特許 6723980 大腸炎抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6723980

(24)【登録日】2020年6月26日

(45)【発行日】2020年7月15日

(54)【発明の名称】大腸炎抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/747 20150101AFI20200706BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20200706BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20200706BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20200706BHJP

   A23L 33/135 20160101ALN20200706BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/747

   A61K35/74 A

   A61P1/04

   C12N1/20 EZNA

   !C12N15/09

   !A23L33/135

【請求項の数】13

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-502510(P2017-502510)

(86)(22)【出願日】2016年2月26日

(86)【国際出願番号】JP2016055811

(87)【国際公開番号】WO2016136942

(87)【国際公開日】20160901

【審査請求日】2019年2月19日

(31)【優先権主張番号】特願2015-38302(P2015-38302)

(32)【優先日】2015年2月27日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NITE  NITE BP-02002

【微生物の受託番号】NITE  NITE BP-02003

【微生物の受託番号】NITE  NITE BP-02004

(73)【特許権者】

【識別番号】000006138

【氏名又は名称】株式会社明治

(74)【代理人】

【識別番号】100091982

【弁理士】

【氏名又は名称】永井 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100082991

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 泰和

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100176083

【弁理士】

【氏名又は名称】松山 祐子

(72)【発明者】

【氏名】小林 杏輔

(72)【発明者】

【氏名】浅見 幸夫

(72)【発明者】

【氏名】小山 里美

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５０２９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HIRAMATSU Yukihiro et al.，The anti-inflammatory effects of a high-frequency oligodeoxynucleotide from the genomic DNA of Lacto，International Immunopharmacology，２０１４年，Vol.23, No.1，pp.139-147，ISSN: 1567-5769, 特に要約、図

【文献】 ELAINE O. Petrof et al.，Probiotics Inhibit Nuclear Factor-kB and Induce Heat Shock Proteins in Colonic Epithelial Cells Thro，GASTROENTEROLOGY，２００４年，Vol.127，pp.1474-1487，ISSN: 0016-5085, 特に要約、第１４７４−１４７５頁、図８

【文献】 FUKUSHIMA Yoichi，Probiotics and Natural Defense Function of the Host，Bioscience and Microflora，２００７年，Vol.26, No.1，pp.1-10，ISSN: 1342-1441, 特に要約

【文献】 大草 敏史 他，乳酸菌LC1株(Lactobacillus johnsonii La1)のDSS腸炎に対する発症予防,抑制効果，日本消化器病学会雑誌，２００５年，Vol.102 臨時増刊号，p.A138 (W1-12)，ISSN:0446-6586, 特に結果欄

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎抑制剤であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌がラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、大腸炎抑制剤。

【請求項2】

ラクトバチルス属乳酸菌が、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞のそれと比較して１．５倍以上に増加させることができる、請求項１に記載の大腸炎抑制剤。

【請求項3】

大腸炎が炎症性腸疾患である、請求項１または２に記載の大腸炎抑制剤。

【請求項4】

炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載の大腸炎抑制剤。

【請求項5】

便性を改善するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸炎抑制剤。

【請求項6】

大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを含む大腸炎抑制剤の製造方法であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、製造方法。

【請求項7】

大腸炎抑制剤の製造における、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、使用。

【請求項8】

大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される使用。

【請求項9】

大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌であって、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、ラクトバチルス乳酸菌。

【請求項10】

大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎を抑制するための組成物であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌がラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、組成物。

【請求項11】

経口摂取用組成物または経口投与用組成物に大腸炎抑制効果を付与するため、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌がラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、使用。

【請求項12】

大腸炎を抑制するための組成物を製造するための、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用であって、前記ラクトバチルス属乳酸菌がラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、使用。

【請求項13】

経口摂取用組成物または経口投与用組成物に大腸炎抑制効果を付与するための方法であって、前記組成物と大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌とを混合する工程を含み、前記ラクトバチルス属乳酸菌がラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株からなる群から選択される、方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本特許出願は、先に出願された日本国特許出願である特願２０１５−０３８３０２号（出願日：２０１５年２月２７日）に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本願発明の開示の一部とされる。

【発明の背景】

【0002】

技術分野
本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎抑制剤に関する。

【0003】

背景技術
大腸炎は、大腸におこる炎症性疾患であり、大腸炎には、自己免疫性疾患である炎症性腸疾患、特発性疾患であるベーチェット症、虚血性腸炎、および感染症性腸炎などが含まれる。炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）は、潰瘍性大腸炎とクローン病の２つに大別され、これらは共に日本の特定疾患に指定されている。これらの病因は不明であり、腸内細菌の関与や免疫機能の異常などが病因として考えられている。現在のところ、潰瘍性大腸炎の発症は、日本において、人口１０万人あたり１００人程度と、米国における半分以下であり、クローン病の発症は、日本において、人口１０万人あたり２７人程度と、米国における約１０分の１であるが、将来には、日本においても、生活の欧米化に伴い、炎症性腸疾患の罹患率は増加すると考えられている。

【0004】

潰瘍性大腸炎とクローン病では、治療が困難であり、根本的な治療方法は確立されていない。内科療法として、潰瘍性大腸炎には、薬物療法（５−アミノサリチル酸薬（５−ＡＳＡ）などのサルファ剤、プレドニゾロンなどのステロイド剤、免疫調節剤・抑制剤など）が主体的に用いられ、クローン病には、栄養療法・食事療法（完全静脈栄養療法、経腸栄養療法、食餌療法）も併用されている。

【0005】

一方、炎症性腸疾患をはじめとする大腸炎では、外的刺激から腸粘膜を保護するために、哺乳動物の腸管で働いている種々の防御機構が破綻することにより発症すると考えられており、腸管保護剤の開発が進められている。例えば、特許文献１：特開２０１０−８３８８１号公報には、ラクトバチルス ブレビス ＳＢＣ８８０３菌株の加熱死菌体の経口投与によって、ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）により誘発される潰瘍性大腸炎類似の腸管炎症が抑制されたことが報告されている。

【0006】

また、特許文献２：特許第５１１６１９４号公報には、ラクトバチルス属細菌のラクトバチルス カゼイ ＹＩＴ９０２９、ラクトバチルス ガッセリ ＹＩＴ０１６８の菌体または菌体由来多糖画分を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤が報告されている。

【0007】

一方で、これらのラクトバチルス属の大腸炎抑制効果は十分ではなく、また特定の菌株が用いられているのみである。このように、日常的に安全に簡単に摂取できる乳酸菌を有効成分とする効果の高い大腸炎抑制剤は報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１０−８３８８１号公報

【特許文献2】特許第５１１６１９４号公報

【発明の概要】

【0009】

本発明は、安全で優れた大腸炎抑制効果を有する大腸炎抑制剤およびその製造方法を提供することを目的とする。

【0010】

本発明者らは、今般、インビトロにて共に培養される大腸細胞において、特にヒートショックプロテイン７０の発現増強活性を示すラクトバチルス属乳酸菌が、安全で優れた大腸炎抑制作用を有することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。

【0011】

本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制剤。
（２）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である、（１）に記載の大腸炎抑制剤。
（３）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株から選択されるものである、（１）または（２）に記載の大腸炎抑制剤。
（４）ラクトバチルス属乳酸菌が、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞のそれと比較して１．５倍以上に増加させることができる、（１）〜（３）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（５）大腸炎が炎症性腸疾患である、（１）〜（４）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（６）炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、（５）に記載の大腸炎抑制剤。
（７）便性を改善するための、（１）〜（６）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（８）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法。
（９）大腸炎抑制剤の製造における、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１０）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１１）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌。
（１２）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法。

【0012】

本発明の大腸炎抑制剤によれば、大腸炎、特に炎症性腸疾患を効果的に抑制することができる。本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることから、大腸炎を安全に抑制し、かつ便性を改善する上で有利に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、Ｃａｃｏ−２細胞における数種類のラクトバチルス ジョンソニ株の投与によるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子発現誘導におけるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の比率を示したグラフである。Ｎ＝３。

【図2】図２は、動物実験のスケジュールの概略を示す概念図である。 第１群（１０匹）：蒸留水＋ＰＢＳ（リン酸緩衝液）の投与群、 第２群（１０匹）：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、 第３群（１０匹）：ＤＳＳ水溶液（２．０ｗ／ｖ％）＋ＰＢＳの投与群、 第４群（１０匹）：ＤＳＳ水溶液（２．０ｗ／ｖ％）＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。

【図3】図３は、ＤＳＳの投与時の各群の平均体重の変化率を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５、Ｇ１群との比較）。 ｄａｙ１（１日目）を１００とした場合の変化率である。 Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、 Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。

【図4】図４は、解剖時のＤＳＳの投与群（Ｇ３とＧ４）の炎症スコアを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。 Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。

【図5】図５は、解剖時の各群の大腸の長さと単位長さ当たりの重量を示すグラフである（＊＊ｐ＜０．０１、Ｇ１群との比較）。 Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、 Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。

【発明の具体的説明】

【0014】

大腸炎抑制剤
本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としている。ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が、顕著な大腸炎抑制作用を有することは意外な事実である。

【0015】

ＨＳＰ７０は、熱や紫外線などにより発現が誘導されるタンパク質の１種であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ＨＳＰ７０は、ＨＳＰＡ１Ａ（エイチエスピーエーワンエー）がコードするタンパク質であり、ＨＳＰＡ１Ａの遺伝子配列は、例えば、配列番号２を参照することで特定できる。よって、本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としてもよい。

【0016】

ラクトバチルス属乳酸菌におけるＨＳＰ７０の発現増強活性の有無は、本願明細書の実施例の例１（インビトロ試験）の記載の通り、ＨＳＰ７０をコードするＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標とした比較試験により判定することができる。かかる比較試験では、ラクトバチルス属乳酸菌と共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して高い場合、ラクトバチルス属乳酸菌はＨＳＰ７０の発現増強活性を有するものとされる。

【0017】

ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））の発現量を基準として算出することができる。

【0018】

本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。

【0019】

本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。

【0020】

本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍倍以上、さらに好ましく１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは、３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。

【0021】

ＨＳＰ７０の発現増強活性の測定に用いられる大腸細胞は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、Ｃａｃｏ−２細胞が好ましい。

【0022】

本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、例えば、ラクトバチルス ジョンソニ、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス ガッセリ、ラクトバチルス ヘルベティカスなどであり、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である。そして、ラクトバチルス属乳酸菌は、好ましくは、生菌体であり、これを摂取することにより、腸内環境が改善され、排便の回数、便の量、その形、色あるいは臭いなどの便性を改善することができる。

【0023】

ラクトバチルス ジョンソニは、グラム陽性の桿菌であり、ホモ乳酸発酵の形式、好気的条件にて発育性を有する。そして、ラクトバチルス ジョンソニは、ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ）平板上に、それを塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学）を用いた嫌気的条件にて３７℃、４８時間で培養すると、円形、白色、扁平状コロニーを形成する。また、ラクトバチルス ジョンソニは、大腸炎を効果的に抑制する上で、特に有利に使用することができる。

【0024】

ラクトバチルス ジョンソニは、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株であり、より好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、さらに好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株である。これらは１種類の単独のものを有効成分として用いてもよいし、２種類以上を混合したものを有効成分として用いてもよい。

【0025】

ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００３（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL203565）として寄託されている。

【0026】

ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００４（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL204255）として寄託されている。

【0027】

ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００２（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL2978）として寄託されている。

【0028】

本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌をそのまま用いてもよく、ラクトバチルス属乳酸菌と共に経口上で許容可能な他の成分を併用してもよい。

【0029】

経口上で許容可能な他の成分は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤等の添加剤や、内科療法用の薬剤などである。

【0030】

本発明の大腸炎抑制剤の形態は、特に制限されず、粉末状、錠剤状、カプセル状またはドリンク剤状であってよい。

【0031】

本発明の大腸炎抑制剤の形態は、ラクトバチルス属乳酸菌が大腸炎の抑制のための有効量となるように、１回の摂取量の単位から構成されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量の単位は、ラクトバチルス属乳酸菌を、１×１０^７〜１×１０^９ＣＦＵ／ｍｌで、１００ｍｌ以上で含有することが好ましく、２００ｍｌ以上で含有することがより好ましい。

【0032】

本発明の大腸炎抑制剤の形態は、１回の摂取量当たりの単位で包装されて提供されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量当たりの単位包装の形態は、ソフトパック、プラスチック容器などの包材で、一定量を規定する形態が挙げられ、それら包材などの表面には、１回の摂取量当たりの成分表示や、大腸炎の抑制などの用途表示を付していてもよい。かかる単位包装の形態は、サプリメント、医薬製剤などを好適に例示できる。

【0033】

本発明の大腸炎抑制剤の形態は、徐放性製剤にしてもよい。本発明の大腸炎抑制剤の形態を徐放性製剤にすることは、ラクトバチルス属乳酸菌が経口摂取されてから、それらを生きたままで大腸細胞に到達させる上で好ましい。

【0034】

本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を、所望により経口上許容な他の成分と共に混合して簡易に製造することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法が提供される。

【0035】

本発明の製造方法は、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共にインビトロにて培養し、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量が、予め設定した閾値よりも高いラクトバチルス属乳酸菌を選択する工程を含んでいてもよい。

【0036】

前記の選択する工程において、ＨＳＰ７０の発現量を測定する方法は、特に制限されず、ＨＳＰ７０の発現量を直接的または間接的に測定する手法を用いることができる。かかる測定方法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングなどが挙げられる。

【0037】

また、前記の選択する工程において、予め設定した閾値は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量とすることができる。かかるＨＳＰ７０の発現量の閾値は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標として測定してもよい。さらに、ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を基準として算出してもよい。かかるハウスキーピング遺伝子として、例えば、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＧＡＰＤＨを用いることが好ましいが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）などを用いてもよい。

【0038】

さらに、前記の選択する工程において、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共に培養する方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、当業者であれば適宜設定することができる。かかる培養条件（温度、培地、培養時間）として、例えば、大腸細胞がＣａｃｏ−２細胞である場合、３７℃、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地、ＣＯ_２環境下で、２４時間が挙げられる。

【0039】

本発明の別の態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤では、大腸炎抑制剤を含んでなる組成物を提供することができる。すなわち、本発明の大腸炎抑制剤では、そのまま単独で使用することもできるが、大腸炎抑制機能が発揮される限りにおいて、食品や医薬品などの種々の経口摂取用（経口投与用）の組成物に対して、原料（素材）や添加剤などとして含ませることもでき、大腸炎抑制効果を有する組成物を得ることができる。よって、本発明の一つの実施態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤を含んでなる組成物が提供される。

【0040】

本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする組成物を提供することができる。本発明の組成物は、食品組成物または医薬組成物であってよい。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。

【0041】

食品組成物とは、医薬組成物以外のものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物など、経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品などが挙げられる。好ましくは、食品は、乳製品であり、より好ましくは乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類である。

【0042】

また食品には、健康食品（サプリメント含む）、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調整粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または疾病リスク低減表示を付した食品のような分類のものも包含される。

【0043】

本発明の好ましい態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制用乳製品、好ましくは大腸炎抑制用乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。

【0044】

医薬組成物とは、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製したものである。経口製剤の場合には、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態をとることができる。また、非経口製剤の場合には、注射剤や座剤の形態をとることができる。簡易性の点からは、経口製剤であることが好ましい。製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物には、大腸炎の抑制を必要とする疾患、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎のための医薬組成物、より具体的には予防用組成物および治療用組成物が含まれる。

【0045】

また、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法が提供される。ここで、「抑制」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来に確立される可能性がある病態を予防する概念も含まれる。さらに本発明の「抑制」には、非治療的な概念、例えば、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和も含まれる。したがって、別の態様によれば、大腸炎の抑制は、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和であり、好ましくは非治療的である。

【0046】

大腸炎の抑制方法は、ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、上述した大腸炎抑制剤における１回の摂取量の単位と同様に設定や調整することができる。

【0047】

ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させる方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、経口摂取や経腸摂取などであり、好ましくは経口摂取である。

【0048】

本発明のラクトバチルス属乳酸菌の摂取計画は、特に限定されず、対象の年齢、性別、症状および状態に応じて、当業者が適宜設定することができる。本発明の対象に対して、１回の経口摂取量の単位を、例えば、１日当たり１〜１０回で投与してもよいが、好ましくは、１日当たり１〜３回で投与することであり、より好ましくは、１日当たり１回で投与することである。また、本発明の大腸炎抑制剤は、食事とともに摂取することができる。

【0049】

本発明の大腸炎として、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎であり、好ましくは、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）であり、より好ましくは、潰瘍性大腸炎である。

【0050】

本発明の対象として、哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類、ヒトであり、好ましくは、ヒトであり、より好ましくは、大腸炎を患う患者である。また、本発明の対象は、健常者であってもよい。かかる健常者の例としては、大腸炎を患う患者と診断されないものの、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態を有するか、あるいはそれらの症状または状態を生じる恐れのある者であることが好ましい。なお、大腸炎を患う患者か否かは、例えば、潰瘍性大腸炎は、Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee, Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan, IBP Research 4: 189-239, 2010（特に（１４）頁の２、（１６）頁の図１参照）等、クローン病は、Fumiaki Ueno et. al. Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn's disease, integrated with formal consensus of experts in Japan, J Gastroenterol (2013) 48: 31-72（特に３８頁のＩＩ、４３頁のＩＩ−８、４４頁の表５参照）等、公知の診断方法に基づき診断することができる。

【0051】

本発明の一つの態様によれば、大腸炎抑制剤の製造における、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用が提供される。また、本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の、大腸炎を抑制するための使用が提供される。本発明の好ましい一つの態様によれば、該使用は、非治療的使用である。かかる使用は、上述した大腸炎抑制剤および大腸炎の抑制方法の記載に準じて実施することができる。

【0052】

本発明の一つの態様によれば、大腸炎を抑制するための、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。

【実施例】

【0053】

本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

【0054】

例１：ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現誘導試験（インビトロ試験）
（１）生菌懸濁液とＣａｃｏ−２細胞の調製
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株、ラクトバチルス ジョンソニＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ）を用いて、３７℃、嫌気条件下にて１回の継代で培養した。そして、各菌を遠心分離処理（８，０００ｒｐｍ、５分間）して沈殿させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、 Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後に、分光光度計（Ｕ−２８１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ， ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、波長６５０ｎｍで濁度（ＯＤ）を測定した。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔｓ）タブレット（ＴａＫａＲａ社）を蒸留水に溶解して調製した。その後に、ＰＢＳを用いて、各菌がＯＤ＝５となるように調整し、生菌懸濁液を調製した。

【0055】

ヒト結腸癌由来細胞であるＣａｃｏ−２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社）を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンとなるように配合した、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、 Ｄ６５４６， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、３７℃、５％のＣＯ_２の環境下（ＮＡＰＣＯ Ｓｅｒｉｅｓ ５４００ ＣＯ_２ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて培養した。

【0056】

生菌懸濁液を投与する前日に、１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、Ｃａｃｏ−２細胞を６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ社）に継代した。

【0057】

（２）ＨＳＰ遺伝子の発現誘導試験
生菌懸濁液を２０μｌ／ｗｅｌｌで、前記の継代後のＣａｃｏ−２細胞を含む６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃、５％のＣＯ_２の環境下にて２４時間で共培養した。この共培養を終了した直後に、これら培養液（培地）を吸引除去し、そこに、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ （Ａｍｂｉｏｎ社）を添加し、細胞を浸漬した。これら細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により、ＲＮＡを抽出してから、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ， ＴａＫａＲａ社）を用いて、逆転写反応を行った。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ， ＴａＫａＲａ社）を用いて、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ−８００（ＴａＫａＲａ）により、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃａｃｏ−２細胞のＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現解析を行った。

【0058】

リアルタイムＰＣＲで用いたプライマーと反応液の組成をそれぞれ表１と表２に示す。

【0059】

【表1】

【0060】

【表2】

【0061】

リアルタイムＰＣＲの反応条件は、（９５℃、３０秒間） → （９５℃、５秒間 →
６０℃、３０秒間）×４０サイクル → ９５℃、１５秒間 → ６０℃、３０秒間 → ９５℃、１５秒間 → ４℃とした。

【0062】

対照群として、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与し、共培養したものを用いた。

【0063】

結果を図１に示す。

【0064】

図１に示されるように、対照群と比較して、ラクトバチルス ジョンソニの生菌の投与群では、ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現上昇が見られた。

【0065】

例２：インビボ試験
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株をマウスに投与し、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、分子量： ３６，０００〜５０，０００Ｄａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で誘発される大腸炎への抑制効果を、動物実験により検討した。

【0066】

生菌懸濁液では、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の １×１０^８ｃｆｕを、ＰＢＳの ２００μｌに懸濁して調製した。そして、この生菌懸濁液を、ゾンデにより毎日で強制経口投与した。なお、ＤＳＳ水を自由飲水とした。

【0067】

ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、オス、チャールスリバー社）を用いて、各群を１０匹ずつとした。ＤＳＳ水（２．０ｗ／ｖ％）の投与の１週間前から、生菌懸濁液をマウスに毎日で投与した。ＤＳＳ水の投与の初日を１日目として１週間で（ＤＳＳ水の投与後の７日目まで）、ＤＳＳ水と生菌懸濁液の混合物を毎日で投与した。

【0068】

対照群として、ＤＳＳ水の代わりに、蒸留水を投与したものと、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与したもの、ＤＳＳと生菌懸濁液の代わりに、蒸留水とＰＢＳを投与したものを用いた（図２参照）。

【0069】

ＤＳＳの投与期間中には、マウスの体重の測定値と炎症スコアを毎日で記録した。

【0070】

炎症スコアでは、下痢と血便のスコアを付けて、表３に従って、スコアを０から３までで評価した。

【0071】

【表3】

【0072】

ＤＳＳの投与期間の終了後（８日目）に、マウスを解剖し、大腸を採取して、それらの長さと重量を測定した。解剖時の炎症スコアとして、下痢と血便のスコアの合計を平均したものについて、ＤＳＳの投与群間で比較した。

【0073】

マウスの体重、大腸の長さ・大腸の単位長さ当たりの重量では、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔで群間を比較した。炎症スコアでは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔで群間を比較した。統計処理の結果、ｐ＜０．０５のときに、有意であると判断した。グラフでは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。

【0074】

それぞれの結果を図３〜５に示す。

【0075】

図３に示されるように、ＤＳＳで誘発される大腸炎により、マウスの体重が減少するが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与により、マウスの体重の減少が抑制されることを確認できた。なお、Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、 Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。

【0076】

図４に示されるように、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、炎症スコアが有意に減少していた。

【0077】

図５に示されるように、ＤＳＳの投与群では、大腸の長さが短縮されていた。また、蒸留水＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群では、単位長さ当たりの重量が有意に増加したが、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、有意差が見られなかった。

【0078】

結論として、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の生菌を投与することで、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制されることを確認できた。

【0079】

ここにはデータを示さないが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の代わりに、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を用いた場合にも、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株と同様にして、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制される傾向があることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]