特許 6605331 抗体−薬物複合体治療での使用のための免疫造影剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6605331

(24)【登録日】2019年10月25日

(45)【発行日】2019年11月13日

(54)【発明の名称】抗体−薬物複合体治療での使用のための免疫造影剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/32 20060101AFI20191031BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20191031BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20191031BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20191031BHJP

   A61K 49/04 20060101ALI20191031BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20191031BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20191031BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20191031BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20191031BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20191031BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20191031BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/32

   C07K16/46ZNA

   A61K39/395 T

   A61K51/10 100

   A61K51/10 200

   A61K49/04

   C12N15/13

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】17

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2015-555820(P2015-555820)

(86)(22)【出願日】2014年2月5日

(65)【公表番号】特表2016-509606(P2016-509606A)

(43)【公表日】2016年3月31日

(86)【国際出願番号】IB2014000279

(87)【国際公開番号】WO2014122529

(87)【国際公開日】20140814

【審査請求日】2017年1月26日

(31)【優先権主張番号】61/761,190

(32)【優先日】2013年2月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】14305082.1

(32)【優先日】2014年1月21日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ヨヒェン・クルイップ

(72)【発明者】

【氏名】スザンタ・ケー・サーカー

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス・ゲバウアー

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン・ランゲ

(72)【発明者】

【氏名】インゴ・フォッケン

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０４１９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０３６４６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００２／００２７８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５０３６０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０５９７５５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質であって、該抗体様結合タンパク質は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1は配列番号２からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2は配列番号２からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1は配列番号８からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2は配列番号８からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有する２つのポリペプチドを含み、
ここで式［Ｉ］のポリペプチド及び式［ＩＩ］のポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成することを特徴とする、上記抗体様結合タンパク質。

【請求項2】

Ｃ_Lはヒト免疫グロブリンカッパ鎖（ＩＧＫＣ）定常ドメインである、請求項１に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項3】

Ｃ_H1はヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインである、請求項１に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項4】

Ｌ₁がＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項5】

Ｌ₂がＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項6】

式［Ｉ］のポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか
１項に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項7】

式［ＩＩ］のポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項8】

少なくとも１つの放射標識、造影剤、治療剤、又は診断剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項9】

放射標識、造影剤、治療剤又は診断剤が、¹¹⁰Ｉｎ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸Ｆ、⁵²Ｆｅ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁸⁶Ｙ、⁹⁰Ｙ、⁸⁹Ｚｒ、⁹⁴Ｔｃ、^99mＴｃ、¹²⁰Ｉ、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、^154-158Ｇｄ、³²Ｐ、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵¹Ｍｎ、^52mＭｎ、⁵⁵Ｃｏ、⁷²Ａｓ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ、^82mＲｂ、又は⁸³Ｓｒである、請求項８に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項10】

放射標識、造影剤、治療剤又は診断剤が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング；コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波；Ｘ線；及び光音響イメージングからなる群から選ばれる１つ又はそれ以上のイメージングプラットフォームのための薬剤を含む、請求項８又は９に記載の抗体様結合タンパク質。

【請求項11】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体様結合タンパク質の式［Ｉ］及び［ＩＩ］のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。

【請求項12】

配列番号５及び配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の単離された核酸分子。

【請求項13】

請求項１１または１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項14】

請求項１１または１２に記載の核酸分子または、請求項１３に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。

【請求項15】

腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を製造する方法であって、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1は配列番号２からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2は配列番号２からなる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1は配列番号８からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2は配列番号８からなる免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有するポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させることを含み；そして
ここで式［Ｉ］のポリペプチド及び式［ＩＩ］のポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する、上記方法。

【請求項16】

Ｃ_Lはヒト免疫グロブリンカッパ鎖（ＩＧＫＣ）定常ドメインである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

Ｃ_H1はヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインである、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
患者集団における治療上の使用のための薬物の開発において多数の挑戦がある。多くの初期薬剤は、いくつもの理由（例えば、臨床的有用性の欠如又は患者集団において証明された安全性の欠如）のために市場には達しない。効果的でかつ安全な薬物の開発のためのいくつかの臨床上の問題は：（１）薬物が患者集団においてその意図された分子標的と相互作用することを確立すること；（２）特定の標的が同じ患者集団において特定の疾患の処置に関連することを確立すること；及び（３）同じ患者集団において標的に対する薬物の効果に基づいて生物学的最適用量を同定することである。特定の薬物に適切なコンパニオン診断薬（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）の開発は、臨床患者集団における使用のための薬物の開発にかなり役立つ。

【0003】

分子イメージングと併用されたコンパニオン診断薬は、分子標的及びインビボでの薬物分子とのその相互作用の強力な非侵襲性４次元評価を提供する。イメージングプラットフォームのいくつかの例としては：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）；単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）；光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；超音波、Ｘ線、又は光音響イメージングが挙げられる。画像化コントラスト（ｉｍａｇｉｎｇ ｃｏｎｔｒａｓｔ）の選択は、特定の分子プローブ及び固有の組織特徴を考慮に入れる。コンパニオン診断薬と分子イメージングとの併用は、患者における特定の薬物のその分子標的との相互作用のより良い理解を可能にし、これは特定の薬物に対する可能性のある応答者を同定する際に役立ち得、そして薬物の感受性及び抵抗性の機序（及びその最適投薬）の理解及び決定を補助し得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

発明の要旨
ヒト化モノクローナル抗体ＤＳ６に基づくコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）生体イメージングのような画像化技術による、腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープ（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）ＣＡ６のインビボ検出及び定量のための診断ツールとしての使用のために開発された。抗体様結合タンパク質は、患者の層別化及び細胞傷害性マイタンシノイドＤＭ４に結合された腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体からなるヒト化ＤＳ６抗体−薬物免疫複合体ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の治療有効性の早期評価を容易にする。

【0005】

コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ＣＡ６エピトープを標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のような高いＣＡ６発現を有する組織（例えば、腫瘍組織）を標的とする薬物での処置に対して優先的に応答し得る高いＣＡ６発現を有する患者及び患者亜集団を同定するために使用され得る。ＡＤＣは、例えば、ＤＭ１若しくはＤＭ４のようなマイタンシン誘導体のような細胞傷害性薬剤、又は国際公開第ＷＯ ２００５／００９３６９号に記載されるような別の薬剤に結合されたｈｕＤＳ６分子であり得る。コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、例えば被験体がＡＤＣでの処置に対して応答する可能性があるかどうかを決定するためにＡＤＣの投与前に投与され得る。

【0006】

コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）のような生体イメージング技術によるインビボＣＡ６検出のために使用され得、そして４８〜２４時間以内又はそれ以下のような短い曝露時間及び速い画像化を可能にし、コンパニオン診断薬は、適切なクリアランス動態を有する高度に特異的な結合剤である。

【0007】

本明細書に開示される発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を提供し、ここで該抗体様結合タンパク質は、キレート剤をさらに含む。抗体様結合タンパク質は、ＰＥＴのような生体イメージング技術によるヒトＣＡ６腫瘍抗原のインビボ検出及び定量のための診断ツールとして使用され得、ここで抗体様結合タンパク質は、生体イメージングトレーサーへのカップリングのために適切なキレート剤に複合体化される。

【0008】

本明細書に開示される発明はさらに、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を提供し、ここで抗体様結合タンパク質はキレート剤をさらに含む。抗体様結合タンパク質は、ＣＡ６腫瘍抗原を発現する組織のための造影剤又は検出剤として使用され得、ここで抗体様結合タンパク質は、薬剤へのカップリングのために適したキレート剤に結合される。

【0009】

本明細書に開示される発明は、直列に（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）配置されかつリンカー配列により分離された、ヒト化ＤＳ６抗体由来のそれぞれＶ_L及びＶ_H ＤＮＡ配列を含むＤＳ６抗体様結合タンパク質を製造する方法をさらに提供する。ＤＳ６ Ｖ_L−リンカー−ＤＳ６ Ｖ_L及びＤＳ６ Ｖ_H−リンカー−ＤＳ６ Ｖ_H構築物は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］に従って、ＤＮＡレベルで３’末端にてヒト定常ドメイン配列に融合される：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
式中：
Ｖ_L1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は、ヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーであり、そして
ここでＶ_L1及びＶ_L2のポリペプチドは、同じか又は異なるＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、そしてＶ_H1及びＶ_H2のポリペプチドは同じか又は異なるＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；そしてここで式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する。Ｃ_L及びＣ_H1ドメインは、例えばジスルフィド結合により接続され得る。さらに、式Ｉ及び式ＩＩのポリペプチドは任意のタグ（例えば、ポリヒスチジン又は６ｘ−Ｈｉｓタグ）を含み得る。

【0010】

本明細書に開示される発明は、患者において癌のような障害を処置する方法をさらに提供し、該方法は、患者においてＣＡ６の発現レベルを得て、［ここでキレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質が患者に投与される］、そして組織がＣＡ６を発現するかどうかに関して決定を行う工程；及び患者が参照組織におけるＣＡ６発現レベルよりも少なくとも１０％高い、例えば、参照組織におけるＣＡ６発現より１０％、２０％、３０％、４０％又はそれ以上であるＣＡ６発現レベルを有する場合に、患者にｈｕＤＳ６−ＤＭ４を投与する工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明において特徴とされる抗体様結合タンパク質は、漿液性卵巣癌、類内膜卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜の新生物、外陰部の新生物、乳癌、膵腫瘍、及び尿路上皮の腫瘍におけるような腫瘍組織におけるＣＡ６発現のレベルを決定するために使用される。

【0011】

本明細書に開示される発明は、癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置のための候補であるかどうかを決定する方法をさらに提供し、該方法は、患者においてＣＡ６の発現レベルを得て、［ここでキレート剤をさらに含む、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質が患者に投与される］、そしてＣＡ６発現レベルが、参照組織におけるＣＡ６発現レベルよりも少なくとも１０％高い、例えば、参照組織におけるＣＡ６発現より１０％、２０％、３０％、４０％又はそれ以上であるかどうかを決定する工程；及び肯定と決定された場合に該癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置のための候補であるという指示を提供する工程を含む。

【0012】

本明細書に開示される発明は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置に対する癌患者の応答をモニタリングする方法をさらに提供し、該方法は、患者においてＣＡ６の発現レベルを得て、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質［ここで抗体様結合タンパク質はキレート剤をさらに含む］を、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置の前及び間に該患者に投与し、ＣＡ６発現レベルがｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置の結果として増加したか、同じか又は減少したかどうかを決定する工程；及びｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置の前のＣＡ６発現レベルと比較して、患者におけるＣＡ６発現レベルが減少した場合に処置が継続されるべきであるという指示を提供する工程を含む。

【0013】

本発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を提供し、ここで抗体様結合タンパク質は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は、ヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有する２つのポリペプチドを含み；
ここで式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成し；そして
ここで抗体様タンパク質はキレート剤をさらに含む。

【0014】

本發明はまた、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を製造する方法を提供し、ここで抗体様結合タンパク質はキレート剤をさらに含み、該方法は：
（ａ） 以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は、ヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有するポリペプチド［ここで、式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する］をコードする１つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させること；並びに
（ｂ） 抗体様結合タンパク質をキレート剤に結合させること
を含む。

【0015】

本発明はさらに、ＣＡ６に特異的に結合しかつキレート剤をさらに含む抗体様結合タンパク質及び造影剤を患者に投与すること；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより患者においてＣＡ６を発現する患部組織を同定すること；並びに患部組織におけるＣＡ６発現が参照標準におけるＣＡ６発現の１０％より高いか１０％に等しい場合に、患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置のための候補であるということを決定することを含む、患者においてＣＡ６を発現する患部組織を処置するための方法を提供する。

【0016】

本発明はさらに、患者においてＣＡ６陽性癌を処置する方法を提供し、該方法は、患者においてＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；及び患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照標準におけるＣＡ６の発現の１０％より高いか又は１０％に等しい場合に、患者にｈｕＤＳ６−ＤＭ４を投与する工程を含む。

【0017】

本発明はさらに、癌患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置のための候補であるかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、患者においてＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；及び患者におけるＣＡ６の発現レベルが参照標準におけるＣＡ６発現の１０％より高いか又は１０％に等しい場合に該患者がｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置のための候補であると決定する工程を含む。

【0018】

本発明はさらに、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置に対する癌患者の応答をモニタリングする方法を提供し、該方法は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の投与後に患者におけるＣＡ６の発現レベルに関する情報を取得する工程；及び患者におけるＣＡ６発現のレベルが、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置前のＣＡ６発現レベルと比較して減少した場合に、処置が継続されるべきであるという指示を提供する工程を含む。

【0019】

本発明は、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を提供し、ここで抗体様結合タンパク質は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は、ヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有する２つのポリペプチドを含み、
ここで式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合分子を形成する。

【0020】

本発明はまた、ＣＡ６に特異的に結合する抗体様結合タンパク質を製造する方法を提供し、該方法は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2はＤＳ６ベースの免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは、ヒトＩＧＫＣ免疫グロブリン軽鎖定常ドメインのような免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は、ヒト免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインのような免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーである］
により表される構造を有するポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の核酸分子を細胞において発現させることを含み、そして
ここで式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、二価単一特異性タンデム免疫グロブリン抗体様結合タンパク質を形成する。

【0021】

本発明の特定の実施態様は、特定の実施態様の以下のより詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】二価の操作された抗体様結合タンパク質である、二価単一特異性タンデム免疫グロブリンフラグメント（Ｂ−Ｆａｂ）の略図。Ｂ−Ｆａｂタンパク質の例としては：Ｇ４ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３）及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ、Ｇ４ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号３）を有しＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを含まないＢ−Ｆａｂ、及びＧ４Ｓリンカー及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂが挙げられる。

【図2-1】ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）₂）リンカー（配列番号３）及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ ＤＳ６ベースの操作された抗体のゲル電気泳動（図２Ａ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図２Ｂ）、及び蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）（図２Ｃ及び図２Ｄ）による評価。

【図2-2】図２−１の続き。

【図2-3】図２−２の続き。

【図3-1】（Ｇ４Ｓ）₂リンカーを有するＢ−Ｆａｂ ＤＳ６ベースの操作された抗体の、ゲル電気泳動（図３Ａ）、ＳＥＣ（図３Ｂ）、及びＦＡＣＳ（図３Ｃ及び図３Ｄ）による評価。

【図3-2】図３−１の続き。

【図3-3】図３−２の続き。

【図4-1】ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを有するＢ−Ｆａｂ ＤＳ６ベースの操作された抗体の、ゲル電気泳動（図４Ａ）、ＳＥＣ（図４Ｂ）、及びＦＡＣＳ（図４Ｃ及び図４Ｄ）による評価。

【図4-2】図４−１の続き。

【図4-3】図４−２の続き。

【図5】ＤＯＴＡを用いないＡ２７８０細胞（図５Ａ）、ＤＯＴＡを用いないＷＩＳＨ細胞（図５Ｂ）、及びＤＯＴＡを用いたＷＩＳＨ細胞（図５Ｃ）を使用したＦＡＣＳによるＢ−Ｆａｂ ＤＳ６ベースの操作された抗体の評価は、ＤＯＴＡ結合がＤＳ６結合を変更しないということを実証する。

【図6A】⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の評価は、⁶⁴Ｃｕ及びＤＯＴＡ結合を用いた放射標識が理想的な放射化学（図６Ａ）及び血清安定性（図６Ｂ）を可能にするということを実証する。

【図6B】⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の評価は、⁶⁴Ｃｕ及びＤＯＴＡ結合を用いた放射標識が理想的な放射化学（図６Ａ）及び血清安定性（図６Ｂ）を可能にするということを実証する。

【図7】二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）骨格（図７Ａ）及びＢ−Ｆａｂ骨格（図７Ｂ）を有する抗体様結合タンパク質間の比較。

【発明を実施するための形態】

【0023】

発明の詳細な説明
本明細書に開示される発明は、ＰＥＴ生体イメージングによるヒトＣＡ６腫瘍抗原のインビボ検出及び定量のための診断ツールとして使用するための、ヒト化モノクローナル抗体ＤＳ６に基づくコンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）診断用抗体様結合タンパク質に関する。コンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、患者の層別化、及び細胞傷害性マイタンシノイドＤＭ４に結合された腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープ（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｔｏｐｅ）のＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体からなるＤＳ６抗体−薬物免疫複合体ｈｕＤＳ６−ＤＭ４の治療有効性の早期評価を容易にする。抗体−薬物免疫複合体ｈｕＤＳ６−ＤＭ４は、例えば国際公開第ＷＯ ２００５／００９３６９号（参照により本明細書に加入される）に記載される。ＤＳ６抗体及びＣＡ６腫瘍抗原は、例えばＫｅａｒｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０００ Ｄｅｃ １５；８８（６）：８６６−７２）（参照により本明細書に加入される）に記載される。

【0024】

ＨｕＤＳ６−ＤＭ４は、細胞傷害性マイタンシノイドＤＭ４に結合された、腫瘍関連ＭＵＣ１−シアログリコトープＣＡ６に対するヒト化モノクローナル抗体（ｈｕＤＳ６）からなる抗体−薬物免疫複合体のクラスの最初のものである。ムチンタンパク質は、上皮表面上に保護的粘膜バリアを形成する際に本質的な役割を果たし、そして肺、乳房、卵巣、胃及び膵臓を含む多くの様々な組織の粘膜表面を覆う上皮細胞の頂端膜側に発現される。ＭＵＣ１（ムチン−１）は、多数の上皮癌において過剰発現することが知られており、そしてＣＡ６過剰発現はヒト癌における高悪性度挙動及び患者の悪い予後に関連する。ＣＡ６は正常成体組織では限られた分布を有し、従ってＤＳ６抗体をＣＡ６陽性腫瘍（例えば、卵巣、子宮、膵臓、乳房又は肺の腫瘍）選択的処置のための見込みのある薬剤にしている。抗体／抗原結合及び内部移行の際に、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４免疫複合体はＤＭ４を放出し、これがチューブリンと結合して微小管の組み立て／分解動力学を妨害し、ＣＡ６を発現する腫瘍細胞の有糸分裂停止を生じる。ＨｕＤＳ６−ＤＭ４は現在、ＣＡ６抗原陽性固形腫瘍と診断された患者においてフェーズＩ臨床試験を受けている。

【0025】

腫瘍におけるＣＡ６の発現を示し、従ってｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置に応答するかもしれない患者を同定するために、高親和性でＣＡ６に結合するコンパニオン診断ツールが開発された。さらに、このコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質は、ｈｕＤＳ６−ＤＭ４治療に対する患者の応答を非侵襲的にモニタリングし、それにより臨床試験又は臨床処置における患者の層別化を容易にする（すなわち、腫瘍退縮と相関したＣＡ６シグナルの減少又は不十分な有効性と一緒になった標的下方調節）ための補助ツールを提供する早期有効性マーカーとして作用する。このようなコンパニオン診断は、消耗を減少させて患者への有効な薬物のより速い送達に役立ち得る。本明細書に開示されるコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質はまた、ＰＥＴ生体イメージングによるインビボでのＣＡ６検出のために使用され得る。高い腫瘍対血液シグナルでの短い曝露時間及び例えば４８〜２４時間以内又はそれ以下の速いイメージングを可能にするために、適切なクリアランス動態を有する高度に特異的な結合剤が必要とされた。

【0026】

ＤＳ６抗体配列由来の様々な新規な抗体様結合タンパク質が、ＰＥＴイメージングのために必要な仕様（例えば、より良好な腫瘍透過、より速いクリアランス動態及び優れた腫瘍対血液比）に合うように適したキレート剤及び放射標識と共に開発された。所定のイメージング性能指数（ｉｍａｇｉｎｇ ｆｉｇｕｒｅｓ ｏｆ ｍｅｒｉｔ）（ＩＦＯＭ）に基づいて、約７０ｋＤａの抗体フラグメント（Ｂ−Ｆａｂと呼ばれる二価単一特異性タンデム免疫グロブリン）を特異性評価及び最終的な臨床解釈のために選択した。Ｂ−Ｆａｂ形式は：（１）熱ストレスに対する高い安定性（４２℃で１週間のインキュベーション）；（２）ヒト血清中での高い安定性（３７℃で２４時間のインキュベーション）；及び（３）一時的細胞培養における合理的な生産性（約２ｍｇ／Ｌ）という利点を提供した。全長抗体（約１５０ｋＤａ）と比較して、抗体フラグメント（約５０〜７５ｋＤａ）は、より速い腎排出速度及び血液クリアランスを示し、これによりＰＥＴ生体イメージングの間により高いシグナル対ノイズ比を生じる。

【0027】

Ｂ−Ｆａｂ ＤＳ６抗体様結合タンパク質は、ＤＳ６ヒト化モノクローナル抗体のＣＡ６抗原認識部位に基づく２つのＣＡ６抗原認識部位を含み、そしてＣＡ６抗原に対して高い結合親和性を示す。キレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＴＰＡ又はＴＥＴＡ）との結合後に、ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂを放射標識し、そしてインビボＰＥＴ生体イメージング実験に使用した。

【0028】

標準的な組み換えＤＮＡ方法を使用して、本発明のコンパニオン診断用抗体（ＤＳ６抗体に基づく）を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組み換え発現ベクターに組み込み、そして上記ベクターを宿主細胞に導入した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄ．）を参照のこと。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従って、当該分野において一般的に理解されるように、又は本明細書に記載されるように、行われ得る。具体的な定義が示されていなければ、本明細書において記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの検査法及び技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。同様に、従来の技術が、化学合成、化学分析、医薬品、製剤、送達及び患者の処置のために使用され得る。

【0029】

１． 一般的定義
本開示に従って利用される以下の用語は、別の指示がなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする。状況により他のものが必要とされなければ、単数形の用語は複数形を含むものとし、かつ複数形の用語は単数形を含むものとする。

【0030】

本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖又は二本鎖核酸ポリマーを指す。特定の実施態様において、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよく、又はいずれかの型のヌクレオチドの修飾された形態でもよい。このような修飾としては、ブロムリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）のような塩基修飾、アラビノシド及び２’，３’−ジデオキシリボースのようなリボース修飾、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）のようなヌクレオチド間連結修飾が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡの一本鎖形態及び二本鎖形態を具体的に含む。

【0031】

「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源、又はそれらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドであり、その起源によって、単離されたポリヌクレオチドは：（１）単離されたポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部とは結合していない、（２）それが天然で連結されていないポリヌクレオチドに連結される、又は（３）より大きな配列の一部として天然で存在しない。

【0032】

「単離されたポリペプチド」は：（１）通常で共に見出されるであろう少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種由来の他のポリペプチドを本質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞により発現される、（４）それが天然で付随しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０％とは分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然で結合しているポリペプチドの部分とは（共有結合又は非共有結合相互作用により）結合していない、（６）それが天然で結合していないポリペプチドと作動可能に結合している（共有結合又は非共有結合相互作用により）、又は（７）天然に存在しないものである。このような単離されたポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はそれらのいずれかの組み合わせによりコードされ得る。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その使用（治療用、診断用、予防的、研究又はその他）を妨害しないであろうその天然の環境において見出されるポリペプチド又は他の夾雑物を実質的に含まない。

【0033】

本明細書で使用される用語「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及びマウス抗体を包含する。

【0034】

本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に相当する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、マウス及びラットのようなげっ歯類、並びにウサギのようなウサギ類を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物において産生される。他の実施態様において、ヒト抗体はハイブリドーマ細胞において産生される。さらに他の実施態様において、ヒト抗体は組み換えにより産生される。

【0035】

天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含む。このような四量体はそれぞれ、典型的にはポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対が１つの全長「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの全長「重」鎖（典型的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。本明細書で使用される用語「重鎖」及び「軽鎖」は、標的抗原に対する特異性を付与するために十分な可変ドメイン配列を有するいずれかの免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖及び重鎖のアミノ末端部分は、典型的に抗原認識に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを典型的に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的にはエフェクター機能に関与する定常ドメインを規定する。従って、天然に存在する抗体において、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（Ｖ_H）及び３つの定常ドメイン（Ｃ_H1、Ｃ_H2、及びＣ_H3）を含み、ここでＶ_Hドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、そしてＣ_H3ドメインはカルボキシル末端にあり、そして全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは可変ドメイン（Ｖ_L）及び定常ドメイン（Ｃ_L）を含み、ここでＶ_Lドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、そしてＣ_Lドメインはカルボキシル末端にある。

【0036】

哺乳動物軽鎖、特にヒト軽鎖は、典型的にはカッパ及びラムダ軽鎖に分類され、そしてヒト重鎖は典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンに分類され、そしてそれぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは同様に、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分される。全長軽鎖及び重鎖内で、可変ドメイン及び定常ドメインは典型的には、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接続され、重鎖は約１０のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ ｅｄ．、１９８９）（参照によりその全体があらゆる目的のために加入される）を参照のこと。各軽／重鎖対の可変領域は典型的には抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域又はＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域により結合される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域と一列になっており、こにより特異的エピトープへの結合が可能となり得る。アミノ末端からカルボキシル末端に、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方が、典型的にはドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。

【0037】

本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」は、単量体形態でも多量体形態でも、抗体の消化により生じるか又は他の手段により産生される非抗原結合フラグメントの配列を含む分子を指し、そしてヒンジ領域を含有し得る。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくはヒト起源であり、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましいが、いずれの免疫グロブリンであってもよい。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合により二量体又は多量体形態に連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）によって１〜４の範囲に及ぶ。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じたジスルフィド結合二量体である。本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」は、単量体形態、二量体形態、及び多量体形態に対する総称である。

【0038】

本明細書で使用される用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから改変されているが、なおサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体ＦｃＲｎ（新生仔（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃ受容体）についての結合部位を含む分子又は配列を指す。例となるＦｃ変異体、及びそれらのサルベージ受容体との相互作用は当該分野で公知である。従って、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含み得る。さらに、天然Ｆｃは、それらが本発明の抗体様結合タンパク質に必要でない構造的特徴又は生物学的活性をもたらすので、除去され得る領域を含む。従って、用語「Ｆｃ変異体」は、以下に影響を及ぼすか又はそれらに関与する、１つ若しくはそれ以上のネイティブＦｃ部位若しくは残基を欠いているか、又は１つ若しくはそれ以上のＦｃ部位若しくは残基が改変されている分子又は配列を含む：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端異種性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。

【0039】

本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」は、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体及び上で定義された配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃ分子と同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、抗体全体から消化されても、他の手段により産生されても、単量体形態又は多量体形態の分子を含む。

【0040】

本明細書で使用される用語「抗体様結合タンパク質」は、少なくとも１つの標的抗原に特異的に結合する、天然に存在しない（又は組み換え）操作された分子を指す。これには、例えば、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント及び二特異性抗体が包含される。

【0041】

特定の局面において、「抗体様結合タンパク質」は、以下の式［Ｉ］及び［ＩＩ］：
Ｖ_L1−Ｌ₁−Ｖ_L2−Ｃ_L ［Ｉ］
Ｖ_H1−Ｌ₂−Ｖ_H2−Ｃ_H1 ［ＩＩ］
［式中：
Ｖ_L1は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_L2は免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H1は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｖ_H2は免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
Ｃ_Lは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
Ｃ_H1は免疫グロブリンＣ_H1重鎖定常ドメインであり；
Ｌ₁及びＬ₂はアミノ酸リンカーであり；そして
ここで式Ｉのポリペプチド及び式ＩＩのポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント（二価単一特異性タンデム免疫グロブリンフラグメント）を形成する］
に従って、直列に配置されかつ短いアミノ酸リンカー配列により隔てられた、抗体からのそれぞれのＶ_L及びＶ_HＤＮＡ配列を含む。

【0042】

特定の局面において、Ｖ_L1及びＶ_L2は同一のポリペプチドであり、そして特定の局面において、Ｖ_H1及びＶ_H2は同一のポリペプチドである。

【0043】

特定の局面において、又は典型的には、Ｃ_L及びＣ_H1ドメインはジスルフィド結合により連結される。

【0044】

特定の局面において、Ｌ₁及びＬ₂はそれぞれ少なくとも５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長を有する。

【0045】

特定の局面において、Ｌ₁及びＬ₂はそれぞれＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）のいずれかである。

【0046】

特定の局面において、式［Ｉ］のポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を含む。

【0047】

特定の局面において、式［ＩＩ］のポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。

【0048】

特定の局面において、上記抗体様結合タンパク質は、少なくとも１つの放射標識、造影剤、治療剤、又は診断剤をさらに含む。

【0049】

特定の局面において、上記抗体様結合タンパク質は、少なくとも１、１．１、１．２、１．３、１．４又は１．５Ｃｉ／μＭｏｌｅの比放射能を有する。

【0050】

特定の局面において、上記抗体様結合タンパク質は、例えば遊離抗体様結合タンパク質を用いて結合をＦＡＣＳにより測定した場合に、多くとも８、７、６、５又は４ｎＭの見かけのＫｄを有し得る。

【0051】

特定の局面において、上記抗体様結合タンパク質は、熱ストレスに対する高い安定性を示す。より詳細には、２５、２０、１５、１０又は５％未満の可溶性抗体様結合タンパク質が、４２℃で１週間のインキュベーション後に失われ得る。

【0052】

特定の局面において、上記抗体様結合タンパク質は、ヒト血清中で高い安定性を示す。より詳細には、抗体様結合タンパク質の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０又は９５％が、ヒト血清中で２４時間３７℃でインキュベーション後に単量体であり得る。

【0053】

「単離された」抗体様結合タンパク質は、その天然環境の構成要素から同定され、そして分離及び／又は回収されたものである。その天然環境の夾雑物成分は、抗体様結合タンパク質の診断又は治療上の使用を妨害するであろう物質であり、これらとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施態様において、抗体様結合タンパク質は：（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定して抗体の９５質量％より高くまで、そして最も好ましくは９９質量％より高くまで、（２）スピニングカップ配列決定機器の使用によるＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー若しくは、好ましくは、銀染色を使用する還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。抗体様結合タンパク質の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、単離された抗体様結合タンパク質は、組み換え細胞内のそのままの抗体様結合タンパク質を含む。

【0054】

本明細書で使用される用語「実質的に純粋」又は「実質的に精製された」は、存在する主な化学種である（すなわち、モルベースで、組成物中のいずれの他の個々の化学種よりも豊富である）化合物又は化学種を指す。いくつかの実施態様において、実質的に精製されたフラクションは、その化学種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を構成する組成物である。他の実施態様において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％より多くを構成する。なお他の実施態様において、化学種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなる本質的均一性（夾雑物種を従来の検出方法により組成物において検出することができない）まで精製される。

【0055】

本明細書で使用される用語「抗原」又は「標的抗原」は、抗体又は抗体様結合タンパク質により結合されることができ、そしてさらにその抗原のエピトープへ結合することができる抗体を産生するために動物において使用することができる分子又は分子の部分を指す。標的抗原は１つ又はそれ以上のエピトープを有し得る。抗体様結合タンパク質により認識される各標的抗原に関して、抗体様結合タンパク質は、標的抗原を認識するインタクトな抗体と競合することができる。「多選択性」又は「多機能性」抗体様結合タンパク質以外の「二価」抗体様結合タンパク質は、同一の抗原特異性を有する抗原結合部位を含むと理解される。

【0056】

二重特異性又は二機能性抗体は、典型的には２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位又はエピトープを有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない様々な方法により産生され得る。

【0057】

Ｆａｂとも呼ばれるＦ（ａｂ）フラグメントは、典型的には、１つの軽鎖並びに１つの重鎖のＶ_H及びＣ_H1ドメインを含み、ここでＦ（ａｂ）フラグメントのＶ_H−Ｃ_H1重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用されるＦ（ａｂ）フラグメントはまた、アミノ酸リンカーにより隔てられた２つの可変ドメインを含有する１つの軽鎖、並びにアミノ酸リンカーにより隔てられた２つの可変ドメイン及びＣ_H1ドメインを含有する１つの重鎖も含み得る。Ｆ（ａｂ）フラグメントはまた、Ｃ_LとＣ_H1との間のジスルフィド結合も含み得る。

【0058】

Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、典型的には、鎖間スルフィド結合が２つの重鎖間に形成されてＦ（ａｂ’）₂分子を形成し得るように、１つの軽鎖、及び定常領域（Ｃ_H1ドメインとＣ_H2ドメインとの間）より多くを含有する１つの重鎖の部分を含む。

【0059】

「二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、典型的には、２つの可変領域を一緒に折り畳むためには短すぎる小さいなペプチドリンカーにより接続されて、ｓｃＦｖｓを二量体化させる、重鎖可変（Ｖ_H）領域及び軽鎖可変（Ｖ_L）領域からそれぞれがなる、２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の二量体である。

【0060】

本発明の抗体様結合タンパク質に関して句「生物学的特性」、「生物学的特徴」、及び用語「活性」は、本明細書において置き換え可能に使用され、そしてこれらとしては、限定されないが、エピトープ親和性及び特異性、抗原標的（又は標的化されたポリペプチド）の活性を拮抗する能力、抗体様結合タンパク質のインビボ安定性、及び抗体様結合タンパク質の免疫原性特性が挙げられる。抗体様結合タンパク質の他の同定可能な生物学的特性又は特徴としては、例えば、交差反応性、（すなわち、一般的に、抗原標的の非ヒトホモログとの、又は他の光源標的若しくは組織との）、及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の高い発現レベルを保つ能力が挙げられる。上述の特性又は特徴は、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析、インビトロ及びインビボ中和アッセイ、並びに免疫組織化学を含むがこれらに限定されない、当該分野で認められた技術を使用して、ヒト、霊長類、又は必要な場合はいずれかの他の供給源を含む異なる供給源からの組織切片を用いて観察又は測定され得る。

【0061】

本明細書で使用される用語「免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメント」は、そのポリペプチドフラグメントが由来する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の少なくともＣＤＲを含有するポリペプチドフラグメントを指す。免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントは、標的抗原に結合することができる。

【0062】

本明細書で使用される「中和」抗体様結合タンパク質は、それが結合する標的抗原のエフェクター機能を遮断するか又は実質的に減少させることができる分子を指す。本明細書で使用される「実質的に減少させる」は、標的抗原のエフェクター機能の、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の減少を意味する。

【0063】

用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体へ特異的に結合することができる、いずれかの決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基のような化学的に活性な表面分子集団を含み、そして特定の実施態様において、特定の３次元構造特徴及び／又は特定の電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体又は抗体様結合タンパク質により結合される抗原の領域である。特定の実施態様において、抗体様結合タンパク質は、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合に抗原に特異的に結合すると言われる。好ましい実施態様において、抗体様結合タンパク質は、平衡解離定数が≦１０^-8Ｍである場合、より好ましくは平衡解離定数が≦１０^-9Ｍである場合、そして最も好ましくは解離定数が≦１０^-10Ｍである場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。

【0064】

抗体様結合タンパク質の解離定数（Ｋ_D）は、例えば表面プラズモン共鳴により決定され得る。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、リガンド（バイオセンサーマトリクス上の標的抗原）と検体（溶液中の抗体様結合タンパク質）との間の実時間結合相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して測定する。表面プラズモン分析はまた、検体（バイオセンサーマトリックス上の抗体様結合タンパク質）を固定し、そしてリガンド（標的抗原）を提示することにより行われ得る。本明細書で使用される用語「Ｋ_D」は、特定の抗体様結合タンパク質と標的抗原との間の相互作用の解離定数を指す。

【0065】

本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、少なくとも約１ｘ１０^-6Ｍ、１ｘ１０^-7Ｍ、１ｘ１０^-8Ｍ、１ｘ１０^-9Ｍ、１ｘ１０^-10Ｍ、１ｘ１０^-11Ｍ、１ｘ１０^-12Ｍ若しくはそれ以上のＫｄでエピトープを含有する抗原に結合する抗体様結合タンパク質若しくはその抗原結合フラグメントの能力、及び／又は非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性でエピトープに結合する抗体様結合タンパク質若しくはその抗原結合フラグメントの能力を指す。

【0066】

本明細書で使用される用語「リンカー」は、免疫グロブリンドメイン間に挿入されて、軽鎖及び重鎖のドメインが交差した二重可変領域免疫グロブリンへと折り畳まるために十分な可動性を提供する、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を指す。非限定的な例としては、グリシン／セリンリンカー、例えばＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）、及びグリシン／アラニンリンカーが挙げられる。リンカーは、配列レベルで、それぞれ可変ドメイン間又は可変ドメインと定常ドメインとの間の変わり目（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）に挿入される。免疫グロブリンドメインのおよそのサイズは十分に理解されているので、ドメイン間の変わり目は同定され得る。ドメインの変わり目の正確な位置は、実験データにより実証されるように、又はモデリング若しくは二次構造推定の技術により推測されるように、ベータ−シート又はアルファ−ヘリックスのような二次構造要素を形成しないペプチド区間（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｅｔｃｈ）を位置づけることにより決定され得る。リンカーは独立しているが、いくつかの場合では同じ配列及び／又は長さを有していてもよい。例となるアミノ酸リンカーは当該分野で公知であり、そして本明細書に記載される使用に適している。

【0067】

本明細書で使用される用語「タグ」は、ポリペプチド又は抗体様結合タンパク質のいずれかの位置（典型的にはＮ末端又はＣ末端）で、通常はインフレームで融合されたいずれかの連結された分子又は親和性ベースの配列を指す。適切なタグの存在は、抗体様タンパク質の検出、精製又は他の特徴を改善するために役立ち得る。適切な親和性ベースのタグとしては、別の部分（非限定的な例としては、ポリヒスチジン、６ｘ−ヒスチジン、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ビオチン、ＨＡ、ＧＳＴ又はＭＢＰが挙げられる）に特異的に結合され得るいずれかの配列が挙げられる。場合によっては、連結された分子は、ポリペプチドの存在をレポートし得るいずれかのドメインを含み得る発光レポーターであり得る。適切な発光レポータードメインとしては、ルシフェラーゼ、蛍光性タンパク質又はその発光変異体が挙げられる。

【0068】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞へと移すために使用されるいずれかの分子（例えば、核酸、プラスミド、又はウイルス）を指す。用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を含む。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは環状２本鎖ＤＮＡ分子を指し、さらなるＤＮＡセグメントがこれに挿入され得る。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に挿入され得る。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有するベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノムに統合され得、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を方向づけることができる。このようなベクターは本明細書で「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用なベクターの発現は、しばしばプラスミドの形態である。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの他の形態を含むことを意図される。

【0069】

用語「作動可能に連結された」は、そのように記載される隣接配列が、それらの通常の機能を行うように構成されるか又は組み立てられる隣接配列の配置を指すために本明細書で使用される。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、コード配列の複製、転写、及び／又は翻訳を達成する能力があり得る。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を誘導する事が出来る場合にプロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、正確に機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、間に入る未翻訳だが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなおコード配列に「作動可能に連結される」とみなされ得る。

【0070】

本明細書で使用される句「組み換え宿主細胞」（又は「宿主細胞」）は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組み換え宿主細胞又は宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫細胞も指す。特定の改変は変異又は環境の影響のいずれかに起因して後継世代において起こり得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、このような細胞はなお本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。多種多様な宿主細胞発現系が、本発明の抗体様結合タンパク質を発現するために使用され得、これらとしては、細菌、酵母、バキュロウイルス、及び哺乳動物発現系（さらにファージディスプレイ発現系）が挙げられる。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。抗体様結合タンパク質を組み換えにより発現させるために、ポリペプチド鎖が宿主細胞で発現され、そして好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、この培地から抗体様結合タンパク質が回収され得るように、抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ又はそれ以上の組み換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする。

【0071】

本明細書で使用される用語「形質転換」は、細胞の遺伝特徴の変化を指し、そして細胞はそれが新しいＤＮＡを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、その天然状態から遺伝的に改変されている場合に形質転換される。形質転換後に、形質転換するＤＮＡは細胞の染色体に物理的に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組み換わり得、又は複製されることなくエピソームエレメントとして一時的に維持され得、又はプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、ＤＮＡが細胞の分裂とともに複製される場合に安定に形質転換されたとみなされる。本明細書で使用される用語「トランスフェクション」は、細胞による外来又は外因性のＤＮＡの取り込みを指し、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に「トランスフェクトされている」。多数のトランスフェクション技術が当該分野で周知である。このような技術は、１つ又はそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。

【0072】

本明細書において使用されそして物体に対して適用される用語「天然に存在する」は、その物体が天然で見出され得、かつ人により操作されていないということを指す。例えば、天然の供給源から単離され得かつ人により意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、天然に存在する。同様に、本明細書で使用される「天然に存在しない」は、天然で見出されないか、又は人により構造的に改変若しくは合成された物体を指す。

【0073】

本明細書で使用される、２０の従来のアミノ酸及びそれらの略号は従来の使用方に従う。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；非天然アミノ酸、例えばα−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本発明の抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖に適した構成要素であり得る。非従来型アミノ酸の例としては：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似したアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法において、標準的な使用法及び慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、そして右手方向はカルボキシル末端方向である。

【0074】

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分けられ得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、 Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；及び
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。

【0075】

保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーとの交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得、これらは典型的には生物系における合成よりも化学的ペプチド合成により組み込まれる。これらとしては、ペプチドミメティック及び他のアミノ酸残基の逆転又は反転した形態が挙げられる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。

【0076】

当業者は、周知の技術を使用して本発明の抗体様結合タンパク質のポリペプチド鎖の適切な変異体を決定することができるだろう。例えば、当業者は、活性に重要でないと考えられる領域を標的化することにより、活性を破壊することなく変化され得るポリペプチド鎖の適切な領域を同定し得る。あるいは、当業者は、類似したポリペプチド間で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。さらに、生物学的活性又は構造に重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、又はポリペプチド構造に不利な影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換され得る。

【0077】

用語「キレート剤」は、少なくとも２つの非金属イオンに配位した金属を含有し得る複素環式環の形態の化学化合物である。抗体様結合タンパク質上の硬い酸カチオンキレート部分の存在は、コンパニオン診断薬の速いインビボクリアランスを確実にするために役立つ。

【0078】

キレート剤は、バイオコンジュゲーション（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の標準的な方法を使用して抗体又は抗体様結合タンパク質に共有結合で結合される。抗体上のアミン含有残基（例えば、リジン又はＮ−末端）は、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を含有するキレート剤とのアミド結合形成を受ける。硫黄含有残基（例えば、システイン）は、活性化エステル又はマレイミド部分を含有するキレート剤との結合を受ける。あるいは、バイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、抗体上の活性化カルボキシレート残基が、キレート剤上のそれぞれアミン又はチオール基とのアミド又はチオエステル形成を受ける場合に形成される。二官能性リンカー、例えば、ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ−Ｍａｌ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）又はＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が必要な場合に使用される。

【0079】

キレート剤は、それらの金属結合特性に関して選択され、そして任意に変更され得る。ＮＯＴＡ （１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ （１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＤＴＰＡ （１，１，４，７，７−ジエチレントリアミン五酢酸）、及びＴＥＴＡ （ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）は、様々な放射標識、放射性核種、放射性同位体、金属及び放射性金属と共に役立つ。リガンドがカルボキシレート又はアミン基のような硬い塩基のキレート官能基を含むＤＯＴＡ型のキレート剤は、硬い酸カチオン、特にＩＩａ族及びＩＩＩａ族金属カチオンをキレート化するために最も有効である。このような金属−キレート錯体は、環サイズを目的の金属に合わせることにより非常に安定にされ得る。また、１つより多くの種類のキレート剤が、多数の金属イオン、例えば診断用放射性核種及び／又は治療用放射性核種を結合するために標的化可能構築物に結合され得る。

【0080】

抗体又は操作された抗体様結合タンパク質のキレート剤に結合され得る特に有用な診断用放射標識、放射性核種、又は放射性同位体としては、限定されないが、¹¹⁰Ｉｎ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸Ｆ、⁵²Ｆｅ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁸⁶Ｙ、⁹⁰Ｙ、⁸⁹Ｚｒ、⁹⁴Ｔｃ、⁹⁴Ｔｃ、^99mＴｃ、¹²⁰Ｉ、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、^154-158Ｇｄ、³²Ｐ、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵¹Ｍｎ、^52mＭｎ、⁵⁵Ｃｏ、⁷²Ａｓ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ、^82mＲｂ、⁸³Ｓｒ、又は他のガンマ−、ベータ−、若しくは陽電子放射体が挙げられる。診断用放射標識は、２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、そしてなおより好ましくは２０〜１，０００ｋｅＶの範囲、そしてさらにより好ましくは７０〜７００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを含む。有用な陽電子放射体放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶより低く、そして最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。ガンマ線検出を利用する診断剤として有用な放射標識としては、限定されないが：Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７、及びＴ１−２０１が挙げられる。有用なガンマ線放射放射標識の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、そして最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。

【0081】

本明細書で使用される用語「患者」は、限定されないが、ヒト及び動物被験体を含む。

【0082】

「障害」は、本発明の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質を使用する処置から利益を得るであろういずれかの状態である。「障害」及び「状態」は、本明細書において交換可能に使用され、そして問題の障害に患者をかかりやすくする病理状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患を含む。特定の局面において、障害は固形腫瘍癌のような癌である。特定の具体的な局面において、癌は乳癌、結腸がん、卵巣癌、子宮内膜癌、骨肉腫、子宮頸部癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌、膵癌、腎臓癌、リンパ系の癌、ＣＡ６が発現される肉腫若しくは癌腫、又はＣＡ６グリコトープが主に発現されるまだ決定されていない他の癌である。癌は、例えば、漿液性卵巣癌、類内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｄ）卵巣癌、子宮頸部の新生物、子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｓ）の新生物、外陰部の新生物、乳癌、膵腫瘍、及び尿路上皮の腫瘍であり得る。

【0083】

選択された細胞集団の殺傷により処置され得る障害は、本明細書に記載される抗体様結合タンパク質を用いた使用に適しており、例えば癌、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、及び多発性硬化症；移植片拒絶、例えば腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、及び骨髄移植拒絶；移植片対宿主病；ウイルス感染症、例えばｍＶ感染症、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳなど；並びに寄生虫感染症、例えばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症、並びに当業者により決定される他のものである。

【0084】

参照発現レベルは、例えば、患者の非患部組織における（例えば、腫瘍を含有する組織型と同じ組織型からの）ＣＡ６発現のレベルであり得、又は参照標準は、例えば当該分野で認められた標準から決定され得、例えば個体集団からの非患部組織における発現レベルから誘導され得る。

【0085】

本明細書で使用される用語「処置」又は「処置する」は、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置を必要とするものは、障害を有するものに加えて、障害を有する傾向があるか障害を予防するべきものを含む。

【0086】

本明細書で使用される用語「医薬組成物」又は「治療用組成物」は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物又は組成物を指す。

【0087】

本明細書で使用される用語「薬学的に許容しうる担体」又は「生理学的に許容しうる担体」は、抗体又は操作された抗体様結合タンパク質の送達を達成又は増強するために適した１つ又はそれ以上の製剤化材料を指す。

【0088】

１つ又はそれ以上の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物に関して使用される場合の用語「有効量」及び「治療有効量」は、所望の治療結果を生じるために十分な量又は投薬量を指す。より詳細には、治療有効量は、処置される状態に関連する１つ又はそれ以上の臨床的に規定された病理プロセスを、いくらかの期間、阻害するために十分な、抗体又は操作された抗体様結合タンパク質の量である。本明細書で使用される「治療有効量」はまた、ＣＡ６を発現する組織、例えば腫瘍組織を可視化するために有効な抗体様タンパク質の量を指す。有効量は、使用されている特定の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質によって変わり得、そして処置される患者に関連する様々な要因及び条件又は障害の重症度に依存する。例えば、抗体又は操作された抗体様結合タンパク質をインビボ投与しようとする場合、患者の年齢、体重、及び健康さらには前臨床動物研究において得られる用量応答曲線及び毒性データのような因子がこれらの因子の中で考慮される。所定の医薬組成物の有効量又は治療有効量の決定は、十分に当業者の能力内である。

【0089】

本明細書で使用される用語「取得する」又は「取得すること」は、物理実体又は値を「直接取得すること」又は「間接的に取得すること」により、物理実体、又は値、例えば数値の所有を得ることを指す。「直接取得すること」は、物理的実体又は値を得るためのプロセスを行うこと（例えば、合成又は分析法を行うこと）を意味する。「間接的に取得すること」は、別の団体又は供給源（例えば、物理実体又は値を直接取得した第三者研究所）から物理実体又は値を受け取ることを指す。物理実体を直接取得することは、物理物質、例えば出発物質における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例となる変化としては、２つ又はそれ以上の出発物質から物理実体を作製すること、物質をせん断又は断片化すること、物質を分離又は精製すること、２つ又はそれ以上の別々の実体を混合して混合物にすること、共有結合又は非共有結合を破壊又は形成することを含む化学反応を行うことが挙げられる。値を直接取得することは、サンプル又は別の物質における物理的変化を含むプロセスを行うこと、例えば、物質、例えば、サンプル、検体、又は試薬における物理的変化を含む分析プロセス（本明細書では「物理分析」と呼ぶこともある）を行うことを含む。

【0090】

間接的に取得される情報は、例えば、オンラインデータベース又はアプリケーション（「Ａｐｐ」）からのような紙又は電子形態で供給されるレポートの形態で提供され得る。レポート又は情報は、例えば、病院若しくは診療所のような健康管理機関；又は医師若しくは看護師のようなヘルスケア提供者により提供され得る。

【0091】

本発明の一実施態様は、薬学的に許容しうる担体及び治療有効量の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。

【0092】

２． 抗体様結合タンパク質の使用
本発明の抗体又は操作された抗体様結合タンパク質は、１つ又はそれ以上の標的抗原の検出及び定量のための競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイのようないずれかの公知のアッセイ方法において使用され得る。抗体又は操作された抗体様結合タンパク質は、使用されるアッセイ方法に適した親和性で１つ又はそれ以上の標的抗原に結合する。

【0093】

診断適用のために、特定の実施態様において、操作された抗体様結合タンパク質は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的又は間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成することができるいずれかの部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射標識、放射性同位体、放射性核種、造影剤、治療剤若しくは診断剤、例えば³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、⁹⁹Ｔｃ、¹¹¹Ｉｎ、¹⁸Ｆ、¹¹Ｃ、⁶⁸Ｇａ、⁶⁴Ｃｕ、⁸⁹Ｚｒ、¹²⁴Ｉ又は⁶⁷Ｇａ；蛍光性若しくは化学発光性化合物、例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、若しくはルシフェリン；又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。

【0094】

適切なレポーター部分は、特定の画像化技術（例えば、ＰＥＴイメージングのための¹⁸Ｆ／¹¹Ｃ／⁶⁸Ｇａ／⁶⁴Ｃｕ／⁸⁹Ｚｒ／¹²⁴Ｉ放射標識レポーター、ＳＰＥＣＴイメージングのための^99mＴｃ／¹¹¹Ｉｎ標識レポーター、光学イメージング用の蛍光色素標識レポーター又はＭＲＩ用の常磁性物質標識レポーター）により検出され得る。適切な適合は抗体又は抗体様結合タンパク質の生物学的半減期と放射標識の物理的半減期との間で推奨される（表１を参照のこと）。

【0095】

【表1】

【0096】

イメージングコンパニオン診断用プローブ又は抗体様結合タンパク質の開発は、本質的に薬物発見と同様のプロセスを必要とする（例えば、標的プローブから始めて、放射線量測定、良好な研究業務毒性研究、良好な製造実践製造、前臨床評価、標的プローブの前臨床検証及び臨床評価）。評価されるべきさらなるパラメーターは：トレーサー投与に対する最適なイメージングのタイミング、エクスビボ分析との相関、トレーサー体内分布及び標的特異性（放射標識された無関係なフラグメントを用いて試験される）である。一旦完全に開発されれば、分子イメージングプローブは特定の薬物又は薬剤のための分子イメージングコンパニオン診断薬として使用され得る。

【0097】

本発明の操作された抗体様結合タンパク質はまた、インビボイメージングのために有用である。検出可能な部分で標識された抗体様結合タンパク質は、動物に、好ましくは血流中に投与され得、そして宿主における標識された抗体の存在及び位置がアッセイされる。抗体様結合タンパク質は、核磁気共鳴でも、陽電子放射断層撮影でも、当該分野で公知の他の検出手段でも、動物において検出可能ないずれかの部分で標識され得る。

【0098】

インビボ画像化技術は、組織におけるＣＡ６グリコトープ発現のレベルを評価するために、腫瘍組織のような組織を画像化するために使用される。組織におけるＣＡ６発現のレベルの決定は、癌患者のような患者がＣＡ６グリコトープを標的とする薬物での処置の良い候補かどうかを決定するために有用である。例えば、抗体様結合タンパク質は、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４細胞傷害剤のためのコンパニオン診断薬として有用である。

【0099】

一実施態様において、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４のようなＣＡ６標的化分子での処置について患者を評価する。患者を、例えば、腫瘍組織（例えば組織生検）のような患部組織におけるＣＡ６発現のレベルに関する情報を取得することにより評価し、そしてＣＡ６発現のレベルが参照発現レベルの１０％より高い（例えば、参照レベルの１０％、２０％、３０％、４０％又はそれ以上より高いか又は等しい）場合、患者はＣＡ６標的化分子での処置のための良い候補であると決定される。ＣＡ６標的化分子での処置のための良い候補である患者は、分子での処置に対してポジティブに反応すると推測される。ＣＡ６発現の適切なレベルを有していない患者（例えば参照標準と比較して１０％未満のＣＡ６発現）は、ＣＡ６標的化分子での処置のための良い候補ではないと決定される。

【0100】

参照発現レベルは、例えば、患者の非患部組織（例えば、腫瘍を含有する組織型と同じ組織型から）におけるＣＡ６発現のレベルであり得、又は参照標準は、例えば、個体集団からの非患部組織における発現レベルから誘導されたような当該分野で受け入れられた標準から決定され得る。

【0101】

一実施態様において、被験体の組織におけるＣＡ６発現のレベルは、病院若しくは診療所若しくは医院のような医療機関のようなサービス提供者から、又は医師若しくは看護師のような医療専門家から、又は保険提供者から、又はデータベースからのように間接的に取得される。別の実施態様において、ＣＡ６発現のレベルは、本発明において特徴とされる抗体様結合タンパク質を被験体に投与し、そして生体イメージング技術によりＣＡ６発現のレベルを決定することのように直接決定される。

【0102】

ＣＡ６標的化分子での処置のために良い候補であると決定された患者は、場合によりＣＡ６標的化分子をさらに投与され得る。いくつかの実施態様において、ＣＡ６標的化分子で処置された患者は、ＣＡ６標的化分子での処置後にＣＡ６発現レベルが変化している（例えば減少している）かどうかを決定するために、ＣＡ６標的化分子の投与後に間隔をおいて（例えば、毎週、二週ごと、毎月、二ヶ月毎）モニタリングされる。特定量の時間の後に、又は患者が有害事象を示した後に、患部組織におけるＣＡ６発現レベルが変化しないままである場合、ＣＡ６標的化分子での処置を停止するか継続する決定が行われ得る。

【0103】

一実施態様において、患者は、ｈｕＤＭ６−ＤＭ４のようなＣＡ６標的化分子での処置の間にモニタリングされる。患者は、例えば、ＣＡ６標的化分子の投与又はｈｕＤＭ６−ＤＭ４のようなＣＡ６標的化分子での処置後に、腫瘍組織のような患部組織におけるＣＡ６発現のレベルに関する情報を取得することによりモニタリングされ、ＣＡ６発現のレベルが、参照発現レベルの１０％より高い（例えば、参照レベルより１０％、２０％、３０％、４０％又はそれ以上より高いか又はそれらに等しい）と決定される場合、患者は、ＣＡ６標的化分子での継続した処置のために良い候補であると決定される。ＣＡ６発現のレベルがｈｕＤＭ６−ＤＭ４のようなＣＡ６標的化分子での処置の間に減少したと決定される場合、患者はその分子での処置にポジティブに応答したと決定され、そしてｈｕＤＳ６−ＤＭ４での処置は継続するべきである。ＣＡ６発現の適切なレベルを有していない、例えば、参照標準と比較して１０％未満のＣＡ６発現の患者、又はＣＡ６発現の増加したレベルを有する患者は、ＣＡ６標的化分子での継続した処置のために良い候補ではないと決定される。

【0104】

本明細書で開示される発明はまた、抗体様結合タンパク質及び生物学的サンプルにおける標的抗原レベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブ及びネガティブ対照サンプル、並びに検出試薬を含み得る。

【0105】

４． 操作された抗体様結合タンパク質組成物及びその投与
操作された抗体様結合タンパク質を含む組成物は、本発明の範囲内である。このような診断用、治療用又は医薬組成物は、診断又は治療有効量の抗体様結合タンパク質、又は抗体様結合タンパク質−薬物複合体を、投与形式との適合性について選択された薬学的又は生理学的に許容しうる製剤化剤と混合して含み得る。

【0106】

許容しうる製剤化材料は、好ましくは使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。

【0107】

診断用又は医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出の速度、吸着若しくは浸透を改変、維持、又は保存するための製剤化材料を含有し得る。適切な製剤材料としては、限定されないが、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン）、抗菌薬、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、又は他の有機酸）、増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（例えばマンニトール又はグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）、着色剤、矯味矯臭剤及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）、懸濁化剤、界面活性剤又は湿潤剤（例えばプルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えばポリソルベート２０又はポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロール又はチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えばスクロース又はソルビトール）、張度増強剤（例えばアルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム−又はマンニトール ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、添加剤及び／又は医薬アジュバント（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１８ｔｈ Ｅｄ．、Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、及びその後続版（あらゆる目的のために参照により本明細書に加入される）を参照のこと）が挙げられる。

【0108】

最適な診断用又は医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達系式、及び望ましい投薬量に依存して当業者により決定される。このような組成物は、抗体様結合タンパク質の物理状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。

【0109】

診断用又は医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、実際は水性でも非水性のいずれでもよい。例えば、注射に適したビヒクル又は担体は、場合により非経口投与のための組成物において一般的な他の材料を補った、水、生理食塩水、又は人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化食塩水又は血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例となるビヒクルである。他の例となる医薬組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトール又は適切な代替物をさらに含み得る。本発明の一実施態様において、操作された抗体様結合タンパク質組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で任意の製剤化剤と混合することにより貯蔵のために調製され得る。さらに、抗体様結合タンパク質は、スクロースのような適切な添加剤を使用して凍結乾燥物として製剤化され得る。

【0110】

本発明の診断用又は医薬組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、組成物は、吸入、又は経口のように消化管を通る送達ために選択され得る。このような薬学的に許容しうる組成物の製造は当該分野の技術範囲内である。

【0111】

製剤成分は、投与部位に許容され得る濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理的ｐＨ又はわずかにより低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。

【0112】

非経口投与が考慮される場合、本発明における使用のための診断用又は治療用組成物は、薬学的に許容しうるビヒクル中に所望の抗体様結合タンパク質を含むパイロジェンフリーの非経口で許容しうる水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中に抗体様結合タンパク質が滅菌等張溶液として製剤化されて適切に保存される。さらに別の製剤は、製品の徐放又は持続性放出を生じる、注射可能マイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸又はポリグリコール酸）、ビーズ、又はリポソームのような薬剤を用いた所望の分子の製剤を含み得、次いでこれがデポー注射により送達され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは循環中での持続期間を増進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。

【0113】

一実施態様において、診断用又は医薬組成物は、吸入用に製剤化され得る。例えば、抗体又は操作された抗体様結合タンパク質は、吸入用の乾燥粉末として製剤化され得る。抗体様結合タンパク質吸入液剤もまた、エアロゾル送達のための噴霧剤を用いて製剤化され得る。さらに別の実施態様において、溶液が噴霧され得る。

【0114】

特定の製剤は経口投与され得るということも考慮される。本発明の一実施態様において、このやり方で投与される抗体様結合タンパク質は、錠剤及びカプセル剤のような固形投薬形態の配合において通例使用される担体を用いて又は用いずに製剤化され得る。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、かつプレシステミック（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最少化される胃腸管中の時点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤は、抗体様結合タンパク質の吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用され得る。

【0115】

別の診断用又は医薬組成物は、錠剤の製造の適した非毒性添加剤と混合した有効量の抗体様結合タンパク質を含み得る。錠剤を滅菌水又は別の適切なビヒクルに溶解することにより、液剤が単回用量形態で製造され得る。適切な添加剤としては、限定されないが、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウム；又は結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、若しくはアラビアゴム；又は滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、若しくはタルクが挙げられる。

【0116】

本発明のさらなる診断用又は医薬組成物は、持続性又は制御送達製剤中に抗体様結合タンパク質を含む製剤を含めて、当業者に明らかである。様々な他の持続性又は制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロパーティクル又は多孔性ビーズ及びデポー注射を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。徐放性製剤のさらなる例としては、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とガンマ エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられ得る。徐放性組成物としてはリポソームも挙げることができ、これは当該分野で公知のいくつかの方法により製造され得る。

【0117】

インビボ投与のために使用しようとする本発明の診断用又は医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前、又は後のいずれかに行われ得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で貯蔵され得る。さらに、非経口組成物は一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈液剤バッグ又は皮下注射針により穿刺可能なストッパを有するバイアル中に入れられる。

【0118】

診断用又は医薬組成物が製剤化されると、液体、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形物、又は脱水若しくは凍結乾燥した粉末として滅菌バイアル中に貯蔵され得る。このような製剤は、すぐに使える（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態又は投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで貯蔵され得る。

【0119】

本発明はまた、単回用量投与単位を製造するためのキットを考慮する。キットは、乾燥したタンパク質を有する第一の容器及び水性製剤を有する第二の容器の両方をそれぞれ含み得る。単一及び多室（ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）充てん済み注射器（例えば、液体用シリンジ及びリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅｓ））を含むキットもまた本発明の範囲内に含まれる。

【0120】

組成物はまた、所望の分子が吸収されているか又は封入されている膜、スポンジ、又は他の適切な材料の移植により局所投与され得る。移植デバイスが使用される場合、デバイスはいずれかの適切な組織又は器官中に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、持続放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）ボーラス、又は継続投与によるものであり得る。

【実施例】

【0121】

以下の実施例は、本発明の特定の実施態様、及びそれらの様々な使用の説明に役立つものである。これらは説明目的のためのみに示され、いかなるようにも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0122】

実施例１： ヒト化ＤＳ６モノクローナル抗体及びＤＳ６−ＤＭ４の放射標識及びインビトロ特徴付け
臨床上有用な分子造影剤は、投与後に妥当な量の時間内に高コントラスト画像を生じ、腫瘍浸透を示し、より速いクリアランス動態を有し、そして優れた腫瘍対血液比を示す。生体イメージングにおいてインタクトな天然抗体を使用することの警告（ｃａｖｅａｔ）は、腫瘍取り込み及び血液クリアランスの本質的に遅い動態であり；これらは高いバックグラウンドを有し、腫瘍の鮮明な画像を得るために長時間（数時間から数日）を要する傾向もある。

【0123】

生体イメージングと組み合わされた放射標識トレーサーは前臨床腫瘍モデルから臨床背景に変換し得るということが以前に示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２３（６）：７９７； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、（２００９） Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ １２：５３０）。我々はさらに、放射標識ＤＳ６抗体及びＤＳ６−ＤＭ４がマウスにおいてＷＩＳＨ異種移植腫瘍を効率的に標的化するということを実証した。これらの結果にもとづいて、３つの操作された抗体様結合タンパク質を、イメージングベースのコンパニオン診断薬として最適化された薬物動態のために開発した。

【0124】

実施例２： ＤＳ６操作Ｂ−Ｆａｂの発現
対応する構築物の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞において増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質についてのポリペプチド配列及びＤＮＡ配列は表２にある）を使用してＥ．ｃｏｌｉから製造した。

【0125】

ＤＳ６抗体様結合タンパク質Ｂ−Ｆａｂを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより製造した。トランスフェクションの７日後に、上清を採取し、そして遠心分離及び０．２μｍ濾過にかけて粒子を除去した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉により精製を行った。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムに結合した後、カラムをＰＢＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２、ＦＰ１２０１６）で洗浄し、続いて０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、そして１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９で中和した。精製ポリッシュ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程は、ＰＢＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２、ＦＰ１２０１６）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーからなるものであった。ポリッシュ工程の後、精製品を限外ろ過により濃縮し、そして最後にＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂを０．２２μｍメンブレンを使用して滅菌濾過した。

【0126】

タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収測定により決定した。各バッチを還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各サブユニット及びモノマーの純度及び分子量を決定した。精製されたＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂの質を以下に記載される分析方法によりチェックした。

【0127】

【表2】

【0128】

【表3】

【0129】

【表4】

【0130】

【表5】

【0131】

実施例３： ＤＳ６抗体に基づく操作された抗体様結合タンパク質の開発
ｈｕＤＳ６−ＤＭ４についてのイメージングベースのコンパニオン診断用抗体様結合タンパク質を開発するために、ヒト化ＤＳ６モノクローナル抗体からのＣＡ６結合配列に基づく３つの操作された抗体様結合タンパク質（Ｂ−Ｆａｂ、図１を参照のこと）を生成した。３つの操作された抗体様結合タンパク質を以下に記載されるようにそれぞれ精製し、そして試験した；結果を表３に示す。ポリ−ヒスチジン（６ｘ−Ｈｉｓ）タグの存在がＰＥＴトレーサーに影響を及ぼすかどうかを決定するための所望の特徴としては、ＨＰＬＣ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度＞９５％、約１０ｍｇ／ｍＬ濃度、安定なペプチド、ＤＳ６抗体と類似した結合が挙げられる。さらなる選択基準としては：＞５％ＩＤ／ｇの腫瘍シグナル；３：１の腫瘍対筋肉比；効率的な腎クリアランス；及びブロックされていない取り込みとブロックされた取り込みとの間の統計学的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が挙げられる（放射標識キレート化Ｂ−Ｆａｂについての品質基準の要約については表４を参照のこと）。

【0132】

【表6】

【0133】

【表7】

【0134】

６ｘ−Ｈｉｓタグを含むか又は含まない（Ｇ４Ｓ）₂リンカーを含有するＢ−Ｆａｂ抗体は、ＣＡ６結合配列が基づく対照ＤＳ６モノクローナル抗体と類似した結合効率を維持していると決定された。精製された抗体様結合タンパク質のそれぞれの品質を以下の分析方法によりチェックした：

【0135】

ａ） 分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析用ＳＥＣを、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）及びＴＳＫｇｅｌ ＳＷＸＬガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＡＥＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。分析を、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ リン酸Ｎａ ｐＨ６．７を使用して２８０ｎｍで検出しながら１ｍＬ／分で行った。タンパク質サンプル３０マイクロリットル（０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）をカラム上にアプライした。分子サイズの推定のために、カラムをゲルろ過標準混合物（ＭＷＧＦ−１０００、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して較正した。データ評価をＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアｖ５．１１を使用して行った。

【0136】

ｂ） ＬＣ−ＭＳによるインタクト質量分析
各サンプルを０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いでＤＴＴ（最終１０ｍＭ）を加えることにより還元した。分離前に、サンプルを２０分間捕捉し、そして２０μＬ／分で一体型トラップカラムで２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（体積／体積）を用いて脱塩し、その後１５％溶離液Ａ（Ｈ₂Ｏ／０．０５％ＴＦＡ）〜５０％溶離液Ｂ（アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ）のグラジエントを用いて溶出した。

【0137】

各サンプルを、ナノフロー（ｎａｎｏｆｌｏｗ）（３００ｎＬ／分）で一体型カラム（ＰＳＤＶＢ；１００μｍ Ｉ．Ｄ．ｘ５ｃｍ）で３７℃にて操作して分離した。各サンプルの導入を、外径３６５μｍ、内径７５μｍ及び先端直径１５μｍを有する新しい対物（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）からのエレクトロスプレー針並びにシースガスを使用して行った。ＱＳｔａｒ ＸＬでの取得後に、スペクトルを対応する時間範囲にわたって合計し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ ＳｃｉｅｘからＢｉｏＡｎａｌｙｓｔと共に供給されるタンパク質再構築ツールを使用してデコンボリューションした。

【0138】

ｃ） ＬＣ−ＭＳを使用したペプチド質量フィンガープリント分析によるタンパク質同定
目的のレーンを穿孔し、カルバミドメチル化し、そしてエンドプロテイナーゼトリプシンで消化した。その後、サンプルをＯｒｂｉＴｒａｐ ＸＬ質量分析計を使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。得られたスペクトルを、所定の構築物が加えられたユーザー定義データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＰＰと、さらにはデータベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ全種と比較した。

【0139】

３つの操作されたＤＳ６ベースの抗体様結合タンパク質の各々を、硬い酸のカチオンキレート剤ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）に化学的に結合し、⁶⁴Ｃｕで放射標識し、そして３つの操作されたＤＳ６ベースの抗体様結合タンパク質のそれぞれを特徴付けするために、前臨床腫瘍モデルにおけるインビボＰＥＴ生体イメージング実験及びインビトロ細胞結合アッセイに使用した。それぞれの操作された抗体についての活性及び実験からのデータの要約は表５及び図２〜４に見られ得る。

【0140】

【表8】

【0141】

上記の抗体様結合タンパク質及びそれらの対応するＤＯＴＡ複合体（１．５〜２．５ ＤＯＴＡ／フラグメント）は全て、ＣＡ６陽性細胞（ＷＩＳＨ細胞株）に対して高い親和性（Ｋ_d＝４〜２０ｎＭ）を有し、ＤＯＴＡ誘導体化が抗原に対する親和性に不利に影響しないということを示した。フラグメントは、ＣＡ６陰性細胞（Ａ２７８０細胞株）に対して低い親和性を有していた。⁶⁴Ｃｕ標識薬剤を、ＷＩＳＨ又はＡ２７８０皮下腫瘍のいずれかを保有するヌードマウスにおいてヒト血清安定性研究及びインビボイメージング及び２４時間生体内分布により評価した。⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂを高収率で合成し（ＲＣＹ−８０％、ＳＡ−５５ＧＢｑ／μｍｏｌｅ、純度＞９９％）、そして２４時間血清安定性（９４±５％、ｎ＝３）試験において良好な結果を得た。異種移植腫瘍保有マウスにおけるインビボ生体内分布実験（表６を参照のこと）は、高い腫瘍／筋肉（８．７：１）、腫瘍／血液（３．６：１）及び陽性／陰性腫瘍（１．８、ｐ＜０．０５、ｎ＝７）比と併せて比較的高いＷＩＳＨ腫瘍取り込み（７．６±０．８７ ％ＩＤ／ｇ、ｎ＝４、２０〜２０６ｍｇ）及び低いＡ２７８０腫瘍取り込み（５．１±０．９２％ＩＤ／ｇ、ｎ＝３、５０〜２７０ｍｇ）を示した。腫瘍取り込みは、腎臓（６２±４％ＩＤ／ｇ）及び肝臓（１０±０．７５％ＩＤ／ｇ）のみが上回った。

【0142】

【表9】

【0143】

⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂを、インビボでの遮断研究により特異性についてＷＩＳＨ保有腫瘍動物においてさらに評価した。遮断は、放射標識した薬剤の投与のそれぞれ２．５又は２５時間前にＢ−Ｆａｂ（２ｍｇ、ｎ＝５）又はＤＳ６（１ｍｇ、ｎ＝４）のいずれかの投与により行った。Ｂ−Ｆａｂ遮断は、ＷＩＳＨ腫瘍取り込みにおいて２３％（ｐ＜０．０５、ｎ＝８）の減少を生じたが、ＤＳ６遮断は２６％（ｐ＜０．０５、ｎ＝７）の減少に達した。対照腫瘍（ｎ＝３）はこの研究では遮断されなかった。これらの前臨床研究は、⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−Ｂ−Ｆａｂが患者におけるｈｕＤＳ６−ＤＭ４のために適したコンパニオン診断薬であるということを示唆する。

【0144】

実施例４： 前臨床腫瘍モデルにおける開発された操作された抗体インビボＰＥＴ研究
ａ） Ｂ−Ｆａｂ （Ｇ４Ｓ）₂リンカー及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグ
Ｂ−Ｆａｂ １１５１は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ （（Ｇ４Ｓ）₂） （配列番号３）としてＬ１及びＬ２リンカーの両方を含有し、かつ発現されたＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを含有するＤＳ６ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。タンパク質をＩＭＡＣ及びＳＥＣにより精製し、そしてインビトロ結合溶液を１．８ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中で調製し、そして結合親和性をＷＩＳＨ ＣＡ６＋細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした（図２Ｃ及び図２Ｄ）。

【0145】

ｂ） Ｂ−Ｆａｂ （Ｇ４Ｓ）₂リンカー
Ｂ−Ｆａｂ １１５３は、（Ｇ４Ｓ）₂としてＬ１及びＬ２リンカーの両方を含有し、かつＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを含有しないＤＳ６ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。このタンパク質はＨｉｓタグを欠いているので、このタンパク質はＩＭＡＣ、Ｋａｐｐａ−ｓｅｌｅｃｔ及びＳＥＣにより精製した。インビトロ結合溶液を、１．６ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中で調製し、そして結合親和性をＷＩＳＨ ＣＡ６＋細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした（図３Ｃ及び図３Ｄ）。

【0146】

ｃ） Ｂ−Ｆａｂ Ｇ４Ｓリンカー及びＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグ
Ｂ−Ｆａｂ １１５２は、Ｇ４Ｓの単一コピーとしてＬ１及びＬ２リンカーの両方を含有し、かつＣ末端６ｘ−Ｈｉｓタグを含有するＤＳ６ベースの操作された抗体様結合タンパク質である。このタンパク質をＩＭＡＣ及びＳＥＣにより精製し、そしてインビトロ結合溶液を１．８ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中で調製し、そして結合親和性をＷＩＳＨ ＣＡ６＋細胞株においてフローサイトメトリーを使用して特徴づけした（図４Ｃ及び図４Ｄ）。

【0147】

実施例５： ＤＯＴＡを用いるか又は用いないＤＳ６についてのインビトロ結合結果
ＤＯＴＡ複合体はＤＳ６活性を変更しないということを示すために、ＤＳ６抗体様結合タンパク質及びＤＯＴＡ−ＤＳ６結合体化抗体の結合をインビトロでＣＡ６陽性ＷＩＳＨ細胞株及びＡ２７８０ ＣＡ６陰性細胞で試験した。蛍光活性化細胞分取実験により、ＤＯＴＡ複合体がＣＡ６陽性ＷＩＳＨ細胞においてＤＳ６結合を変更しないということが決定された（図５を参照のこと）。

【0148】

実施例６： ⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の放射標識及び安定性
銅−６４で標識されたＤＯＴＡ結合ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂを使用するヒト血清安定性研究及び２４時間生体内分布研究を、ＣＡ６陽性（ＷＩＳＨ）又はＣＡ６陰性（Ａ２７８０）皮下腫瘍（ｗｅｒｅ）のいずれかを保有するヌードマウスにおいて行った。放射化学研究は、⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂ操作抗体様結合タンパク質が約３０％の放射化学収率、＞９５％の放射化学純度、及び１．９ Ｃｉ／μｍｏｌｅの比放射能を有するということを示す（図６Ａを参照のこと）。⁶⁴Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ＤＳ６ Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の血清安定性実験を、２４時間ヒト血清中で３７℃にて行い、そして０時間の時点で９７．２％活性及び２４時間の時点で９６．３％活性を示し、２４時間後に活性に有意な損失が無いことを実証した（図６Ｂを参照のこと）。

【0149】

実施例７： 異なる骨格を有する抗体様結合タンパク質間の比較
上記のＢ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の特性を、どの骨格がイメージングコンパニオン診断薬としての使用に最も適するかを評価するために、ＣＡ６に特異的に結合する二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の特性と比較した。ホモ二量体を形成するその抗ＣＡ６二特異性抗体のアミノ酸配列を配列番号１２として示す（表７）。いくつかの実施態様において、そのホモ二量体二特異性抗体は、ＧＧＣタグ、配列番号１３のタグ、及び配列番号１４のタグからなる群より選択されるＣ末端タグをさらに含んでいた。

【0150】

図７に示されるように、二特異性抗体は、Ｂ−Ｆａｂ抗体様結合タンパク質の骨格とは異なる骨格を有する。例えば、これはいずれのＣ_LドメインもＣ_H1ドメインも含まない。

【0151】

【表10】

【0152】

結果を以下の表８Ａ〜８Ｃに示す。これらの結果は、配列番号１４のタグに融合された配列番号１２の二特異性抗体を、Ｂ−Ｆａｂ １１５３（（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含むがＨｉｓタグを含まない）と比較することにより得られた。

【0153】

【表11】

【0154】

【表12】

【0155】

これらの結果から、Ｂ−Ｆａｂはコンパニオン診断薬としての使用のために二特異性抗体より優れていると結論づけることができる。例えば、二特異性抗体は、血漿安定性アッセイ及び温度ストレスアッセイにおいて分解を示したが、Ｂ−Ｆａｂは両方のアッセイで安定であった。

【0156】

本発明は様々な実施態様に関して記載されてきたが、変形及び改変が起こるであろうことは当業者に理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内に入る全てのこのような等価な変形を含むということが意図される。さらに、本明細書で使用されるセクションの見出しは、編成目的のみであり、記載される主題を限定するとは解釈されるべきではない。

【0157】

本明細書に記載される各実施態様は、それとは反対に明確に示されていなければ、いずれかの他の実施態様（単数又は複数）と組み合わされ得る。特に好ましいか又は有利であると示されるいずれかの特徴又は実施態様は、それとは反対に明確に示されていなければ、好ましいか又は有利であると示されるいずれかの他の特徴又は実施態様と組み合わされ得る。

【0158】

本出願において引用される全ての参照文献は、参照により本明細書に明示的に加入される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]