特許 6695896 Ｌ−フコースの生体触媒生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6695896

(24)【登録日】2020年4月24日

(45)【発行日】2020年5月20日

(54)【発明の名称】Ｌ−フコースの生体触媒生産

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/02 20060101AFI20200511BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20200511BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20200511BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20200511BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20200511BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20200511BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/02

   C12N15/53

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   !C12N9/02

【請求項の数】17

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-550162(P2017-550162)

(86)(22)【出願日】2016年2月19日

(65)【公表番号】特表2018-509169(P2018-509169A)

(43)【公表日】2018年4月5日

(86)【国際出願番号】EP2016053591

(87)【国際公開番号】WO2016150629

(87)【国際公開日】20160929

【審査請求日】2019年2月19日

(31)【優先権主張番号】15160945.0

(32)【優先日】2015年3月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】508020155

【氏名又は名称】ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ナヴィクカス，ヴァイドタス

(72)【発明者】

【氏名】ブロイアー，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】プール，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ヴァインガルテン，メラニー

(72)【発明者】

【氏名】バルデニウス，カイ−ウーヴェ

(72)【発明者】

【氏名】ジーゲル，ヴォルフガング

【審査官】 清野 千秋

(56)【参考文献】

【文献】 Carbohydrate Research，２００９年，344，14-20

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １９／０２

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／５３

Ｃ１２Ｎ ９／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

L-フコースを生産する方法であって、以下のステップ：
(a)L-フシトールを提供するステップ、
(b)酵素クラスEC1.1.3.9のガラクトースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びカタラーゼを提供するステップ、
(c)ガラクトースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びカタラーゼを用いて、得られた混合物をL-フシトールのL-フコースへの生体触媒酸化を可能にする条件下でインキュベートして、L-フシトールを酸化するステップ、
を含む、方法。

【請求項2】

(d)合成したL-フコースを単離するステップ、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ(b)が、以下のサブステップを含む又は以下のサブステップからなる、請求項１又は２に記載の方法：
(b1)酵素クラスEC1.1.3.9のガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための組換え微生物又は真菌を提供するステップであって、微生物又は真菌は、フザリウム属(Fusarium)から選択される真菌、フザリウム・オキシスポルム種(Fusarium oxysporum)を含む、ボタンタケ目(Hypocreales)の真菌から選択される真菌に由来するガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、ステップ、
(b2)ガラクトースオキシダーゼの合成を可能にする条件下で組換え微生物を培養するステップ。

【請求項4】

(b3)合成されたガラクトースオキシダーゼを単離するステップ、をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

組換え微生物又は真菌が、大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)、大腸菌W3110(E. coli W3110)、及びその子孫を含む大腸菌種(Escherichia coli spp.)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫を含むバシラス属種(Bacillus spp.)、サッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、サッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、コマガタエラ(Komagataella)属のもの、ハンゼヌラ(Hansenula)、ピキア属種(Pichia spp.)、P. パストリス(P. pastoris)、及びその子孫を含むサッカロマイセテス(Saccharomycetes)、K. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫を含むクルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、A. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)、A. ニガー(A. niger)、及びその子孫を含むアスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、又は、T. リーゼイ(T. reesei)、T. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫を含むトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、並びに、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)を含む子嚢菌門(Ascomycota)の真菌及びその子孫からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

ペルオキシダーゼが、西洋ワサビ(Armoracia rusticana)由来のペルオキシダーゼを含む、酵素クラスEC1.11.1.7からなる群のペルオキシダーゼから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

カタラーゼが、ウシ(Bos taurus)由来のカタラーゼを含む、酵素クラスEC1.11.1.6からなる群のカタラーゼから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のL-フシトールの濃度が、1〜500g/Lの範囲である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のガラクトースオキシダーゼの濃度が、0.005〜6.25g/Lの範囲である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のペルオキシダーゼの濃度が、0〜0.5g/Lの範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のカタラーゼ濃度が、0〜0.4g/Lの範囲である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

組換え微生物又は真菌であって、該微生物又は真菌は、請求項３に定義されるようにフザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、請求項６に定義されるようなペルオキシダーゼ及び請求項７に定義されるようなカタラーゼから選択される導入遺伝子をさらに含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)、大腸菌W3110(E. coli W3110)、及びその子孫を含む大腸菌種(Escherichia coli spp.)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫を含むバシラス属種(Bacillus spp.)、サッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、サッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、コマガタエラ(Komagataella)属のもの、ハンゼヌラ(Hansenula)、ピキア属種(Pichia spp.)、P. パストリス(P. pastoris)、及びその子孫を含むサッカロマイセテス(Saccharomycetes)、K. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫を含むクルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、A. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)、A. ニガー(A. niger)、及びその子孫を含むアスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、又は、T. リーゼイ(T. reesei)、T. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫を含むトリコデルマ属種(Trichoderma spp.) 、並びに、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)を含む子嚢菌門(Ascomycota)の真菌及びその子孫からなる群から選択され、該組換え微生物又は真菌は、機能的形態で導入遺伝子を発現することができる、組換え微生物又は真菌。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法における、請求項１２に記載の組換え微生物又は真菌の使用。

【請求項14】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法におけるガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための、組換え微生物又は真菌の使用であって、該微生物又は真菌は、請求項３に定義されるようにフザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)、大腸菌W3110(E. coli W3110)、及びその子孫を含む大腸菌種(Escherichia coli spp.)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫を含むバシラス属種(Bacillus spp.)、サッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、サッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、コマガタエラ(Komagataella)属のもの、ハンゼヌラ(Hansenula)、ピキア属種(Pichia spp.)、P. パストリス(P. pastoris)、及びその子孫を含むサッカロマイセテス(Saccharomycetes)、K. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫を含むクルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、A. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)、A. ニガー(A. niger)、及びその子孫を含むアスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、又は、T. リーゼイ(T. reesei)、T. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫を含むトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、又は子嚢菌門(Ascomycota)の真菌又はその子孫からなる群から選択され、該組換え微生物又は真菌は、機能的形態で導入遺伝子を発現することができる、使用。

【請求項15】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法におけるL-フシトールのL-フコースへの生体触媒変換のための、ガラクトースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びカタラーゼの使用。

【請求項16】

ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼは、以下のステップを含む方法によって得られる、請求項１５に記載の使用：
(a)ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼの組換え発現のための組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物はフザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼをコードするさらなる導入遺伝子を含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)、大腸菌W3110(E. coli W3110)、及びその子孫を含む大腸菌種(Escherichia coli spp.)、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫を含むバシラス属種(Bacillus spp.)、サッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、サッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、コマガタエラ(Komagataella)属のもの、ハンゼヌラ(Hansenula)、ピキア属種(Pichia spp.)、P. パストリス(P. pastoris)、及びその子孫を含むサッカロマイセテス(Saccharomycetes)、K. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫を含むクルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、A. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)、A. ニガー(A. niger)、及びその子孫を含むアスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、又は、T. リーゼイ(T. reesei)、T. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫を含むトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、並びに、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)を含む子嚢菌門(Ascomycota)の真菌及びその子孫からなる群から選択される、又は
(b1)ガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための第1の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、フザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、及び
(b2)ペルオキシダーゼの組換え発現のための第2の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、請求項６に定義されるようなペルオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、及び/又は、
(b3)カタラーゼの組換え発現のための第3の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、請求項７に定義されるようなカタラーゼをコードする導入遺伝子を含む、
(c)ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼの合成を可能にする適切な条件下で組換え微生物を培養するステップ。

【請求項17】

(d)合成されたガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼを単離するステップ、をさらに含む、請求項１６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、L-フシトールからのL-フコースの生体触媒的、すなわち酵素的及び/又は発酵的生産のための方法に関する。本発明はさらに、L-フシトールからのL-フコースの生体触媒生産に適した酵素、特にガラクトースオキシダーゼを開示する。さらに、L-フシトールからL-フコースを生産するための酵素に必要とされる、導入遺伝子として発現可能な核酸配列を有し、これを機能的に発現することができる組換え微生物及び真菌が開示され、本発明に係る方法におけるこれらの微生物又は真菌の使用も開示される。

【背景技術】

【0002】

フコースは、L-フコース(イソズルシトールとも呼ばれる)及びD-フコース(CAS3615-37-0)の2つのエナンチオマー形態で生じる。L型は天然に広く存在する。L-フコースは、研究開発に使用するための基本分子であり、グリカン構造の特徴的な成分である。フコシル化物質の分野における科学的調査は、とりわけ、これらが胚発生において非常に重要であり、生物の免疫応答に関与していることを示している。

【0003】

L-フコースは、とりわけ、ヒト母乳中に見出される。ヒト母乳は、健康な子供の発達に重要な役割を果たす。その中に存在する物質、特にオリゴ糖(ヒト乳オリゴ糖(HMO))は、母乳の不可欠な主要成分の1つであり、還元末端にラクトース単位を有し、N-アセチルラクトサミン単位によって分岐状又は鎖状の様式で伸長されるコア構造を有する。とりわけ、末端位置でのフコシル修飾によって構造的可変性が拡張される。健康及び発達の影響に関して、HMOの生物学的機能は多くの研究の対象であるが、これは、十分な量における化合物の技術的純度を要する。現在、L-フコースは、天然源からの直接的抽出によって、又は単糖類の化学的改変によって提供される(要約について、P. T. Vanhooren et al. J. Chem. Technol. Biotechnol. 74, 479 (1999)及びそこに引用されたソースを参照)。現在、母乳からの労力のかかる抽出が、最も広く使用される方法である。HMOのための生物工学的生産プロセスが記載されているが(Han et al., Biotechnol. Adv. 2012, 30, 1268-1278を参照)、対応するHMOは、しばしば妥当な価格で入手できない。

【0004】

L-フコース及びL-フコース含有物質は、進行中の研究の対象である。L-フコース自体及びフコシル化物質は、化学及び製薬産業において重要な出発材料であり、化粧品及び栄養補助食品の製造にも有用である。したがって、工業的規模でのL-フコースの生産のための革新的な生産プロセスが引き続き必要とされている。

【0005】

L-フコースを得るための生物工学的方法が提案されている。例えば、WO2012/034996A1は、発酵によるL-フコースの生産のための、配列番号1の特定の16S rRNAを有する腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の単離された微生物(DSM 22227として寄託されている)を用いてL-フコースを生産する方法を教示している。しかし、L-フコースは、時間のかかる発酵の後に、精製されていない混合物としてのみ得られ、このため、L-フコースを得るために手間がかかるさらなる精製工程が必要である。US8,642,297B2は、とりわけ、セロリ(Apium graveolens)由来の組換えマンニトール-1-デヒドロゲナーゼを用いてL-フコースを生産することを意図した一般的な発酵プロセスを主張している。しかし、具体的な実施例も例示も開示されていない。さらに、反応に使用できる代替酵素は開示されていない。WO2005/087941A1は、L-フコースを提供するための組み合わせた発酵的-酵素的方法を開示する。この目的のために、アセトバクテリウム(Acetobacterium)のデヒドロゲナーゼを使用することにより、L-フクロースがL-フシトールから最初に生産される。次いで、L-フコースを与えるためのさらなる工程においてこれを合成しなければならない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】WO2012/034996A1

【特許文献2】US8,642,297B2

【特許文献3】WO2005/087941A1

【非特許文献】

【0007】

【特許文献1】P. T. Vanhooren et al. J. Chem. Technol. Biotechnol. 74, 479 (1999)

【特許文献2】Han et al., Biotechnol. Adv. 2012, 30, 1268-1278

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、工業的に使用可能なプロセスにおいて、可能な限り少ない工程で、十分な純度のL-フコースを経済的に製造できることが依然として強く求められている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、本発明の目的は、L-フコースを工業的規模で一段階反応でL-フシトールから直接得ることができる、L-フコースの生物工学的生産方法、及びこの目的に適した酵素、並びに組換え微生物及び真菌を提供することである。

【0010】

本発明は、L-フシトール及びガラクトースオキシダーゼ及びさらに場合により、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼから選択されるさらなる酵素を用いる方法を提供することによってこの目的を達成し、これにより、L-フシトールのL-フコースへの変換を一段階反応で実施でき、この場合、高収率を達成することができる。この目的に適した酵素もまた開示される。最後に、開示された合成経路のための関連酵素を生産することができる組換え微生物若しくは真菌、並びにその使用も開示される。

【0011】

本発明の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例、図面、並びに添付の特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図1は、L-フコースを与えるためのL-フシトールを介したガラクトースの反応経路を示し、ここで、L-フシトールの酸化工程はガラクトースオキシダーゼによって生じる。

【図2】図2は、経時的なガラクトースオキシダーゼを用いたL-フシトールのL-フコースへの変換に対する基質濃度の影響を示す。

【図3】図3は、経時的なガラクトースオキシダーゼを用いたL-フシトールのL-フコースへの変換に対するH₂O₂の影響を示す。

【図4】図4は、経時的なガラクトースオキシダーゼを用いたL-フシトールのL-フコースへの変換に対するL-フコースの影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

定義
タンパク質、ポリペプチド及び酵素という用語は、本明細書に開示されるポリペプチドの一定の酵素機能のために交換可能に使用される。

【0014】

生体触媒の(biocatalytic)又は生体触媒作用(biocatalysis)という用語は、本明細書で使用される場合、酵素が生物学的触媒として働く化学反応の反応並びに促進若しくは制御を指す。生体触媒作用は、単離された酵素の添加によって(酵素的)、又は生細胞において直接的に(ここでは発酵的)、行うことができる。

【0015】

組換え微生物又は真菌という用語は、本明細書で使用される場合、組換えの、すなわち(部分的に)人工の目的生体分子を含む微生物又は真菌を指し、ここで、生体分子は核酸配列又はポリペプチド配列であり得る。さらに、選択された微生物又は真菌株は、目的生体分子の核酸配列に関係しない、非改変又は野生型株と比較した、そのゲノム又は封入化プラスミドDNAにおける変異を有することができる。

【0016】

導入遺伝子という用語は、本明細書で使用される場合、別の種のゲノムに直接導入されたか、又はゲノムの外側のベクターによって導入されたが、他の種において複製可能な、ある種の核酸分子を指す。このように改変された生物は、本明細書において組換え体と称される(上記参照)。

【0017】

子孫という用語は、本明細書で使用される場合、性的及び無性的を含む増殖の自然生殖プロセスによって起源生物から生じる、本開示に係る組換え微生物又は真菌の背景におけるそのような生物の子孫を指す。生殖の過程で、変異が生物のゲノムに自然に導入され得、それによって子孫は親生物とゲノム的に異なるが、依然として同じ(亜)種に割り当てられ得ることは、当業者に知られている。したがって、自然のプロセスによって改変されたそのような子孫もまた、本開示に係る子孫という用語に包含される。

【0018】

ベクターという用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子を細胞、微生物又は真菌に移入するための輸送媒体を指す。ベクターは、とりわけ、プラスミド、コスミド又は改変ウイルスであり得る。さらに、ベクターという用語はまた、ポリペプチドを細胞又は微生物に直接導入するのに適した手段を包含することを意図している。

【0019】

「機能的形態で発現する」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え微生物又は真菌が、上に定義されるように、ガラクトースオキシダーゼ、カタラーゼ及びペルオキシダーゼからなる群から選択される1つ以上の導入遺伝子を翻訳し、適切な反応条件下で、上記のガラクトースオキシダーゼ、カタラーゼ又はペルオキシダーゼの酵素的機能を満たすポリペプチドを形成することができる能力を指す。

【0020】

発明の詳細な説明
一態様では、本発明は、L-フコースを生産する方法であって、以下のステップ：(a)L-フシトールを提供するステップ、(b)酵素クラスEC1.1.3.9のガラクトースオキシダーゼ及び場合により1つ以上のさらなる成分を提供するステップ、(c)ガラクトースオキシダーゼ及び場合によりさらなる成分を用いて、得られた混合物をL-フシトールのL-フコースへの生体触媒酸化を可能にする条件下でインキュベートし、L-フシトールを酸化するステップ、(d)場合により、合成したL-フコースを単離するステップを含む、方法を提供する。

【0021】

ガラクトースオキシダーゼ(EC1.1.3.9)は、銅依存性オキシダーゼである。それはしばしば、多くの糸状真菌によって分泌される細胞外の単量体酵素として天然に見出される。ガラクトースオキシダーゼは、第一級アルコールの対応するアルデヒドへの酸化を触媒し、一方で同時に、分子酸素はH₂O₂に還元される(Paukner, R. et al.; Galactose oxidase from Fusarium oxysporum - expression in E. coli and P. pastoris and biochemical characterization; PLoS ONE, 2014, 9, e100116/1)。ガラクトースオキシダーゼの活性は、当業者に公知の方法によって決定することができ、ここで、酸素(O₂)の還元からの過酸化水素(H₂O₂)の放出は、適切な基質(特にガラクトース)の存在下で定量される。あるいは、O₂濃度の低下はまた、ガラクトースオキシダーゼの活性の尺度である。

【0022】

この態様の一実施形態では、この方法は、以下のサブステップ：(b1)酵素クラスEC1.1.3.9のガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための組換え微生物又は真菌を提供するステップであって、微生物又は真菌は、ボタンタケ目(Hypocreales)の真菌、好ましくはフザリウム属(Fusarium)から選択される真菌、特にフザリウム・オキシスポルム種(Fusarium oxysporum)に由来するガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、ステップ、(b2)ガラクトースオキシダーゼの合成を可能にする条件下で組換え微生物を培養するステップ、(b3)場合により、合成されたガラクトースオキシダーゼを単離するステップを含む。本開示に係るフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)由来の好ましいガラクトースオキシダーゼは、681個のアミノ酸を含むポリペプチド(GenBank(登録商標)寄託番号: AHA90705.1)である。コード配列の対応する核酸配列(停止コドンを含む2046ヌクレオチド)は、寄託番号KF601698.1としてGenBank(登録商標)においてアクセス可能である。

【0023】

酵素が、同時に分子酸素をH₂O₂に還元しながら、第一級アルコールを対応するアルデヒドに酸化する上記の機能を触媒する限り、同等の触媒活性によって定義される酵素クラス1.1.3.9の任意の酵素を、本発明に係る方法に使用し得ることは、当業者には知られている。同様に、反応条件が、使用される酵素に依存して変化し得ることが当業者に知られている。反応及び/又は培養条件の調節は、当業者によって容易に行われ得る。

【0024】

この態様の一実施形態では、1つ以上の選択的なさらなる成分が、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼからなる群から選択される。

【0025】

本発明の任意の態様によれば、L-フシトールから出発するL-フコースの生体触媒回収は、ガラクトースオキシダーゼ及び場合によりさらにペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼの使用によって教示される。本発明の全ての態様によるこれらの生体触媒反応は、完全に酵素的に、酵素的及び発酵的に、又は専ら発酵によって行うことができる。この文脈における酵素的とは、単離され、場合により精製され、さらに改変された酵素の使用を意味する。この文脈における発酵的とは、機能的形態での酵素の発現を可能にする適切な反応条件下での組換え宿主生物における1つ以上の標的酵素の発現を意味する。

【0026】

ガラクトースオキシダーゼを用いたL-フシトールのL-フコースへの変換反応が酸素依存的反応であるという事実のために、本発明の全ての態様及び実施形態によれば、反応物が常に酸素と十分に接触することが提供される。この酸素供給は、当業者に周知の手段、例えば、培養又は反応バッチのガス処理又はエアレーションによる通気によって行うことができる。

【0027】

既に言及したように、1つ以上の選択的なさらなる成分が、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼからなる群から選択される場合、好ましい。カタラーゼは、全体の式：2 H₂O₂→O₂ + 2 H₂Oの反応を触媒し、したがって、ガラクトースオキシダーゼのL-フシトールとの反応において副産物H₂O₂が形成される。西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼは、過酸化物の還元を触媒する酵素である。触媒反応の全体的な式はまた、2 H₂O₂→O₂ + 2 H₂Oである。ペルオキシダーゼの基質特異性は著しく変化し得る。西洋ワサビペルオキシダーゼは、広範囲のドナー及びアクセプターを有するこの酵素クラスの代表的な例である。本発明における使用のために、適切な反応条件下でH₂O₂の酸素及び水への分解を触媒することができる任意のカタラーゼ又はペルオキシダーゼが適している。

【0028】

とりわけガラクトースオキシダーゼの活性によって形成されたH₂O₂は、これらの追加のH₂O₂解毒酵素の活性によって除去され、したがって、L-フコースの収率を高めることができるので、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼの添加は、L-フシトールのL-フコースへの変換に有利に影響することが見出されている。一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼに加えて、カタラーゼ又はペルオキシダーゼのいずれかが使用される。好ましい実施形態では、ガラクトースオキシダーゼに加えて、カタラーゼ及びペルオキシダーゼの両方が使用される。後者の実施形態の有利な結果が図3に示されている。

【0029】

一実施形態では、ペルオキシダーゼは、酵素クラスEC1.11.1.7からなる群のペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビ(Armoracia rusticana)由来のペルオキシダーゼから選択される。西洋ワサビペルオキシダーゼは、商業的に購入することができ(SIGMA-ALDRICH、例えば製品番号: P8250)、又は組換え生産することができる。GenBankにおける寄託番号は、西洋ワサビ(Armoracia rusticana)由来の酵素について、核酸配列のmRNAについてはX57564.1又はポリペプチド配列についてはCAA40796.1である。

【0030】

本発明の第1の態様によるさらなる実施形態では、カタラーゼは、酵素クラスEC1.11.1.6からなる群のカタラーゼ、特にウシ(Bos taurus)由来のカタラーゼから選択される。

【0031】

一実施形態では、カタラーゼは、酵素クラスEC1.11.1.6のウシ肝臓カタラーゼ(供給元、例えばSIGMA ALDRICH、製品番号: C30)であり、これは直接的酵素変換に適している。組換え発現のために、例示的なウシ肝臓カタラーゼの核酸配列は、NCBI参照配列NM_001035386.2(mRNA)として公に入手可能であり、対応する翻訳されたポリペプチド配列は、NCBI参照配列NP_001030463.1として公に入手可能である。

【0032】

同様に、本発明に係る酵素の発酵による生成の全ての態様において、上記で定義されたデータベース配列と、少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列相同性を有するガラクトースオキシダーゼ及び/又はペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼ配列が提案され、ここで、核酸又はポリペプチド配列は、翻訳されたポリペプチドが依然として野生型参照配列の機能を果たす限り、コドン最適化されていてもよく、又は標的化点変異を含んでいてもよい。酵素の核酸配列及びしたがってポリペプチド配列を適合させるためのそのような改変は、当業者に周知であり、とりわけ、発現のために選択された組換え宿主生物のコドン使用に配列を適合させるために、酵素の安定性又は機能を最適化するために、及びまた、選択された宿主生物についての酵素生成物の収率を増加させる若しくは細胞毒性を低下させるために、使用される。

【0033】

さらに、本開示の核酸又はポリペプチド配列は、翻訳されたポリペプチド配列の精製又は検出を可能にする標識配列(「タグ」)を担持することができ、融合分子としてタグを有して翻訳される。そのようなタグ及びそれらの配列並びに標的配列の改変のための方法は、当業者に周知であり、ストレプトアビジンタグ、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグ、フラッシュタグ、組換えポリペプチドの培養上清中への分泌を媒介するタグなどの配列が挙げられる。

【0034】

本発明の一実施形態では、第1の態様によるステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のガラクトースオキシダーゼの濃度は、0.005〜6.25g/Lの範囲であり、好ましくは0.005〜3.2g/Lの範囲であり、より好ましくは0.005〜0.5g/Lの範囲であり、特に好ましくは0.005〜0.05g/Lの範囲である。使用されるガラクトースオキシダーゼの濃度は、使用される具体的な酵素及びまたその具体的な酵素活性に依存することが当業者に知られている。酵素活性は、2つの可能な単位: (1)ユニット(1酵素ユニット)=1μmol基質 分^-1、又はカタールにおけるSIユニット(kat)=1mol基質 秒^-1で特定され得る。当業者には、酵素反応の速度及びしたがってまた酵素活性の近似計算は、ミカエリス・メンテン式によって知られており、そのため、目的酵素の酵素活性は適切なアッセイで容易に決定することができる。

【0035】

本発明の別の実施形態では、第1の態様によるステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のペルオキシダーゼの濃度は、0〜0.5g/Lの範囲、好ましくは0〜0.3g/Lの範囲、より好ましくは0〜0.15g/Lの範囲である。

【0036】

本発明のさらなる実施形態では、第1の態様によるステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のカタラーゼ濃度は、0〜0.4g/Lの範囲、好ましくは0〜0.2g/Lの範囲、より好ましくは0〜0.1g/Lの範囲である。

【0037】

本発明のなおさらなる実施形態では、第1の態様によるステップ(c)におけるインキュベーションの開始時の混合物中のL-フシトールの濃度は、1〜500g/Lの範囲、好ましくは5〜250g/Lの範囲、特に好ましくは20〜125g/Lの範囲である。

【0038】

本発明の任意の態様による一実施形態では、組換え微生物又は真菌は、大腸菌種(Escherichia coli spp.)、好ましくは大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)若しくは大腸菌W3110(E. coli W3110)及びその子孫、バシラス属種(Bacillus spp.)、好ましくはバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)若しくはバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫、サッカロマイセテス(Saccharomycetes)、好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、より好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、より好ましくはコマガタエラ(Komagataella)属のもの、好ましくはハンゼヌラ(Hansenula)若しくはピキア属種(Pichia spp.)、特に好ましくはP. パストリス(P. pastoris)及びその子孫、クルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、好ましくはK. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫、アスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、好ましくはA. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)若しくはA. ニガー(A. niger)、及びその子孫、又はトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、好ましくはT. リーゼイ(T. reesei)若しくはT. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫、又は子嚢菌門(Ascomycota)の真菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)、又はその子孫からなる群から選択される。

【0039】

本発明のさらなる態様によれば、組換え微生物又は真菌が提供され、ここで、該微生物又は真菌は、フザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、さらに、上で定義されるようにペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼから選択される導入遺伝子を含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌種(Escherichia coli spp.)、好ましくは大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)若しくは大腸菌W3110(E. coli W3110)及びその子孫、バシラス属種(Bacillus spp.)、好ましくはバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)若しくはバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫、サッカロマイセテス(Saccharomycetes)、好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、より好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、より好ましくはコマガタエラ(Komagataella)属のもの、好ましくはハンゼヌラ(Hansenula)若しくはピキア属種(Pichia spp.)、特に好ましくはP. パストリス(P. pastoris)及びその子孫、クルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、好ましくはK. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫、アスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、好ましくはA. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)若しくはA. ニガー(A. niger)、及びその子孫、又はトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、好ましくはT. リーゼイ(T. reesei)若しくはT. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫、又は子嚢菌門(Ascomycota)の真菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)、又はその子孫からなる群から選択され、該組換え微生物又は真菌は、機能的形態で導入遺伝子を発現することができる。

【0040】

酵素の関連における「適切な(反応)条件」という用語が、必要な基質、緩衝液条件、特に塩濃度、場合により補因子(とりわけ、補欠分子族、補酵素及び金属イオンを含む)、及びpH及び温度条件(これらは対応する酵素の活性に不可欠であるか又は活性の助けとなる)が提供されなければならないことを示すことは、当業者に周知である。ガラクトースオキシダーゼ(酸素依存性酵素)の使用の場合、これは、例えば、培養又は反応バッチのガス処理又はエアレーションによる通気を含む。本発明のすべての酵素及びそれによって触媒される反応は十分に特徴付けられているので、適切な反応条件の決定は、したがって、当業者の能力の範囲内である。

【0041】

一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子に加えて、カタラーゼをコードするさらなる導入遺伝子が、組換え微生物又は真菌に存在する。

【0042】

別の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子に加えて、ペルオキシダーゼをコードするさらなる導入遺伝子が、組換え微生物又は真菌に存在する。

【0043】

さらに別の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子に加えて、ペルオキシダーゼをコードするさらなる導入遺伝子及びカタラーゼをコードする導入遺伝子の両方が、組換え微生物又は真菌に存在する。

【0044】

それぞれの導入遺伝子の提供、組換え微生物又は真菌へのその組み込み、並びにそれぞれの導入遺伝子の転写及び翻訳を可能にする適切な培養及び反応条件の選択は、当業者に周知である。

【0045】

一実施形態では、組換え微生物又は真菌は、発酵によってL-フシトールからL-フコースを直接生産するために、培地にL-フシトールを添加することによって使用してもよく、すなわち、組換え微生物又は真菌は、上記の方法を実施するために直接使用される。この実施形態は、発酵バッチにおける、L-フコースの直接的な生産を可能にし、場合によりさらなる精製ステップが続く。

【0046】

一実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ、並びにさらにはペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼの導入遺伝子に、翻訳されたポリペプチドの培養上清中への分泌を可能にするタグを提供してもよい。これにより、培養上清からの酵素の容易な単離、又はL-フシトールの添加後のL-フシトールのL-フシトースへの変換の直接的な実施のいずれか、及び分泌された酵素がそれらの酵素機能を達成できるように反応条件の調節が可能となる。

【0047】

別の実施形態では、ガラクトースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼをコードする導入遺伝子は、1つではなく、様々な組換え微生物又は真菌で提供され、適切な培養条件下で発現され、場合により精製される。次いで、L-フコースを、適切な反応条件を提供することによってL-フシトールから得ることができるように、本明細書に記載の方法を、L-フシトールの添加後にこうして得られた酵素を用いてインビトロ又はインビボで実施することができる。

【0048】

さらなる態様において、本発明は、上述の方法におけるガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための、組換え微生物又は真菌の使用を提供し、ここで、該微生物又は真菌は、上で定義したようにフザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌種(Escherichia coli spp.)、好ましくは大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)若しくは大腸菌W3110(E. coli W3110)及びその子孫、バシラス属種(Bacillus spp.)、好ましくはバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)若しくはバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫、サッカロマイセテス(Saccharomycetes)、好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、より好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、より好ましくはコマガタエラ(Komagataella)属のもの、好ましくはハンゼヌラ(Hansenula)若しくはピキア属種(Pichia spp.)、特に好ましくはP. パストリス(P. pastoris)及びその子孫、クルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、好ましくはK. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫、アスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、好ましくはA. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)若しくはA. ニガー(A. niger)、及びその子孫、又はトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、好ましくはT. リーゼイ(T. reesei)若しくはT. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫、又は子嚢菌門(Ascomycota)の真菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)、又はその子孫からなる群から選択され、該組換え微生物又は真菌は、機能的形態で導入遺伝子を発現することができる。

【0049】

さらなる態様において、本発明は、本発明の第1の態様に係る方法におけるL-フシトールのL-フコースへの生体触媒変換のための、ガラクトースオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼから選択される少なくとも1つのさらなる酵素の使用を提供し、ここで、ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼは、好ましくは、以下のステップを含む方法によって得られる：
(a)ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼの組換え発現のための組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物はフザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼをコードするさらなる導入遺伝子を含み、該組換え微生物又は真菌は、大腸菌種(Escherichia coli spp.)、好ましくは大腸菌BL21(E. coli BL21)、大腸菌MG1655(E. coli MG1655)若しくは大腸菌W3110(E. coli W3110)及びその子孫、バシラス属種(Bacillus spp.)、好ましくはバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subitilis)若しくはバシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、及びその子孫、サッカロマイセテス(Saccharomycetes)、好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetales)目のもの、より好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科のもの、より好ましくはコマガタエラ(Komagataella)属のもの、好ましくはハンゼヌラ(Hansenula)若しくはピキア属種(Pichia spp.)、特に好ましくはP. パストリス(P. pastoris)及びその子孫、クルイベロミセス属種(Kluyveromyces spp.)、好ましくはK. ラクティス(K. lactis)、及びその子孫、アスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、好ましくはA. オリゼ(A. oryzae)、A. ニデュランス(A. nidulans)若しくはA. ニガー(A. niger)、及びその子孫、又はトリコデルマ属種(Trichoderma spp.)、好ましくはT. リーゼイ(T. reesei)若しくはT. ハルチアナム(T. harzianum)、及びその子孫、又は子嚢菌門(Ascomycota)の真菌、好ましくはミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)、又はその子孫からなる群から選択される、又は
(b1)ガラクトースオキシダーゼの組換え発現のための第1の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、フザリウム(Fusarium)属の真菌由来のガラクトースオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、及び
(b2)ペルオキシダーゼの組換え発現のための第2の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、ペルオキシダーゼをコードする導入遺伝子を含む、及び/又は、
(b3)カタラーゼの組換え発現のための第3の組換え微生物又は真菌を提供するステップ、ここで、該微生物又は真菌は、カタラーゼをコードする導入遺伝子を含む、
(c)ガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼの合成を可能にする適切な条件下で組換え微生物を培養するステップ、
(d)場合により、合成されたガラクトースオキシダーゼ並びにペルオキシダーゼ及び/若しくはカタラーゼを単離するステップ。

【0050】

したがって、ペルオキシダーゼ及び/又はカタラーゼについては、上記の記述がそれぞれの場合に対応して適用される。

【0051】

本発明のこの態様は、L-フシトールのL-フコースへの生体触媒変換を実施し、次いで、L-フシトールのL-フコースへのインビトロ変換を制御された様式で酵素的に実施するるための、全ての所望の単一の酵素を1つ以上の組み換え微生物において提供し、生産し、場合により個別に単離するために特に有用である。

【実施例】

【0052】

本発明を、限定するものと見なすべきではない実施例によって、より詳細に説明する。

【0053】

実施例1：ペルオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下でのガラクトースオキシダーゼによるL-フシトールの生体触媒酸化によるL-フコースの生産
丸底三つ口フラスコ(50mL)に、L-フシトールの溶液(600mgのL-フシトール、CAS13074-06-1、Santa Cruz Biotechnologyを含む水溶液6.0mL)を添加し、1.2mLのK₂HPO₄/KH₂PO₄(1000mM、pH=7.0)及び0.095mLのカタラーゼ(ウシ肝臓由来、SIGMA、21 300U/mg、34mg/mL)の添加、0.120mLのペルオキシダーゼ(西洋ワサビ由来、173U/mg固体、SIGMA)及び2.218mLのガラクトースオキシダーゼ(38.4mg/mL、2708U/mL)の添加が続いた。全てのL-フシトールがL-フコースに変換されるまで、得られた溶液を室温にてO₂でパージした。反応をHPLCによってモニターした。最終生成物を単離し、1H-及び13C-NMRによって分析した。結果を表1に要約する。

【0054】

【表1】

【0055】

実施例2：L-フシトールの生体触媒酸化に対するペルオキシダーゼ及びカタラーゼの影響
以下の実験を1.0mLスケールで行った：ガラクトースオキシダーゼ(GO)：0.250mLのL-フシトール溶液(100mg/mL)に0.635mLの水、次に0.050mLのK₂HPO₄/KH₂PO₄緩衝液pH7.0、0.065mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K₃PO₄緩衝液pH6.0中2705U/mL)を添加した。；GO+カタラーゼ：0.250mLのL-フシトール溶液(100mg/mL)に、0.631mLの水、続いて0.050mLのK₂HPO₄/KH₂PO₄緩衝液pH7.0、0.004mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.065mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K₃PO₄緩衝液pH6.0中2705U/mL)を添加した。GO+ペルオキシダーゼ：0.250mLのL-フシトール溶液(100mg/mL)に、0.630mLの水、続いて0.050mLのK₂HPO₄/KH₂PO₄緩衝液pH7.0、0.005mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.065mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K₃PO₄緩衝液pH6.0中2705U/mL)を添加した。；GO+ペルオキシダーゼ+カタラーゼ：0.250mLのL-フシトール溶液(100mg/mL)に、0.626mLの水、続いて0.050mLのK₂HPO₄/KH₂PO₄緩衝液pH7.0、0.005mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.004mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.065mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K₃PO₄緩衝液pH6.0中の2705U/mL)を添加した。全ての反応物を酸素でパージし、60分間撹拌した。反応の経過をHPLCによってモニターした。種々の反応の結果を図3に要約する。

【0056】

実施例3：L-フシトールの生体触媒酸化に対するL-フシトール濃度の影響
以下の実験を1.0mLスケールで行った：
25g/LのL-フシトール：0.100mLのL-フシトール溶液(100mg/mL)に、0.231mLの水、次いで0.040mLのK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0、0.005mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.004mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.065mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K3PO4緩衝液pH6.0中2705U/mL)を添加した。50g/LのL-フシトール：0.020gのL-フシトールを、0.281mLの水に添加し、0.040mLのK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0、0.004mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.0032mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.052mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K3PO4緩衝液pH6.0中2705U/mL)が続いた。100g/LのL-フシトール：0.040gのL-フシトールを、0.202mLの水に添加し、0.040mLのK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0、0.0080mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.0064mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.104mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K3PO4緩衝液pH6.0中の2705U/mL)が続いた。200g/LのL-フシトール：0.080gのL-フシトールを、0.044mLの水に添加し、0.040mLのK2HPO4/KH2PO4緩衝液pH7.0、0.0160mLのペルオキシダーゼ(水中)(7500U/mL)、0.0127mLのカタラーゼ(水中)(724 200U/mL)、0.207mLのガラクトースオキシダーゼ(100mM K3PO4緩衝液pH6.0中2705U/mL)が続いた。全ての反応物を酸素でパージし、60分間撹拌した。反応の経過をHPLCによってモニターした。結果を図2に要約する。

【0057】

図4は、L-フシトールの変換に対するL-フコースの影響をさらに調べたさらなる対照実験を示す。

【0058】

実施例4：ガラクトースオキシダーゼの発酵生産及び回収
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)を、フザリウム属種(Fusarium spp.)の野生型ガラクトースオキシダーゼ遺伝子がクローニングされている適切なベクターで形質転換した。ベクターとして、任意の入手可能なピキア適合性ベクターが有用であることが判明した。さらに、得られた酵素の精製を助け、及び/又は培養上清中へのその分泌をもたらすために、様々なタグを使用した。メタノール誘導性プロモーターをプロモーターとして選択した。これは、大量のガラクトースオキシダーゼの発現を誘導するために、ピキアが発酵槽規模で宿主生物として適していることを示した。得られたガラクトースオキシダーゼを、場合により、培養上清から単離又は回収し、場合により、精製した。回収されたガラクトースオキシダーゼは約3000U/gの活性を有していた。組換え真菌としての糸状真菌の使用の場合、ガラクトースオキシダーゼの分泌はまた、培養上清に直接もたらされた。

【0059】

大腸菌及び種々の周知の真菌株を含むさらなる発現株によるさらなる例を作製し、使用したベクター、制御エレメント、培地及び培養条件を適宜適合させた。これらの改変は、当業者に周知である。これらの全ての発現は、十分な量、純度、及びL-フコースの生体触媒生産を触媒するのに十分な活性のガラクトースオキシダーゼを与えた。酵母及び真菌株は、特に好ましい株であることが判明している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】