特許 6712737 バイオマーカー、疾患関連遺伝子の探索方法、及び腎がんマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6712737

(24)【登録日】2020年6月4日

(45)【発行日】2020年6月24日

(54)【発明の名称】バイオマーカー、疾患関連遺伝子の探索方法、及び腎がんマーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20200615BHJP

   G01N 27/62 20060101ALI20200615BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20200615BHJP

   C12Q 1/6872 20180101ALI20200615BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N27/62 V

   C12Q1/04

   C12Q1/6872 Z

【請求項の数】10

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2018-547766(P2018-547766)

(86)(22)【出願日】2017年10月26日

(86)【国際出願番号】JP2017038812

(87)【国際公開番号】WO2018079689

(87)【国際公開日】20180503

【審査請求日】2019年4月18日

(31)【優先権主張番号】特願2016-211239(P2016-211239)

(32)【優先日】2016年10月28日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）平成２８年度「次世代がん医療創生研究事業」研究領域Ｄ（ユニット型）：患者に優しい高感度・高精度ながん診断法の研究（診断／バイオマーカー）「切除組織培養分泌エクソソームの網羅的解析によるがん早期診断薬開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】植田 幸嗣

(72)【発明者】

【氏名】大西 なおみ

(72)【発明者】

【氏名】野々村 祝夫

(72)【発明者】

【氏名】植村 元秀

(72)【発明者】

【氏名】藤田 和利

(72)【発明者】

【氏名】辻川 和丈

(72)【発明者】

【氏名】神宮司 健太郎

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０８６１５６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１４−５１９３４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Kentaro Jingushi et al.，Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin，International Journal of Cancer，２０１７年１０月１４日，Vol.142 No.3，Page.607-617

【文献】 F. Raimondo et al.，Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes，Molecular BioSystems，２０１３年，Vol.9，Page.1220-1233

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

Ｃ１２Ｑ １／０４

Ｃ１２Ｑ １／６８７２

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液に含まれる細胞外小胞のＡＺＵ１を検出し、
所定値と比較することを特徴とする腎細胞がんの検査方法。

【請求項2】

さらに、ＣＡ９、ＳＴＢＤ１、ＣＯＭＴ、ＧＹＧ１の少なくとも１つを検出し、
所定値と比較することを特徴とする請求項１記載の腎細胞がんの検査方法。

【請求項3】

前記体液が血液又は尿であることを特徴とする
請求項１又は２記載の腎細胞がんの検査方法。

【請求項4】

ＡＺＵ１からなる、
腎細胞がん検査のためのバイオマーカー。

【請求項5】

ＡＺＵ１を指標として、
候補化合物を選択することを特徴とするＡＺＵ１を標的とする腎細胞がんの治療薬スクリーニング方法。

【請求項6】

切除された疾患組織片を直ちに無血清浸漬液に浸漬し、
無血清浸漬液中の前記疾患組織から培養することなく分泌した滲出した疾患組織由来の滲出成分を解析し、
質量分析により解析し、
前記疾患組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を同定することを特徴とする探索方法。

【請求項7】

前記切除された疾患組織の周囲の正常組織片を直ちに無血清浸漬液に浸漬し、
無血清浸漬液中の前記正常組織から培養することなく分泌した正常組織由来の滲出成分を集め、
質量分析により解析し、
前記正常組織由来バイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を同定し、
前記疾患組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子と前記正常組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を比較検討し疾患特異的なバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を選択することを特徴とする請求項６記載の探索方法。

【請求項8】

前記滲出成分が、
細胞外小胞、タンパク質、核酸、脂質であることを特徴とする請求項６又は７記載の探索方法。

【請求項9】

前記滲出成分が細胞外小胞であり、
細胞外小胞に含まれる前記バイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子が、
タンパク質、核酸、脂質であることを特徴とする請求項６〜８いずれか１項記載の探索方法。

【請求項10】

前記疾患が、
がん、神経変性疾患、多発性硬化症、糖尿病、肝疾患、自閉症、脳梗塞であることを特徴とする請求項６〜９いずれか１項記載の探索方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞外小胞を分離・精製し、バイオマーカー、疾患関連遺伝子を同定する方法、及び検査方法に関する。また、当該探索方法を用いて得られた腎がんマーカーに関する。

【背景技術】

【0002】

バイオマーカーとは、身体の正常なプロセスや病的なプロセス、あるいは治療に対する薬理学的な反応に相関する生体内の物質や画像データを指し、身体の状態の客観的な指標となるものである。バイオマーカーは、生化学検査、血液検査、腫瘍マーカーのようないわゆる臨床検査値や、ＣＴやＭＲＩのような画像診断データなど様々なものを含んでいる。特に、疾患の指標として疾患の存在や進行度を表すバイオマーカーは、疾患の発見、診断、予後予測など、現在の診療においてなくてはならないものとなっている。また、バイオマーカーは、新薬開発において、開発化合物の選択や、評価において利用されている。

【0003】

近年、極微量のタンパク質や核酸を検出できる技術の開発や、ゲノム解析やプロテオーム解析が進展した結果、多くのバイオマーカーが発見されている。しかし、実際に臨床現場で使用されているマーカーはそのうちのごくわずかである。特に、疾患の初期の段階では自覚症状の乏しいがんや神経変性疾患などの疾患において、診断や創薬ツールとして有用なバイオマーカーが望まれている。しかしながら、実用化されているバイオマーカーはほとんどない。

【0004】

例えば、腎細胞がんは多くの場合、ほとんど症状がなく、かなり進行してから発見されるケースが大半を占めている。最近では、健康診断や他の病気で超音波検査やＣＴ検査を受けた際に偶然発見されることが増えてきているものの、依然として早期発見が困難ながんであるとされている。特許文献１〜３には、腎細胞がんのバイオマーカーが報告されているが、いまだ実用化にはいたっていない。

【0005】

近年、バイオマーカーを用いた臨床診断の分野では、リキッドバイオプシー（ｌｉｑｕｉd ｂｉｏｐｓｙ、体液診断）が注目されている。リキッドバイオプシーは、がんの診断の領域では、腫瘍組織を採取する従来のバイオプシー（生検）を行わず、体液を検体として用いて、がん細胞を検出したり、バイオマーカーを測定することによって非侵襲、低侵襲的に疾患を検出することができる。

【0006】

リキッドバイオプシーの解析対象としては、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ；ＣＴＣ）やがん細胞に由来するＤＮＡ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ）がよく知られている。しかし、ＣＴＣやｃｔＤＮＡはがん細胞が転移する際に検出されることが想定されるため、がんの予後予測には向いているものの早期診断には用いることができないと考えられている。そこで、がんをはじめ、他の疾患の早期診断をするための解析対象として細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、以下ＥＶｓと記載することもある。）が注目を集めるようになってきた。

【0007】

細胞外小胞とは、ほとんどすべての細胞から放出される小胞であり、大きさや表出するマーカー分子によってエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体に大別される。細胞外小胞は、近年種々の役割を担っていることが明らかになってきている。特に、エクソソームや微小小胞体には、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの核酸や、タンパク質が含まれており、近接する細胞だけではなく臓器間のコミュニケーションに関与することが明らかになってきている（非特許文献１〜４）。

【0008】

細胞外小胞は、がんにおいては血管新生、免疫抑制、転移を含む、がんの進展に関わることが報告されている。さらに、細胞外小胞に含まれる特殊なインテグリンの組成から、がん細胞の転移の準備を行っている可能性が示唆されている（非特許文献５）。このように細胞外小胞は疾患の進展にも関わり、細胞外小胞に内包されるタンパク質や核酸は、生体の状態によって変化する。したがって、疾患の種類や状態によって細胞外小胞で検出されるタンパク質や核酸が異なり、バイオマーカーとなることが知られている。

【0009】

しかし、これまでに報告されている研究結果は、主として培養細胞を用いて行われた結果であり、組織学的に同じバックグラウンドを備えた疾患部位、正常部位から得られた微小小胞体を比較検討したデータは全くなかった。そのため、疾患の診断や、新薬開発に有効なバイオマーカーとして機能するか疑問がもたれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２０１６−８６６７８号公報

【特許文献2】特開２０１３−１４００３０号公報

【特許文献3】特表２０１５−５０５９６５号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Kahlert, C.,& Kalluri, R., J. Mol. Med. (Berl)., 2013, Vol.91(4), p.431-437.

【非特許文献2】An,T. et al., J. Extracell. Vesicles., 2015, Vol.4, 27522.

【非特許文献3】Peinado,H. et al., Nat. Med., 2012, Vol.18(6), p.883-891

【非特許文献4】Costa-Sliva,B. et al., Nat. Cell Biol., 2015, Vol.17(6), p.816-826.

【非特許文献5】Hoshino,A. et al., Nature, 2015, Vol.527(7578), p.329-335.

【非特許文献6】Lasser,C., et al, J. Vis. Exp., 2012, Vol.59, e3037, doi:10.3791/3037.

【非特許文献7】Geissler,K. et al., Oncoimmunology, 2015, Vol.4, e985082.

【非特許文献8】Teltsh,O., et al., Oncotarget, 2015, Vol.32, p.33191-33205.

【非特許文献9】Guldur,M. E. et al., J. Pak. Med. Assoc., 2014, Vol.3, p.300-303.

【非特許文献10】Bussolati,B. et al., FASEB J., 2003, Vol.17(9), p.1159-1161.

【非特許文献11】Wiklander,O.P. et al., J. Extracell. Vesicles, 2015, Vol.4, 26316.

【非特許文献12】Tominaga,N. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2015, Vol.95, p.50-55.

【非特許文献13】Lai,C. P. et al., ACS Nano., 2014, Vol.8(1), p.483-494.

【非特許文献14】Gruenwald,V. et al., BMC Cancer, 2010, 10:695.

【非特許文献15】Vroling,L. et al., Angiogenesis, 2009, Vol.12(1), p.69-79.

【非特許文献16】del Puerto-Nevado, L. et al., Br. J. Cancer, 2014, Vol.110, p.2700-2707.

【非特許文献17】Shankhajit,D. et al., International Journal of Nutrition, Pharmacology, Neurologicaldiseases, 2012, Vol.2, p.3-7.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、リキッドバイオプシーに用いることができる細胞外小胞に含まれる生体構成成分から新規のバイオマーカーを探索する方法を提供することを課題とする。また、疾患関連遺伝子の新たな探索方法を提供することを課題とする。さらに、これまで有効なバイオマーカーが存在しなかった腎細胞がん（Ｒｅｎａｌ Cｅｌｌ Cａｒｃｉｎｏｍａ）の新たなバイオマーカー、及び検査方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は以下の疾患組織由来のバイオマーカーや疾患関連遺伝子探索方法、腎細胞がんの検査方法、腎細胞がんのバイオマーカー、腎細胞がんの治療薬スクリーニング方法に関する。

【0014】

（１）切除された疾患組織を浸漬液に浸漬し、浸漬液中の前記疾患組織から滲出した疾患組織由来の滲出成分を解析し、前記疾患組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を同定することを特徴とする探索方法。
（２）前記切除された疾患組織の周囲の正常組織を浸漬液に浸漬し、浸漬液中の前記正常組織から滲出した正常組織由来の滲出成分を解析し、前記正常組織由来バイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を同定し、前記疾患組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子と前記正常組織由来のバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を比較検討し疾患特異的なバイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子を選択することを特徴とする（１）記載の探索方法。
（３）前記滲出成分が、細胞外小胞、タンパク質、核酸、脂質であることを特徴とする（１）又は（２）記載の探索方法。
（４）前記滲出成分が細胞外小胞であり、細胞外小胞に含まれる前記バイオマーカー及び／又は疾患関連遺伝子が、タンパク質、核酸、脂質であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の探索方法。
（５）前記疾患が、がん、神経変性疾患、多発性硬化症、糖尿病、肝疾患、自閉症、脳梗塞であることを特徴とする（１）〜（４）いずれか１つ記載の探索方法。
（６）体液に含まれる細胞外小胞を分離し、前記細胞外小胞に含まれる表１、表２、表４に記載のバイオマーカーの少なくとも１つを検出し、所定値と比較することを特徴とする腎細胞がんの検査方法。
（７）前記バイオマーカーが、ＡＺＵ１、ＣＡ９、ＳＴＢＤ１、ＣＯＭＴ、ＧＹＧ１であることを特徴とする（６）記載の腎細胞がんの検査方法。
（８）前記体液が血液又は尿であることを特徴とする（６）又は（７）記載の腎細胞がんの検査方法。
（９）表１、表２、表４に記載の腎細胞がんのバイオマーカー。
（１０）ＡＺＵ１、ＣＡ９、ＳＴＢＤ１、ＣＯＭＴ、ＧＹＧ１を指標として、候補化合物を選択することを特徴とするＡＺＵ１、ＣＡ９、ＳＴＢＤ１、ＣＯＭＴ、ＧＹＧ１を標的とする腎細胞がんの治療薬スクリーニング方法。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】組織滲出性の細胞外小胞の単離、及びバイオマーカー探索方法の概略を示す図。

【図2】得られた組織滲出性の細胞外小胞のマーカー解析、サイズ分布を示す図。

【図3】組織滲出性の細胞外小胞におけるテトラスパニンファミリーの分子の発現を質量分析により解析した結果を示す図。

【図4】遺伝子オントロジー解析による組織滲出性の細胞外小胞の解析結果。図４Ａは腎細胞がん組織、がん組織周辺の正常組織から得られた組織滲出性の細胞外小胞において同定されたタンパク質の数を示す。図４Ｂは細胞成分、図４Ｃは生物学的プロセス、図４Ｄは分子機能の３つのカテゴリーに分類したタンパク質がどのような生物学的性質を備えているかまとめた図である。

【図5】正常組織、がん組織由来の細胞外小胞のタンパク質発現を対応のあるｔ検定により解析した結果を示すｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ。

【図6】正常組織、がん組織由来の細胞外小胞におけるＡＺＵ１の発現を示す図。図６ＡはＡＺＵ１の発現を同一患者由来のサンプルを対として示した図。図６Ｂは、がんの病期を表すステージとＡＺＵ１発現の相関を示す図。図６ＣはＡＺＵ１発現をウェスタンブロットにより解析した図。図６Ｄは血清サンプル中のＡＺＵ１量を示す図。

【図7】腎細胞がん株由来の細胞外小胞による血管内皮層のＡＺＵ１に依存した崩壊を示す図。図７Ａは免疫電子顕微鏡像によるＡＺＵ１の発現と局在を示す図。図７Ｂは腎細胞がん株でのＡＺＵ１の発現量と分泌された細胞外小胞中の含有量を示す図。図７Ｃは細胞株から分泌された細胞外小胞を用いたＴＥＥＲ解析結果を示す図。図７ＤはＡＺＵ１を強制発現させたＡＣＨＮ細胞株により分泌される細胞外小胞内のＡＺＵ１量を示すウェスタンブロットの図。図７Ｅは強制発現させたＡＺＵ１の局在を示す免疫電子顕微鏡像。図７ＦはＡＺＵ１強制発現させたＡＣＨＮ細胞株により分泌された細胞外小胞を用いたＴＥＥＲ解析結果を示す図。

【図8】患者由来の細胞外小胞により血管内皮層が崩壊することを示す図。図８Ａ−Ｂは患者組織由来の組織滲出性の細胞外小胞を用いたＴＥＥＲ解析結果を示す図。図８Ｃはがん組織、正常組織由来の組織滲出性の細胞外小胞のＨＵＶＥＣ細胞への取り込みを示す顕微鏡像。図８Ｄは患者由来の組織滲出性の細胞外小胞を用いたＴＥＥＲ解析結果を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、腎細胞がんマーカーの探索を例に、組織から細胞外小胞を単離し、バイオマーカーを解析する方法、疾患関連遺伝子の探索方法を詳述するが、本発明のバイオマーカー、疾患関連遺伝子の探索方法は腎細胞がんに限らず、あらゆる疾患に応用することができる。特に、手術によって疾患組織の切除治療を行うがんは、本発明の方法により有用なバイオマーカー、疾患関連遺伝子を探索することができる。また、疾患組織は、手術だけではなく剖検により得られた組織を用いてもよく、今まで有効なバイオマーカーが見つかっていない筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、多発性硬化症、前立腺がん、膵臓がん、糖尿病、肝疾患、自閉症などの発達障害、脳梗塞など様々な疾患にも応用することができる。

【0017】

例えば、手術によって切除治療を行うがんの場合には、がん部の周囲のいわゆる非がん部（正常組織）も一緒に切除を行う。したがって、同一患者から疾患部位、正常部位の組織を得ることができるため、遺伝的なバックグラウンドの揃ったサンプルを得ることができる。したがって、これらの試料から得られた細胞外小胞を解析することによって、その個体において対象とする疾患とは関係なく発現しているタンパク質や核酸を除外することができる。その結果、疾患特異的なバイオマーカーを探索することができる。また、神経変性疾患など、完全な正常組織が入手できない場合には、重症度、進行度の異なる患者群から組織を入手して、比較定量解析することにより疾患関連遺伝子、バイオマーカーを特定することができる。さらに、組織から滲出するバイオマーカーと血清などの体液から得られたバイオマーカーの情報を組み合わせて用いてもよい。

【0018】

また、患者から得られる組織だけではなく、モデル動物から組織を得て、バイオマーカーを探索することもできる。神経変性疾患、糖尿病など、患者から治療のために組織を切除することのない疾患についても、モデル動物を使うことによって、バイオマーカーを探索することができる。

【0019】

また、探索された疾患特異的なバイオマーカーは、疾患組織から滲出されるものであるが、この中から尿、血液などの体液中に分泌される細胞外小胞に含有されるものを選択することにより、リキッドバイオプシーに用いる疾患マーカーとすることができる。

【0020】

さらに、細胞外小胞には多くのタンパク質などの生体構成成分が含まれていることから、疾患特異的な多数のバイオマーカーを見出すことができる。得られたバイオマーカーの中から複数のバイオマーカーを選択し、組み合わせて測定することにより、診断の感度とともに特異度を上げることができる。複数のマーカーを用いることによって、今まで早期発見することができなかった疾患も検出することが可能となる。

【0021】

また、疾患特異的に発現しているタンパク質や核酸の解析から、疾患に関連し、治療薬のターゲットとなり得る生体構成成分を見出すことも可能である。例えば、疾患組織で高発現しているタンパク質の機能を解析し、疾患の発症や進展に必須の機能を有していれば、それを治療薬のターゲットとして医薬の開発を進めることができる。

【0022】

また、分子標的薬に耐性を獲得した患者由来の組織を用いることで、分子標的薬耐性獲得細胞が放出する細胞外小胞を捉えることが可能になる。細胞のレプリカと考えられている細胞外小胞より耐性打破への活路を見出すことも可能となる。

【0023】

また、探索されたバイオマーカーは、創薬研究の場で候補化合物のスクリーニングを行う際にも使用することができる。ハイスループットスクリーニングでは、細胞株を用いてスクリーニングする場合も多い。スクリーニングに使用する細胞株として、本発明の方法により探索された複数の疾患マーカーと同様の発現傾向を示す細胞株を予め選択すれば、候補化合物の絞込みをより正確に行うことができる。また、細胞株だけではなく、動物モデル、あるいは治験の段階で候補化合物の効果を検討する場合にも、得られたバイオマーカーを使用することができる。

【0024】

以下、腎細胞がんを例に、新規のバイオマーカー探索方法、及びこれを用いた検査方法について詳細に説明する。なお、ヒト組織を用いた解析は各研究機関の倫理委員会の承認を得て行っている。また、腎細胞がん組織、がん組織周辺の正常組織は、患者からインフォームド・コンセントにより同意を得て解析に用いている。

【0025】

［実施例１］Ｔｅ-ＥＶｓの単離方法
図１は疾患組織から組織滲出性の細胞外小胞（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ＥＶｓ、以下、Ｔｅ-ＥＶｓと記載することもある。）を単離し、バイオマーカーを解析する方法の概要を示したものである。手術により切除した組織は、疾患組織、正常組織を切り出し、直ちに浸漬液に浸漬する。腎細胞がんの場合には、浸漬液として無血清ＤＭＥＭを用いているが、浸漬液は、Ｔｅ-ＥＶｓを抽出する組織によって適宜選択することができる。血清中には細胞外小胞が含まれるため、浸漬液としては無血清培地を使用することが好ましいが、予め細胞外小胞を除去すれば、血清を含有した培地を使用してもよい。

【0026】

疾患部位、正常部位より採取した組織片は、浸漬液中で、４℃、１時間程度静置し、細胞外小胞を分泌させる。浸漬液中で静置する時間は、得られた組織片の量によって調整することができる。組織片を長時間浸漬液中に静置することによって、より多くの細胞外小胞を得ることができる。また、組織を浸漬する温度条件は０℃〜３７℃であれば、いずれの温度でもよい。温度が高い方が、分泌速度が速く、得られる細胞外小胞等の量も多いことから、浸漬時間、温度は適宜定めればよい。また、静置ではなく、振盪、転倒、回転など浸漬液が緩やかに撹拌されるようにして浸漬することもできる。十分に細胞外小胞を分泌させた後、２，０００ｇで３０分遠心し、組織片、及び細胞を沈殿させ除去する。次に、１６，０００ｇで３０分遠心し、細胞破片を沈殿させ除去する。さらに、上清を１００，０００ｇで９０分遠心することによって、疾患組織、正常組織から分泌されたＴｅ-ＥＶｓを沈殿させて集める。得られたＴｅ-ＥＶｓはＰＢＳに懸濁し、１００，０００ｇで９０分遠心し洗浄する。単離されたＴｅ-ＥＶｓは、同一の患者から得られた疾患組織、正常組織由来の細胞外小胞であることから、遺伝的バックグラウンドは同一であり、両者を比較解析することにより、疾患特異的なバイオマーカーを選択することができる。

【0027】

単離したＴｅ−ＥＶｓはトリプシン消化により、質量分析で解析可能なペプチドに分解する。得られたペプチドは、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）解析により、同定と定量を行う。さらに、統計分析によって各Ｔｅ−ＥＶｓに特異的なタンパク質を解析する。

【0028】

［実施例２］腎組織からの細胞外小胞の精製
２０名の腎細胞がん患者から、がん組織、正常組織（非がん部）、両者が得られたものについてＴｅ-ＥＶｓを採取し解析を行った。腎細胞がんの組織診断は、ヘマトキシリン・エオジン染色により行った。ＡＪＣＣ ＴＮＭ第６版に基づいて分類した患者の病期は、Ｔ１ａ〜Ｔ３ｃまでであった。

【0029】

得られた細胞外小胞の精製度は、ウェスタンブロッティング法、免疫電子顕微鏡法、ナノ粒子トラッキング解析（図２）、及び質量分析（図３）によって解析した。ウェスタンブロッティング法は、得られたＴｅ-ＥＶｓタンパク質各１００ｎｇを用いて常法により行った。一次抗体として、エクソソームマーカーである抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（８Ａ１２）、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（１２Ｃ４）、抗ＣＤ９モノクローナル抗体（１２Ａ１２）（いずれもコスモバイオ社製）、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を用い、ＥＣＬ（ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって検出した。

【0030】

図２上パネルは、３人の患者から得たＴｅ-ＥＶｓをウェスタンブロッティング法により解析した結果である。Ｎは非がん部（正常組織）、Ｔはがん部由来のＴｅ-ＥＶｓを表す。がん部、非がん部を問わず、いずれの試料でもエクソソームマーカーであるＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９の発現が確認された。

【0031】

免疫電子顕微鏡は、一次抗体として抗ＣＤ９モノクローナル抗体（１２Ａ１２）、二次抗体として、２０ｎｍ金コロイド標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社製）を用い、Ｌａｓｓｅｒらの方法（非特許文献６）に基本的に従って行った。具体的には、Ｔｅ-ＥＶｓ試料１μｇをカーボン蒸着されたフォルムバール支持膜上で１時間静置した後、２％パラフォルムアルデヒドで固定し、一次抗体と反応させた。その後、二次抗体と反応させ、電子顕微鏡Ｈ−７６５０（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて観察した。正常組織、がん組織、いずれの組織由来のＴｅ-ＥＶｓ上でも、矢印で示したようにＣＤ９に結合した金コロイドが観察された（図２中央パネル）。

【0032】

電子顕微鏡により観察したところ、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓの粒子径は、ばらつきが大きかった。そこで、各組織由来のＴｅ-ＥＶｓの粒子径をナノ粒子トラッキングにより測定した。腎細胞がん組織は、がん細胞だけではなく、非がん細胞（免疫細胞、内皮細胞、マスト細胞）を含んでいることが知られている（非特許文献７〜１０）。そのため、がん細胞由来のＥＶｓだけではなく、正常細胞由来のＥＶｓが分泌されていると考えられる。そこで、Ｔｅ-ＥＶｓだけではなく、腎細胞がんから樹立された細胞株、７８６−Ｏ、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ-１細胞株から分泌された細胞外小胞も同様に単離、精製し、サイズ分布の解析を行った。

【0033】

７８６−Ｏ、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ-１細胞株はいずれもＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧ、０．１μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地（和光純薬工業株式会社製）中で培養した。細胞株からＥＶｓを単離する場合には、５．０×１０^５細胞を１０ｃｍの培養皿に播種し、４８時間培養し、培養液に分泌されたＥＶｓをＴｅ-ＥＶｓと同様に超遠心法によって集め解析に用いた。

【0034】

２１の正常組織から得られたＴｅ-ＥＶｓ、２８のがん組織から得られたＴｅ-ＥＶｓ、及び上記３つの腎細胞がん株から単離されたＥＶｓを用いて粒子径の解析を行った。ナノ粒子トラッキング解析は、ＮＴＡ ２．０解析ソフトウェアを搭載したＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（マルバーン社製）を用い、すべて同一の条件で解析した（図２下パネル）。腎細胞がん株から得られたＥＶｓの平均粒子径の値は、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓの粒径分布の範囲内であることから、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓには、がん細胞から分泌されたＥＶｓが含まれていることが示唆された。また、正常組織、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓの平均粒子径は有意に異なっていることが明らかとなった（ｐ＜０．００１）。腎細胞がん患者由来の組織では疾患組織、正常組織でＴｅ-ＥＶｓの粒径分布に差が見られたことから、Ｔｅ-ＥＶｓは疾患組織由来、正常組織由来でその粒径分布にも差が見られる可能性がある。

【0035】

次に、２０人の患者から得られたがん組織由来、及び対となる正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓを用い、質量分析によりエクソソームマーカーとして知られている、テトラスパニン分子を同定し、その発現量をＬＣ/ＭＳにより解析を行った（図３）。

【0036】

単離したＴｅ-ＥＶｓは、２０ｍＭジチオスレイトールによって、１００℃、１０分間還元した後、５０ｍＭヨードアセトアミドによって、周囲温度で４５分間アルキル化を行った。その後、５μｌの固定化されたトリプシン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、３７℃で６時間、１０００ｒｐｍで回転搖動させながら消化した。得られたペプチドは、酢酸エチル抽出後、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ μ−ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ（ウォ−ターズ社製）で脱塩し、質量分析を行った。質量分析は、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ ｎａｎｏ−ｆｌｏｗ ＨＰＬＣシステムに直結したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−Ｖｅｌｏｓ質量分析計（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。タンパク質の同定と定量はＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアにより解析した。

【0037】

得られたＴｅ-ＥＶｓの性質を調べるために、テトラスパニン分子の発現量を比較した。１５のテトラスパニン分子が検出され、いずれの組織由来のＴｅ-ＥＶｓも精製度が高いものであることが示された。さらに、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓと比較して、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓにおいては、テトラスパニンファミリーのほとんどの分子の発現が減少していることが明らかとなった。

【0038】

［実施例３］腎細胞がんにおける、がん組織、正常組織のＴｅ-ＥＶｓの解析
２０人の患者から得られたがん組織、及び対になるがん部周辺の正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓを用いて上記と同様にしてＬＣ/ＭＳ解析を行った（図４）。合計で３８７１のタンパク質が同定され、そのうち１６０は正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓ、２５３はがん組織由来のＴｅ-ＥＶｓに特異的な発現であり、３４５８は両者に共通して発現していた（図４Ａ）。

【0039】

図４Ｂ〜Ｄは、これら遺伝子をＤＡＶＩＤ遺伝子オントロジー解析にしたがって、細胞の構成要素（ＣＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、図４Ｂ）、生物学的プロセス（ＢＰ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ、図４Ｃ）、分子機能（ＭＦ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、図４Ｄ）に分類し、夫々組織全体、正常組織、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓに特徴的なタンパク質群を上位６つずつ示したものである。

【0040】

遺伝子オントロジーエンリッチメント解析によれば、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓでは、細胞の構成要素に分類されるタンパク質では膜タンパク質が（図４Ｂ）、生物学的プロセスでは代謝に関するタンパク質が（図４Ｃ）、分子機能ではヌクレオチド結合タンパク質の発現（図４Ｄ）の存在が特徴的であった。がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓ、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓに含まれるタンパク質に違いが見られることは、細胞外小胞に含まれるタンパク質が、がんに関連した種々の事象によっても調節されていることを意味しており、がんマーカーとして有用であることを示している。

【0041】

同定された３８７１タンパク質のうち、腎細胞がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓに特異的な発現を示すタンパク質の解析を行った。同一患者の腎組織から得られたがん組織、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓを一対として対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）により解析した。図５に、がん部、非がん部由来のＴｅ-ＥＶｓで有意（ｐ＜０．０５、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ≧２．０、図５中、点線の両側）に発現に差が見られたタンパク質を示している。また、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅの大きいものを矢印で示している。Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９）、Ｓｔａｒｃｈ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＳＴＢＤ１）、Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ（ＡＺＵ１）、Ｃａｔｅｃｈｏｌ Ｏ-ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＯＭＴ）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎｉｎ−１（ＧＹＧ１）は、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓでは正常組織由来のＴｅ−ＥＶｓに比べ、顕著に含有量が増加していた。

【0042】

腎細胞がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓでは、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓに含まれるタンパク質と比較して、表１の１０６のタンパク質（表１−１、１−２）、あるいは表２の２９１（表２−１〜表２−５）のタンパク質が夫々有意に発現増加、又は発現減少していることが示された。

【0043】

【表1-1】

【表1-2】

【0044】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【0045】

１０６の発現増加が見られるタンパク質のうち、アズロシジン（ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ、以下ＡＺＵ１と記載する。）をはじめとする表３に記載するタンパク質は、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓに含まれるタンパク質と発現量の差が大きく特徴的であることから、腎細胞がんのマーカーとしてより好ましく用いることができる。

【0046】

【表3】

【0047】

特に、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（カルボニックアンヒドラーゼ−９）、Ｃａｔｅｃｈｏｌ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）、Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ １、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（白血球関連免疫グロブリン様レセプター１）、Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＢ、Ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｅｐｓｉｌｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇａｍｍａ、Ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ２， ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｍｅｍｂｅｒ ３、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｎｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｙｐｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ビメンチン）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ３（カルボニックアンヒドラーゼ３）は、腎がんで高発現しているとの報告があることから、特に有用なマーカーであると考えられる。さらにＰｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ-ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ １、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ-ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｎｏｎ-ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １は高発現することによりＴ細胞活性抑制やがん細胞による免疫回避に寄与していることから、創薬標的候補としても有望であると考えられる。これらのマーカーは単独で用いてもよいし、複数のマーカーを組み合わせて用いることにより、特異度、感度を高めることができる。さらに、既存のバイオマーカーと組み合わせて診断に用いてもよい。

【0048】

また、ここではＴｅ-ＥＶｓに含まれるタンパク質の解析結果を示したが、Ｔｅ-ＥＶｓに含まれるどのような生体構成成分を解析してバイオマーカーとして用いてもよい。このような生体構成成分としては、核酸、脂質がある。

【0049】

［実施例４］ＡＺＵ１の解析
以下に、ｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔの原点からの距離が最も離れているＡＺＵ１（ｐ＝２．８５×１０^−３、ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ＝３１．５９、図５において矢印ＡＺＵ１で示す。）について詳細な解析を行った結果を示すが、上記で示した他のタンパク質についても同様にマーカーとして用いることができることは言うまでもない。

【0050】

図６Ａは、２０症例の腎細胞がん患者の正常組織、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓにおけるＡＺＵ１の濃度を示している。質量分析によって解析を行った２０症例の腎細胞がん患者すべてで、がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓでは、ＡＺＵ１の発現増強が見られた。図６Ｂは、がんの進展別にＡＺＵ１の濃度を示したものであるが、腎細胞がんが進行するに伴って、Ｔｅ-ＥＶｓに含まれるＡＺＵ１量は増加していた。病期Ｔ３の腎細胞がん（Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ）のがん部では、非がん部に比べて有意にＡＺＵ１の含有量が高かった。また、図６Ｂ中に拡大図を示すように、初期のがん（Ｔ１ａ〜Ｔ２ａ）であっても、正常組織由来のＴｅ-ＥＶｓと比較して、ＡＺＵ１含有量には差が見られた。

【0051】

また、がんの進行に伴うＡＺＵ１の発現増加をウェスタンブロッティング法によって確認した（図６Ｃ）。各レーン５００ｎｇのＥＶｓタンパク質を電気泳動により分離し、膜に転写後、抗ＡＺＵ１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製）を一次抗体として用い、実施例２と同様にして検出を行った。Ｔ１ａからＴ３ｂの４名の患者から得られたＴｅ-ＥＶｓを解析した結果、いずれの試料においても、がん部（Ｔ）より得られたＴｅ-ＥＶｓでは、非がん部（Ｎ）から得られたＴｅ-ＥＶｓと比較して、顕著にＡＺＵ１の発現が増加していることが確認された。

【0052】

がん由来の細胞外小胞は血清中でも検出されることが報告されている（非特許文献３〜５、１１〜１３）。そこで、血清サンプル中に含まれるＥＶｓのＡＺＵ１量を定量的な質量分析によって測定した（図６Ｄ）。

【0053】

血清試料中のＥＶｓは、ＥＶＳｅｃｏｎｄカラム（ジーエルサイエンス株式会社製）を用いて精製した。健常者１０例の血清に含まれるＥＶｓからは全くＡＺＵ１が検出されなかったのに対し、腎細胞がん患者１９例中１０例でＡＺＵ１が検出された。腎細胞がん組織由来のＴｅ-ＥＶｓのように、がんの進行に伴うＡＺＵ１含有量の増加は見られないものの、Ｔ１ａ〜Ｔ２ｂといった早期のがん患者血清中に含まれるＥＶｓで検出される割合が高かった。この結果は、血清を用いてＡＺＵ１を検出する腎細胞がん検査が有効であることを示している。

【0054】

腎細胞がん患者の血清中に存在する細胞外小胞でＡＺＵ１が検出されたことは、Ｔｅ-ＥＶｓにおいて含有量に差が見られたタンパク質は血清中で検出可能であることを示す。したがって、この方法により探索したバイオマーカーは、血清を用いて検査を行うことができる疾患マーカーとして機能することを示している。

【0055】

［実施例５］腎細胞がんにおけるＡＺＵ１の作用解析
ＡＺＵ１の発現が腎細胞がん組織に特異的に検出されたことから、ＡＺＵ１の生物学的作用の検討を行った。腎細胞がんでは、多くの血管新生が生じ、がん組織の微小環境を構築していることが知られている（非特許文献１４〜１７）。そこで、ＡＺＵ１が血管内皮細胞の形態に及ぼす影響を検討した。

【0056】

まず、免疫電子顕微鏡によって内在性のＡＺＵ１の局在を検討した。ウサギを免疫して得られた抗ＡＺＵ１抗体（アブカム社製）、抗ＣＤ９モノクローナル抗体を一次抗体として用い、大きさの異なる金コロイド粒子によって標識した二次抗体を用いて同一患者の正常組織、がん組織から得られたＴｅ−ＥＶｓでＡＺＵ１の局在を調べた（図７Ａ）。

【0057】

抗ウサギ抗体は４０ｎｍの金コロイド粒子で標識した抗体を、抗マウス抗体は２０ｎｍの金コロイド粒子で標識した抗体を用いている。したがって、図７Ａで大きな粒子はＡＺＵ１の発現を、小さな粒子はＣＤ９の発現を示している。ＣＤ９は正常組織、がん組織どちらから得られたＴｅ−ＥＶｓ表面でも発現が確認できるのに対し、ＡＺＵ１はがん組織由来のＴｅ−ＥＶｓ表面にのみ発現が見られた。

【0058】

腎細胞がん株におけるＡＺＵ１発現をウェスタンブロット法により確認した（図７Ｂ）。７８６−Ｏ、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２（ＡＴＣＣより入手）細胞株から単離したＥＶｓ、及び細胞溶解物（Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）におけるＡＺＵ１の発現を検討した。いずれの細胞においてもＡＺＵ１の発現が確認されたが、７８６−Ｏ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２の３つの細胞株の培養液から単離されたＥＶｓ（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅｄｉａ ＥＶｓ、以下ＣＭ−ＥＶｓと記載することもある。）においてはＡＺＵ１が検出されるものの、ＡＣＨＮ細胞株由来のＣＭ−ＥＶｓではＡＺＵ１がほとんど検出されなかった。

【0059】

次に、これら細胞株から得られたＣＭ−ＥＶｓの血管内皮細胞の透過性を経内皮電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）によって解析した（図７Ｃ）。ＴＥＥＲはＨＵＶＥＣ細胞（Ｇｉｂｃｏ社より入手。）を用いて測定した。４．０×１０^４個のＨＵＶＥＣ細胞を細孔径０．４μｍの２４ウェルカルチャーインサート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に播種し４日間培養後、各細胞株から得たＣＭ−ＥＶｓを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ−２電圧電流計（ミリポア社製）を用いてＴＥＥＲを測定し、以下の式により各試料のＴＥＥＲを算出した。

【0060】

[式１]
（試料ウェルの電気抵抗（Ω）−空のウェルの電気抵抗（Ω））×培養面積（ｃｍ^２）＝ＴＥＥＲ（Ωｃｍ^２）

【0061】

結果を図７Ｃに示す。経時的にＴＥＥＲを測定した結果、ＣＭ−ＥＶｓ添加２４時間後には、ＨＵＶＥＣ細胞シートのＴＥＥＲの減少が見られた。特に、より多くのＡＺＵ１がＥＶｓ上に表出していたＣａｋｉ−１及び７８６−Ｏ細胞から得られたＣＭ−ＥＶｓを添加したものでは顕著にＴＥＥＲの減少が確認された。

【0062】

より多くのＡＺＵ１を表出しているＥＶｓが透過性を高める作用があると考えられたことから、ＡＺＵ１を強制発現させた系を用いて詳細な解析を行った。ＡＺＵ１がＣＭ−ＥＶｓにほとんど検出されなかったＡＣＨＮ細胞に、ＡＺＵ１−ＦＬＡＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）を導入し強制発現させた。図７Ｄに示すように、ＡＺＵ１−ＦＬＡＧを強制発現させたＡＣＨＮ細胞株では、ＥＶｓにも多くのＡＺＵ１−ＦＬＡＧが含まれていることが確認された。

【0063】

さらに、ＥＶｓ上にもＡＺＵ１−ＦＬＡＧが表出していることを免疫電子顕微鏡により確認した。抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社製）を一次抗体として、金コロイド標識抗マウス抗体を用いてＦＬＡＧの検出を行った（図７Ｅ）。ベクターのみを導入した細胞から得られたＣＭ−ＥＶｓにはＦＬＡＧが検出されないのに対し、ＡＺＵ１−ＦＬＡＧを導入した細胞から得られたＣＭ−ＥＶｓ上にはＦＬＡＧが検出された。以上の結果から、強制発現させたＡＺＵ１−ＦＬＡＧも内在性のＡＺＵ１と同様にＥＶｓ上に表出していることが確認された。

【0064】

この発現系を用いＨＵＶＥＣを用いて透過性を検討した（図７Ｆ）。ＡＺＵ１を強制発現させた細胞から得られたＣＭ−ＥＶｓは、ベクターのみを導入した細胞から得られたＣＭ−ＥＶｓに比べて、顕著にＴＥＥＲを減少させることが明らかとなった。したがって、ＡＺＵ１には血管内皮細胞の形態を破壊する作用があることが示唆される。

【0065】

次に、腎細胞がん患者から得られたＴｅ−ＥＶｓでも同様の作用があるか検討を行った。様々な病期の６人の患者から得られた正常組織、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓを用いて細胞の透過性を測定した。図８Ａは、患者ごとに正常組織、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓ添加後のＴＥＥＲの経時的な変化を示したものであり、図８Ｂは各測定値をまとめてプロットしたものである。がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓを添加することにより１２時間後からＴＥＥＲの顕著な減少が見られた。また、がんが進行している患者から得られたＴｅ−ＥＶｓを添加することにより、より顕著なＴＥＥＲの減少が示された。

【0066】

正常組織、がん組織に由来するＴｅ−ＥＶｓのＴＥＥＲに対する効果の違いが、夫々の組織に由来するＴｅ−ＥＶｓの細胞への取り込みに起因するか検討した。正常組織由来、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓを夫々ＰＫＨ−６７、又はＰＫＨ−２６（シグマアルドリッチ社製）で標識した後に混合し、ＨＵＶＥＣ細胞の培養液に添加し、１２時間後に顕微鏡観察を行った。図８Ｃは、２人の患者から得られたＴｅ−ＥＶｓを用いた結果を示している。いずれの試料でも核の周囲に明るく見える正常組織由来のＴｅ−ＥＶｓ（蛍光顕微鏡下では緑色に染色されている。）も、暗い染色像として確認されるがん組織由来のＴｅ−ＥＶｓ（蛍光顕微鏡下では赤に染色されている。各２つずつ矢印で示している。）も同程度検出されている。したがって、Ｔｅ−ＥＶｓの取り込み効率は、Ｔｅ−ＥＶｓの由来する組織によって変化がないことが確認された。すなわち、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓが引き起こすＴＥＥＲの減少は、Ｔｅ−ＥＶｓの取り込み効率の違いによるものではないことが示された。したがって、Ｔｅ−ＥＶｓ上に表出しているＡＺＵ１に代表されるタンパク質等によるものであると考えられる。

【0067】

患者の血液中では、がん組織由来、正常組織由来のＴｅ−ＥＶｓが混合された状態で循環している。混合した状態でＴＥＥＲの減少が誘導されるか検討した。図８Ｄは３人の患者から得られた正常組織由来、がん組織由来のＴｅ−ＥＶｓを混合し、ＨＵＶＥＣ細胞の培養液に添加し、経時的にＴＥＥＲ測定を行った結果である。いずれの患者から得られたＴｅ−ＥＶｓも、がん組織由来、正常組織由来のＴｅ−ＥＶｓを混合して用いてもＴＥＥＲの減少が観察された。この結果は実際の患者体内での現象を反映しているものと考えられ、ＡＺＵ１により血行性の転移が誘導されるものと考えられる。

【0068】

上記結果からＡＺＵ１は、腎細胞がんの発症や進展に密接に関与している疾患関連遺伝子であると考えられる。したがって、ＡＺＵ１を標的として治療薬を創製することができる。このように、疾患特異的に発現しているタンパク質や核酸などの生体構成成分の機能を解析することによって、新たな治療薬の標的を見出すことができる。

【0069】

［実施例６］患者血清を用いた解析
血清中のＥＶｓで腎細胞がん患者に特徴的なタンパク質を検出することができれば、腎細胞がんの早期発見に有用なマーカーとすることができる。そこで、血清中に含まれるＥＶｓ中において、腎細胞がん患者と健常者とで差が見られるタンパク質を探索した。表４は、血清中のＥＶｓにおいて、腎細胞がん患者では検出できるが、健常者では検出できなかったタンパク質のうち、表１及び表２に示すＴｅ−ＥＶｓの解析結果により検出されたものを除いて記載している。

【0070】

【表4】

【0071】

これらタンパク質は、腎細胞がん患者に特徴的ではあるものの、すべての腎細胞がん患者から検出されるわけではない。しかし、これらのマーカーを複数組み合わせることによって、血液試料を用いて腎細胞がんの患者を早期に検出することが可能となる。腎細胞がん患者のＴｅ-ＥＶｓから得られた知見に加えて、腎細胞がん患者の血清中で特異的に検出されたこれらタンパク質は今まで有効なバイオマーカーのなかった腎細胞がんの新たなマーカーとなる。

【産業上の利用可能性】

【0072】

本発明のバイオマーカーの探索方法により、細胞外小胞に含まれる組織特異的な疾患マーカーを得ることができる。細胞外小胞は体液に分泌されることから、非侵襲的、あるいは低侵襲的な疾患マーカーとして非常に有用である。この方法を用いれば、今まで有効なバイオマーカーのなかった疾患であっても、バイオマーカーを得ることができる。

【0073】

さらに、ここで示した腎細胞がんマーカーは、これまで有効なバイオマーカーが存在しなかった腎細胞がんの新しいマーカーとして腎細胞がんの検査に用いることができる。また、ＡＺＵ１は血管内皮細胞の形態を破壊する作用を有することから、がん細胞の転移に重要であることが示唆される。よって、ＡＺＵ１を標的とした分子標的薬は抗がん転移作用が期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】