特許 6619092 細胞の立体構造体の作製装置及び作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6619092

(24)【登録日】2019年11月22日

(45)【発行日】2019年12月11日

(54)【発明の名称】細胞の立体構造体の作製装置及び作製方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20191202BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20191202BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20191202BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/42

   C12Q1/02

   C12N5/07

【請求項の数】2

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2018-519101(P2018-519101)

(86)(22)【出願日】2017年3月1日

(86)【国際出願番号】JP2017008048

(87)【国際公開番号】WO2017203780

(87)【国際公開日】20171130

【審査請求日】2018年11月7日

(31)【優先権主張番号】特願2016-105762(P2016-105762)

(32)【優先日】2016年5月27日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】501387839

【氏名又は名称】株式会社日立ハイテクノロジーズ

(74)【代理人】

【識別番号】110000350

【氏名又は名称】ポレール特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】河内 良介

(72)【発明者】

【氏名】桜井 智也

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１６５９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１４５２８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１２３６１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１６１９５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００２２３７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 SOUZA, G.R., et al.，Three-dimensional Tissue Culture Based on Magnetic Cell Levitation，Nature Nanotechnology，２０１０年，Vol.5, No.4，p.291-296

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

磁性化された細胞が配置される培養容器と、
前記培養容器に磁場を発生させる磁場発生部と、
前記培養容器を内部に収容し、前記培養容器内を所定の温度に保つインキュベータと、
前記培養容器内に配置される細胞の培養条件を制御する制御部と、を備え、細胞の立体構造体を作製する立体構造体作製装置であって、
オペレータにより作製したい立体構造体に関する情報が入力される入力部を備え、
前記磁場発生部は、電磁石が複数配置されることにより構成され、
前記制御部は、
当該入力された情報に基づいて、当該立体構造体の形状パターンを取得し、
当該取得した形状パターンに基づいて、当該磁場発生部における複数の電磁石のうち、所定の領域内に配置された電磁石に選択的に磁場を発生させるように制御することを特徴とする立体構造体作製装置。

【請求項2】

細胞の立体構造体作製方法であって、
外部から入力された、作製したい立体構造体に関する情報に基づいて、当該立体構造体の作製条件を取得するステップと、
当該取得された作製条件に基づいて、
細胞の培養容器に磁場を発生するステップと、
当該磁場が発生した培養容器に、磁性化された細胞を供給するステップと、
当該供給された細胞を培養するステップと、を有し、
当該立体構造体の作製条件は、当該立体構造体の形状パターンを含み、
当該取得された形状パターンに基づいて、
細胞の培養容器に磁場を発生させる複数の電磁石のうち、所定の領域内に配置された電磁石に選択的に磁場を発生させることを特徴とする立体構造体作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の立体構造体の作製技術に関し、特に、磁性体を取り込ませたスフェロイド細胞などの細胞に対し、外部磁場を利用して細胞操作を行い、細胞塊などの任意の形状の立体構造体を作製する装置、及び方法に関する

【背景技術】

【0002】

近年、再生医療技術の発展に伴い、再生組織や再生臓器が、研究用途のみならず、臨床における治療用途としても求められている。

【0003】

特許文献１には、細胞（スフェロイド細胞など）を操作し、剣山状の針に個々のスフェロイド細胞を串刺しにした状態で培養することで任意の形状の細胞塊を形成する技術について説明されている。

【0004】

特許文献２には、細胞を培養する培養容器に遠心力を発生させることや、細胞を磁性粒子で磁性化し、外部から磁石による磁力を発生させることで、細胞間を接着して組織を形成する手法について説明されている。

【0005】

特許文献３には、磁性粒子により磁性化した細胞を磁石の磁力によって培養容器の底面に吸引した状態で培養し、重層化組織シートを形成する手法について説明されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２００８／１２３６１４号

【特許文献2】特開２０１０−１６１９５４号公報

【特許文献3】国際公開第２００４／０８３４１２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

生体から採取された細胞を利用して所望の大きさや形状、構造を有する再生組織・再生臓器を形成する場合、細胞にコンタミネーションやダメージを与えることなく、かつ精度高く培養条件の調整を行うことが求められる。

【0008】

しかしながら、特許文献１の技術では、細胞操作において、任意の形状の細胞塊を形成するために、剣山状の複数の針に、直接細胞を串刺しするため、細胞へのダメージの影響が無視できず、またコンタミネーションの恐れもある。

【0009】

特許文献２、３に記載された技術においては、上述の通り、外部からの遠心力や磁力を利用して細胞と培養容器との接着や細胞同士の接着を促しているため、細胞に直接接触する必要がなく、コンタミネーションやダメージの影響を低減することができる。しかしながら、再生組織・再生臓器を所望の形状や大きさとなるように形成するための具体的な培養手法については考慮されていない。

【0010】

本発明は、上記課題に鑑み、細胞にコンタミネーションやダメージを与えることなく、かつ、精度の高い培養条件の調整によって、所望の大きさや形状、構造を有する再生組織
・再生臓器の形成を実現することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記課題を解決するための一態様として、磁性化された細胞が配置される培養容器と、前記培養容器に磁場を発生させる磁場発生部と前記培養容器を内部に収容し、前記培養容器内を所定の温度に保つインキュベータと、前記培養容器内に配置される細胞の培養条件を制御する制御部と、を備え、オペレータにより作製したい立体構造体に関する情報が入力されると、前記制御部は、当該入力された情報に基づいて、当該立体構造体の作製条件を取得し、当該取得された作製条件に基づいて、前記磁場発生部に磁場を発生させるように制御することを特徴とする装置、及び当該装置を用いた方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

上記一態様によれば、細胞にコンタミネーションやダメージを与えることなく、かつ、精度の高い培養条件の調整によって、所望の大きさや形状、構造を有する再生組織・再生臓器の形成を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本実施の形態に係る細胞の立体構造体を作製する装置の基本構成を示す図である。

【図2】本実施の形態に係る磁場発生装置の基本構成を示す図である。

【図3】本実施の形態（実施例１）に係る細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。

【図4】本実施の形態（実施例１）に係る磁場形成パターンの例を示す図である。

【図5】本実施の形態（実施例１）に係る培養容器への細胞の投入動作の例を示す図である。

【図6】本実施の形態（実施例１）に係る、単層の細胞の培養開始（定着前）時の状態（ａ）と培養後（定着）の状態（ｂ）の様子を示す図である。

【図7】本実施の形態（実施例１）に係る、細胞の多層化の処理の様子を示す図である。

【図8】本実施の形態（実施例２）に係る細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。

【図9】本実施の形態（実施例２）に係る培養容器への細胞の投入動作を示す図である。

【図10】本実施の形態（実施例２）に係るカメラを用いた細胞の位置確認の例を示す図である。

【図11】本実施の形態（実施例２）に係る磁場形成パターンの具体例を示す図である。

【図12】本実施の形態（実施例２）に係る単層または多層の細胞の培養開始（定着前）時の状態（ａ）と培養後（定着）の状態（ｂ）の様子を示す図である。

【図13】本実施の形態（実施例３）に係る、径の異なる複数の細胞からなる立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。

【図14】本実施の形態（実施例３）に係る細胞の培養開始〜定着の状態の様子を示す図である。

【図15】本実施の形態（実施例４）に係る磁性ビーズの除去ステップを有する細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。

【図16】本実施の形態（実施例４）に係る磁性ビーズの除去ステップを有する細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。

【図17】本実施の形態（実施例４）に係る磁性ビーズの除去ステップの詳細を示すフローチャートである。

【図18】本実施の形態に係る細胞の立体構造体の作製条件の決定処理を実施する機能ブロック図である。

【図19】本実施の形態に係る細胞の立体構造体の作製イメージを示す図である。

【図20】本実施の形態（実施例１〜３）に係る細胞の立体構造体の情報を表示するＧＵＩ画面を示す図である。

【図21】本実施の形態（実施例４）に係る細胞の立体構造体の情報を示すＧＵＩ画面を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

＜装置の全体構成＞
以下、本実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、全体を通して、本実施の形態を説明するための各図において同一の機能を有する各構成部分については重複した説明を省略することがある。

【0015】

図１は、本実施の形態に係る細胞の立体構造体を作製する装置の基本構成を示す図である。

【0016】

本装置は、主として、インキュベータ１０１内に、培養容器１０３、アーム１０２、磁場発生装置１０４、カメラ１０５を備えることで構成される。インキュベータ１０１の外には磁場処理エンジン１０６、アーム処理エンジン１０７、画像処理エンジン１０８、データバス１０９、制御部１１０、表示部１１１、入力部１１２から構成される。インキュベータ１０１は、内部の温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度を調節できるものである。カメラ１０５は、鮮明な像を撮像するためには、インキュベータ１０１内に設置することが望ましいが、内部の温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度が撮影に不適切な場合や、コンタミネーションのリスク低減のために、インキュベータ１０１外に設置しても良い。

【0017】

また全体を通して、制御部１１０は、インキュベータ１０１内の環境条件の調整やアーム１０２の動作、磁場発生装置１０４による磁場発生条件の調整、カメラ１０５による撮像動作や撮像条件の調整等といった、本装置を構成する種々の各種機構の動作や条件設定・調整等の制御を実施する。制御部１１０はデータバス１０９を介して磁場処理エンジン１０６、アーム処理エンジン１０７、画像処理エンジン１０８との間で情報のやりとりを行い、各種機構への指令の送信や各種機構から得られる信号や画像等のデータを取得することができる。また、細胞培養条件に関する各種データ、キーボードやマウス等の入力部１１２を介してオペレータから入力された指示等の情報を取得・記憶し、後述する細胞の立体構造体の作製条件を求める演算処理を実行し、これらの情報をグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）等を表示する表示部１１１に表示することができる。なお
、本図において制御部１１０は各々の構成部に接続され、本装置の全体を制御するものとしたが、構成部毎に各々独立した制御部を備えるように構成することもできる。

【0018】

次に、図２を用いて上述した磁場発生装置１０４の構成についてより詳細に説明する。

【0019】

図２は、本実施の形態に係る磁場発生装置の基本構成を示す図である。磁場の印加の方式は、特定の位置にスポットで磁場を印加する（２ａ）に示す方式と、所定の領域に亘って面状の磁場を印加する（２ｂ）に示す方式がある。（２ａ）に示す方式では、電磁石２
０１に、Ｘ軸可動調節機構２０２と、Ｙ軸可動調節機構２０３を備えたことを特徴とする
。Ｘ軸可動調節機構２０２と、Ｙ軸可動調節機構２０３を用いて、ＸＹ面内の電磁石２０１の位置を自在に変化させることができる。（２ｂ）方式では、ＸＹ面内に複数の電磁石
２０１を備えることで、所望の領域に配置される電磁石２０１に磁力を印加させることができる。ここで、電磁石２０１のサイズについては限定されるものではないが、（２ａ）
に示す方式と、（２ｂ）に示す方式のいずれにおいても、磁性体を取り込んで磁性化した
細胞（以下、単に磁性化細胞ということがある）を電磁石２０１によって操作するので、細胞操作の際の位置正確性を向上するためには、電磁石２０１のサイズは小さいものを選択することが望ましい。また、少なくとも、電磁石２０１の直径が磁性体細胞の直径よりも小さい方が細胞操作の際の位置正確性が高く、細胞の立体構造体の再現度を高めることができる。

【0020】

ここで、図１８は本実施の形態に係る細胞の立体構造体の作製条件の決定処理を実施する機能ブロック図である。オペレータは図１に示した入力部１１２において、細胞立体構造情報入力部１８０１から作製したい所望の立体構造体の情報（形状イメージ、大きさ、厚み等）を入力すると、作製条件取得部１８０２は、入力された情報、及びデータベース１８０７に記憶された情報（細胞の種類に応じた接着条件等の特性や作製までの時間的制限、磁気ビーズの種類やその特性等の種々の情報）とに基づいて、最適な立体構造体の作製条件を求める。その後、求めた条件に基づいて作製動作を開始するために、機構制御部１８０３は画像処理エンジン１８０４、アーム処理エンジン１８０５、磁場処理エンジン１８０６に指示信号を送信する。

【0021】

ここで、図１９は本実施の形態に係る細胞の立体構造体の作製イメージを示す図である。本図に示すように、オペレータは表示部１１１のＧＵＩに表示されるＸ−Ｚ平面１９０１、Ｙ−Ｚ平面１９０２、Ｘ−Ｙ平面１９０３、及びＸＹＺ空間１９０４における細胞の立体構造体のイメージを視覚的に確認することができ、また、１９０１〜１９０３の各平面における横軸、縦軸の長さを調節することにより所望の大きさ、厚みの立体構造体のイメージを設計することができる。ここで、本実施の形態ではＸ−Ｚ平面１９０１、Ｙ−Ｚ平面１９０２、Ｘ−Ｙ平面１９０３の全ての平面、及びＸＹＺ空間１９０４において立体構造体の作製イメージを表示する場合について説明したが、これらのうちのいずれかを選択的に表示することも可能である。

【実施例1】

【0022】

次に、上述した装置を用いた細胞の立体構造体の作製について図３〜図７、及び図２０を用いて説明する。

【0023】

図３は本実施の形態に係る細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートであり、図４は本実施の形態に係る磁場形成パターンの例を示す図である。

【0024】

まず、磁場発生装置１０４にて、図４における細胞塊の目標形状（形状パターン）４０２に基づいて、この形状に近似するように設定された、磁場印加パターン４０３を印加する（ステップＳ３０１）。本実施の形態では磁場発生装置１０４は、所定の領域に亘って
面状の磁場を印加する（２ｂ）に示す方式を採用する。

【0025】

磁場印加の際に、細胞塊の目標形状（形状パターン）４０２に近似して設定された磁場印加パターン４０３の領域に含まれる部分の電磁石２０１のみを、磁場処理エンジン１０６を介して、印加させる。この場合の電磁石２０１は、電流値によって面に対して垂直な磁束を制御することが出来る、ソレノイドコイルが望ましい。

【0026】

次に、培養容器１０３内に、磁性ビーズなどの磁性体を取り込ませた磁性化細胞を、単層細胞シートの構成細胞数だけ投入する（ステップＳ３０２）。ここで、図５に、培養容
器への細胞の投入動作の例を示す。ここでは、図５（ａ）に示すように、ウェルプレート５０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞５０７を、アーム５０１を介して、培養容器５０３内に投入する方法を示す。ウェルプレート５０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞５０７は、単層細胞シートの再現性を向上するためには、出来る限り細胞径が一様であることが望ましい。この場合、ウェルプレート５０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞５０７は、細胞へのダメージ低減を図るために、１個ずつ確実に培養容器５０３に移すこともできる。また、投入の効率を高めるために、ノズル５０８の一度の吸引動作中に、複数のスフェロイド細胞５０７を培養容器５０３内に投入しても良い。ステップＳ３０２にて、スフェロイド細胞５０７に磁性体が取り込ませてあった場合、ノズル５０８先端に電磁石２０１を設置し、磁場でスフェロイド細胞５０７を操作し、培養容器５０３内に投入してもすることもできる。あるいは図５（ｂ）に示すように、培養したスフェロイド細胞５０７を、遠沈管５０４のような容器に、単層細胞シートの構成細胞数集め、遠沈管５０４に備え付けられているチューブ５０５とバルブ５０６を用いて、細胞塊の目標形状４０２を形成するのに最適な細胞数を、培養容器５０３内に投入しても良い。この場合、短時間で投入が完了するように、多量のスフェロイド細胞５０７を含む遠沈管５０４を、遠心分離、もしくはスフェロイド細胞５０７に磁性体が取り込まれている場合は外部磁場により、スフェロイド細胞５０７を遠沈管５０４の底部に凝集させてから投入処理を行うようにすることもできる。

【0027】

次に、培養容器１０３内に投入した細胞を培養し、定着させる（ステップＳ３０３）。
ここで、図６に、本実施の形態に係る単層の細胞の培養開始（定着前）時の状態（ａ）と培養後（定着）の状態（ｂ）の様子を示す。ステップＳ３０１にて印加した磁場パターン４０３に従い、磁性体を取り込んだ細胞は単層状に配置される。図６（ａ）に示すように単層状に配置された細胞６０１は、インキュベータ１０１内で最適な温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度を与えると、図６（ｂ）に示すように個々のスフェロイド細胞が融合・定着し、単層細胞シート６０２が形成される。

【0028】

次に、ステップＳ３０４にて、単層に変換した細胞シート６０５について、目標の３次元状の細胞塊を作製するために必要な枚数の全てが形成されているかどうかを判断する（ステップＳ３０４）。ここで、必要な全ての枚数が形成されていない場合は、再度ステ
ップＳ３０１、Ｓ３０２を繰り返し、必要な分だけ単層細胞シートを形成させる。

【0029】

単層細胞シートが必要な分だけすべて形成された場合は、次に多層化処理に進む（ステップＳ３０５）。ここで、図７に本実施の形態に係る細胞の多層化の処理の様子を示す。
図７（ａ）に示すように、上記ステップＳ３０４で形成した全ての単層細胞シートを多層化配置７０９し（ステップＳ７０１）、インキュベータ１０１内で最適な温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度を与えて培養すると（ステップＳ７０２）、個々の単層細胞シートが融
合・定着し、目的の細胞塊７１０を形成する（ステップＳ７０３）。ここで、多層化操作
の方法は、アーム５０１を用いて各単層細胞シートを積み重ねていく方法がある。また、上記ステップＳ３０４では形成した全ての単層細胞シートを、単層細胞シートの数だけ用意した個別の培養容器１０３、もしくは一つの培養容器１０３内の他所スペースに配置することになる。このため、図７（ａ）の方法は、大きな面積、もしくは体積を持った培養容器１０３が必要となり、必然的に作製装置のサイズが大きくなる恐れがある。そこで、最低限として単層細胞シート１枚分の面積の培養容器１０３があれば、多層化することができる図７（ｂ）の方法がある。図７（ｂ）の様に、培養容器１０３内に、ステップＳ３０３で形成した単層細胞シート７１２の上に、磁場発生装置１０４にて新たな層の磁場パターンを印加し、図５のようにして細胞を投入させ、単層細胞シート状に新たな細胞層を磁場配置させる（ステップＳ７０４）。次に、インキュベータ１０１内で最適な温度、酸
素濃度、二酸化炭素濃度を与えて培養すると（ステップＳ７０５）、２層目の細胞シート
が融合・定着し、２層分の細胞塊７１３を形成する（ステップＳ７０６）。上記ステップ
Ｓ７０４、Ｓ７０５、Ｓ７０６を繰り返すことで、図７（ａ）の方法で形成した細胞塊と同じ形状で形成が可能となる。また、図７（ｂ）の方法は、最低限として単層細胞シート１枚分の面積の培養容器１０３があれば、多層化できるため作製装置をより小型化することが可能となる。

【0030】

ここで、図２０は本実施の形態に係る細胞の立体構造体の情報を表示するＧＵＩ画面を示す図である。形状イメージ表示部２００１は、図１９にて上述した方法により設計した細胞の立体構造体の形状のイメージを表示する。また、オペレータは、成形条件入力部２００２から、作製したい立体構造体の目的や適用する組織に応じて決定される使用細胞名や、成形方式（単層定着方式、単細胞定着方式等）、成形モード（短時間モード、形状高
再現モード等）等の条件を入力することができる。そして、最適化成形条件表示部２００３では、図１８にて上述した作製条件取得部１８０２により求められた最適な条件が表示され、この条件により成形の処理を開始する場合にはオペレータは「上記条件で成形」と示された入力ボタンを介して処理の開始を指示することができる。

【0031】

なお、本ＧＵＩ画面による立体構造体の作製条件の入力と確認は、後述する実施例２及び実施例３にも適用することができる。

【実施例2】

【0032】

上述した実施例１では、細胞投入は単層細胞シートの構成細胞数を一度に培養容器１０３に投入することについて説明した（ステップＳ３０２）。次に、本実施の形態では、より単層細胞シートの再現性を向上させるために、細胞を１個ずつ培養容器１０３に投入する技術を利用した細胞の立体構造体の作製について図８〜図１２を用いて説明する。

【0033】

図８は、本実施の形態に係る細胞の立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートである。まず、培養容器１０３に細胞を１個ずつ投入する（ステップＳ８０１）。この
とき、上述の通りオペレータから入力された情報に基づいて、制御部は、所望の立体構造体を作製するために、培養容器１０３内において細胞が配置されるべき目標位置を設定し、この目標位置に細胞を移動させる。本実施の形態では磁場発生装置１０４は、Ｘ軸可動調節機構２０２、Ｙ軸可動調節機構２０３を用いて目標位置に向かって電磁石２０１を移動させ、特定の位置にスポットで磁場を印加する（２ａ）に示す方式を採用する。

【0034】

ここで、図９に本実施の形態に係る培養容器への細胞の投入動作を示す。図９（ａ）に示すように、ウェルプレート９０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞９０４を、アーム９０１を介して、培養容器９０３内に投入する方法がある。

【0035】

ウェルプレート９０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞９０４は、細胞塊の再現性を向上するためには、できるだけ細胞径が一様であることが望ましい。ステップＳ８０１の時点で、スフェロイド細胞９０４に磁性体が取り込ませてあった場合、ノズル９０７先端に電磁石を設置し、磁場でスフェロイド細胞９０４を操作し、培養容器９０３内に投入しても良い。あるいは、図９（ｂ）に示すように、ウェルプレート９０２内で培養した、個々のスフェロイド細胞９０４を、ウェルプレート９０２に接続された、チューブ９０５とバルブ９０６によって、培養容器９０３に投入する手法がある。この方法では、投入された細胞が、立体構造体を作製するために配置されるべき目的の位置（目標位置）で定着されたことを、カメラ１０５で確認してから、次の細胞のバルブ９０６を開けることで、細胞投入を行うことが出来る。このようにすることで、細胞投入に際し、アーム９０１のような接触物がないため、コンタミネーションのリスクを最小限で細胞投入が出来る。

【0036】

次に、投入した細胞の位置を把握する（ステップＳ８０２）。ここで、図１０に本実施
の形態に係るカメラを用いた細胞の位置確認の例を示す。図１０（ａ）に示す方法では、カメラ１００１と照明版１００２を用い、照明版１００２による反射光をカメラ１００１で撮像することにより培養容器１００３に対する相対的な細胞１００９の位置を測定することができる。ここで、培養容器１００３面とカメラ１００１とのハレーションの影響を最小限にするため、図１０（ａ）に示すように２枚の照明板１００２ａ、ｂを用いることが望ましい。

【0037】

また、図１０（ｂ）に示す方法では、細胞位置を把握するために、細胞１００９を蛍光色素で染色し、培養容器１００３内に励起光としてレーザーなどの単色光源１００７を用い、可動ミラー１００４によって励起光源を培養容器１００３内で走査することにより、蛍光を発する細胞１００９の位置をカメラ１００１で測定することができる。この方法では、可動ミラー１００４によって光源の三次元走査を行うので、適当なピンホール１００６とレンズ１００５を用いることで励起光源を共焦点系にすることが細胞位置の把握に有効である。

【0038】

図１０（ａ）、（ｂ）に示した方法において、細胞位置は、培養容器１００３内の三次
元空間で検出する必要があるため、カメラ１００１はＸ，Ｙ，Ｚ方向などの３方向に設置することがより精度の高い細胞位置把握にとって有効となる。また、カメラ１００１と培養容器１００３との相対位置が変化した際は、相対位置のキャリブレーションを行うことで、細胞位置の変動を最小限にすることが可能となる。具体的には、例えば、培養容器１００３内に細胞培養過程において不活性な物質で絶対位置を決めるキャリブレータを用い、そのキャリブレータのカメラ１００１による測定値の真値との乖離量をもとに補正係数を決定し、カメラ１００１の位置のキャリブレーションを行うことができる。

【0039】

次に、磁場の印加により細胞の操作を行い（ステップＳ８０３）、カメラ１００１にて
細胞位置を測定する（ステップＳ８０４）、そして測定細胞の位置が目標位置に細胞があるかどうかについての判定を行う（ステップＳ８０５）。

【0040】

ここで、図１１に本実施の形態に係る磁場形成パターンの具体例を示す。図１１（ａ）は、培養容器１１０１内の細胞１１０３を、培養容器１１０１外の磁場発生装置１１０２で発生した磁場を用いて到着点１１０４まで移動するための操作の例を示す。一般的には、磁場発生装置１１０２は電流にて磁場を自在に制御できる電磁石２０１を用い、その中の代表的なソレノイドコイルの作り出す磁場Ｈは、（１）式：Ｈ＝ｎ・Ｉ（ｎ：コイル巻
数、Ｉ：電流値）で表すことができる。続いて、磁界Ｈの中で、ｍ［Ｗｂ］の磁極を置いた際に発生する力Ｆ［Ｎ］は（２式）：Ｆ＝ｍ・Ｈと表すことができる。

【0041】

上記の２式を組み合わせると、（３式）：Ｆ＝ｍ・ｎ・Ｉと表すことができ、ｍ［Ｗｂ
］の磁性体を取り込んだ細胞は、電流値で外力を与えることができる。続いて、質量Ｍ［
ｋｇ］の物質に、Ｆ［Ｎ］の力が作用すると、加速度ａ［ｍ／ｓ＾２］は（４式）ａ＝Ｆ／Ｍと表すことができる。そして、初速度０で加速度ａ［ｍ／ｓ＾２］で移動する物体のｔ［ｓ］後の変位ｘは（５式）ｘ＝（１／２）・ａ・（ｔ）＾２と表すことができるので
、（３式）、（４式）、（５式）により、（６式）ｘ＝（ｍ・ｎ／２Ｍ）・Ｉ・ｔ＾２で
表すことができる。ここで、（６式）により、磁性体を取り込んだ細胞は、電流値と印加
時間で変位を制御することが可能となるだけでなく、細胞の到着点までの最適電流値と、最適印加時間を算出することもできる。

【0042】

また、図１１（ｂ）に示すように、電流をパルス的に印加することで、一定の距離ずつ細胞を外部磁場によって制御し（ステップＳ８０３）、カメラ１００１で細胞位置を確認
し（ステップＳ８０４）、測定細胞位置に基づいて、再度の細胞操作をすることができる
（ステップＳ８０５）。また、ステップＳ８０４において、カメラ１００１の撮像結果か
ら、到着点１００４までの距離に対してこの時点までに用いている電流値での１パルスあたりの移動距離では大きすぎると判断した場合は、次回以降の細胞移動における電流値を低下させるように条件を調整することで、１パルスあたりの移動距離をより少なくして操作することができ、到着点１００４まで確実に移動させることが可能となる。

【0043】

続いて、ステップＳ８０４で、図１１（ｃ）に示すように、１パルスあたりの移動量が、到着点１００４を超えてしまったと判断した場合は、次回の細胞操作でソレノイドコイルに流す電流値を逆転させることで、磁界の向きを反転させ、到着点１００４まで移動させることが可能となる。本実施の形態のように、磁性体を取り込んだ細胞１１０３を培養容器１１０１内を三次元で操作する必要あるため、磁場発生装置１１０２をＸ，Ｙ，Ｚ方向などの３方向に設置することが、より精度の高い細胞操作にとって望ましい。

【0044】

次に、培養容器１０３内に投入した細胞を培養し、定着させる（ステップＳ８０６）。
ここで、図１２に、本実施の形態に係る単層または多層の細胞の培養開始（定着前）時の状態（ａ）と培養後（定着）の状態（ｂ）の様子を示す。本実施の形態では、細胞を１個ずつ操作するが、その際に細胞塊の目標形状１２０８に対して、端から細胞を定着させていく図１２（ａ）に示す方式と、中央から細胞を定着させていく図１２（ｂ）に示す方式がある。

【0045】

図１２（ａ）に示す方式では、単純組織であるが形状を最も優先したいといった組織再生の場合等に有用である。また、図１２（ｂ）に示す方式では、臓器などの内部機能を最も優先したいといった臓器再生の場合等に有用である。図１２（ａ）、（ｂ）に示すいずれの方式においても、細胞の定着の順序は、実施例１にて上述したように１細胞ずつ単層細胞シートを形成し、次に上層の単層細胞シートを形成することもできるし、あるいは初めから３次元状の細胞塊を形成してこれを核とし、核を中心に形成させていくこともできる。従って、作製したい細胞の立体構造体の条件に合わせて最適な方法を採用することが望ましい。

【実施例3】

【0046】

上述した実施例１、２では使用細胞の細胞径が一様である場合についての細胞の立体構造体の作製の例を示した。しかしながら、細胞の立体構造体により形成される臓器の形状の再現性を高めるためには、径の異なる幾つかの細胞を使用することが必要になることがある。本実施の形態では、径の異なる複数の細胞から構成される立体構造体の作製について、図１３、図１４を用いて説明する。

【0047】

図１３は、本実施の形態に係る径の異なる複数の細胞からなる立体構造体を作製する基本動作を示すフローチャートであり、図１４は、本実施の形態に係る細胞の培養開始〜定着の状態の様子を示す図である。

【0048】

はじめに、ステップＳ１４０１では、培養容器１０３内を撮像し（ステップＳ１３０１
）、撮像結果から、細胞塊の目標形状と、前ステップまでに定着した細胞塊像を抽出する。抽出された結果に基づいて、次ステップに必要となる細胞径を算出する（ステップＳ１３０２）。

【0049】

次に、ステップＳ１４０２では、ステップＳ１３０２にて決定した細胞径の細胞を培養容器１０３内に投入する。続いてステップＳ１４０３では、培養容器１０３内を撮像し（ステップＳ１３０４）、実施例２と同じく、カメラ１００１での撮像と細胞の磁場操作を
繰り返し（ステップＳ１３０４、Ｓ１３０５、Ｓ１３０６）、目標の位置に細胞を操作し、定着することで細胞塊を形成する。

【0050】

本実施の形態によれば、同種細胞で大きな体積を占める部位には、大きな径の細胞を用いることで細胞塊の形成に要する時間を大幅に短縮することが可能となる。また、複雑な形状部位には、小さな径の細胞を使うことで、細胞塊の形状再現性を向上させることができる。

【実施例4】

【0051】

上述した実施の形態では、磁性化細胞に対して、磁性体の除去を行うことなく細胞の立体構造体を作製している。細胞の種類や、磁性体によっては、細胞自身の代謝で、取り込まれた磁性体を自然に排出することができるため、このような場合には、磁性体の除去処理を行なわなくても、磁性体による影響はないと考えられる。しかしながら、細胞の種類や、磁性体の種類、また細胞の大きさによっては、磁性体の自然排出が不十分である場合がある。また、細胞塊の用途によっては、臨床用などの体内移植用として使う場合は、確実に磁性体を除去しておく必要がある場合がある。このような場合、外部操作によって細胞内の磁性体を確実に除去すること必要となる。

【0052】

本実施の形態では、上述した実施例１、実施例２において、磁性体を取り入れた細胞を用いて立体構造体を形成した後、細胞内の磁性体を除去する工程を組み込んだ態様について図１５〜図１７、及び図２１を用いて説明する。

【0053】

図１５、図１６はそれぞれ、実施例１、実施例２にて上述した細胞の立体構造体の作製において、本実施の形態に係る磁性ビーズの除去ステップを追加した態様の基本動作を示すフローチャートである。図１５のフローチャートにおいては、単層細胞シート形成後（ステップＳ１５０３）、磁性体除去操作（ステップＳ１５０４）を行う。また、図１６のフローチャートにおいては、１個の細胞の定着後（ステップＳ１６０８）、磁性体除去操
作（ステップＳ１６０９）を行う。

【0054】

図１７は、本実施の形態に係る磁性ビーズの除去ステップの詳細を示すフローチャートである。

【0055】

まず、カメラ１００１により細胞シートの厚みあるいは細胞の径を測定する。ここで、実施例１を適用する場合には細胞シートの厚みを測定し、実施例２を適用する場合には細胞径を測定する（ステップＳ１７０１）。磁性体除去の操作において、磁性体の排出を促
進するための代謝活性因子等を細胞に作用させる際に、細胞シートの厚みまたは細胞径が大きいと中心部の細胞までこれらの活性因子が届きにくくなる。そこで、本ステップでこれらの情報を取得することにより、中心部まで確実に活性因子を届かせるための種々の条件（温度、時間等）設定を最適化することができる。

【0056】

次に、ステップ１７０１で測定した細胞径または細胞シートの厚みの情報に基づいて、細胞種や磁性体の種類を考慮し、磁性体除去のための条件（温度、時間等）を求める（ステップＳ１７０２）。

【0057】

続いてステップＳ１７０２にて決定した磁性体除去条件を用いて、代謝活性因子等を細胞に作用させ、磁性体を除去する（ステップＳ１７０３）。

【0058】

その後、ステップ１７０４にて、ステップ１７０３の除去処理によって磁性体が確実に除去されているかどうかの判定を行う（ステップＳ１７０４）。ここで、具体的には、培
養容器１０３内に単細胞を幾つかコントロールとして配置しておき、そのコントロールに対して磁場発生装置１０４にて外部磁場を発生させた際の細胞位置をカメラ１００１で測定することで、磁性粒子が除去できたかどうかを判定することができる。以上の除去操作を行うことで、磁性体を確実に除去し、より如何なる場合にも高い安全性が保証された立体構造体を作製することが可能となる。

【0059】

ここで、図２１は本実施の形態に係る細胞の立体構造体の情報を示すＧＵＩ画面を示す図である。

【0060】

本図において、形状イメージ表示部２１０１、成形条件入力部２１０２、最適化成形条件表示部２１０３はそれぞれ図２０にて上述した構成と同様であるが、本実施の形態では、磁性体を除去する工程が組み込まれているため、このときの除去の条件を設定するために必要な情報を入力する磁気ビーズ条件入力部２０１２−１、及び入力された情報に基づいて求められる除去の条件を表示する脱磁気ビーズ条件表示部２１０３−１をさらに備えている。

【0061】

このように、上述した本実施の形態によれば、細胞にコンタミネーションやダメージを与えることなく、かつ、精度の高い培養条件の調整によって、所望の大きさや形状、構造を有する再生組織・再生臓器の形成を実現するができる。

【0062】

なお、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施の形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施の形態の構成の一部を他の実施の形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施の形態の構成に他の実施の形態の構成を加えることも可能である。また、各実施の形態構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

【符号の説明】

【0063】

１０１・・・インキュベータ
１０２・・・アーム
１０３・・・培養容器
１０４・・・磁場発生装置
１０５・・・カメラ
１０６・・・磁場処理エンジン
１０７・・・アーム処理エンジン
１０８・・・画像処理エンジン
１０９・・・データバス
１１０・・・制御部
１１１・・・表示部
１１２・・・入力部
２０１・・・電磁石
２０２・・・Ｘ軸可動調節機構
２０３・・・Ｙ軸可動調節機構
４０１・・・外部磁場発生装置
４０２・・・細胞塊の目標形状（形状パターン）
４０３・・・磁場印加パターン
５０１・・・アーム
５０２・・・ウェルプレート
５０３・・・培養容器
５０４・・・遠沈管
５０５・・・チューブ
５０６・・・バルブ
５０７・・・細胞
５０８・・・ノズル
６０１・・・単層状に配置した細胞
６０２・・・培養後、形成した細胞シート
７０９・・・多層化配置した単層細胞シート
７１０・・・培養後、形成した細胞塊
７１１・・・単層シート上に磁場配置した細胞層
７１２・・・単層細胞シート
７１３・・・２層分の細胞シート
９０１・・・アーム
９０２・・・ウェルプレート
９０３・・・培養容器
９０４・・・細胞
９０５・・・チューブ
９０６・・・バルブ
９０７・・・ノズル
１００１・・・カメラ
１００２・・・照明版
１００３・・・培養容器
１００４・・・可動ミラー
１００５・・・レンズ
１００６・・・ピンホール
１００７・・・単色光源
１００８・・・カラーフィルタ
１００９・・・細胞
１０１０・・・励起光光線
１０１１・・・蛍光光線
１１０１・・・培養容器
１１０２・・・磁場発生装置
１１０３・・・磁性体を取り込んだ細胞
１１０４・・・細胞操作の到着点
１２０６・・・磁性体を取り込んだ細胞
１２０７・・・細胞操作の到着点
１２０８・・・細胞塊の目標形状
１２０９・・・形成した細胞塊
１８０１・・・細胞立体構造情報入力部
１８０２・・・作製条件取得部
１８０３・・・機構制御部
１８０４・・・画像処理エンジン
１８０５・・・アーム処理エンジン
１８０６・・・磁場処理エンジン
１８０７・・・データベース
１９０１・・・Ｘ−Ｚ平面における入力形状イメージ
１９０２・・・Ｙ−Ｚ平面における入力形状イメージ
１９０３・・・Ｘ−Ｙ平面における入力形状イメージ
１９０４・・・ＸＹＺ空間における入力形状イメージ
２００１、２１０１・・・形状イメージ表示部
２００２、２１０２・・・成形条件入力部
２１０２−１・・・磁気ビーズ条件入力部
２００３、２１０３・・・最適化成形条件表示部
２１０３−１・・・脱磁気ビーズ条件表示部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】