特許 6665414 Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6665414

(24)【登録日】2020年2月25日

(45)【発行日】2020年3月13日

(54)【発明の名称】Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/735 20060101AFI20200302BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/735ZNA

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-63067(P2015-63067)

(22)【出願日】2015年3月25日

(65)【公開番号】特開2016-183112(P2016-183112A)

(43)【公開日】2016年10月20日

【審査請求日】2018年2月19日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】大江 正剛

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２６１５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２３５０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１０５７１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０２７９６１４４（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−１１２６４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２０６０４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液であって、
前記水溶液のｐＨが７．０から８．５であり、
前記水溶液が０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含み、
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１以上のアミノ酸置換が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質である、
前記水溶液：
（ａ）配列番号１の６６番目に該当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（ｂ）配列番号１の１４７番目に該当するグリシンがアスパラギン酸に置換
（ｃ）配列番号１の１５８番目に該当するチロシンがヒスチジンに置換
（ｄ）配列番号１の１７６番目に該当するバリンがフェニルアラニンに置換。

【請求項2】

Ｆｃ結合性タンパク質を０．５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０から８．５の水溶液中で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法であって、
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１以上のアミノ酸置換が生じているアミノ酸配列からなるタンパク質である、方法：
（ａ）配列番号１の６６番目に該当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（ｂ）配列番号１の１４７番目に該当するグリシンがアスパラギン酸に置換
（ｃ）配列番号１の１５８番目に該当するチロシンがヒスチジンに置換
（ｄ）配列番号１の１７６番目に該当するバリンがフェニルアラニンに置換。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間保存可能な方法に関する。特に本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のＦｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間保存可能な方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

【0003】

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０^７Ｍ^−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

【0004】

遺伝子組換え技術を利用したＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の発現に関しては、これまで、大腸菌（特許文献１）、動物細胞（非特許文献３）、バチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）を宿主とした発現が報告されている。中でも大腸菌を宿主として用いた系では、高密度培養によるＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の製造法（特許文献５）、疎水クロマトグラフィー（特許文献６）や陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の精製法も報告されている。さらにはＦｃレセプター構造遺伝子の改変によりＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）の安定化や生産性が向上する（特許文献７）など、Ｆｃレセプターの産業利用への関心が高まっている。

【0005】

一方でＦｃレセプターは精製後に溶液状態で保存すると凝集しやすいことが問題となっており、産業利用において重大な欠点となっていた。すなわち、精製したＦｃレセプターを使用するまでの間放置しておくと、凝集し析出する問題があった。さらに凝集したＦｃレセプターをそのまま放置しておくと変性し再溶解できなくなる問題もあった。

【0006】

タンパク質の保存方法としては、特定の抗体を安定に保存する緩衝液（特許文献８）や保存方法（特許文献９）が知られている。しかしながら前述した方法は、タンパク質としての性質の異なるＦｃ結合性タンパク質には適用できなかった。そのためＦｃレセプターを安定に保存できる方法の開発が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００８−２４５５８０号公報

【特許文献2】特開２００９−２０１４０３号公報

【特許文献3】特開２０１１−０７２２４６号公報

【特許文献4】特開２０１１−２００２０３号公報

【特許文献5】特開２０１２−０３４５９１号公報

【特許文献6】特開２０１１−１２６８２７号公報

【特許文献7】特開２０１１−２０６０４６号公報

【特許文献8】特表２００８−５１５７７５号公報

【特許文献9】ＷＯ２００５／０３５５７３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１

【非特許文献2】Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７

【非特許文献3】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、Ｆｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）を凝集させずに長期間安定的に保存可能な溶液、およびＦｃレセプターを凝集させずに長期間安定的に保存する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記課題を解決するために鋭意検討した結果、水溶液中のＦｃレセプター（Ｆｃ結合性タンパク質）を安定に保存できるｐＨを見出し、本発明の完成に至った。

【0011】

すなわち本発明は、以下の態様を包含する：
（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液であって、前記水溶液のｐＨが７．０から９．０である、前記水溶液。

【0012】

（Ｂ）さらに０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含む、（Ａ）に記載の水溶液。

【0013】

（Ｃ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ａ）または（Ｂ）に記載の水溶液。

【0014】

（Ｄ）Ｆｃ結合性タンパク質をｐＨ７．０から９．０の水溶液中で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。

【0015】

（Ｅ）Ｆｃ結合性タンパク質を、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０から９．０の水溶液中で保存する、Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法。

【0016】

（Ｆ）Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
（Ｄ）または（Ｅ）に記載の保存方法。

【0017】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0018】

本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図１）を構成するタンパク質があげられる。なお必ずしもヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。本明細書におけるヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。

【0019】

前記（ｉｉ）の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１４−１６６８８３号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また前記（ｉｉ）の別の具体例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（１１１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられ、さらに具体的な例として配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特願２０１５−０４７４６２号）。
（４１）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号２の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号２の６７番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号２の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号２の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号２の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号２の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号２の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号２の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（５８）配列番号２の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジン、スレオニンのいずれかに置換
（５９）配列番号２の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（６０）配列番号２の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号２の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（６２）配列番号２の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（６３）配列番号２の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（６４）配列番号２の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（６５）配列番号２の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号２の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（６７）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（６８）配列番号２の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６９）配列番号２の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（７０）配列番号２の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（７１）配列番号２の８４番目のセリンがプロリンに置換
（７２）配列番号２の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号２の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号２の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（７５）配列番号２の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（７６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（７７）配列番号２の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（７８）配列番号２の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（７９）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（８０）配列番号２の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８１）配列番号２の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（８２）配列番号２の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（８３）配列番号２の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（８４）配列番号２の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８５）配列番号２の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（８６）配列番号２の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（８７）配列番号２の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（８８）配列番号２の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８９）配列番号２の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（９０）配列番号２の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（９１）配列番号２の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（９２）配列番号２の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（９３）配列番号２の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（９４）配列番号２の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（９５）配列番号２の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（９６）配列番号２の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（９７）配列番号２の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（９８）配列番号２の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（９９）配列番号２の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（１００）配列番号２の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（１０１）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（１０２）配列番号２の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０３）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（１０４）配列番号２の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０５）配列番号２の９４番目のアラニンがセリンに置換
（１０６）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１０７）配列番号２の１１７番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１０８）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１０９）配列番号２の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１０）配列番号２の１８１番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１１）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはチロシンに置換
また前記（ｉｉ）のさらに別の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１１２）から（１１５）に示す天然に生じるアミノ酸置換のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられる。
（１１２）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１１３）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１１４）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１５）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液のｐＨを７．０から９．０の範囲とすることを特徴としている。好ましくは、前記ｐＨの範囲で緩衝能を有する緩衝液成分を含むとよく、一例として、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＳＰＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液があげられる。なお、Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムをさらに含ませると、保存中に発生するＦｃ結合性タンパク質の凝集をさらに抑えることができるため、より好ましい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液の調製法に特に限定はなく、例えば、透析による方法や、限外ろ過による方法や、硫安などの塩またはアセトン、エタノール等の水と任意の容量比で混和する有機溶媒を加えて沈殿物として回収する方法を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液（またはＦｃ結合性タンパク質そのもの）を調製した後、ｐＨが７．０から９．０の緩衝液に再溶解させればよい。中でも処理の簡便性から、透析や限外ろ過による方法が工業的には好ましく用いられる。塩化ナトリウムの添加は、前述した方法で得られたｐＨが７．０から９．０の水溶液に、必要量の塩化ナトリウムを添加すればよい。

【発明の効果】

【0020】

本発明はＦｃ結合性タンパク質を含む水溶液を保存する際、当該水溶液のｐＨを７．０から９．０とすることを特徴としている。これにより、精製したＦｃ結合性タンパク質を、他の用途（例えばアフィニティークロマトグラフィー用リガンド）に用いるまでの間に、凝集により生じる、Ｆｃ結合性タンパク質のロスが防止され、Ｆｃ結合性タンパク質の利用効率を大幅に向上させることできる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造を示す図。

【図2】Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液の、ｐＨによる安定性の違いを示す図。

【図3】Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩による、安定性の違いを示す図。

【図4】Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩化ナトリウムの濃度による、安定性の違いを示す図。

【図5】本発明のＦｃ結合性タンパク質水溶液の保存安定性を示す図。

【実施例】

【0022】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。

【0023】

実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質の調製
以降の実施例で用いるＦｃ結合性タンパク質を、以下の方法で調製した。
（１）配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ９Ｔ８−Ｒ１を、特開２０１４−２２３０６４号公報で開示の方法にて作成し、当該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。なお配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である（特願２０１５−０４７４６２号）。
（Ｉ）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（ＩＩ）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（２）得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報で開示の方法に基づき、培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させた。
（３）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、特開２０１３−２５２０９９号公報で開示の抽出液を用いて、菌体内に発現したＦｃ結合性タンパク質を抽出した。
（４）（３）で得られた菌体抽出液から遠心分離により上清を回収し、Ｆｃ結合性タンパク質抽出液を得た。
（５）（４）で得られたＦｃ結合性タンパク質抽出液を、あらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０とを含んだ２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ ７．５））で平衡化した、アフィニティークロマトグラフィー用ゲル（ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに添加した。
（６）平衡化緩衝液Ａでゲルを十分洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を溶出し、高純度に精製したヒトＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を得た。

【0024】

実施例２ ｐＨの違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液の、ｐＨによる安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。
（検討した緩衝液）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸緩衝液（ｐＨ ３．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ ５．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９．０）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９．５）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ １０．０）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。

【0025】

凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図２に示す。ｐＨが７．０から９．０で凝集開始温度が高くなっていることから、当該ｐＨ領域の水溶液でＦｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。

【0026】

実施例３ 塩の違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩による、安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。なお塩の濃度は、各塩のイオン強度の効果を考慮し、適宜調整した。
（検討した緩衝液）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１２ｍｏｌ／Ｌ 硫酸マグネシウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．１６ｍｏｌ／Ｌ 硫酸ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．００５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。

【0027】

凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図３に示す。添加する塩として塩化ナトリウムを用いることで、Ｆｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。

【0028】

実施例４ 塩濃度の違いによる水溶液中のＦｃ結合性タンパク質の安定性評価
Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液に添加する塩化ナトリウムの濃度による、安定性の違いを確認した。
（１）実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を以下の組成からなる緩衝液で透析した。
（検討した緩衝液）
０．１ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．２ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．３ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．４ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．６ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．７ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．８ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
０．９ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
１．０ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
（２）アヴァクタ社製Ｏｐｔｉｍ２タンパク質物性解析装置を用いて、温度上昇によるＦｃ結合性タンパク質の凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定をすることで、タンパク質の安定性を評価した。

【0029】

凝集開始温度Ｔａｇｇ（℃）の測定結果を図４に示す。塩化ナトリウム濃度を０．５ｍｏｌ／Ｌ以上添加することでＦｃ結合性タンパク質の安定性が向上することがわかる。

【0030】

上記実施例２から４の結果をまとめると、Ｆｃ結合性タンパク質を含む水溶液のｐＨが７．０から９．０であり、かつ前記水溶液に０．５ｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムをさらに含ませると、Ｆｃ結合性タンパク質を最も安定的に保存できることがわかる。

【0031】

実施例５
本発明のＦｃ結合性タンパク質水溶液の保存安定性を確認した。
（１）０．８ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に実施例１で得られた精製Ｆｃ結合性タンパク質を添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質水溶液を調製した。
（２）調製した水溶液を、−２０℃での凍結保存、または３から１０℃での冷蔵保存を行なった。

【0032】

結果を図５に示す。凍結保存、冷凍保存ともに６ヶ月以上保存しても、Ｆｃ結合性タンパク質の劣化はなく、沈殿物や凝集体も確認できなかった。このことから本発明により、Ｆｃ結合性タンパク質を水溶液中で長期間、安定に保存できることがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]