後のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物の全相に含まれる薬量×１００
結果は２４％／２４ｈｒであった。

【0100】

（実施例１）
Ｃａｐａｎ−１皮下移植担がんモデルマウスでの薬効試験
被験物質として、ゲムシタビン（以下、Ｇｅｍともいう）、アブラキサン（以下、Ａｂｘともいう）およびゲムシタビン内包リポソーム組成物（以下、組成物Ａともいう）を用いた。
Ｇｅｍは、ゲムシタビン塩酸塩（ＴＥＶＡ社製）を生理食塩水に溶解させたものを用いた。Ａｂｘは、アブラキサン（Ｃｅｌｇｅｎｅ社製）を生理食塩水に溶解させたものを用いた。ゲムシタビン内包リポソーム組成物は、参考例１で作製したものを用いた。
ヒト膵臓癌細胞株であるＣａｐａｎ−１細胞１×１０⁷個を雌性ヌードマウスの脇腹部皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。腫瘍体積を指標としてＡｂｘおよび組成物Ａの併用投与における皮下腫瘍の抑制効果を評価した。被験物質として、群１はスクロース溶液、群２はＧｅｍ、群３は組成物Ａ、群４および群５はＡｂｘおよびＧｅｍ、群６および群７はＡｂｘおよび組成物Ａを用いた。群１〜５が比較例、群６および群７が実施例である。被験物質はいずれも移植後１７日目から週１回、計３週間、尾静脈投与した。
なお、各薬剤の投与量は、体重減少率が２０％を超えない量をＭＴＤ（最大耐用量）回復が認められないような重篤な最低体重に達しないと思われる用量として設定した。
群構成および投与量を表１に示す。

【0101】

【表1】

【0102】

腫瘍体積の推移を図１に示す。

【0103】

移植後３８日目の腫瘍体積平均値、移植後３８日目の腫瘍体積標準偏差、投薬開始時からの腫瘍退縮率および腫瘍体積平均値２０００ｍｍ³までの到達日数を表２に示す。
統計学的解析として、Tukeyの多重比較検定（Tukey's multiple comparisons test）を実施し、群間でＰ値５％未満を統計学的有意差ありと判定した。データ処理にはGraphpad Prism version 5.03を用いた。
表２において、ａは群１との比較によりＰ＜０．００１であったものを、ｂは群２との比較によりＰ＜０．００１であったものを、ｃは群４との比較によりＰ＜０．０５であったものを示し、Ｎ．Ｒ．は退縮なしを示す。

【0104】

【表2】

【0105】

群６または群７では、群４または群５に比べて移植後３８日目で腫瘍体積が小さく、群６では群４に対して統計学的に有意な差を示した（Ｐ＜０．０５）。また、投薬開始時からの腫瘍退縮率については、群４での腫瘍退縮は見られず、群５での腫瘍退縮率は３１％であったのに対し、群６での腫瘍退縮率は４７％、群７での腫瘍退縮率は８６％であり、群６および群７は優れた腫瘍退縮効果を示した。さらに、腫瘍体積平均２０００ｍｍ³までの到達日数は、群４では移植後６９日目、群５では移植後８０日目であるのに対し、群６および群７では＞８７日であり、遅延していた。
以上の結果から、組成物ＡはＡｂｘとの併用においてヌードマウスの皮下に移植したＣａｐａｎ−１腫瘍細胞の増殖抑制効果を有し、その増殖抑制効果はＧｅｍとＡｂｘとの併用よりも上回ることが示された。

【図1】