特許 6675520 Ｄ型アミノ酸脱水素酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6675520

(24)【登録日】2020年3月12日

(45)【発行日】2020年4月1日

(54)【発明の名称】Ｄ型アミノ酸脱水素酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20200323BHJP

   C12N 9/06 20060101ALI20200323BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20200323BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200323BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200323BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200323BHJP

   C12P 13/04 20060101ALI20200323BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200323BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12N9/06 B

   C12N15/53

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12P13/04

   C12N5/10

【請求項の数】12

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2019-535715(P2019-535715)

(86)(22)【出願日】2018年8月9日

(86)【国際出願番号】JP2018029892

(87)【国際公開番号】WO2019031575

(87)【国際公開日】20190214

【審査請求日】2019年12月6日

(31)【優先権主張番号】特願2017-154768(P2017-154768)

(32)【優先日】2017年8月9日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000001100

【氏名又は名称】株式会社クレハ

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100131705

【弁理士】

【氏名又は名称】新山 雄一

(72)【発明者】

【氏名】秋田 紘長

(72)【発明者】

【氏名】中道 優介

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 真宏

(72)【発明者】

【氏名】松鹿 昭則

(72)【発明者】

【氏名】森田 友岳

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１７−１０８７４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 GenBank Database [online], Accession No.CP019699.1, 21-FEB-2017, [検索日:2018.10.12]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1148968360

【文献】 ビタミン，2016，Vol.90，p.544-554

【文献】 Biotechnol Lett, 2012, Vol.34, p.1693-1699

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ９／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する酵素：
（ａ）Ｄ−アミノ酸を可逆的に脱水素する活性を有する
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの６量体である。

【請求項2】

２−オキソブタン二酸からＤ−アスパラギン酸を生産する活性を有する、請求項１に記載の酵素。

【請求項3】

更に下記特徴（ｃ）を有する請求項１又は２に記載の酵素：
（ｃ）ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの両方を補酵素として利用可能である。

【請求項4】

更に下記特徴（ｄ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の酵素：
（ｄ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合のｋ_ｃａｔ（ｍｉｎ^−１）が１．０×１０^４以上である。

【請求項5】

更に下記特徴（ｅ）を有する請求項１〜４のいずれかに記載の酵素：
（ｅ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性ｐＨが１０．５である。

【請求項6】

更に下記特徴（ｆ）を有する請求項１〜５のいずれかに記載の酵素：
（ｆ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性温度が７５度である。

【請求項7】

配列番号２のアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれかの酵素をコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを組み込んだベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを含む形質転換体。

【請求項11】

請求項１０に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素の製造方法。

【請求項12】

請求項１〜６のいずれかに記載の酵素を２−オキソ酸に作用させ、Ｄ−アミノ酸を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｄ型アミノ酸脱水素酵素に関連する技術が開示される。

【背景技術】

【0002】

生体における重要な成分の１つであるタンパク質は、主として２０種類のα-アミノ酸から構成されている。そのうちグリシンを除く１９種類は不斉炭素を持つため、Ｄ型アミノ酸とＬ型アミノ酸の２種の光学異性体が存在する。タンパク質を構成するアミノ酸はそのほとんどがＬ型アミノ酸であることが知られているが、近年の分析技術の発展により、ヒトを含めた哺乳類や水生動物、植物等の高等生物の細胞内に、Ｄ型アミノ酸も微量に存在することが明らかになっている。

【0003】

Ｄ型アミノ酸は、排卵誘発剤、血液凝固阻止剤、鎮痛剤などの医薬品の生産原料として、さらには殺虫剤や抗生物質、化粧品などの工業製品の中間体として、広い工業的用途を有している。そこで、Ｄ型アミノ酸の効率の良い製造方法が必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

Ｄ型アミノ酸の効率的な製造に資する技術の提供が１つの課題である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

斯かる課題の解決のため、日夜研究を重ねた末、下記に代表される発明を提供するに至った。
項１．
下記（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する酵素：
（ａ）Ｄ−アミノ酸を可逆的に脱水素する活性を有する
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの６量体である。
項２．
２−オキソブタン二酸からＤ−アスパラギン酸を合成する活性を有する、項１に記載の酵素。
項３．
更に下記特徴（ｃ）を有する項１又は２に記載の酵素：
（ｃ）ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの両方を補酵素として利用可能である。
項４．
更に下記特徴（ｄ）を有する項１〜３のいずれかに記載の酵素：
（ｄ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合のｋ_ｃａｔ（ｍｉｎ^−１）が１．０×１０^４以上である。
項５．
更に下記特徴（ｅ）を有する項１〜４のいずれかに記載の酵素：
（ｅ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性ｐＨが１０．５である。
項６．
更に下記特徴（ｆ）を有する項１〜５のいずれかに記載の酵素：
（ｆ）ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性温度が７５℃である。
項７．
配列番号２のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、項１又は２に記載の酵素。
項８．
項１〜７のいずれかの酵素をコードするポリヌクレオチド。
項９．
項８に記載のポリヌクレオチドを組み込んだベクター。
項１０．
項９に記載のベクターを含む形質転換体。
項１１．
項１０に記載の形質転換体を培養することを含む、項１〜７のいずれかに記載の酵素の製造方法。
項１２．
項１〜７のいずれかに記載の酵素を２−オキソ酸に作用させ、Ｄ−アミノ酸を製造する方法。

【発明の効果】

【0006】

Ｄ型アミノ酸及び／又は２−オキソ酸を効率的に合成することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。下線は、クローニング用の制限酵素認識部位であり、太字は終止コドンである。

【図2】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列を示す。

【図3】粗酵素液、熱処理酵素液、及び各種クロマトグラフィー後に得られる活性画分と分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は粗酵素液、レーン３は熱処理後粗酵素液、レーン４はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０陰イオン交換クロマトグラフィー後活性画分、レーン５はＢｕｔｙｌ−６５０Ｍ疎水性クロマトグラフィー後活性画分、レーン６はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィー後活性画分の結果を示す。

【図4】精製酵素をタンパク質染色及び活性染色に供した結果を示す。レーン１はタンパク質染色、レーン２は補酵素にＮＡＤ^＋を用いた場合の活性染色、レーン３はＮＡＤＰ^＋を用いた場合の活性染色の結果を示す。

【図5】酵素のｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の脱アミノ反応のｐＨ依存性を測定した結果を示す。グリシン緩衝液（ｐＨ １０．５）における比活性を１００％として各ｐＨにおける相対活性を算出した。横軸は測定ｐＨ（ｐＨ）であり、縦軸は相対活性 (％)である。●はグリシン緩衝液、■は炭酸緩衝液をそれぞれ示す。

【図6】酵素のｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の脱アミノ反応の温度依存性を測定した結果を示す。横軸は測定温度（℃）であり、縦軸は相対活性（％）である。

【図7】酵素の熱安定性を測定した結果を示す。横軸は熱処理温度（℃）であり、縦軸は相対活性（％）である。

【図8】酵素のｐＨ安定性を測定した結果を示す。横軸は測定温度（ｐＨ）であり、縦軸は相対活性 (％)である。●は酢酸緩衝液、■はクエン酸緩衝液、◆はリン酸緩衝液、▲はホウ酸緩衝液、▼はグリシン緩衝液、〇は炭酸緩衝液、□はリン酸緩衝液、◇は塩化カリウム緩衝液をそれぞれ示す。

【図9】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨの結晶を示す。

【図10】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨの三次元構造を示す。

【図11】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列と他の４種類のｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素のアミノ酸配列とのアライメントを示す。他の4種類のｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のもの（配列番号３）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のもの（配列番号４）、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のもの（配列番号５）、及びＵｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のもの（配列番号６）である。

【図12】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の３つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。四角は変異導入箇所であり、下線はクローニング用の制限酵素認識部位、太字は終止コドンである。

【図13】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の３つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列を示す。四角は変異導入箇所である。

【図14】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の６つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。四角は変異導入箇所であり、下線はクローニング用の制限酵素認識部位、太字は終止コドンである。

【図15】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の６つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列を示す。四角は変異導入箇所である。

【図16】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の５つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。四角は変異導入箇所であり、下線はクローニング用の制限酵素認識部位、太字は終止コドンである。

【図17】Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素の５つのアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列を示す。

【図18】精製したＤ型アミノ酸脱水素酵素をタンパク質染色及び活性染色に供した結果を示す。レーン１はタンパク質染色、レーン２は基質にＤ−アラニンを用いた場合の活性染色、レーン３は基質にＬ−アラニンを用いた場合の活性染色の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

酵素は、Ｄ型アミノ酸を可逆的に脱水素する活性を有することが好ましい。尚、本書では、Ｄ型アミノ酸を「Ｄ−アミノ酸」又は「Ｄアミノ酸」とも表記する。Ｄ型アミノ酸とは、不斉炭素を有するアミノ酸の光学異性体である。本書において、Ｄ型アミノ酸には、分子内にＬ型とＤ型の両方の構造を有するｍｅｓｏ型アミノ酸（例えば、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸）も含まれる。一実施形態において、Ｄ型アミノ酸はｍｅｓｏ型ではない（Ｌ型が実質的に存在しない）Ｄ型アミノ酸であることが好ましい。

【0009】

Ｄ型アミノ酸を可逆的に脱水素するとは、Ｄ型アミノ酸を対応するオキソ酸に変換する反応とオキソ酸を対応するＤ型アミノ酸に変換する反応の両方を触媒することを意味する。この反応を式で表せば次のとおりである。

Ｄ−アミノ酸＋ＮＡＤ(Ｐ)^＋＋Ｈ_２Ｏ⇔２−オキソ酸＋ＮＨ_４^＋＋ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ＋Ｈ^＋

【0010】

例えば、Ｄ型アミノ酸がｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の場合、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸をＬ−２−アミノ−６−オキソピメリン酸に変換する反応、及び、Ｌ−２−アミノ−６−オキソピメリン酸をｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸に変換する反応の両方を触媒する。このような酵素を「ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素」と称することもできる。一実施形態において、酵素は、少なくともオキソ酸のＤ型アミノ酸への変換を触媒する活性を有することが好ましい。即ち、一実施形態において、酵素は必ずしもＤ型アミノ酸をオキソ酸に変換する活性を有する必要はない。

【0011】

酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれとの同一性が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％、９１％以上、９２％以上、９３％条、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上％以上であるアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号２は、Ｎｕｍｉｄｕｍ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列である。

【0012】

アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｐを用い、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０、Ｆｉｌｔｅｒは全てＯＦＦにして、ＭａｔｒｉｘにＢＬＯＳＵＭ６２を用い、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ、及びＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１、０．８５（デフォルト値）にして、他の各種パラメーターもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。

【0013】

酵素は、配列番号２のアミノ酸配列における６番目〜１７番目、１９番目、２３番目、２７〜３５番目、３７番目、４８番目、５４番目、６２番目、６４番目、６５番目、６８番目〜７０番目、７３番目、７５番目、８４番目、９０番目〜９５番目、９７番目、１００番目、１０７番目、１０８番目、１１０番目、１１１番目、１１５番目、１１７番目〜１２７番目、１３０番目、１３１番目、１３３番目、１３９番目、１４６番目、１４７番目、１４９番目、１５０番目、１５２番目〜１５８番目、１６０番目〜１６２番目、１６４番目、１６６番目〜１７２番目、１７４番目〜１７６番目、１８２番目、１８４番目、１８７番目、１８８番目、１９１番目、１９３番目〜１９５番目、１９９番目〜２０１番目、２０３番目、２０５番目、２０７番目、２０９番目、２１３番目、２１４番目、２１６番目、２１９番目、２２７番目、２２８番目、２３０番目、２３１番目、２３４番目、２３８番目、２４０番目、２４１番目、２４５番目、２４６番目、２４８番目、２５０番目、２５２番目〜２５４番目、２５６番目、２５７番目、２５９番目〜２６２番目、２６５番目、２６６番目、２６９番目、２７０番目、２７１番目、２７３番目、２７５番目、２７７番目、２７８番目、２８０番目〜２８４番目、２９１番目、２９３番目、３００番目、及び３０２番目から成る群から選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。ここで、「１以上のアミノ酸残基」とは、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、９５以上、１００以上、１０５以上、１１０以上、１１５以上、１２０以上、１２５以上、１３０以上、１３５以上、１４０以上、又は１４５であることが好ましい。

【0014】

一実施形態において、酵素は、配列番号２のアミノ酸配列における１０〜１４番目、１６番目、２７〜２９番目、３１番目、３７番目、５４番目、６９番目、９０番目、９２番目、９５番目、９７番目、１２１番目、１２３番目〜１２７番目、１３０番目、１３３番目、１４７番目、１５０番目、１５２番目、１５４番目、１５６番目、１５８番目、１６０番目、１６４番目、１６６番目、１６７番目、１７０番目、１７４番目、１７６番目、１８２番目、１８４番目、１８８番目、１９４番目、１９５番目、２０３番目、２０７番目、２０９番目、２１６番目、２３０番目、２３１番目、２３８番目、２５６番目、２５７番目、２６０番目、２６６番目、２７０番目、２７１番目、２７７番目、２８０番目、及び２９１番目から成る群から選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。ここで「１以上のアミノ酸残基」は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、又は６０のアミノ酸残基であり得る。一実施形態において、前記特定のアミノ酸残基のより多くのアミノ酸残基を有することが好ましい。

【0015】

好適な一実施形態において、酵素は、更に配列番号２のアミノ酸配列における７番目、９番目、１５番目、１７番目、２３番目、３０番目、３４番目、４８番目、６２番目、６４番目、６５番目、６８番目、７３番目、７５番目、８４番目、９１番目、９３番目、９４番目、１００番目、１０７番目、１０８番目、１１１番目、１１８〜１２０番目、１３１番目、１３９番目、１４６番目、１４９番目、１５３番目、１６１番目、１６２番目、１６８番目、１７１番目、１７５番目、１８７番目、１９１番目、１９９番目、２００番目、２０５番目、２１３番目、２１９番目、２２８番目、２４０番目、２４５番目、２４６番目、２５０番目、２５２番目、２５４番目、２５９番目、２６１番目、２６５番目、２７１番目、２７３番目、２８１番目〜２８４番目、及び３０２番目から成る群より選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。ここで「１以上のアミノ酸残基」とは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、又は６０のアミノ酸残基であり得る。一実施形態において、前記特定のアミノ酸残基のより多くのアミノ酸残基を有することが好ましい。

【0016】

より好適な一実施形態において、酵素は、更に配列番号２のアミノ酸配列における６番目、８番目、１９番目、３２番目、３３番目、７０番目、１１０番目、１１７番目、１２２番目、１６９番目、１７２番目、１９３番目、２０１番目、２１４番目、２２７番目、２４１番目、２４８番目、２５３番目、２６２番目、２７５番目、２７８番目、２９３番目、及び３００番目から成る群より選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。ここで「１以上のアミノ酸残基」は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、又は２５のアミノ酸残基であり得る。

【0017】

一実施形態において、酵素は、配列番号２のアミノ酸配列において、下記表１のアミノ酸残基の置換の１以上を有していてもよい。ここで「１以上」とは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、又は８５であり得る。

【0018】

【表1】

【0019】

表１において、「位置」とは、配列番号２におけるアミノ酸残基の位置を意味する。「置換アミノ酸残基」とは、配列番号２の特定の位置のアミノ酸残基を置換することができるアミノ酸残基の種類を意味する。表１において、アミノ酸残基の種類は、アルファベット一文字表記で示されている。

【0020】

一実施形態において、アミノ酸残基の置換は、保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。

【0021】

一実施形態において、酵素は、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５、Ｍｅｔ１５５、Ｖａｌ１５９、Ｔｈｒ１７４、Ａｒｇ１８４、及びＨｉｓ２３０から成る群より選択される１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。一実施形態において、酵素は、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎから成る群より選択される１以上のアミノ酸残基の置換を有することが好ましい。ここで、「Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ」とは、１５５番目のメチオニン残基がロイシン残基に置換されていることを意味する。他の置換についても同様である。また、「１以上」とは、好ましくは２以上、３以上、４以上、５以上、又は６であり得る。Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及び／又はＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有することにより、より幅広い種類のＤ−アミノ酸及び２−オキソ酸を基質として対応するオキソ酸及びＤ−アミノ酸を生産することが可能になる。また、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ及び／又はＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有することにより、触媒効率をより高めることが可能である。

【0022】

例えば、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有することにより、酵素は、変異前と比較して、次の反応を触媒する高い活性を有する：２−オキソ−３−メチルブタン酸をＤ−バリンに変換する反応、２−オキソ−４−メチルペンタン酸をＤ−ロイシン酸に変換する反応、２−オキソ−３−メチルペンタン酸をＤ−イソロイシンに変換する反応、２−オキソ−４−（メチルチオ）ブタン酸をＤ−メチオニンに変換する反応、２−オキソブタン酸をＤ−２−アミノ酪酸に変換する反応、及び、２−オキソオクタン酸をＤ−２−アミノオクタン酸に変換する反応。従って、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素は、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−２−アミノ酪酸、及びＤ−２−アミノオクタン酸の製造に適している。また、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎだけでなく、更にＭｅｔ１５５Ｌｅｕ及びＶａｌ１５９Ｇｌｙという置換を有することにより、酵素は、次の反応を触媒する更に高い活性を有する：２−オキソ−４−メチルペンタン酸をＤ−ロイシン酸に変換する反応、２−オキソ−３−フェニルプロパン酸をＤ−フェニルアラニンに変換する反応、２−オキソ−４−（メチルチオ）ブタン酸をＤ−メチオニンに変換する反応、及び、２−オキソオクタン酸をＤ−２−アミノオクタン酸に変換する反応。

【0023】

一方、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎといった変異を有さない酵素は、次の反応を触媒する比較的高い活性を有する：２−オキソプロパン酸をＤ−アラニンに変換する反応、２−オキソブタン二酸をＤ−アスパラギン酸に変換する反応、及び２−オキソグルタル酸をＤ−グルタミン酸に変換する反応。従って、上述の特定の変異（置換）を有さない酵素は、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン酸、及びＤ−グルタミン酸の製造に好適である。

【0024】

一実施形態において、酵素は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５、Ａｓｐ１２５、Ｍｅｔ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ｔｈｒ１７４、Ａｒｇ１８４、及びＨｉｓ２３０から成る群より選択される１以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。「１以上」とは、好ましくは２以上、３以上、４以上、５以上、６以上又は７であり得る。これらの１以上のアミノ酸残基を有すること（維持すること）により、後述するｋ_ｃａｔ（ｍｉｎ^−１）等に関する特性を好適に満たすと考えられる。

【0025】

酵素は、６量体であることが好ましい。６量体であるとは、酵素が活性型（活性を有する状態）のときに６個のポリペプチド（モノマー）が１個の纏まった構造を形成している状態であることを意味する。６量体は、ホモ６量体とヘテロ６量体のいずれでもよいが、ホモ６量体であることが好ましい。

【0026】

一実施形態において、酵素は、２−オキソブタン二酸からＤ−アスパラギン酸を生産する活性を有することが好ましい。このような酵素は、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、上述のＡｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎといった変異を有していても、有していなくても良い。一実施形態において、より効率的にＤ−アスパラギン酸を生産するという観点で、酵素は、前記変異を有さないことが好ましい。

【0027】

一実施形態において、酵素は、２−オキソグルタル酸からＤ−グルタミン酸を生産する活性を有することが好ましい。このような酵素は、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、上述のＡｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎといった変異を有さないことが好ましい。

【0028】

酵素は、Ｄ型アミノ酸を可逆的に脱水素する反応を触媒するための補酵素としてＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのいずれを利用することも可能であることが好ましい。ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨよりも一般的に安価に入手できる。よって、ＮＡＤＨを補酵素として利用できることは、酵素を用いたＤ型アミノ酸等の製造コストを低減する上で有意義である。

【0029】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合のｋ_ｃａｔ（ｍｉｎ^−１）が１．０×１０^４以上であることが好ましい。ｋ_ｃａｔ（ｍｉｎ^−１）は１．５×１０^４、２．０×１０^４以上、２．５×１０^４以上又は３．０×１０^４以上、３．５×１０^４以上又は３．８×１０^４以上であることが好ましい。ｋ_ｃａｔは単位時間当たりに何個の基質を触媒できるかというパラメーターである。

【0030】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合のＫ_ｍ値が４．０ ｍＭ以下、又は３．５ｍＭ以下であることが好ましい。Ｋ_ｍ値は、酵素と基質との親和性を示すパラメーターであり、その値が低いほど親和性が高く、少ない量の酵素で効率的に所望の反応を進めることができる。

【0031】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とし、ＮＡＤ^＋を補酵素とする場合のＮＡＤ^＋に対するＫ_ｍ値が１０００ｍＭ以下、９５０ｍＭ以下、又は９００ｍＭ以下であることが好ましい。このようなＫ_ｍ値を満たすことにより、酵素を用いてＤ−アミノ酸又はオキソ酸を生産するために必要となるＮＡＤ^＋の量を低減することができる。

【0032】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とし、ＮＡＤＰ^＋を補酵素とする場合のＮＡＤＰ^＋に対するＫ_ｍ値が１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、又は０．５ｍＭ以下であることが好ましい。このようなＫ_ｍ値を満たすことにより、酵素を用いてＤ−アミノ酸又はオキソ酸を生産するために必要となるＮＡＤＰ^＋の量を低減することができる。

【0033】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性ｐＨが１０．５であることが好ましい。至適活性ｐＨが１０．５とは、図５に示すように、ｐＨが９．０〜１０．０及びｐＨが１１．０〜１１．５の場合と比較してｐＨが１０．５の場合の酵素活性が高いことを意味する。

【0034】

酵素は、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする場合の至適活性温度が７５℃であることが好ましい。至適活性温度が７５℃とは、図６に示すとおり、５０℃〜７０℃及び８０℃における酵素活性と比較して７５℃における酵素活性が高いことを意味する。

【0035】

酵素は、そのポリペプチド部分（モノマー）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約３２ｋＤａであることが好ましい。「約３２ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常３２ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のポリペプチドを意味する。

【0036】

酵素は、熱安定性に優れていることが好ましい。例えば、酵素は、４０℃で３０分間保持した後の活性（ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質とする）と比較して、６０℃で３０分間保持した後の活性が、７５％以上であることが好ましい。

【0037】

酵素は、ｐＨ安定性に優れていることが好ましい。例えば、酵素は、ｐＨ５．５〜９．５の緩衝液中で３０分間保持した後の残存活性が、ｐＨ５．５の緩衝液中で３０分間保持した後の残存活性と比較して９０％以上であることが好ましい。また、酵素は、ｐＨ５．５〜１３．０の緩衝液中で３０分間保持した後の残存活性が、ｐＨ５．５の緩衝液中で３０分間保持した後の残存活性と比較して８０％以上であることが好ましい。

【0038】

酵素の由来は特に制限されない。例えば、酵素は、Ｎｕｍｉｄｕｍ属に属する微生物（例えば、Ｎｕｍｉｄｕｍ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）に由来することが好ましい。

【0039】

酵素は、結晶状態であってもよい。結晶状態の酵素は、例えば、後述する実施例に従って得ることができる。結晶状の酵素は、高純度での精製、高密度でプロテアーゼ抵抗性の強い安定な保存、固定化への利用に有用である。

【0040】

上述の酵素は、任意の手法で得ることができる。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子をそのまま(又はアミノ酸残基に変異を加えた上で)利用し、宿主細胞を形質転換し、その培養物から上記活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。また、酵素はそれを構成するポリペプチドを化学合成することによっても得ることができる。

【0041】

上述の酵素をコードするポリヌクレオチドの構造は特に制限されない。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列との同一性が６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である塩基配列を有することが好ましい。

【0042】

塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツール（例えば、ＢＬＡＳＴ等）を用いて算出することができる。ＢＬＡＳＴを用いる場合、各種パラメーターは初期条件で計算することができる。

【0043】

ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド等のいずれでもよい。ポリヌクレオチドは、単離されたものであることが好ましい。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、ｃＤＮＡであってもよい。

【0044】

ポリヌクレオチドは、任意の手法で得ることができる。例えば、配列番号１の情報を基に化学的合成法（例えば、フォスフォアミダイト法による固相合成法）により製造、取得することができる。また、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することもできる。

【0045】

ベクターは、上記酵素をコードするポリヌクレオチドを組み込んでいることが好ましい。ベクターの種類は特に制限されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。

【0046】

ベクターは、ポリヌクレオチドが宿主において発現できる限りその構成は制限されない。ベクターは、ポリヌクレオチドの発現に必要な他の塩基配列が含んでいることが好ましい。他の塩基配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、シグナル配列、エンハンサー配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。

【0047】

形質転換体は、上述の酵素をコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。このような形質転換体は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入することで得ることができる。宿主細胞は、上記ポリヌクレオチドを発現して上記酵素を生産可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、及び枯草菌等の原核細胞、酵母、カビ、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞等の真核細胞等を挙げることができる。ベクターを用いた宿主の形質転換は、常法（例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソームフェクション法）に従って行うことができる。

【0048】

上記形質転換体を培養することにより上記酵素を得ることができる。培養条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定することができる。培養後、培養液又は菌体より酵素を回収することができる。酵素を菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば、培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて単離、精製を行うことにより酵素を得ることができる。このようにして上述の酵素を低コストで大量生産することができる。

【0049】

一実施形態において酵素は熱安定性に優れる。そこで、単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して熱安定性に優れる酵素は変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。熱処理の条件は、特に限定するものではないが、例えば約５０〜６５℃で１０〜３０分間の処理とすることができる。培養液をそのまま、若しくは粗抽出液の熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活させ、効率的に目的の酵素を得ることができる。

【0050】

上述の酵素を利用することにより、Ｄ−アミノ酸を合成することができる。Ｄ−アミノ酸の合成は、例えば、基質である２−オキソ酸のアミノ化により行うことができる。ＮＡＤＰＨ（又はＮＡＤＨ）とアンモニアの存在下で、酵素を基質となる２−オキソ酸と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するＤ−アミノ酸を回収することができる。Ｄ−アミノ酸の回収は任意の手法（例えば、イオン交換樹脂を用いた方法）で行うことができる。同様に、上述の酵素を用いて、Ｄ−アミノ酸から２−オキソ酸を製造することができる。

【0051】

Ｄ−アラニンは、２−オキソプロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−アラニンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎといった変異を有さない酵素を用いることが好ましい。

【0052】

Ｄ−バリンは、２−オキソ−３−メチルブタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−バリンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有する酵素を用いることが好ましい。

【0053】

Ｄ−ロイシンは、２−オキソ−４−メチルペンタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−ロイシンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有する酵素を用いることが好ましい。

【0054】

Ｄ−イソロイシンは、２−オキソ−３−メチルペンタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−イソロイシンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有する酵素を用いることが好ましい。

【0055】

Ｄ−メチオニンは、２−オキソ−４−（メチルチオ）ブタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−メチオニンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有する酵素を用いることが好ましい。

【0056】

Ｄ−フェニルアラニンは、２−オキソ−３−フェニルプロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−フェニルアラニンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0057】

Ｄ−アスパラギン酸は、２−オキソブタン二酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−アスパラギン酸の製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有さない酵素を用いることが好ましい。

【0058】

Ｄ−グルタミン酸は、２−オキソグルタル酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−グルタミン酸の製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換を有さない酵素を用いることが好ましい。

【0059】

Ｄ−２−アミノ酪酸は、２−オキソブタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−２−アミノ酪酸の製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素を用いることが好ましい。

【0060】

Ｄ−２−アミノオクタン酸は、２−オキソオクタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−２−アミノオクタン酸の製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0061】

Ｄ−２−アミノヘプタン酸は、２−オキソヘプタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−２−アミノヘプタン酸の製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0062】

Ｄ−ノルロイシンは、２−オキソヘキサン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−ノルロイシンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0063】

Ｄ−ノルバリンは、２−オキソペンタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−ノルバリンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0064】

Ｄ−セリンは、２−オキソ−３−ヒドロキシプロピオン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−セリンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0065】

Ｄ−スレオニンは、２−３−ヒドロキシブタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−スレオニンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0066】

Ｄ−システインは、２−オキソ−３−スルファニルプロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−システインの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0067】

Ｄ−アスパラギンは、２−オキソ−３−カルバモイルプロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−アスパラギンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0068】

Ｄ−グルタミンは、２−オキソ−４−カルバモイルブタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−グルタミンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0069】

Ｄ−トリプトファンは、２−オキソ−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−トリプトファンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0070】

Ｄ−リジンは、２−オキソ−６−アミノカプロン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−リジンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0071】

Ｄ−アルギニンは、２−オキソ−５−グアニジノペンタン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−アルギニンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0072】

Ｄ−チロシンは、２−オキソ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−チロシンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【0073】

Ｄ−ヒスチジンは、２−オキソ−３−（４−イミダゾリル）プロピオン酸に上述の酵素を作用させることにより得ることができる。一実施形態において、Ｄ−ヒスチジンの製造には、配列番号２又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、及びＨｉｓ２３０Ａｓｎの置換を有する酵素、又はＴｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、及びＶａｌ１５９Ｇｌｙの置換（又は、更にＡｓｐ９５Ｓｅｒの置換）を有する酵素を用いることが好ましい。

【実施例】

【0074】

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

【0075】

［実施例１ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子のクローニングと発現ベクターの作製］
Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースを検索することによって取得可能な配列情報を基に遺伝子を合成して取得できる。

【0076】

ＧＥＮＥＷＩＺ社から配列番号1の塩基配列を有するＮ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを取得した。これを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後のＤＮＡ断片を、タンパク質発現用プラスミドのｐＥＴ−２１ａ（＋）（ノバジェン社製）の制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ）にライゲーション反応により組み込み、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。当該発現ベクターは、Ｔ７プロモーター、リポソーム結合部位の下流、Ｔ７ターミネーターの上流にＮ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を組み込むように構築した。このＤ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列（配列番号1）を図１に示す。また、配列番号1の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）を図２に示す。

【0077】

なお、この発現ベクターには、ヒスチジン-タグが含まれていない。また、他の発現ベクターにＤ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を挿入する際には、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子に終止コドン（本実施例ではＴＡＡを利用）を加えて、塩基配列以降のヒスチジン-タグを翻訳させないように塩基配列をデザインすることもできる。

【0078】

［実施例２ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の合成］
上記実施例1で得られた発現ベクターを利用して、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。これを、抗生物質アンピシリン（最終濃度 １００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地（５００ ｍＬ）に接種し、Ａ_６００＝０．６程度になるまで３７℃で振とう培養し、その後、イソプロピル−β−Ｄ（−）−ガラクトピラノシド（和光純薬社製）を最終濃度で０．１ ｍＭとなるように加え、３７℃でさらに６時間振とう培養した。

【0079】

培養液中の菌体を遠心分離によって集め、この菌体を５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。超音波破砕後に遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液を、５０℃で３０分間熱処理し、その処理酵素液を、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０陰イオン交換クロマトグラフィー（東ソー社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ疎水性クロマトグラフィー（東ソー社製）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて精製した。得られたＤ型アミノ酸脱水素酵素のタンパク質量をブラッドフォード法により測定した。

【0080】

図３に、粗酵素液、熱処理酵素液、及び各種クロマトグラフィー後に得られた活性画分と分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す。図１のレーン６より、３２ ｋＤａの位置にタンパク質のシングルバンドを確認することができ、良好な精製結果を得ることができた。

【0081】

［実施例３ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の補酵素依存性の確認］
上記実施例２で取得したＤ型アミノ酸脱水素酵素について、補酵素依存性を評価した。前記酵素の補酵素依存性は、酵素の触媒反応に起因した活性染色法により評価した。

【0082】

より詳細には、適量の酵素溶液を、ディスクゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルを、２００ ｍＭ リン酸種緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ ｍＭ ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸、０．１ ｍＭ ２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物 （ＩＮＴ）（同仁化学社製）、 ０．０４ ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩（ＰＭＳ）（同仁化学社製）及び１．２５ ｍＭの各種補酵素を含む反応液に浸して、５０℃で３０分間保温した。この反応液中の２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物が還元されて、水溶性ホルマザンを生じる。反応式を以下に示す。尚、下記の反応式では、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素を「ｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨ」と表記する。

【0083】

【化1】

【0084】

図４に、精製された酵素をタンパク質染色及び活性染色に供した結果を示す。図４の各レーンより、酵素に起因したシングルバンドが確認された。また、レーン２、３より、本酵素はＮＡＤ^＋とＮＡＤＰ^＋の両補酵素を利用することが確認された。

【0085】

［実施例４ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の触媒反応における最適ｐＨの確認］
実施例２で得られたＤ型アミノ酸脱水素酵素について、最適ｐＨを評価した。前記酵素の活性は、酵素の触媒反応で生成するＮＡＤＰＨを波長３４０ ｎｍの吸光度の増大を測定することに定量し、これを指標として、酵素活性を求めることにより測定した。

【0086】

より詳細には、適量の酵素溶液を、１０ ｍＭ ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸、１．２５ ｍＭ ＮＡＤＰ^＋を含む２００ ｍＭの各種緩衝液中で混合することにより反応液を調製した。続いて、この反応液中のＮＡＤＰ^＋からＮＡＤＰＨへの変化に伴う３４０ ｎｍの吸光度の増大を反応温度５０℃で測定することにより活性測定を行った。

【0087】

吸光度は、紫外可視分光光度計ＵＶ-１８００（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）により測定した。得られた吸光度変化と下記式を利用して、使用した酵素のタンパク質量と酵素希釈率から酵素の比活性を算出した。

【0088】

【数1】

ΔＡ３４０：３４０ ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量
Ｄ：酵素希釈率
６．２２：３４０ ｎｍにおけるＮＡＤＰＨのミリモル分子吸光係数 （Ｌ・ｍｍｏｌ^-１・ｃｍ^-１）
Ｃ：タンパク濃度 （ｍｇ／ｍＬ）
ｄ：光路長 （１ｃｍ）

【0089】

測定結果を図５に示す。この結果から、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸の脱アミノ反応における最適活性ｐＨは１０．５であることが示された。

【0090】

［実施例５ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の触媒反応における最適温度の確認］
所定温度（５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０℃）で加温した反応溶液に１．２５ ｍＭ ＮＡＤＰ^＋を添加し、直ちに吸光度の増大を測定した以外は実施例４と同様にして吸光度を測定し、相対活性を算出した。図６に、測定結果を示す。この結果から至適活性温度は、約７５℃であることが確認された。

【0091】

［実施例６ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の熱安定性の確認］
実施例２で精製したＤ型アミノ酸脱水素酵素を、１０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）中で、様々な温度条件（４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０℃）下で３０分間熱処理し、氷中に５分間静置後の残存活性を確認した。酵素活性は、実施例４に記載の方法で、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質として利用した場合のＮＡＤＰＨの生成に起因した３４０ｎｍにおける吸光度の増大により評価した。４０℃での処理における活性を１００％として、その他の温度での処理後の残存活性を相対活性として算出した。

【0092】

図７に、測定結果を示す。この結果から、当該酵素は６０℃熱処理後、約７６％の残存活性を保持することが確認された。

【0093】

［実施例７ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素のｐＨ安定性の確認］
実施例２で精製したＤ型アミノ酸脱水素酵素を、１００ ｍＭの各緩衝液（ｐＨ ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．３、１２．０、１２．３、又は１３．０）中で、５０℃で３０分間熱処理し、氷中に５分間静置後の残存活性を確認した。酵素活性は、実施例４に記載の方法で、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質として利用した場合のＮＡＤＰＨの生成に起因した３４０ｎｍにおける吸光度の増大により評価した。ｐＨ ５．５での処理における活性を１００％として、その他のｐＨでの処理後の残存活性を相対活性として算出した。

【0094】

図８に測定結果を示す。図８に示すように、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素は、ｐＨ ５．５から９．５での処理後、約９０％以上の残存活性を保持していた。

【0095】

［実施例８ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の速度論的解析］
実施例２で得られたＤ型アミノ酸脱水素酵素について、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質に、ＮＡＤＰ^＋またはＮＡＤ^＋を補酵素に用いて活性の測定を行い、速度論的解析を行った。

【0096】

反応速度パラメーターである代謝回転数（ｋ_ｃａｔ）、ミカエリ定数（Ｋ_ｍ）値及び触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）は、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ ｖｅｒ． ３．１４（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社製）を用いて、異なる基質・補酵素濃度におけるＤ型アミノ酸脱水素酵素の触媒反応の初速度を、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの時間に対するプロットから決定した後、ミカエリス・メンテン式に基づいて決定した。酵素活性は、実施例４に記載の方法で、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を基質として利用した場合のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成に起因した３４０ ｎｍにおける吸光度の増大により評価した。

【0097】

表２に、前記精製酵素の速度論的解析結果を示す。表２に示すように、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素は、ＮＡＤ^＋よりもＮＡＤＰ^＋を補酵素に利用した方が、触媒効率が高くなることが示された。

【0098】

【表2】

ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸に対するｋ_ｃａｔ、Ｋ_ｍ、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍについては、ＮＡＤＰ^＋を補酵素に用いて決定した。

【0099】

［実施例９ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の結晶化］
精製したＤ型アミノ酸脱水素酵素（濃度１７．８０ ｍｇ／ｍＬ）溶液と、１．０ Ｍ １，６−ヘキサンジオール、０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム三水和物（ｐＨ ４．６）、０．０１ Ｍ 塩化コバルト（ＩＩ）六水和物から成る結晶化溶液を同量ずつ（各々０．５ μＬ）混合した。９６穴プレート（ハンプトン・リサーチ社）を使用して、上記の結晶化溶液５０ μＬを母液とし、シッティングドロップ法での蒸気拡散を用いて、２０℃にて静置した。１日後に結晶が析出し、３日後には測定可能な大きさ（１．５×１．０×１．０ ｍｍ程度）の結晶に成長した（図９）。

【0100】

［実施例１０ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の結晶構造解析］
Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の結晶は、常温測定ではＸ線損傷により結晶が劣化し、徐々に分解能が下がるため、低温条件下での測定を行った。結晶を、３０％のグリセロールを含む結晶化溶液に移した後、９０Ｋの窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。Ｘ線回折装置 ＭＸ３００ＨＥ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｒａｙｎｏｎｉｘ社製）を用いて、１．４２Å分解能のＸ線回折データを収集し、結晶学的パラメーターを決定した。空間群はＰ２１２１２１、格子定数は、ａ＝１２８．８３Å、ｂ＝１２９．８０Å、ｃ＝１３６．３４Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°となった。非対称単位に６つの分子が含まれると仮定すれば、結晶の水分含有率は５７．７％となった。

【0101】

［実施例１１ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の立体構造決定］
得られたＸ線回折強度データと、実施例１０で取得したＤ型アミノ酸脱水素酵素の三次元構造座標を用いて、プログラムＰＨＡＳＥＲによる分子置換法を行った。Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ由来のｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨの三次元構造座標をサーチモデルとして分子置換法の計算を行った。５０．０Åから１．４２Å分解能までの構造因子を用いた計算の結果、1種類の有意な解が得られた。

【0102】

得られたその構造モデルを、プログラムＲＥＦＭＡＣ５の中の制限精密化の方法により、３０．０Åから１．４２Å分解能までのＸ線回折データを用いて精密化した結果、２９８アミノ酸残基からなるｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨのうち、Ａ、Ｂ両分子においてＶａｌ４−Ｖａｌ３０２のアミノ酸残基を同定した。またタンパク質以外の原子として、２，６０９個の水分子を同定した。精密化の最終段階で、Ｒ因子は１３．７％、Ｆｒｅｅ−Ｒ因子は１８．３％であった。更に各原子間の結合距離および結合角の理想状態からの二乗平均平方根誤差は、それぞれ０．０３Åおよび２．６６度であった。

【0103】

以上の解析により、三次元構造座標が得られた。得られた構造座標から、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の会合状態は六量体であることが確認された(図１０)。

【0104】

［実施例１２ 変異型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の合成］
Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列に対して、３種類の変異（Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ）が導入されたポリペプチドをコードするＤＮＡを合成により取得した。これを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後のＤＮＡ断片を、タンパク質発現用プラスミドのｐＥＴ−２１ａ（＋）（ノバジェン社製）の制限酵素部位（ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ）にライゲーション反応により組み込み、３変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。当該発現ベクターは、Ｔ７プロモーター、リポソーム結合部位の下流、且つ、Ｔ７ターミネーターの上流に上記３変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を組み込むように構築した。この３変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列（配列番号７）を図１２に示す。また、配列番号７の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号８）を図１３に示す。

【0105】

上記発現ベクターには、ヒスチジン-タグが含まれていない。また、他の発現ベクターにＤ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を挿入する際には、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子に終止コドン（本実施例ではＴＡＡを利用）を加えて、塩基配列以降のヒスチジン-タグを翻訳させないように塩基配列をデザインすることもできる。

【0106】

Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列に対して、６種類の変異（Ａｓｐ９５Ｓｅｒ、Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ）が導入されたポリペプチドをコードするＤＮＡを合成により取得した。さらに、上記と同様の手法により、６変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。この６変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列（配列番号９）を図１４に示す。また、配列番号９の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号１０）を図１５に示す。

【0107】

Ｎ． ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ由来のＤ型アミノ酸脱水素酵素に対して、５種類の変異（Ｍｅｔ１５５Ｌｅｕ、Ｖａｌ１５９Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１７４Ｉｌｅ、Ａｒｇ１８４Ｍｅｔ、Ｈｉｓ２３０Ａｓｎ）が導入された変異酵素の遺伝子を作製するため、上記で作製した６変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を鋳型に利用して、タカラバイオ社製の「ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」を使用し、ＰＣＲにより当該発現ベクターを作製した。ＰＣＲは、製造業者の指示に従って実行した。ＰＣＲ反応液は、以下のプライマーを各０．３μＭ、上記の鋳型ＤＮＡを５０ ｎｇ含んで調製した。

【0108】

５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＡＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＡＣ−３’
（配列番号１１）
５’−ＧＴＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＴＧＴＣＧＡＣＣＧ−３’
（配列番号１２）

【0109】

ＰＣＲ後、反応液にＤｐｎＩを２μＬ加えて３７℃で１時間処理し、処理後の溶液を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換細胞を、抗生物質アンピシリン（最終濃度 １００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地プレート上に塗布し、３７℃で１６時間培養した。生成したコロニーを採取し、アンピシリンを含むＬＢ培地で一晩震とう培養した。遠心分離により、培養液から菌体を回収後、５変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素／ｐＥＴ−２１ａ（＋）をＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯＮＥＥＲ）を利用して、製造元のプロトコールに従って回収した。この５変異導入型Ｄ型アミノ酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１３）を図１６に示す。また、配列番号１３の塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号１４）を図１７に示す。

【0110】

上記で得られた各種の発現ベクターまたはＤ型アミノ酸脱水素酵素／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を利用して、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株をそれぞれ形質転換した。これらを、アンピシリンを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＬＢ 培地（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）２５０ ｍＬに接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。

【0111】

培養液中の菌体を遠心分離によってそれぞれ回収し、各菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。超音波破砕後に遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液を、５０℃で３０分間熱処理し、その処理酵素液を、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０陰イオン交換クロマトグラフィー（東ソー社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ疎水性クロマトグラフィー（東ソー社製）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて精製した。得られた各種の精製酵素のタンパク質量をブラッドフォード法により測定した。

【0112】

［実施例１３ Ｄ型アミノ酸脱水素酵素の光学活性の確認］
上記実施例２で取得したＤ型アミノ酸脱水素酵素について、光学活性を評価した。なお酵素の光学活性は、酵素の触媒反応に起因した活性染色法により評価した。より詳細には、適量の酵素溶液を、ディスクゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルを、２００ ｍＭ リン酸種緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ ｍＭ Ｄ−アラニンまたはＬ-アラニン、０．１ ｍＭ ２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物 （ＩＮＴ）（同仁化学社製）、 ０．０４ ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩（ＰＭＳ）（同仁化学社製）及び１．２５ ｍＭのＮＡＤＰ^＋を含む反応液に浸して、５０℃で３０分間保温した。この反応液中の２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩化物が還元されて、水溶性ホルマザンを生じる。反応式を以下に示す。尚、下記の反応式では、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素を「ｍｅｓｏ−ＤＡＰＤＨ」と表記する。

【0113】

【化2】

【0114】

図１８に、精製されたＤ型アミノ酸脱水素酵素をタンパク質染色及び活性染色に供した結果を示す。図１８のレーン１と２より、酵素に起因したシングルバンドが確認された。また、レーン２より、本酵素はＤ−アミノ酸に選択的に作用することが確認された。また、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素は可逆的にＤ−アミノ酸の脱アミノ反応を触媒する。従って、Ｄ型アミノ酸脱水素酵素は、２−オキソ酸のアミノ化により、Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を合成することが確認された。

【0115】

［実施例１４ 各種酵素のＤ-アミノ酸合成活性の確認］
実施例２及び１２で得られた各種酵素のＤ-アミノ酸合成活性の測定を行い、各種変異導入が、Ｄ-アミノ酸の合成活性に及ぼす影響を検討した。前記酵素の活性は、酵素の触媒反応で減少するＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを波長３４０ ｎｍの吸光度の減少を測定することに定量し、これを指標として、酵素活性を求めることにより測定した。より詳細には、適量の酵素溶液を、５ ｍＭ ２−オキソ酸、０．１ ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、２００ ｍＭ 塩化アンモニウムを含む２００ ｍＭのグリシン−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）中で混合することにより反応液を調製した。続いて、この反応液中のＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）^＋への変化に伴う３４０ ｎｍの吸光度の減少を反応温度５０℃で測定することにより活性測定を行った。吸光度は、紫外可視分光光度計 ＵＶ−１８００（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）により測定した。得られた吸光度変化と実施例４で使用した式と同じ式を利用して酵素活性を測定し、また使用した酵素のタンパク質量と酵素希釈率から酵素の比活性を算出した。表３に、各種酵素のＤ-アミノ酸合成活性をそれぞれ示す。

【0116】

【表3】

【0117】

表１の結果から、変異導入前のＤ型アミノ酸脱水素酵素は、種々の２−オキソ酸を基質に利用して、分岐鎖Ｄ-アミノ酸や含硫Ｄ-アミノ酸、酸性Ｄ-アミノ酸、芳香族Ｄ-アミノ酸等の様々な種類のＤ-アミノ酸を合成することが確認された。またＤ型アミノ酸脱水素酵素に対して変異を導入することで、分岐鎖Ｄ-アミノ酸や含硫Ｄ-アミノ酸を合成する活性を３０倍程度まで上昇させることが確認された。更に、変異導入前の酵素では活性が検出されなかったＮＡＤＨ依存的なＤ-アミノ酸の合成活性の新たな発現が確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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