特許 6644326 核酸搭載ユニット型ポリイオンコンプレックス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6644326

(24)【登録日】2020年1月10日

(45)【発行日】2020年2月12日

(54)【発明の名称】核酸搭載ユニット型ポリイオンコンプレックス

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/713 20060101AFI20200130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20200130BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20200130BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20200130BHJP

   C08G 69/40 20060101ALN20200130BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20200130BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/713

   A61K48/00

   A61K9/10

   A61K47/34

   A61K31/7088

   !C08G69/40

   !C12N15/00

【請求項の数】8

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2019-528600(P2019-528600)

(86)(22)【出願日】2018年8月30日

(86)【国際出願番号】JP2018032040

(87)【国際公開番号】WO2019044937

(87)【国際公開日】20190307

【審査請求日】2019年5月23日

(31)【優先権主張番号】特願2017-166735(P2017-166735)

(32)【優先日】2017年8月31日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２６年度、文部科学省、科学技術試験研究委託事業「次世代がん研究推進のためのシーズ育成支援基盤」（有望な創薬シーズの効果的な導出に向けたＤＤＳ技術支援）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願；平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 センター・オブ・イノベーション（ＣＯＩ）プログラム「スマートライフケア社会への変革を先導するものづくりオープンイノベーション拠点」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願；平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】514299594

【氏名又は名称】公益財団法人川崎市産業振興財団

(74)【代理人】

【識別番号】100122471

【弁理士】

【氏名又は名称】籾井 孝文

(74)【代理人】

【識別番号】100150212

【弁理士】

【氏名又は名称】上野山 温子

(72)【発明者】

【氏名】片岡 一則

(72)【発明者】

【氏名】宮田 完二郎

(72)【発明者】

【氏名】福島 重人

(72)【発明者】

【氏名】林 光太朗

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 秀美代

(72)【発明者】

【氏名】キム ヒョンジン

(72)【発明者】

【氏名】藤 加珠子

【審査官】 伊藤 清子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１６２０４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１１４０１３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｋ ９／１０

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ４７／３４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ｃ０８Ｇ ６９／４０

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する２分子のブロックコポリマーと、１分子の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、
該ユニット型ポリイオンコンプレックス中に含まれる全ての該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の電荷量の合計（絶対値）が、該ユニット型ポリイオンコンプレックス中に含まれる全ての該核酸由来の電荷量の合計（絶対値）の９０％未満または１１０％を超え１５０％以下であり、
該核酸の鎖長が、１０〜５０塩基長であり、
該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０^３以上であり、
該カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数の９０％以上が、塩基性アミノ酸残基であり、
該ブロックコポリマーの該核酸に対する結合定数（Ｋａ）が、３．０×１０^５以上である、ユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項2】

前記カチオン性ポリアミノ酸セグメントが、構成アミノ酸として、リシン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸および２，４−ジアミノ酪酸から選択される少なくとも１種の塩基性アミノ酸を含み、
前記カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数に対する、該少なくとも１種の塩基性アミノ酸の残基数の割合が、８０％〜１００％である、請求項１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項3】

前記核酸が二本鎖核酸である、請求項１または２に記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項4】

前記ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、６０×１０^３以上である、請求項１から３のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項5】

前記ポリエチレングリコールセグメントが二鎖分枝型であり、
各ポリエチレングリコール鎖の分子量が、２０×１０^３以上である、請求項１から４のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項6】

前記カチオン性ポリアミノ酸が、構成アミノ酸としてオルニチンを含む、請求項１から５のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。

【請求項7】

請求項１から６のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックスと、
該ユニット型ポリイオンコンプレックスを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離のブロックコポリマーと、を含む、核酸送達用組成物。

【請求項8】

組成物中における前記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と前記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比（Ｎ／Ｐ比）が、１〜２０である、請求項７に記載の核酸送達用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸を搭載したユニット型ポリイオンコンプレックスおよび該ユニット型ポリイオンコンプレックスを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸医薬は、細胞内の様々な遺伝子を制御し得ることから、これまで治療困難とされてきた癌、遺伝性疾患等の種々の疾患への適用が強く期待されている。その一方で、核酸医薬は、核酸分子自体の生体内での安定性が低いことから、標的細胞への適切な送達技術を必要とする。例えば、核酸の送達技術として、従来、親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーを利用し、核酸と該ブロックコポリマーとに静電的相互作用を介した複合体（ポリイオンコンプレックス）を形成させる技術がある。

【0003】

上記従来技術で得られるポリイオンコンプレックスとしては、例えば、それぞれ不特定数の核酸とブロックコポリマーとからなるポリイオンコンプレックスであって、該ブロックコポリマーが親水性ポリマーセグメントを外側に向けるとともにカチオン性ポリマーセグメントを内側に向け、核酸を内包した状態で放射状に配列しているポリイオンコンプレックス（以下、「ミセル型ポリイオンコンプレックス」と称する場合がある）、および、それぞれ特定数の核酸とブロックコポリマーとからなるポリイオンコンプレックスであって、生体内、例えば、血中で安定な構成単位体として存在するポリイオンコンプレックス（以下、「ユニット型ポリイオンコンプレックス」または「ｕＰＩＣ」と称する場合がある）が挙げられる（例えば、特許文献１）。

【0004】

特許文献１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックスは、それぞれ特定数の核酸とブロックコポリマーとからなる明確な構造を有し、核酸の血中滞留性を向上することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１３／１６２０４１号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックスの調製においては、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とが相殺されてユニット型ポリイオンコンプレックスが電気的に中性となるように核酸および／またはブロックコポリマーの設計を慎重に行う必要がある。

【0007】

本願発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、より簡便に設計可能なユニット型ポリイオンコンプレックスを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスが提供される。該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおいては、該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず；該核酸の鎖長が、１０〜５０塩基長であり；該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０^３以上であり；該ブロックコポリマーの該核酸に対する結合定数（Ｋａ）が、３．０×１０^５以上である。
１つの実施形態において、上記ユニット型ポリイオンコンプレックスは、２分子の上記ブロックコポリマーと１分子の上記核酸とから構成される。
１つの実施形態において、上記核酸が二本鎖核酸である。
１つの実施形態において、上記ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、６０×１０^３以上である。
１つの実施形態において、上記ポリエチレングリコールセグメントが二鎖分枝型であり、各ポリエチレングリコール鎖の分子量が、２０×１０^３以上である。
１つの実施形態において、上記カチオン性ポリアミノ酸が、構成アミノ酸としてオルニチンを含む。
本発明の別の局面によれば、上記ユニット型ポリイオンコンプレックスと、該ユニット型ポリイオンコンプレックスを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離のブロックコポリマーと、を含む、核酸送達用組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記組成物中における上記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と上記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比（Ｎ／Ｐ比）が、１〜２０である。

【発明の効果】

【0009】

本発明においては、核酸に対して所定の親和性を有するブロックコポリマーを用いる。これにより、驚くことに、電荷が相殺されていない状態においても核酸の血中滞留性を向上可能なユニット型ポリイオンコンプレックスが得られる。このようなユニット型ポリイオンコンプレックスは、調製の際に、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とを厳密に制御する必要がないことから、従来のユニット型ポリイオンコンプレックスよりも簡便に設計され得る。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の１つの実施形態におけるユニット型ポリイオンコンプレックスの構成を説明する概略図である。

【図2】ユニット型ポリイオンコンプレックスの平均粒子径およびユニット型ポリイオンコンプレックス中の核酸会合数を示すグラフである。

【図3】核酸の血中滞留性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［Ａ．ユニット型ポリイオンコンプレックス］
本発明によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されていないユニット型ポリイオンコンプレックス（結果として、電気的に中和されていないユニット型ポリイオンコンプレックス）が提供される。以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。なお、本発明に用いられるブロックコポリマーおよび核酸はそれぞれ、重合反応物として得られる場合に、ある程度の多分散性を示し得る。よって、本明細書において、ブロックコポリマーの特性（分子量、重合度、電荷等）および核酸の特性（塩基長、電荷等）について言及する際は、特段の記載がない限り、多分散性を示す重合反応物全体の平均について言及するものとする。したがって、例えば、ブロックコポリマーの電荷量は、実際に測定して得られるカチオン性アミノ酸残基の重合度を平均重合度とし、該平均重合度に基づいて算出される。また例えば、ポリエチレングリコールセグメントの分子量としては、実際に測定して得られる平均分子量（例えば、数平均分子量）が適用され得る。
［Ａ−１．第１の実施形態］
［Ａ−１−１．ユニット型ポリイオンコンプレックスの全体構成］
図１（ａ）〜（ｄ）は、本発明の第１の実施形態におけるｕＰＩＣの一例を説明する概略図である。具体的には、図１（ａ）は、本発明で使用され得るブロックコポリマーの概略図であり、図１（ｂ）は、本発明で使用され得る核酸の概略図であり、図１（ｃ）は、図１（ａ）のブロックコポリマーと図１（ｂ）の核酸とから構成されるｕＰＩＣの概略図であり、図１（ｄ）は、図１（ｃ）のｕＰＩＣにおけるＰＥＧセグメントの空間的な広がりを示した概略図である。

【0012】

図１（ａ）に示されるブロックコポリマー１０ａ、１０ｂはそれぞれ、二鎖分枝型のＰＥＧセグメント１３ａ、１４ａ、１３ｂ、１４ｂとカチオン性ポリアミノ酸セグメント１２ａ、１２ｂとを有する。また、図１（ｂ）に示される核酸２０ａは、各々２塩基のオーバーハングを有する二本鎖核酸である。ブロックコポリマー１０ａ、１０ｂと核酸２０ａとは、カチオン性ポリアミノ酸セグメント１２ａ、１２ｂ由来の正電荷と核酸２０ａ由来の負電荷との間の静電的相互作用によって会合し、これにより、ｕＰＩＣ１００を形成している（図１（ｃ））。ｕＰＩＣ１００において、ブロックコポリマー１０ａ、１０ｂは、代表的には、核酸２０ａの主鎖方向において互いに逆向きに配列し得る。これにより、ＰＥＧセグメント１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ相互の重なりに起因する立体障害を抑制することができる。その結果、分枝型かつ長鎖のＰＥＧセグメントを有するブロックコポリマーであっても核酸と好適に静電結合してｕＰＩＣを形成することができる。また、このように配列することにより、図１（ｄ）に示されるとおり、４本のＰＥＧセグメント１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂが、核酸２０ａの全体を覆うように広がることができ、核酸２０ａの高度な保護に寄与し得る。１つの実施形態において、４本のＰＥＧセグメントは、各々の端部が略正四面体の頂点となるように位置し得、核酸は、該正四面体内に位置し得る。

【0013】

本実施形態のｕＰＩＣは、特定数のブロックコポリマーと特定数の核酸とから構成されるものであればよく、上記図示例の構成に限定されるものではない。

【0014】

本実施形態のｕＰＩＣは、生理的ｐＨ環境（ｐＨ＝約７．４）において、ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量が核酸由来の負の電荷量によって相殺されず、結果として、電気的に中和されていない。なお、本明細書において、「ユニット型ポリイオンコンプレックスにおけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されない」または「ｕＰＩＣが電気的に中和されていない」との記載は、ｕＰＩＣ中に含まれる全てのブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の電荷量の合計（絶対値）が、ｕＰＩＣ中に含まれる全ての核酸由来の電荷量の合計（絶対値）の９０％未満または１１０％超であることを意味する。ｕＰＩＣの開発においては、従来、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷と核酸由来の負電荷とが相殺されない場合、ｕＰＩＣが全体として電荷を帯びた状態となり、血液中のタンパクや酵素を静電的に誘引して血中滞留性が低下することや、電荷を帯びたｕＰＩＣが相互に、または、ブロックコポリマーおよび／または核酸とさらに会合して均一性が低下することが懸念されていた。これに対し、本発明者らの検討によれば、核酸に対して所定の親和性を有するブロックコポリマーを選択し、かつ、長鎖のＰＥＧセグメントを採用することにより、電荷を帯びたｕＰＩＣであっても、その構造を安定に維持して、優れた血中滞留性を有し得ることがわかった。１つの実施形態において、生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中の全ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量の合計は、ｕＰＩＣ中の全核酸由来の負電荷量の合計の４５％以上９０％未満（例えば５０％〜８５％、または、５０％〜８０％）であり得る。別の実施形態において、生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中のブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計は、核酸由来の負の電荷量の合計の１１０％を超え１５０％以下（例えば１１５％〜１４０％）であり得る。

【0015】

本実施形態のｕＰＩＣは、代表的には、ミセル型ＰＩＣよりも小型である。本実施形態のｕＰＩＣの粒子径（流体力学的直径）は、好ましくは１０ｎｍ〜３０ｎｍであり、例えば１０ｎｍ〜２５ｎｍ、また例えば１０ｎｍ〜２０ｎｍであり得る。このように小型であることは、搭載した核酸を組織の深部まで送達することに寄与し得る。

【0016】

［Ａ−１−２．ブロックコポリマー］
本実施形態で使用され得るブロックコポリマーは、ＰＥＧセグメントと、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと、を有し、送達対象の核酸に対して３．０×１０^５以上、好ましくは５．０×１０^５以上（例えば、８．０×１０^５以上、１．０×１０^６以上、１．５×１０^６以上、または２．０×１０^６以上）の結合定数（Ｋａ）を有する。核酸に対して上記所定の親和性を有するブロックコポリマーを用いることにより、血中においてｕＰＩＣからブロックコポリマーが解離し難くなる、あるいは、解離したとしてもすぐに再会合することができ、結果として、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とが相殺されていない状態においても、核酸を良好に保護して高い血中滞留性を得ることができると推測される。一方、結合定数（Ｋａ）の上限値は、特に限定されないが、実現容易性の観点から、例えば、４．０×１０^６以下であり得る。なお、本明細書において、ブロックコポリマーは、該ブロックコポリマーの薬学的に許容可能な塩も包含する。

【0017】

上記結合定数（Ｋａ）は、後述の実施例に記載の方法で測定される。結合定数（Ｋａ）は、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと核酸との間の静電結合が多くなるにつれて、または、個々の静電結合が強くなるにつれて増大する傾向にある。よって、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの正電荷数を調整すること、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの構成アミノ酸の種類を適切に選択すること等によって、結合定数（Ｋａ）を所望の範囲に制御可能である。なお、ブロックコポリマーの構成を固定した場合、結合定数（Ｋａ）は、主として核酸の負電荷量に依存し、塩基長が同じであれば塩基配列の違いによって実質的に変化しないと考えられる。

【0018】

上記ＰＥＧセグメントは、好ましくは分枝型であり、より好ましくは二鎖分枝型である。言うまでもないが、上記ＰＥＧセグメントは、ＰＥＧ鎖を１本のみ含む単鎖型であってもよい。

【0019】

上記ＰＥＧセグメントの分子量（分枝型の場合は各ＰＥＧ鎖の分子量の合計）は、４０×１０^３以上であり、好ましくは５０×１０^３以上、より好ましくは６０×１０^３以上である。分枝型の場合、各ＰＥＧ鎖の分子量は、各鎖の分子量の合計が上記範囲を満たす限りにおいて制限されず、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。分枝型の各ＰＥＧ鎖の分子量は、好ましくは１０×１０^３以上、例えば２０×１０^３以上、２５×１０^３以上、３０×１０^３以上、または、３５×１０^３以上であり得る。好ましくは、分枝型のＰＥＧ鎖のすべてが、２０×１０^３以上、２５×１０^３以上、３０×１０^３以上、または、３５×１０^３以上の分子量を有する。一方、各ＰＥＧ鎖の分子量はそれぞれ独立して、例えば８０×１０^３以下、６０×１０^３以下、または、５０×１０^３以下であり得る。ＰＥＧセグメントの分子量がこのような範囲内にあることにより、ｕＰＩＣが電荷を帯びた状態であっても核酸を酵素分解等から好適に保護することができる。また、ｕＰＩＣの生体適合性を高め、異物として分解または排出されることを防止し得る。なお、ＰＥＧセグメントの分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）等によって求めることができ、その際には、分子量が既知の市販のＰＥＧ（例えば、ＧＦＣ用分子量標準物質としてのＰＥＧ）を分子量マーカーとして用いることができる。

【0020】

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、生理的ｐＨ環境で所望の正電荷を有し、かつ、ブロックコポリマーの核酸への結合定数（Ｋａ）が３．０×１０^５以上となる限りにおいて、任意の適切な塩基性アミノ酸を構成単位として含み得る。該塩基性アミノ酸としては、所望の結合定数を容易に実現できることから、リシン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸および２，４−ジアミノ酪酸から選択される少なくとも１種の塩基性アミノ酸が好ましく、なかでも、オルニチンがより好ましい。

【0021】

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数に対する、上記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の数（２種以上の上記塩基性アミノ酸を含む場合はその合計数）の割合は、好ましくは５０％〜１００％であり得、例えば８０％〜１００％、９０％〜１００％または１００％であり得る。

【0022】

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、所望の結合定数が得られる限りにおいて、構成単位として他の塩基性アミノ酸をさらに含み得る。他の塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン等の天然塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸側鎖にカチオン性残基を導入したアミノ酸誘導体（例えば、アスパラギン酸の側鎖にエチレンジアミン構造を導入したＡｓｐ（ＤＥＴ））が挙げられる。

【0023】

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、所望される核酸との結合定数（Ｋａ）、ｕＰＩＣの構成、核酸の負電荷量、塩基性アミノ酸残基の種類等に応じて適切に設定され得る。該正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、核酸の負電荷量、塩基性アミノ酸残基の種類等によってその好適範囲が変動し得ることから、限定されるものではないが、例えば９以上、１０以上または１１以上の整数であり得る。別の観点から、該正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、同様に限定されるものではないが、核酸の負電荷量の２２．５％以上、２５％以上または２７％以上であり得る。上記塩基性アミノ酸残基（例えば、リシン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸または２，４−ジアミノ酪酸）を用いてこのような正電荷量とすることにより、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。一方、該正電荷量が多すぎると、ポリマー自身の血中滞留性が低下するおそれがある。よって、該正電荷量は、好ましくは５０以下、例えば４０以下、３０以下または２５以下であり得る。

【0024】

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、本発明の効果が得られる限りにおいて、非塩基性アミノ酸残基（例えば、疎水性アミノ酸残基）を含んでいてもよい。非塩基性アミノ酸残基の数は、カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数の、例えば１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下とすることができる。

【0025】

上記ＰＥＧセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとは任意の適切な連結基を介して結合される。例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ基、炭素−炭素結合、エーテル結合等を含む連結基が挙げられる。また、これらのセグメントは、生体内で開裂可能な連結基（例えば、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレアメート結合、アセタール基）を介して連結されていてもよい。

【0026】

上記ブロックコポリマーのＰＥＧセグメント側末端および／またはカチオン性ポリアミノ酸セグメント側末端には、本発明の効果が得られる範囲において、任意の適切な修飾がなされ得る。該修飾としては、例えば、保護基の導入、標的結合部位の導入等が挙げられる。

【0027】

上記標的結合部位は、標的となる組織や目的等に応じて任意の適切な部位であり得る。標的結合部位は、例えば、標的結合部位を有する化合物を上記ブロックコポリマーのＰＥＧセグメントの自由末端に結合させることにより形成され得る。なお、本明細書において、標的結合部位とは、生体およびウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る、生物学的な認識機能を有する部位をいう。標的結合部位を導入することにより、標的となる所望の部位への核酸の到達性を向上できる。

【0028】

上記ブロックコポリマーの好ましい具体例は、以下の一般式（１）または（２）で表され得る。

【化1】

【化2】

（上記各式において、
Ｒ^１ａ〜Ｒ^１ｄは、相互に独立して、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ^２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル基あるいは炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ^３は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基あるいは炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｌは、二価の連結基または原子価結合を表し、
ｘ１〜ｘ４は、相互に独立して、４５５〜１，８００の整数を表し、
ｚは、９〜５０の整数を表し、
ｗは、１〜４の整数を表し、
ｌおよびｍは、相互に独立して、０〜５の整数を表す。）

【0029】

上記式（１）または（２）において、Ｌは、二価の連結基または原子価結合である。二価の連結基としては、任意の適切な連結基が採用され得る。例えば、式（１）において、Ｌは、−Ｌ^１−Ｌ^２−Ｌ^３−であり得、式（２）において、Ｌは、−Ｌ^４−Ｌ^５−Ｌ^６−であり得る。ここで、Ｌ^１およびＬ^４は、相互に独立して、−（Ｏ−（ＣＨ_２）_ａ）_ｂ−Ｌ^１ａ−であり、ここでａは１〜５、ｂは０〜３００の整数であり、ｂが２以上の時ａはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ^１ａは原子価結合、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−またはＣＯＯであり；Ｌ^２およびＬ^５は、相互に独立して、原子価結合または−Ｌ^２ａ−Ｌ^２ｂ−Ｌ^２ｃ−であり、ここでＬ^２ａおよびＬ^２ｃはスペーサーとなる構造であり、特に限定はされないが、例えば置換または未置換の炭素数１〜１２のアルキル基であり、Ｌ^２ｂは下記式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）に示す構造のいずれかであり；Ｌ^３は、−（（ＣＨ_２）_ｃ−Ｏ）_ｄ−（ＣＨ_２）_ｅ−Ｌ^３ａ−であり、ここでｃは１〜５、ｄは０〜５００、ｅは０〜５の整数であり、ｄが２以上の時ｃはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ^３ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり；Ｌ^６は、−（（ＣＨ_２）_ｆ−Ｏ）_ｇ−（ＣＨ_２）_ｈ−Ｌ^６ａ−（ＣＨ_２）_ｉ−ＣＯ−であり、ここでｆは１〜５、ｇは０〜３００、ｈは０〜５、ｉは０〜５の整数であり、ｇが２以上の時ｆはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ^６ａは−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＯＯ−である。

【化3】

【0030】

上記Ｒ^１ａ〜Ｒ^１ｄ、Ｒ^２、またはＲ^３の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、およびアルキル基のアルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基または炭素数２〜１２の直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が２以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。

【0031】

このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ_１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ_１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ_１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素またはフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、「Ｃ_１−６」の表示は、炭素数１〜６を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。また、該置換基は、標的結合部位を含む基であってもよい。

【0032】

ｚは、ｕＰＩＣを形成した際にブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計の９０％未満または１１０％超となるように設定される。また、ｚは、核酸との結合定数（Ｋａ）が所定の値以上となるように設定され得る。ｗの値、核酸の負電荷数等によって変動し得るが、ｚが、例えば核酸の負電荷量の２２．５％以上、２５％以上または２７％以上の整数である場合、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。同様に、ｗの値、核酸の負電荷数等によって変動し得るが、ｚが、９以上の整数、例えば１０以上の整数または１１以上の整数である場合、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。ｚの上限は、例えば４０以下の整数または３０以下の整数であってもよい。

【0033】

ｗは、核酸との結合定数を高める観点から、好ましくは１〜３の整数であり、さらに製造容易性の観点から、より好ましくは３である。例えば、ｚが１４以下、特に１３以下の場合、ｗは、１〜３の整数、例えば、３であることが好ましい。ｗは、属する繰り返し単位全てについて同一の基が選択されてもよく、各々の繰り返し単位について異なる基が選択されてもよい。異なる基が選択される場合、各繰り返し単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。

【0034】

エチレングリコールの繰り返し数を表すｘ１〜ｘ４は、相互に独立して、下限が例えば６００、また例えば７００、また例えば８００であり、上限が例えば１４００、また例えば１２００、また例えば１１００である。

【0035】

［Ａ−１−３．核酸］
本明細書において、核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、または、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ二本鎖核酸等の二本鎖核酸が好ましく用いられ得る。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。

【0036】

上記核酸の鎖長（二本鎖核酸においては二重鎖を構成する部分の長さ）は、代表的には１０〜５０塩基長、例えば１０〜３０塩基長であり得る。

【0037】

上記核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ、ｓｈＲＮＡ、デコイ核酸等の機能性核酸を好ましく挙げることができる。

【0038】

上記ｓｉＲＮＡとしては、例えば、標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、任意の適切な方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。

【0039】

［Ａ−２．第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、
該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず、
該核酸の鎖長が、１０〜５０塩基長であり、
該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０^３以上であり、
該ブロックコポリマーが、配列番号１で示されるセンス鎖および配列番号２で示されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（ただし、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていない）に対して所定の結合定数（Ｋａ）を有する、ユニット型ポリイオンコンプレックスが提供される。

【0040】

本実施形態のｕＰＩＣにおいては、生理的ｐＨ環境におけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が核酸由来の負の電荷量の合計によって相殺されず、結果として、電気的に中和されていない。生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中の全ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量の合計は、ｕＰＩＣ中の全核酸由来の負電荷量の合計の４５％以上９０％未満（例えば５０％〜８５％、または、５０％〜８０％）、あるいは、１１０％を超え１５０％以下（例えば１１５％〜１４０％）であり得る。

【0041】

上記ブロックコポリマーは、例えば、配列番号１で示されるセンス鎖および配列番号２で示されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（ただし、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていない）に対して３．０×１０^５以上、好ましくは５．０×１０^５以上（例えば、８．０×１０^５以上、１．０×１０^６以上、１．５×１０^６以上、または２．０×１０^６以上）の結合定数（Ｋａ）を有し得る。該二本鎖核酸に対する結合定数（Ｋａ）は、例えば４．０×１０^６以下とすることができる。このようなブロックコポリマーは、１０〜５０塩基長程度の短鎖核酸全般に対して高い親和性を示し、好適に会合してｕＰＩＣを形成することができる。上記ブロックコポリマーとしては、例えばＡ−１−２項に記載のブロックコポリマーが用いられ得る。

【0042】

上記核酸としては、例えばＡ−１−３項に記載の核酸が用いられ得る。本実施形態のｕＰＩＣにおいては、二本鎖核酸と同様に一本鎖核酸（例えば、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡ、または、ＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ一本鎖核酸）も好ましく用いられ得る。鎖長が１０〜５０塩基長である一本鎖核酸の具体例としては、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム等の機能性核酸を好ましく挙げることができる。一本鎖核酸を用いる場合、第２の実施形態のｕＰＩＣは、１分子の核酸と１分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣまたは１分子の核酸と２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣであり得る。

【0043】

［Ｂ．ユニット型ポリイオンコンプレックスの調製方法］
本発明のｕＰＩＣは、例えば、任意の適切なブロックコポリマーと核酸とを、必要により緩衝化された水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液）中で混合することにより調製することができる。

【0044】

［Ｃ．核酸送達用組成物］
本発明の核酸送達用組成物は、Ａ項に記載のｕＰＩＣと、該ｕＰＩＣを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離状態のブロックコポリマーと、を含む。本発明の核酸送達用組成物によれば、ｕＰＩＣを単独で用いる場合よりも優れた核酸の血中滞留性が得られ得る。このような効果が得られる理由は、例えば以下のように推測できる。すなわち、ｕＰＩＣを含む溶液においては、核酸−ブロックコポリマー間の解離および会合が可逆反応として生じており、その結果、ｕＰＩＣが可逆的に分解および再形成されている。よって、ｕＰＩＣに加えて遊離状態のブロックコポリマーを配合することにより、平衡を会合側にシフトさせることができ、結果として、ｕＰＩＣ単独の場合よりも核酸を好適に保護できると考えられる。

【0045】

上記遊離状態のブロックコポリマーとしては、ｕＰＩＣを構成しているブロックコポリマーと置き換わってｕＰＩＣを形成し得るものであればよい。具体例としては、Ａ−１−２項に記載のブロックコポリマーが挙げられ、好ましくはｕＰＩＣを構成しているブロックコポリマーと同一のブロックコポリマーが挙げられる。該ブロックコポリマーは、核酸との親和性が高いことから、血中においても核酸と好適に再会合し得る。

【0046】

本発明の核酸送達用組成物は、必要により緩衝化された水溶液中で上記ブロックコポリマーと核酸とを、所望のＮ／Ｐ比となるように混合することによって得られ得る。ここで、Ｎ／Ｐ比とは、組成物中における上記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と上記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比を意味する。

【0047】

本発明の核酸送達用組成物において、Ｎ／Ｐ比は、例えば１以上であり、好ましくは１．５以上、より好ましくは２以上である。また、Ｎ／Ｐ比の上限は、代表的には２０以下、例えば１０以下、５以下、または４以下とすることができる。本発明の核酸送達用組成物においては、送達対象の核酸として二本鎖核酸を選択し、該核酸に対して、例えば８．０×１０^５以上、好ましくは１．０×１０^６以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーを用いることにより、Ｎ／Ｐ比が５以下（例えば、３程度）であっても投与から３時間後に１０％以上の核酸の血中滞留性を実現することができる。

【実施例】

【0048】

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例においては、ＰＥＧの分子量（ｋＤａ）およびポリアミノ酸の重合度の順序でポリマー構造を記す。例えば、二鎖分枝型ＰＥＧ鎖の各々の分子量が３７ｋＤａであり、カチオン性ポリアミノ酸セグメントが１０個のオルニチン残基からなる場合は、「ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１０）」と略記する。

【0049】

＜ブロックコポリマーの調製＞
種々の分子量を有する二鎖分枝型のポリ（エチレングリコール）誘導体（ＮＯＦ社製）を用い、特許文献１の実施例に記載のブロックコポリマーの調製方法と同様の方法で、以下のブロックコポリマー（塩酸塩）：ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）、ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１４）、ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−２０）、ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−４０）、ＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−９）、ＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−１４）、ＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−２０）、ＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−４０）の白色粉末を得た。ポリアミノ酸セグメントの重合度は、^１Ｈ-ＮＭＲによって決定した。

【0050】

［実施例１］
ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）とｓｉＲＮＡとを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解し、ｓｉＲＮＡの終濃度が１０μＭとなるように、かつ、Ｎ／Ｐ比が０．２５、０．５、１、２、３、５または１０となるように混合してＰＩＣ溶液を調製した。ｓｉＲＮＡとしては、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていないｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）を用い、必要に応じて、５’末端にＡｌｅｘａ６４７等の標識を付して用いた。

【0051】

ｓｉＬｕｃの塩基配列：
センス ５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
アンチセンス ５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）

【0052】

［実施例２］
ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）の代わりにＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１４）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。

【0053】

［実施例３］
ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）の代わりにＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−１４）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。

【0054】

［比較例１］
ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）の代わりにＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−９）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。

【0055】

［参考例１］
ＰＥＧ−ｐＯｒｎ（３７×２−１１）の代わりにＰＥＧ−ｐＬｙｓ（３７×２−２０）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ｕＰＩＣ溶液を調製した。参考例１で得られたｕＰＩＣ溶液（Ｎ／Ｐ比＝１０）は、特許文献１の表２において医薬製剤Ｂとして開示されたｕＰＩＣ溶液に略相当し、１分子のｓｉＲＮＡと２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣを含むものである。

【0056】

＜ｕＰＩＣの構造解析１＞
上記実施例１〜３および比較例１で調製したＰＩＣ溶液について、沈降平衡法による超遠心分析（ＳＥ−ＡＵＣ分析）および蛍光相関分光解析（ＦＣＳ解析）を行うことによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数およびブロックコポリマー会合数を求めた。具体的な方法は以下のとおりである。

【0057】

［ＳＥ−ＡＵＣ分析］
ＳＥ−ＡＵＣ分析は、吸収光学系を備えた分析用超遠心システムＢｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ−Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて行った。上記実施例および比較例においてＮ／Ｐ比＝１で調製したＰＩＣ溶液をｓｉＲＮＡ濃度が０．６μＭになるように１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して測定試料とした。２０℃で７２時間遠心後、波長２６０ｎｍにおける吸収をｒの関数として測定した。各試料の測定結果を、ＯＲＩＧＩＮソフトウェアを用いて解析してＰＩＣの分子量（Ｄａ）を求めた。

【0058】

［ＦＣＳ解析］
ＦＣＳ解析は、４０×対物レンズ（Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）およびＣｏｎｆｏＣｏｒ３モジュールを搭載した共焦点レーザスキャン顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、製品名「ＬＳＭ５１０」）を用いて行った。上記実施例および比較例においてＮ／Ｐ比＝１で調製したＰＩＣ溶液をｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭになるように１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して測定試料とした。測定試料を８ウェルチャンバーに移してサンプリング時間１５秒、繰り返し回数５回にてＦＣＳ測定を行った。測定結果をＣｏｎｆｏＣｏｒ３ソフトウェアで解析することにより測定領域内における平均蛍光粒子数を求めた。次いで、以下の式（ａ）を用いて計算することによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数を求めた。
ＡＮ_{ｓｉＲＮＡ}＝Ｎ_{ｓｉＲＮＡ}／Ｎ_ＰＩＣ （ａ）
（式中、ＡＮ_{ｓｉＲＮＡ}は、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数であり、Ｎ_{ｓｉＲＮＡ}およびＮ_ＰＩＣはそれぞれ、蛍光標識したｓｉＲＮＡのみを含む対照試料の平均蛍光粒子数およびＰＩＣ溶液由来の測定試料の平均蛍光粒子数である。）

【0059】

上記ＰＩＣの分子量（Ｄａ）およびＰＩＣ１個あたりの核酸会合数を以下の式（ｂ）に代入することにより、ＰＩＣ１個あたりのブロックコポリマー会合数を算出した。
ＡＮ_{ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ}＝［ＭＷ_ＰＩＣ−（ＭＷ_{ｓｉＲＮＡ}×ＡＮ_{ｓｉＲＮＡ}）］／ＭＷ_{ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ} （ｂ）
（式中、ＡＮ_{ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ}は、ＰＩＣ１個あたりのブロックコポリマー会合数であり、ＭＷ_ＰＩＣは、上記ＳＥ−ＡＵＣ分析で得たＰＩＣの分子量（Ｄａ）であり、ＭＷ_{ｓｉＲＮＡ}およびＭＷ_{ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ}はそれぞれ、ｓｉＲＮＡおよびブロックコポリマーの構造式に基づいて算出される分子量（Ｄａ）である。）

【0060】

上記構造解析の結果を表１に示す。

【表1】

【0061】

表１に示されるとおり、実際にＦＣＳ解析および超遠心分析を行って決定されたｓｉＲＮＡおよびブロックコポリマーの会合数はそれぞれ、約１および約２である。ここで、各会合数の標準偏差が０．１以下であることは、実施例１〜３および比較例１で得られたＰＩＣは、構成上の均質性が非常に高く、特定の均一な構成を有することを示す。以上より、実施例１〜３および比較例１で調製されたＰＩＣが、１分子のｓｉＲＮＡと２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣであることが合理的に理解される。

【0062】

＜ｕＰＩＣの構造解析２＞
上記参考例１で得られたｕＰＩＣ溶液について、上記ｕＰＩＣの構造解析１と同様にＦＣＳ解析を行うことによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数およびＰＩＣの平均粒子径（流体力学的直径：Ｄ_Ｈ）を求めた。なお、ＰＩＣの平均粒子径（Ｄ_Ｈ）は、ＣｏｎｆｏＣｏｒ３を用いて、上記ＦＣＳ測定で得られた自己相関曲線を拡散時間に変換し、次いで、該拡散時間をＣｙ５色素を対照として用いて拡散係数（Ｄ_Ｃ）に変換し、該拡散係数をアインシュタインの関係式（Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）に代入することによって算出した。結果を図２に示す。

【0063】

図２に示されるとおり、参考例１のｕＰＩＣ溶液においては、Ｎ／Ｐ比＝１〜１０の範囲にわたって、ｕＰＩＣの平均粒子径が約１８ｎｍであり、また、核酸会合数が約１であり、両者ともほぼ一定であった。このことから、参考例１のｕＰＩＣは、ｕＰＩＣ相互または遊離のブロックコポリマーと二次会合をすることなく、安定な構成単位体として存在することがわかる。

【0064】

＜結合定数の測定＞
上記で得られた各ブロックコポリマーのｓｉＲＮＡに対する結合定数（Ｋａ）を以下の方法により決定した。結果を表２に示す。
結合定数は、エチジウムブロマイド(ＥｔＢｒ)とブロックコポリマーのｓｉＲＮＡに対する結合の競合を、ＥｔＢｒが核酸に結合すると増強する蛍光の強度を定量することにより決定した。上記蛍光強度の定量は、蛍光分光光度計(日本分光社製、ＦＰ‐６６００)を用いて行った。具体的には、測定対象のブロックコポリマーと上記ｓｉＲＮＡ（実施例および比較例で用いたｓｉＬｕｃ、ただし、Ａｌｅｘａ６４７で標識されていない）とを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解し、ｓｉＲＮＡの終濃度が１μＭとなるように、かつ、Ｎ／Ｐ比が０．２５、０．５または１となるように混合してＰＩＣ溶液を調製した。各Ｎ／Ｐ比のＰＩＣ溶液 １ｍＬに対して、約０．５ｍＭのＥｔＢｒ水溶液を１０μＬずつ１０回滴下し、滴下する度に蛍光強度（ｅｘ ５２５ｎｍ，ｅｍ ６００ｎｍ）の測定を行った。得られた蛍光強度を、既報の方法（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕ．７１，７７（１９９４））に基づいて解析して結合定数を算出した。

【0065】

【表2】

【0066】

＜ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価１＞
実施例、比較例および参考例で得られたｕＰＩＣ溶液（Ｎ／Ｐ比＝１）を６週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに尾静脈投与した。このとき、ｓｉＬｕｃの投与量が２ｎｍｏｌ／マウスとなるように投与した。その後、Ｉｎ ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム(Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ、ニコン社製)を用いて、マウスの耳血管内でのｓｉＬｕｃ由来の蛍光強度を経時的に測定し、次式によって相対蛍光強度を求めた（Ｎ＝１）。投与直後、５分後、１０分後、３０分後および６０分後の相対蛍光強度を表３に示す。
相対蛍光強度（％）=（測定時の強度−バックグラウンド強度）／（最大強度−バックグラウンド強度）×１００

【0067】

【表3】

【0068】

表３に示されるように、実施例１〜３のｕＰＩＣ溶液によれば、参考例１のｕＰＩＣ溶液と同等以上の優れた核酸の血中滞留性が得られた。特に、核酸との結合定数（Ｋａ）が１．０×１０^６を超えるブロックコポリマーを用いた実施例１および２では、参考例１よりも優れた核酸の血中滞留性が得られた。一方、比較例１のｕＰＩＣ溶液は、投与直後に蛍光強度が大きく低下し、その後は安定な測定ができなかった。

【0069】

＜ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価２＞
Ｎ／Ｐ比＝１０のｕＰＩＣ溶液を用いたこと以外は、ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価１と同様にして、６週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスにｕＰＩＣ溶液を尾静脈投与し、マウスの耳血管内でのｓｉＬｕｃ由来の蛍光強度を経時的に測定して相対蛍光強度を求めた（Ｎ＝１）。相対蛍光強度の経時的変化を図３に示す。

【0070】

図３に示されるように、実施例１〜３のｕＰＩＣ溶液（核酸送達用組成物）によれば、参考例１のｕＰＩＣ溶液と同等の優れた核酸の血中滞留性が得られた。一方、比較例１のｕＰＩＣ溶液は、実施例および参考例１のｕＰＩＣ溶液よりも核酸の血中滞留性が劣っていた。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明のｕＰＩＣは、核酸医薬等のドラッグデリバリーシステムにおいて好適に適用され得る。

【符号の説明】

【0072】

１００ ユニット型ポリイオンコンプレックス
１０ ブロックコポリマー
１２ カチオン性ポリアミノ酸セグメント
１３、１４ ポリエチレングリコールセグメント
２０ 核酸

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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