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特許6705190増幅反応を利用した測定方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6705190

(24)【登録日】2020年5月18日

(45)【発行日】2020年6月3日

(54)【発明の名称】増幅反応を利用した測定方法

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/6844 20180101AFI20200525BHJP

C12N 15/10 20060101ALN20200525BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 ZZNA

!C12N15/10 Z

【請求項の数】6

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-18515(P2016-18515)

(22)【出願日】2016年2月3日

(65)【公開番号】特開2017-118860(P2017-118860A)

(43)【公開日】2017年7月6日

【審査請求日】2019年1月21日

(31)【優先権主張番号】特願2015-37514(P2015-37514)

(32)【優先日】2015年2月27日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2015-254066(P2015-254066)

(32)【優先日】2015年12月25日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】武藤悠

【審査官】斉藤貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７−５２５１７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２−３４５４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２−３４５４７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８−５４５４１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／００−１／７０

Ｇ０１Ｎ３３／５３２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するプローブＡ、及び
・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するプローブＢ、
を用いた、ホモジニアス系で行われる測定対象の測定方法であって、
（ｉ）二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
プロモーター配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
（ｉｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させ、
（ｉｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させ、
（ｉｖ）それを起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、
（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを増幅させ、
（ｖｉ）増幅したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする、ＲＮＡ増幅が一定温度条件下で行われる測定方法。

【請求項2】

プローブＡとプローブＢにおいて、一方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しており、他方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

プローブＡとプローブＢにおいて、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

プローブＡとプローブＢにおいて、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

プローブＡ及び／又はプローブＢの会合部位と一本鎖ＤＮＡとがスペーサーを介して結合している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

スペーサーがＤＮＡ鎖である、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、増幅反応を利用した測定方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）の原理を用いた測定法は、臨床診断や基礎研究の分野で広く用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡによる測定では、標識化合物の非特異吸着を除去するための洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、操作に時間がかかること、また洗浄操作に耐えることのできない弱い相互作用のホスト分子は使用できないなどの問題があった。そのため、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスアッセイ方法が、生物医学研究の現場でのハイスループットスクリーニングに用いられる（非特許文献１）。従来のホモジニアスアッセイにおける検出方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）などの手法を用いて検出される。これらの検出系は、ＥＬＩＳＡなどの酵素を用いた検出系と異なり、反応系中でシグナルの増幅が行われないため、検出感度が問題となることがあった。

【0003】

例えば非特許文献２では、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）の抗原結合領域近傍に修飾した蛍光分子がタンパク中のトリプトファンによる消光を受けることを利用して、抗原結合により蛍光回復するプローブを開発している。また非特許文献３では、ホスト分子と蛍光色素のピレンで修飾された２つのＤＮＡ鎖が、ゲスト分子との会合により二重鎖形成をして、結果としてピレンが近接位にくることで、ピレン由来の発光のスイッチングが起こるプローブを開発している。これらの測定方法は、どちらもＢ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな系で機能するが、シグナル増幅系を有する測定系ではなかった。

【0004】

シグナル増幅の機能を有し、ホモジニアスな系で働く測定方法の例として、特許文献１に記載のルシフェラーゼの半反応を利用したものがあげられる。しかし、この測定方法ではバックグランドのシグナルが高いことが課題となっていた。また、分子量の大きいルシフェラーゼをホスト分子に修飾しなければならない点も、プローブ作製時の課題となることが考えられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１０−２６８７９３号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】化学と生物Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．８，２０００．５５５

【非特許文献2】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３（４３），１７３８６

【非特許文献3】ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，２００８，１９，１１３２

【非特許文献4】ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００９、Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．３ｅ２０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、シグナルの増幅が可能で、プローブの作製が容易な測定方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するプローブＡ、及び
・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するプローブＢ、
を用いた測定対象の測定方法であって、
（ｉ）二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
プロモーター配列と増幅配列は、それぞれプローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
（ｉｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させ、
（ｉｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡの二重鎖を形成させ、
（ｉｖ）それを起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、
（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを増幅させ、
（ｖｉ）増幅したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする、測定方法。
（２）プローブＡとプローブＢにおいて、一方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しており、他方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合している、（１）に記載の方法。
（３）プローブＡとプローブＢにおいて、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合している（１）に記載の方法。
（４）プローブＡとプローブＢにおいて、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合している（１）に記載の方法。
（５）ホモジニアス系で行われる、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）ＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われる、（１）〜（５）いずれかに記載の方法。
（７）プローブＡ及び／又はプローブＢの会合部位と一本鎖ＤＮＡとがスペーサーを介して結合している、（１）〜（６）いずれかに記載の方法。
（８）スペーサーがＤＮＡ鎖である、（７）に記載の方法。

【0009】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0010】

（１）測定方法
本発明の測定方法は、測定対象の有無を測定する定性測定であってもよく、また測定対象の量を測定する定量測定であってもよい。本発明の測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、いわゆるホモジニアス系で行われることが好ましい。

【0011】

（２）プローブ
本発明に用いられるプローブＡ及びプローブＢは、会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するものである。会合部位とＤＮＡ鎖の結合は３’末端側、５’末端側のどちらで行っても良く、反応原理に応じて適宜選択すればよい。例えばプローブＡとプローブＢにおいて、一方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しており、他方のプローブは会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合しているものをあげることができ、これは例えば後述の測定原理１に用いることができる。またプローブＡとプローブＢにおいて、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しているものをあげることができ、また同様に、いずれのプローブも会合部位と一本鎖ＤＮＡの３’末端側とが結合しているものをあげることができる。これらは例えば後述の測定原理２、３、４に用いることができる。

【0012】

会合部位と一本鎖ＤＮＡとは直接結合されていてもよく、またスペーサー等を介して間接的に結合されていてもよい。その結合方法は特に限定されないが、例えば、非特許文献３に記載のように、会合部位をホスホロアミダイト化して、ＤＮＡ固相合成に組み込むことで一本鎖ＤＮＡと結合させてもよいし、固相合成により一本鎖ＤＮＡ鎖中にアミノ基、チオール基などの反応性の官能基を導入し、会合部位と反応させてもよい。スペーサーの種類も特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン（ＰＥＧ）鎖をスペーサーとして用いてもよいし、ＤＮＡ鎖をスペーサーとして用いてもよい。このスペーサーとして用いられるＤＮＡ鎖は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は会合部位と結合している側のＤＮＡ鎖に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよく、また反対に会合部位と結合しているＤＮＡ鎖の相補鎖側に二重鎖形成配列を有する一本鎖ＤＮＡが結合していてもよい。

【0013】

（３）会合部位
会合部位は、プローブＡとプローブＢに含まれるものであり、測定対象と会合しうるものであればよく特に限定されない。例えば、会合部位としては、ホスト分子として用いられる小分子（シクロデキストリン、クラウンエーテル、ボロン酸など）や、測定対象と親和性を有するタンパク（レクチン、抗体など）または親和性を有する核酸（アプタマーなど）、アビジン又はビオチン等を用いればよい。プローブＡとプローブＢが共に測定対象に会合した状態をとることができる限り、プローブＡとプローブＢの会合部位は同一のものであっても異なっていてもよい。またプローブＡとプローブＢの会合部位は、測定対象に対してどちらを先に会合させてもよく、また同時に会合させてもよい。

【0014】

（４）二重鎖形成配列
本発明における二重鎖形成配列は、プローブＡとプローブＢの一本鎖ＤＮＡ中にそれぞれ存在するものであるが、それぞれの一本鎖ＤＮＡ中の位置は特に限定されるものではない。それらは互いに相補的な配列を有するものであり、そのＤＮＡ鎖長は特に限定されないが、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜６塩基である。

【0015】

（５）プロモーター配列
本発明においてプロモーター配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーターであればよい。具体的には、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。

【0016】

（６）増幅配列
本発明における増幅配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列はＲＮＡ合成の鋳型となるアンチセンス鎖又はセンス鎖であればよく、特に限定されない。

【0017】

（７）検出
本発明におけるシグナルの検出は、ＲＮＡポリメラーゼによって生産・増幅されたＲＮＡ鎖を検出することで行えばよく、特に限定されない。例えばＲＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系を用いてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、合成されるＲＮＡ配列がＲＮＡｚｙｍｅ活性を有するように配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。

【0018】

検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いればよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０東ソー製）を用いてもよい。

【0019】

（８）酵素
本発明の測定方法には、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いる。その際、ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮＡポリメラーゼ活性を兼ね備えた酵素を用いてもよいし、それぞれのポリメラーゼ活性を有する異なる酵素をそれぞれ用いてもよい。例えばＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３などを用いればよい。特に本発明では、ＤＮＡポリメラーゼとしては９６−７を、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７を用いることが好ましい。

【0020】

（９）測定原理１
本発明の測定原理の一例を模式図（図１）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの５’側に向かって二重鎖形成配列、プロモーター配列、増幅配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（９−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（９−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（９−３）それを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、プロモーター配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（９−４）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（９−５）増幅されたＲＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。

【0021】

（１０）測定原理２
本発明の測定原理の一例を模式図（図２）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かってプロモーター配列、二重鎖形成配列を含むものである。プローブＢはスペーサーとして一本鎖部分と二本鎖部分とを有するＤＮＡ鎖を用い、その５’末端に会合部位が結合し、その３’側に二重鎖部分とそれにつながる一本鎖ＤＮＡ（二重鎖形成配列及び増幅配列を有するもの）を含むものである。以下、このような場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１０−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１０−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１０−３）それを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、プロモーター配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（１０−４）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（１０−５）増幅されたＲＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。

【0022】

（１１）測定原理３
本発明の測定原理の一例を模式図（図５）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かってプロモーター配列、二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって、増幅配列、二重鎖形成配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１１−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１１−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１１−３）それを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、プロモーター配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（１１−４）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（１１−５）増幅されたＲＮＡをモレキュラービーコンなどで検出する。

【0023】

（１２）測定原理４
本発明の測定原理の一例を模式図（図８）に示す。ＤＮＡの３’末端に会合部位を有するプローブＡ、ＤＮＡの３’末端に会合部位を有するプローブＢを使用する。プローブＡにおけるＤＮＡは、一部に相補的な配列を有するＤＮＡ配列その１（３’末端に会合部位を有する）及びＤＮＡ配列その２で構成し、ＤＮＡ配列その１の５’末端はＤＮＡ配列その２の５’末端と相補的な配列であり、更にＤＮＡ配列その２は３’末端に向かってプロモーター配列、二重鎖形成配列を含む。一方、プローブＢにおけるＤＮＡは、一部に相補的な配列を有するＤＮＡ配列その３（３’末端に会合部位を有する）及びＤＮＡ配列その４で構成し、ＤＮＡ配列その３の５’末端はＤＮＡ配列その４の５’末端と相補的な配列であり、更にＤＮＡ配列その４は３’末端に向かって増幅配列、二重鎖形成配列を含む。

【0024】

以下、このような場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１２−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１２−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１２−３）それを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長や、例えば鎖置換反応が行われ、その結果、プロモーター配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（１２−４）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（１２−５）増幅されたＲＮＡをＩＮＡＦプローブなどで検出する。

【0025】

（１３）測定原理５
本発明の測定原理の一例を模式図（図１２）に示す。プローブＡは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かってプロモーター配列、二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって、増幅配列、二重鎖形成配列を含む。また反応系中に、プロモーター配列を有し増幅されるＲＮＡの一部と相同的な配列を有する第一のプライマー（ＰｒｏｍｏｔｅｒＰｒｉｍｅｒ）、増幅されるＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ＲＴＰｒｉｍｅｒ）、逆転写酵素、及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。

【0026】

（１３−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１３−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１３−３）それを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡの伸長が行われ、その結果、プロモーター配列の二重鎖、増幅配列の二重鎖が形成される。
（１３−４）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（１３−５）増幅されたＲＮＡをモレキュラービーコンで検出する。また増幅されたＲＮＡと第二のプライマーの二重鎖形成を起点として、逆転写酵素活性によりＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（１３−６）ＲＮａｓｅＨ活性により、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖のＲＮＡ鎖が分解され、一本鎖となったＤＮＡ鎖と第一のプライマーが二重鎖形成する。
（１３−７）ＤＮＡポリメラーゼ活性により、第一のプライマーのプロモーター二重鎖が形成されることで、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し合成・増幅させる。
（１３−８）ＲＮＡ鎖の検出と、増幅されたＲＮＡをテンプレートとした（１３−５〜７）のＲＮＡ増幅反応が繰り返し行われ、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する。

【発明の効果】

【0027】

ホモジニアス系で行われる測定においても、シグナル増幅ができないために、目標の感度に達しないことがある。本発明の測定法では、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたＲＮＡを測定するため、シグナルを増幅して検出することが可能である。このため、高感度な測定が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明の測定方法の概要を示す図である。

【図2】本発明の測定方法の概要を示す図である。

【図3】実施例１でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図4】図３の蛍光強度が小さい領域の拡大図である。

【図5】実施例２の測定方法の概要を示す図である。

【図6】実施例２でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図7】図６の蛍光強度が小さい領域の拡大図である。

【図8】実施例３の測定方法の概要を示す図である。

【図9】実施例３でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図10】実施例４の測定方法の概要を示す図である。

【図11】実施例４でＢＮＰの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図12】実施例５，６の測定方法の概要を示す図である。

【図13】実施例５でＢＮＰの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図14】実施例６でストレプトアビジンの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【図15】実施例７でＭＡＣＳストレプトアビジンマイクロビーズの検出を行った際の時間あたりの蛍光強度変化を示す図である。

【実施例】

【0029】

以下、本発明を、会合部位としてビオチンを用いた場合の実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。

【0030】

実施例１
（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号１）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２）の３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号１の５〜１０位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号２の４７〜５２位）、プロモーター配列（配列番号２の３０〜４９位）、増幅配列（配列番号２の４〜２９位）を含むよう設計した。

【0031】

（２）モレキュラービーコン作製
配列番号３のＤＮＡ配列の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒで修飾したモレキュラービーコンは、非特許文献２の配列を参考に、ニッポンジーン社へ依頼して作製した。

【0032】

（３）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、モレキュラービーコンを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0033】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１４４Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ５ｍＭ、ＮＴＰ３ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２Ｕ／μＬ、ＤＭＳＯ２０％、プローブＡ５０ｎＭ、プローブＢ５０ｎＭ、モレキュラービーコン２０ｎＭ。反応温度４２℃。

【0034】

上記測定溶液中に図３に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図３、４に示す。図４には、図３の蛍光強度が小さい領域の拡大図を示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。

【0035】

以上の結果から、本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0036】

実施例２５’末端標識プローブ
実施例２における測定原理の模式図を図５に示す。

【0037】

（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号４）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号５）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡ配列はプロモーター配列（配列番号４の７〜３４位）、二重鎖形成配列（配列番号４の５９〜６４位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は増幅配列（配列番号５の２８〜４７位）、二重鎖形成配列（配列番号５の４８〜５３位）を含むよう設計した。

【0038】

（２）モレキュラービーコン作製
配列番号６のＤＮＡ配列の５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾したモレキュラービーコンは、グライナー社へ依頼して作製した。

【0039】

【0040】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１５０Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ５ｍＭ、ＮＴＰ３ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２Ｕ／μＬ、ＤＭＳＯ１５％、プローブＡ２５０ｎＭ、プローブＢ２５０ｎＭ、モレキュラービーコン３００ｎＭ。反応温度４２℃。

【0041】

上記測定溶液中に図６、７に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図６、７に示す。図７には、図６の蛍光強度が小さい領域の拡大図を示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。

【0042】

以上の結果から、ＤＮＡ５’末端に会合部位を有する２つのプローブ（プローブＡ、プローブＢ）を用いた本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0043】

実施例３３’末端標識プローブ
実施例３における測定原理の模式図を図８に示す。

【0044】

（１）プローブ作製
ＤＮＡの３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、ＤＮＡの３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡは、一部に相補的な配列を有する配列番号７（３’末端をビオチン修飾）及び配列番号８のＤＮＡで構成し、配列番号７の１〜２０位は配列番号８の１〜２０位と相補的な配列であり、プロモーター配列（配列番号８の２１〜４３位）、二重鎖形成配列（配列番号８の６７〜７２位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡは、一部に相補的な配列を有する配列番号９（３’末端をビオチン修飾）及び配列番号１０のＤＮＡで構成し、配列番号９の１〜２１位は配列番号１０の１〜２１位と相補的な配列であり、ＤＮＡ配列は増幅配列（配列番号１０の４２〜６１位）、二重鎖形成配列（配列番号１０の６２〜６７位）を含むよう設計した。

【0045】

（２）ＩＮＡＦプローブ
配列番号１１のＩＮＡＦプローブは特開２００６−３４０６６４号公報に記載のプローブを用いた。

【0046】

（３）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、ＩＮＡＦプローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0047】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１４４Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ５ｍＭ、ＮＴＰ３ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２Ｕ／μＬ、ＤＭＳＯ２０％、プローブＡ２００ｎＭ、プローブＢ２００ｎＭ、ＩＮＡＦプローブ５０ｎＭ。反応温度４２℃。

【0048】

上記測定溶液中に図９に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、ＩＮＡＦプローブ由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図９に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。

【0049】

以上の結果から、ＤＮＡ３’末端に会合部位を有する２つのプローブ（プローブＡ、プローブＢ）を用いた本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0050】

実施例４会合部位にＢＮＰ（ｂｒａｉｎｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ）認識抗体を用いた測定系
実施例４における測定原理の模式図を図１０に示す。

【0051】

（１）ＢＮＰ認識抗体
ＢＮＰのＣ末認識抗体は、特許５８１０５１４号公報に記載のＢＣ２３−１１抗体を用いた。またＢＮＰの環状部位認識抗体は特開２０１２−１４０３３１号公報に記載のＢＭ３３−２８抗体を用いた。

【0052】

（２）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号１２）の５’末端にＢＣ２３−１１（会合部位）を修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号１３）の５’末端にＢＭ３３−２８（会合部位）を修飾したプローブＢは、それぞれ以下に示す方法で作製した。

【0053】

３ｎｍｏｌの各抗体と５００ｎｍｏｌのＳＭ（ＰＥＧ）２４（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を室温、ＰＢＳ中で１時間反応させた後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ０．５ｍＬ（３０Ｋ）（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で限外濾過することで、未反応のＳＭ（ＰＥＧ）２４を除いた。そこに５’末端をチオール修飾したＤＮＡ（配列番号１２及び配列番号１３、グライナー社で受託合成）をそれぞれ添加し、室温で３０分反応させた後、ゲル濾過精製（Ｇ３０００ｓｗｘｌカラム、東ソー社製）を行うことで、プローブＡ、プローブＢを得た。

【0054】

プローブＡにおけるＤＮＡ配列はプロモーター配列（配列番号１２の７〜３４位）、二重鎖形成配列（配列番号１２の５９〜６４位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は増幅配列（配列番号１３の２８〜４７位）、二重鎖形成配列（配列番号１３の４８〜５３位）を含むよう設計した。

【0055】

（３）モレキュラービーコン
モレキュラービーコンは実施例２に記載の配列番号６と同じものを用いた。

【0056】

（４）ＢＮＰの測定
ＢＮＰをプローブＡ、プローブＢ、モレキュラービーコンを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0057】

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製）１４４Ｕ／ａｓｓａｙ、９６−７ＤＮＡポリメラーゼ（ニッポンジーン製）８Ｕ／ａｓｓａｙ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＢｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）、ＤＴＴ５ｍＭ、ＮＴＰ３ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２Ｕ／μＬ、プローブＡ２００ｎＭ、プローブＢ２００ｎＭ、モレキュラービーコン３００ｎＭ。反応温度４２℃。

【0058】

上記測定溶液中に図１１に示す各濃度のＢＮＰを添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図１１に示す。その結果、ＢＮＰ濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、ＢＮＰと各プローブ中の抗体の会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。

【0059】

以上の結果から、会合部位として抗体を用いた２つのプローブ（プローブＡ、プローブＢ）を用いた本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0060】

実施例５ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する測定系（会合部位にＢＮＰ認識抗体を用いた測定系）
実施例５における測定原理の模式図を図１２に示す。
（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号１２）の５’末端にＢＣ２３−１１（会合部位）を修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号１３）の５’末端にＢＭ３３−２８（会合部位）を修飾したプローブＢは、実施例４で用いたプローブと同様のものを用いた。
（２）モレキュラービーコン
モレキュラービーコンは実施例２と同じものを用いた。
（３）プライマー
５’末端側にプロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１４）及び、第二のプライマー（配列番号１５）はグライナー社による受託合成により作製した。第一のプライマーにおけるＤＮＡ配列はプロモーター配列（配列番号１４の１〜２８）を含むよう設計した。

【0061】

（４）ＢＮＰの測定
ＢＮＰをプローブＡ、プローブＢ、モレキュラービーコン、第一のプライマー、第二のプライマーを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0062】

１８ｍＭＭｇＣｌ_２、６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．２５ｍＭｄＮＴＰ、３ｍＭＮＴＰ、３．０６ｍＭＩＴＰ、０．１２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、２％ｓｏｒｂｉｔｏｌ、４０ｍＭＫＣｌ、０．２Ｕ／μＬＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、８Ｕ／３０μＬ９６−７ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１４４Ｕ／３０μＬＴ７ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、７．４Ｕ／３０μＬＡＭＶ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ活性有）、プローブＡ２００ｎＭ、プローブＢ２００ｎＭ、第一のプライマー１μＭ、第二のプライマー１μＭ。反応温度４２℃。

【0063】

上記測定溶液中に図１３に示す各濃度のＢＮＰを添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図１３に示す。その結果、ＢＮＰ濃度に応じて蛍光強度が増幅することが確認され、その増幅曲線がシグモイドのカーブを描くことが確認された。これは、増幅されたＲＮＡが鋳型となり第一のプライマーと第二のプライマーにより新たなＲＮＡ合成プロモーター二重鎖が形成され、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅したためと考えられる。

【0064】

以上の結果から、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する測定系を用いた本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0065】

実施例６ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する測定系（会合部位にビオチンを用いた測定系）
実施例６における測定原理の模式図を図１２に示す。
（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号４）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号５）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、実施例２で用いたプローブと同様のものを用いた。
（２）モレキュラービーコン
モレキュラービーコンは実施例２と同じものを用いた。
（３）プライマー
５’末端側にプロモーター配列を有する第一のプライマー（配列番号１４）及び、第二のプライマー（配列番号１５）は実施例５で用いたものと同様のものを用いた。

【0066】

（４）ストレプトアビジンの測定
ストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、モレキュラービーコン、第一のプライマー、第二のプライマーを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0067】

１８ｍＭＭｇＣｌ_２、６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．２５ｍＭｄＮＴＰ、３ｍＭＮＴＰ、３．０６ｍＭＩＴＰ、０．１２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、２％ｓｏｒｂｉｔｏｌ、４０ｍＭＫＣｌ、０．２Ｕ／μＬＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、８Ｕ／３０μＬ９６−７ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１４４Ｕ／３０μＬＴ７ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、７．４Ｕ／３０μＬＡＭＶ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ活性有）、プローブＡ２ｎＭ、プローブＢ２ｎＭ、ＤＭＳＯ１３％，第一のプライマー１μＭ、第二のプライマー１μＭ。反応温度４３℃。

【0068】

上記測定溶液中に図１４に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図１４に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度に応じて蛍光強度が増幅することが確認され、その増幅曲線がシグモイドのカーブを描くことが確認された。これは、増幅されたＲＮＡが鋳型となり第一のプライマーと第二のプライマーにより新たなＲＮＡ合成プロモーター二重鎖が形成され、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅したためと考えられる。

【0069】

以上の結果から、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する測定系を用いた本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。

【0070】

実施例７測定対象が微粒子である場合の測定系
実施例７における測定原理は、図５と同様である。
（１）プローブ作製
一本鎖ＤＮＡ（配列番号４）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号５）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、実施例２で用いたプローブと同様のものを用いた。
（２）モレキュラービーコン
モレキュラービーコンは実施例２と同じものを用いた。
（３）測定対象微粒子
測定対象の微粒子には５０ｎｍの微粒子表面にストレプトアビジンが固定化された、ＭＡＣＳストレプトアビジンマイクロビーズ（ＭＡＣＳ社、オーダーＮｏ．１３０−０４８−１０２）を用いた。

【0071】

（３）微粒子の測定
ＭＡＣＳストレプトアビジンビーズをプローブＡ、プローブＢ、モレキュラービーコンを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。

【0072】

【0073】

上記測定溶液中に図１５に示す希釈倍率の微粒子を添加し、モレキュラービーコン由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図１５に示す。その結果、微粒子濃度に応じて、時間あたりの蛍光強度の増幅が大きくなることが確認された。これは、微粒子表面上のストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。

【0074】

以上の結果から、ＤＮＡ５’末端に会合部位を有する２つのプローブ（プローブＡ、プローブＢ）を用いた本発明の方法により、測定対象微粒子を測定できることが確認された。

【図1】