特許 6665485 抗体依存性細胞傷害活性に基づく抗体の分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6665485

(24)【登録日】2020年2月25日

(45)【発行日】2020年3月13日

(54)【発明の名称】抗体依存性細胞傷害活性に基づく抗体の分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20200302BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20200302BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 NZNA

   G01N33/543 501A

【請求項の数】2

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-213184(P2015-213184)

(22)【出願日】2015年10月29日

(65)【公開番号】特開2017-83349(P2017-83349A)

(43)【公開日】2017年5月18日

【審査請求日】2018年9月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】大江 正剛

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５３１８９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０４１３０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０８７５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０６−５０１５５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 新井悦郎，抗体医薬品開発及び品質管理におけるキャピラリー電気泳動法の応用，生物物理化学，日本，２００８年，Vol.52，Page.139-144

【文献】 Shinkawa T、他１１名，The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity，J Biol Chem. ，２００３年 １月３１日，Vol.278,No.5，Page.3466-3473，DOI:10.1074/jbc.M210665200

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト免疫グロブリンと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体と、標識物質を結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体とを反応させることで、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合力の違いに基づきヒト免疫グロブリンを分析する方法であって、
Ａ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを担体に固定化する工程、
Ｂ）固定化したヒトＦｃγＲＩＩＩａとヒト免疫グロブリンを酸性条件下、反応させる工程、
Ｃ）検出試薬を用いて、結合した免疫グロブリンの量を測定する工程
を含み、
ヒト免疫グロブリンと、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを固定化した担体との反応をｐＨ３．５からｐＨ５．５の条件で行なう、前記方法。

【請求項2】

ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目から２０８番目までのアミノ酸を含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体が有する薬理活性、特に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性の強さに基づき、抗体を分析する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、がんや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。また前記抗体が有する薬理活性の一つである、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン残基に付加するＮ型糖鎖の違いにより変化することが知られており、特に糖鎖の一種であるフコースを除去した抗体でＡＤＣＣ活性が向上することが報告されている（非特許文献１）。そのため抗体医薬で用いる抗体を工業的に製造する際は、前記抗体が有する糖鎖構造を制御して製造する必要がある。

【0003】

抗体医薬に用いる抗体は通常、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を培養して製造する。しかしながら、この方法は前記細胞内で付加される糖鎖を制御することは難しく、前記細胞で発現した抗体に付加された糖鎖構造を分析する必要がある。

【0004】

抗体の分析方法として従来より、ペプチドマッピング、二次元電気泳動、糖鎖の切り出しを含むＬＣ−ＭＳ分析（非特許文献２）が知られている。しかしながら、これらの方法は非常に煩雑な操作を必要とした。

【0005】

より簡便な抗体の分析方法の一例として、液体クロマトグラフィーによる分析が知られている。例えばゲルろ過クロマトグラフィーにより、分子の大きさに基づき抗体を分離することができるため、凝集体や分解物の分離・定量が可能である。またイオン交換クロマトグラフィーにより、電荷の違いによる抗体の分離が可能である。しかしながら、これらの方法では、抗体に付加した糖鎖構造といった微小な構造の違いを分析することは困難であった。

【0006】

より簡便な抗体の分析方法の別の例として、特定の糖鎖と結合可能なレクチンを用いた、レクチンＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着）法（特許文献１から３）が知られている。しかしながら、レクチンは特定の構造を有した糖鎖のみと結合するため、ＡＤＣＣ活性等の薬理活性に基づく抗体の分析は困難であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平０７−３２５０８３号公報

【特許文献2】特開平０８−２８５８５３号公報

【特許文献3】特開平１０−３１１８３２号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｓｈｉｎｋａｗａ．Ｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６−３４７３，２００３

【非特許文献2】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， ７２０，２１７−２２５，１９９６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の強さに基づき簡便に抗体を分析可能な方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒト免疫グロブリンと、ヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体と、標識物質を結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体との間の特異的反応を利用して、ヒト免疫グロブリン（抗体）を抗体依存性細胞障害活性の強さに基づき分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下の（Ａ）から（Ｄ）の態様を包含する：
（Ａ）ヒト免疫グロブリンとヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体と標識物質を結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体とを反応させることで抗体依存性細胞障害活性の強さに基づきヒト免疫グロブリンを分析する方法であって、ヒト免疫グロブリンとヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応を酸性条件で行なう、前記方法。

【0012】

（Ｂ）ヒトＦｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（Ａ）に記載の方法。

【0013】

（Ｃ）ヒトＦｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸を含むタンパク質である、（Ａ）に記載の方法。

【0014】

（Ｄ）酸性条件がｐＨが３．０から６．０までの範囲である、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載の方法。

【0015】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0016】

本発明においてヒトＦｃ結合性タンパク質とは、ヒト抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、一例としてヒトＦｃγレセプターである、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂがあげられる。ヒトＦｃ結合性タンパク質の例として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである、
（ｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含むポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載の野生型Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したポリペプチド、
があげられる。前記（ｉｉ）の一態様としては、ＷＯ２０１５／０４１３０３号に記載のポリペプチドがあげられる。また前記（ｉｉ）の別の態様としては、配列番号２に記載の配列からなるポリペプチドがあげられる。また前記（ｉｉ）のさらに別の態様としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（８４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドがあげられる（特願２０１５−１１５０７８号）。
（１）配列番号４の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（２）配列番号４の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３）配列番号４の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４）配列番号４の６７番目のチロシンがセリンに置換
（５）配列番号４の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（６）配列番号４の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（７）配列番号４の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（８）配列番号４の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（９）配列番号４の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（１０）配列番号４の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（１１）配列番号４の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（１２）配列番号４の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１３）配列番号４の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（１４）配列番号４の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（１５）配列番号４の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（１６）配列番号４の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（１７）配列番号４の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（１８）配列番号４の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジンまたはスレオニンに置換
（１９）配列番号４の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（２０）配列番号４の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（２１）配列番号４の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（２２）配列番号４の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（２３）配列番号４の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（２４）配列番号４の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（２５）配列番号４の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（２６）配列番号４の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（２７）配列番号４の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（２８）配列番号４の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（２９）配列番号４の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（３０）配列番号４の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（３１）配列番号４の８４番目のセリンがプロリンに置換
（３２）配列番号４の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号４の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（３４）配列番号４の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（３５）配列番号４の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（３６）配列番号４の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（３７）配列番号４の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（３８）配列番号４の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（３９）配列番号４の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（４０）配列番号４の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４１）配列番号４の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（４２）配列番号４の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（４３）配列番号４の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（４４）配列番号４の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（４５）配列番号４の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（４６）配列番号４の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（４７）配列番号４の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（４８）配列番号４の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（４９）配列番号４の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（５０）配列番号４の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（５１）配列番号４の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（５２）配列番号４の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（５３）配列番号４の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（５４）配列番号４の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（５５）配列番号４の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５６）配列番号４の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（５７）配列番号４の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（５８）配列番号４の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（５９）配列番号４の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（６０）配列番号４の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（６１）配列番号４の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（６２）配列番号４の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（６３）配列番号４の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（６４）配列番号４の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
（６５）配列番号４の９４番目のアラニンがセリンに置換
（６６）配列番号４の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（６７）配列番号４の１１７番目のグルタミンがアルギニンに置換
（６８）配列番号４の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６９）配列番号４の１８１番目のリジンがグルタミン酸に置換
（７０）配列番号４の２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはチロシンに置換
（７１）配列番号４の５６番目のリジンがグルタミンに置換
（７２）配列番号４の６２番目のリジンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号４の６６番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号４の７２番目のアスパラギンがチロシンに置換
（７５）配列番号４の７８番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号４の８１番目のセリンがグリシンに置換
（７７）配列番号４の９０番目のチロシンがヒスチジンに置換
（７８）配列番号４の１３８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（７９）配列番号４の１５３番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（８０）配列番号４の１５６番目のスレオニンがアラニン、アルギニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、セリン、バリンまたはメチオニンに置換
（８１）配列番号４の１５７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８２）配列番号４の１７４番目のチロシンがロイシン、システイン、イソロイシン、リジン、トリプトファンまたはバリンに置換
（８３）配列番号４の２０６番目のイソロイシンがバリンに置換
（８４）配列番号４の２０７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
本発明におけるＦｃ結合性タンパク質中、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また本発明におけるＦｃ結合性タンパク質には糖鎖を付加されていてもよいし、付加されていなくてもよい。

【0017】

本発明の方法は、前述したヒトＦｃ結合性タンパク質を担体に固定化した後、前記固定化した担体にヒト免疫グロブリン（抗体）を含む溶液を添加し反応させることでヒトＦｃ結合性タンパク質−ヒト免疫グロブリン複合体を形成し、添加した標識物質を結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体との抗原抗体反応によりヒトＦｃ結合性タンパク質−ヒト免疫グロブリン（抗体）−抗ヒト免疫グロブリン抗体複合体を形成した後、形成したヒトＦｃ結合性タンパク質−ヒト免疫グロブリン（抗体）−抗ヒト免疫グロブリン抗体複合体を抗ヒト免疫グロブリン抗体に結合した標識物質を用いて分析することで、抗体依存性細胞障害活性の強さに基づきヒト免疫グロブリン（抗体）を分析する方法である。

【0018】

ヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化するのに用いる担体の一例として、通常ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着）測定に用いられている９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートがあげられる。中でも、タンパク質の非特異吸着を抑制したプレートを用いると好ましく、前記好ましいプレートの一例としてＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）があげられる。

【0019】

ヒトＦｃ結合性タンパク質の固相への固定化条件は、通常、当業者がＥＬＩＳＡ測定用プレート等を作製するときの条件で行なえばよい。具体的には、緩衝液はＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）やＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）等の生理条件に近い緩衝液を用いると好ましく、緩衝液中に含まれるヒトＦｃ結合性タンパク質の濃度は０．０１から１０μｇ／ｍＬの間（より好ましくは０．１から１μｇ／ｍＬの間）とすると好ましく、反応温度／時間は４から４０℃の間で１０分から２４時間（より好ましくは４から１０℃の間で１２から１６時間）とすると好ましい。固定化反応終了後は、例えばＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０を０．０５％含んだＴＢＳ）等の洗浄液を用いてヒトＦｃ結合性タンパク質が固定化されたウェルを洗浄すればよい。

【0020】

前記洗浄操作終了後、固相化したヒトＦｃ結合性タンパク質との非特異的な結合を抑制するため、ブロッキング剤をウェルに添加しブロッキング処理を行なう。ブロッキング剤の例としては、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）といった当業者がブロッキング剤として通常用いる物質や、市販のブロッキング剤（ＥＣＬ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ、ＧＥヘルスケア社製）があげられる。ブロッキング剤の濃度は、非特異的結合を抑制できれば特に限定はなく、０．１から５％とすると好ましく、０．３から２％の間とするとより好ましく、０．５から１％の間とするとさらに好ましい。ブロッキング処理の温度や時間も特に限定はないが、２５から４０℃の間で１０分から２時間反応させると好ましく、３０から３７℃の間で３０分から１時間反応させるとより好ましい。

【0021】

本発明の分析方法で用いる、抗ヒトグロブリン抗体に標識させる物質は、検出方法により適宜選択すればよい。例えばＥＬＩＳＡ法により検出する場合は酵素を標識させればよい。なお標識に使用される酵素は特に限定はなく、一般的に使用されているアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などが使用できる。またＦＩＡ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ、蛍光免疫測定法）により検出する場合は蛍光物質を標識させればよく、ＣＬＩＡ法（ＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ、化学発光免疫測定法）により検出する場合は発光物質を標識させればよく、ＲＩＡ法（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ、放射免疫測定法）により検出する場合は放射性同位物質を標識させればよい。

【0022】

本発明のヒト免疫グロブリンの分析方法は、ヒト免疫グロブリンと、ヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応を酸性条件で実施することを特徴としている。前記反応を酸性条件で実施することで抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性に基づく、ヒト免疫グロブリンの分析が容易となる。なおｐＨ３．０からｐＨ６．０までの酸性条件で実施すると好ましく、ｐＨ４．０からｐＨ５．５までの酸性条件で実施するとさらに好ましく、ｐＨ４．３からｐＨ４．８までの酸性条件で実施するとさらにより好ましい。なお添加する標識物質を結合した抗ヒトグロブリン抗体の濃度は、適宜調製され、適切な濃度希釈系列にて反応させればよく、反応条件も、通常ＥＬＩＳＡ法等で使用する温度、時間等の条件とすればよい。

【0023】

本発明の分析方法をＥＬＩＳＡ法を用いて行なう場合は、前述した反応後、抗ヒト免疫グロブリン抗体に標識した酵素に適した基質を添加し、当該酵素と基質との反応生成物由来の発光または蛍光を検出することで、ヒト免疫グロブリンを分析すればよい。例えば、標識酵素としてＨＲＰを用いる場合は、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を基質として用いることができる。

【0024】

本発明の分析対象であるヒト免疫グロブリンは、固定化したヒトＦｃ結合性タンパク質と親和性（反応性）を有するＦｃ領域を少なくとも含んでいればよく、一般に抗体医薬品として用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそのアミノ酸改変体等をあげることができる。また、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質などの人工的に構造改変した抗体も分析対象に含まれる。

【発明の効果】

【0025】

本発明は、ヒト免疫グロブリンとヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体と標識物質を結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体とを反応させることで抗体依存性細胞障害活性の強さに基づきヒト免疫グロブリンを分析する方法において、ヒト免疫グロブリンとヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応を酸性条件で行なうことを特徴としている。本発明により、抗体医薬品の開発に必要なＡＤＣＣ活性の高い抗体のスクリーニングを迅速かつ容易に行なうことができ、また抗体医薬品の製造工程管理や品質管理をより精度よく行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】糖鎖含有抗体とヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応を様々なｐＨで実施したときのＥＬＩＳＡ測定結果を示した図である。

【図2】Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムを用いた、抗体の溶出パターンを示した図である。図中のＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣはそれぞれフラクションＡ、フラクションＢ、フラクションＣの位置を示している。

【図3】Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムで分取した各フラクションに含まれる抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示した図である。

【図4】糖鎖含有抗体とヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応をｐＨ４．５の酸性条件で反応させたときのＥＬＩＳＡ測定結果を示した図である。

【図5】糖鎖含有抗体とヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体との反応をｐＨ７．４の中性条件で反応させたときのＥＬＩＳＡ測定結果を示した図である。

【実施例】

【0027】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。

【0028】

実施例１ ヒトＦｃ結合性タンパク質の調製
（１）配列番号２に記載したヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ９Ｔ８−Ｒ１を特開２０１４−２２３０６４号にて開示した方法にて作製し、当該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報に記載の方法を参考に培養することで、前記タンパク質を発現させた。
（２）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、特開２０１３−２５２０９９号に記載した抽出液を用いて、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（３）（２）で得られた菌体抽出液から遠心分離により上清を回収し、Ｆｃ結合性タンパク質抽出液を得た。
（４）（３）で得られたＦｃ結合性タンパク質抽出液をあらかじめ平衡化緩衝液Ａ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだ２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５））で平衡化した、アフィニティークロマトグラフィー用ゲル（ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに添加し、平衡化緩衝液Ａで十分洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を溶出し、高純度に精製したヒトＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を得た。

【0029】

実施例２ ヒトＦｃ結合性タンパク質のＥＬＩＳＡプレートへの固定化
（１）ＥＬＩＳＡ測定用９６穴プレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の各ウェルに、１．０μｇ／ｍＬとなるようＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液にて希釈したＦｃ結合性タンパク質を１００μＬ添加し、４℃で一晩（１６時間）反応することで、ＥＬＩＳＡプレートへのヒトＦｃ結合性タンパク質の固定化反応を実施した。
（２）０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ緩衝液）３５０μＬにて各ウェルを３回洗浄した。
（３）を０．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含んだＴＢＳ緩衝液を２００μＬ／ウェル添加し、３０℃にて１時間、または４℃で一晩（１６時間）ブロッキング操作を実施した。
（４）（３）で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化したＥＬＩＳＡプレートを使用時まで４℃にて保存した。

【0030】

実施例３ ＥＬＩＳＡ測定法による評価
（１）以下に示す緩衝液のいずれかを用いて、糖鎖含有ヒト抗体濃度０．０１ｍｇ／Ｌから１０ｍｇ／Ｌの希釈系列を作製し、作製した希釈系列の抗体溶液を実施例２で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質を固定化したプレートのウェルに１００μＬ添加した。
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）
（２）糖鎖含有抗体希釈系列を添加したプレートを３０℃で１時間静置した後、３５０μＬのＴＢＳＴで各ウェルを３回洗浄した。
（３）ＴＢＳ緩衝液で０．１μｇ／ｍＬに希釈したａｎｔｉ−ｈＩｇＧ（Ｆａｂ）−ＨＲＰ（コスモ・バイオ社製）を標識抗体として各ウェルに１００μＬずつ添加し、３０℃で１時間静置した。
（４）各ウェルを３５０μＬのＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに５０μＬずつ添加した。
（５）標識酵素ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）による発色の後、１Ｍリン酸水溶液を各ウェル５０μＬ添加し、発色反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）にて測定した。

【0031】

各反応ｐＨにおけるＥＬＩＳＡ測定の結果を、各抗体濃度を横軸に、４５０ｎｍでの吸光度を縦軸にしたグラフを図１に示す。図１より、同じ濃度の抗体をＦｃ結合性タンパク質と反応させても、反応ｐＨを酸性条件とすることで、通常の生理条件に近いｐＨであるｐＨ７．４と比較し、吸光度の低下が確認できる。これは酸性条件とすることで、抗体のうち、固定化したＦｃ結合性タンパク質との吸着力が弱い糖鎖構造を有した抗体、すなわち抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、当該Ｆｃ結合性タンパク質と結合しなくなることを示している。つまり、ＥＬＩＳＡプレートに固定されたＦｃ結合性タンパク質と抗体との反応における緩衝液のｐＨを酸性条件、特にｐＨ４．０から５．５までの酸性条件とすることで、抗体濃度０．１から１０ｍｇ／Ｌの範囲で、ＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体を選択的に分析できるといえる。

【0032】

実施例４ 糖鎖を有した抗体の分離
（１）ビニルポリマーゲル（粒子径１０μｍ、東ソー社製）が有するヒドロキシ基を常法によって官能基変換を行ない、ヨードアセチル基にて活性化されたゲルを得た。
（２）（１）で得られた活性化ゲルに、実施例１で調製したヒトＦｃ結合性タンパク質を、ゲル１ｍＬあたり２．５ｍｇの割合で反応させることで、ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを作製した。
（３）（２）で得られたヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲル０．５ｍＬを、φ４．６×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、分離用Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムを作製した。
（４）（３）で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質固定化カラムを、高速液体クロマトグラフィー装置（東ソー社製）に接続し、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した。
（５）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で４．０ｍｇ／ｍＬに希釈した糖鎖含有ヒト抗体（リツキサン、全薬工業社製）を、（４）で平衡化したカラムに流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで０．１５ｍＬアプライした。
（６）流速０．３ｍＬ／ｍｉｎのまま２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で２分間洗浄後、１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（３８分で１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着した糖鎖構造を有した抗体を溶出した。

【0033】

結果（溶出パターン）を図２に示す。糖鎖を有した抗体はＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルと相互作用するため、当該抗体が有する糖鎖の構造に基づき、複数のピークに分離された。

【0034】

実施例５ 分離した抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性測定
（１）実施例４に記載の方法で分離した後、図２に記載のクロマトグラフ中に示されたフラクションＡ（ＦｒＡ）、フラクションＢ（ＦｒＢ）、およびフラクションＣ（ＦｒＣ）の領域を分取した。
（２）分取したＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣを限外ろ過膜（メルクミリポア社製）で濃縮しながらＰＢＳ（１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．７６ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。
（３）濃縮、緩衝液交換したＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣに含まれる抗体、ならびに分離前の抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。
（４）以下の方法によりＡＤＣＣ活性を測定した。なお測定キットとして、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）使用し、製品マニュアルに従い、測定した。
（４−１）１．４ｍＬのＬｏｗ ＩｇＧ Ｓｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を混合し、これをＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒとした。
（４−２）ＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いてＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣに含まれる抗体および分離前の抗体を３μｇ／ｍＬから３倍希釈で８段階の希釈系列を調製した。
（４−３）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒにて約５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ウェルプレート（コーニング社製：３９１７）に２５μＬ／ウェルで加えた。Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（４−２）で調製したＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣおよび分離前の抗体希釈系列、ならびにＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ブランク）を、２μＬ／ウェル加えた。
（４−４）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞をＡＤＣＣ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒにて約３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたウェルに２５μＬ／ずつ添加した後、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）で６時間静置した。
（４−５）９６穴プレートを室温で５から３０分静置した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに７５μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で発光を測定した。測定した発光強度からブランクの発光強度を引くことで、各溶液の発光強度を求めた。

【0035】

ＦｒＡ、ＦｒＢおよびＦｒＣ、ならびに分離前の抗体の発光強度を比較した結果を図３に示す。なお図３の結果では、発光強度が高い程、ＡＤＣＣ活性が高いことを示している。分離前の抗体溶液の発光強度と比較し、ＦｒＡおよびＦｒＢの発光強度は低くなっている一方、ＦｒＣの発光強度は約１．５倍となった。この結果より、ＦｒＣに含まれる抗体が有するＡＤＣＣ活性は、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体が有するＡＤＣＣ活性よりも高いことがわかる。つまりＦｃ結合性タンパク質固定化カラムからの溶出が遅い（カラムに保持される時間が長い）抗体（ＦｒＣ）が、よりＡＤＣＣ活性の高い抗体であり、抗体をＡＤＣＣ活性に基づき分離できることがわかる。

【0036】

実施例６ 分離した抗体のＥＬＩＳＡ測定（酸性条件）
（１）ＡＤＣＣ活性が高い抗体を含むフラクションであるＦｒＣ、ならびにＡＤＣＣ活性の低い抗体を含むフラクションであるＦｒＡおよびＦｒＢについて、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて濃度希釈系列を作製し、作製した希釈系列の抗体溶液を実施例２で作製したＦｃ結合性タンパク質を固定化したＥＬＩＳＡプレートのウェルに１００μＬ添加した。
（２）実施例３と同様な方法で、洗浄、標識抗体の添加、発色操作後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0037】

結果を図４に示す。ＥＬＩＳＡプレートに固定されたＦｃ結合性タンパク質と抗体との反応を酸性条件（ｐＨ４．５）で行なうことで、糖鎖構造を有した抗体とＦｃ結合性タンパク質との結合力を弱められ、ＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体（ＦｒＡおよびＦｃＢ）の吸光度は低くなる一方、ＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体（ＦｒＣ）の吸光度は高くなる。つまり本方法により、Ｆｃ結合性タンパク質との結合性がより強い、ＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体をＥＬＩＳＡ法にて分析することできる。

【0038】

比較例１ 分離した抗体のＥＬＩＳＡ測定（中性条件）
濃度希釈系列を作製する際に用いる緩衝液として１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた他は、実施例６と同様な方法でＥＬＩＳＡ測定した。

【0039】

結果を図５に示す。ＥＬＩＳＡプレートに固定されたＦｃ結合性タンパク質と抗体との反応を中性条件（ｐＨ７．４）で行なうと、いずれのフラクションもほぼ同じ値となり、糖鎖構造の違いによる、抗体とＦｃ結合性タンパク質との結合力に変化は見られなかった。したがって本方法では、ＥＬＩＳＡ法によるＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体の分析は困難といえる。

【産業上の利用可能性】

【0040】

本発明により、従来困難であった抗体医薬品や抗体類縁医薬品が有する薬効を、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性に基づき、簡便に分析することができる。また本発明により、抗体医薬品の開発に必要な、薬効の高い抗体を産生する細胞の迅速なスクリーニングや、抗体医薬品製造の課題である、品質の向上、すなわちロット間における薬効のばらつきを低減させることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]