特許 6741280 ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物、及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6741280

(24)【登録日】2020年7月29日

(45)【発行日】2020年8月19日

(54)【発明の名称】ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物、及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/05 20060101AFI20200806BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20200806BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20200806BHJP

   A61K 35/68 20060101ALI20200806BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20200806BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20200806BHJP

   C07K 5/068 20060101ALN20200806BHJP

   C07K 5/072 20060101ALN20200806BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20200806BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/05

   A61P43/00 111

   A61P9/12

   A61K35/68

   A23L33/18

   A23L33/10

   !C07K5/068

   !C07K5/072

   !C12N1/00 B

【請求項の数】9

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2019-68561(P2019-68561)

(22)【出願日】2019年3月29日

(65)【公開番号】特開2019-172674(P2019-172674A)

(43)【公開日】2019年10月10日

【審査請求日】2020年1月10日

(31)【優先権主張番号】特願2018-65230(P2018-65230)

(32)【優先日】2018年3月29日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】592072377

【氏名又は名称】株式会社ウォーターエージェンシー

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(74)【代理人】

【識別番号】100094248

【弁理士】

【氏名又は名称】楠本 高義

(74)【代理人】

【識別番号】100203688

【弁理士】

【氏名又は名称】平松 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185454

【弁理士】

【氏名又は名称】三雲 悟志

(74)【代理人】

【識別番号】100199831

【弁理士】

【氏名又は名称】中川 茂樹

(74)【代理人】

【識別番号】100121337

【弁理士】

【氏名又は名称】藤河 恒生

(72)【発明者】

【氏名】中野 長久

(72)【発明者】

【氏名】吉田 京子

(72)【発明者】

【氏名】久保 暢子

(72)【発明者】

【氏名】六代 稔

(72)【発明者】

【氏名】尾崎 紀哉

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６０−１９７６２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１８６１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−１００２７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１０１３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３７１９４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ユーグレナの細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ未満であるペプチドを含有する水溶性成分の画分から成るか、又は前記画分を含んで成る組成物であって、
前記組成物は、前記細胞に由来する脂質、当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるタンパク質、及び当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるポリペプチドを実質的に含有しておらず、
前記細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ未満であるペプチドには、アンジオテンシンI変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有する、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物が含まれている、
ＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物。

【請求項2】

経口摂取または経口投与される、請求項１に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物。

【請求項3】

前記ジペプチド化合物の含有量が２．０ｍｇ／Ｌ以上である、請求項１又は請求項２に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物。

【請求項4】

さらに、前記細胞に由来する遊離アミノ酸およびその塩を実質的に含有していない、請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物。

【請求項5】

前記細胞は、アンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育したか、または、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３４．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上でありアンモニア態窒素の含有量が１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育した、請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物。

【請求項6】

請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物が、添加または配合または混合されて成る食品組成物。

【請求項7】

請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物が、添加または配合または混合されて成る医薬組成物。

【請求項8】

乾燥させられたユーグレナの細胞、又は前記細胞が破砕された破砕処理物を準備する工程と、
前記細胞または前記破砕処理物を分画して、当該細胞に由来する脂質、当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるタンパク質、及び当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるポリペプチドを実質的に含有していない、当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ未満であるペプチドを含有する水溶性成分の画分を得る工程と、
を含み、
前記細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ未満であるペプチドには、ＡＣＥ阻害活性を有する、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物が含まれている、
前記画分から成るか又は当該画分を含んで成る組成物であり、前記細胞に由来する脂質および当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるタンパク質および当該細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるポリペプチドを実質的に含有していない、ＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物の製造方法。

【請求項9】

前記準備する工程においてユーグレナの細胞を、アンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地か、または、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３４．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上でありアンモニア態窒素の含有量が１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で培養して生育させ、生育した前記細胞を乾燥させる、請求項８に記載されたＡＣＥ阻害用組成物または血圧上昇抑制用組成物または血圧降下用組成物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アンジオテンシンI変換酵素（Angiotensin I-Converting Enzyme：以下「ＡＣＥ」という。）阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物、及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

高血圧は、心血管病（例えば、脳卒中または心疾患等）において最大の危険因子と考えられている。数多くの人々に高血圧を予防または改善しやすい食を提供できれば、健康寿命の向上や医療費の削減につながり、社会的に貢献できる意義が大きいと考えられる。これに関連して例えば、非特許文献４ではゴマに含有されるゴマペプチドが、非特許文献５では鰹節に含有される鰹節ペプチドが、それぞれＡＣＥ阻害活性を有することが報告されている。ＡＣＥは、アンジオテンシンIを加水分解して、アンジオテンシンIIを生成させる酵素である。アンジオテンシンIIは、血圧を上昇させるアルドステロンの分泌を促進させる。このため、生体内においてＡＣＥ阻害によりアンジオテンシンIIの生成量が少なく抑えられると、血圧の上昇が抑えられる。

【0003】

また、特許文献１で開示された血圧降下剤は、ドコサヘキサエン酸（以下「ＤＨＡ」という。）を強化されたユーグレナの細胞を有効成分とするものである。ユーグレナ（属名：Euglena、和名：ミドリムシ）は、鞭毛運動をする動物的な性質と葉緑体により光合成を行う植物的な性質を両立させた、ユニークな単細胞生物である。ユーグレナの細胞（以下「ユーグレナ細胞」という。）は、多様な栄養条件下で生育することができ、各種の栄養素を含蓄することができる。このため、ユーグレナ細胞を食糧、飼料、燃料等の生物資源として有効活用することを念頭に置いて、数多くの研究や商品開発が行われてきた。例えば、特許文献１で開示された血圧降下剤は、ＤＨＡを多く含有する培地でユーグレナ細胞を培養して生育させ、培養後に培地を遠心分離して細胞を沈殿させ、沈殿した細胞を採取して乾燥させ、得られる細胞粉末そのものである。この細胞粉末が配合された飼料を、脳卒中易発症性高血圧自然発症ラットに経口投与して飼育したところ、このラットで血圧の上昇が抑えられたことが特許文献１で報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平８−１３３９８０号公報

【特許文献2】特開２０１２−２５４９７５号公報

【特許文献3】特開２００５−９７２４７号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】E. S. Kempner、他１名、「The Molecular Biology of Euglena gracilis. III. General Carbon Metabolism」、Biochemistry、１９６５年、第４巻、第１２号、p.2735-2739

【非特許文献2】E. S. Kempner、他１名、「The Molecular Biology of Euglena gracilis IX. Amino Acid pool Composition」、The Journal of Protozoology、１９７４年、第２１巻、第２号、p.363-367

【非特許文献3】家守幸男、「栄養による脳卒中の予防」、栄養学雑誌、１９８３年、第４１巻、第３号、p.129-137

【非特許文献4】Daisuke Nakano、他１５名、「Antihypertensive Effect of Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides from a Sesame Protein Hydrolysate in Spontaneously Hypertensive Rats」、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry、２００６年、第７０巻、第５号、p1118-1126

【非特許文献5】Keiichi Yokoyama、他２名、「Peptide Inhibitors for Angiotensin I-Converting Enzyme from Thermolysin Digest of Dried Bonito」、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry、１９９２年、第５６巻、第１０号、p1541-1545

【非特許文献6】M. Cramer、他１名、Arch. Mikrobiol.、１９５２年、第１７巻、p.384-402

【非特許文献7】J. A. Schiff、他２名、Methods Enzymol.、１９７１年、第２３巻、p.143-162

【非特許文献8】L. E. Koren、他１名、The Journal of Protozoology、１９６７年、第１４巻、増補、p.17

【非特許文献9】「ACE Kit - WST Technical Manual 100 tests」、［online］、平成２２年１２月１４日、株式会社同仁化学研究所、［平成２９年１０月２５日検索］、インターネット＜URL:http://www.dojindo.co.jp/manual/a502.pdf＞

【非特許文献10】「Softron ラット・マウス自動血圧計 ＢＰ−９８Ａ−Ｌ」、［online］、ソフトロン株式会社、［平成３１年３月２５日検索］、インターネット＜URL: http://www.softron-tokyo.co.jp/_userdata/cat_BP-98A-L.pdf＞

【非特許文献11】「KSA005Ra11 96T x 5 ELISA Kit DIY Materials For Angiotensin II (AngII) Organism Species: Rattus norvegicus (Rat) Instruction manual FOR RESEARCH USE ONLY NOT FOR USE IN CLINICAL DIAGNOSTIC PROCEDURES 2nd Edition」、［online］、Cloud-Clone Corp. WUHAN社、［平成３１年３月２８日検索］、インターネット＜URL: http://cloud-clone.com/manual/ELISA-Kit-DIY-Materials-for-Angiotensin-II-(AngII)-KSA005Ra11.pdf＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

なお、非特許文献１では、ユーグレナ細胞においてＬ−グルタミン酸から、Ｌ−メチオニンやＬ−アルギニン等の遊離アミノ酸が生合成されることが報告されている。また、ＤＨＡやエイコサペンタエン酸等のｎ−３系の多価不飽和脂肪酸（以下「ｎ−３系ＰＵＦＡ」という。）や、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸を摂取すると、高血圧性疾患を予防し得ることが知られている（非特許文献３を参照）。Ｌ−アルギニンは、ＡＣＥ阻害活性を有することが知られている（特許文献２を参照）。これらの知見に基づいて、特許文献１で報告された血圧降下作用は、ＤＨＡ強化ユーグレナ細胞に含蓄された、ＤＨＡ等のｎ−３系ＰＵＦＡやＬ−メチオニン等の遊離アミノ酸に起因する作用であると考えられてきた。

【0007】

一方、非特許文献２では、ユーグレナ細胞で生合成されたＬ−アルギニンの多くが、分子内にアルギニン残基を有するペプチド（以下「アルギニン包含ペプチド」という。）の形態で、ユーグレナ細胞内に含蓄され得ることが報告されている。本願に係る発明者ら（以下「本発明者ら」という。）は、このアルギニン包含ペプチドについて、タンパク源として利用する他に何か有効活用できるか、検討を重ねてきた。このアルギニン包含ペプチドは、ユーグレナ細胞により生合成された天然物であるため、それぞれ異なるアミノ酸配列を有する多種多様なペプチドが混在した状態にあると考えられる。従来、ユーグレナ細胞に含蓄され得るアルギニン包含ペプチドとして、具体的にどのようなアミノ酸配列を有するペプチドが混在しているのか、ほとんど明らかでなかった。ゴマからゴマペプチドが発見されたように、ユーグレナ細胞に含蓄され得るアルギニン包含ペプチドからＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを発見できれば望ましいと、本発明者らは想起した。

【0008】

そこで、本発明の課題は、アルギニン包含ペプチド（分子内にアルギニン残基を有するペプチド）を有効活用するために、ユーグレナ細胞に含蓄され得るアルギニン包含ペプチドからＡＣＥ阻害活性を有する有用なペプチドを発見して、発見した有用なペプチドを含有する組成物、及びその製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記した課題を解決しようと鋭意検討する過程で、ユーグレナ細胞から水溶性成分を分離して組成を分析した。その結果、この水溶性成分には、アルギニン包含ペプチドとして、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びＬ−アルギニル−Ｌ−アスパラギンからなる群より選ばれた１種以上のジペプチドが含有される場合があることを発見した。また、本発明者らは、これら４種類のジペプチドの各々について試験的にＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果、意外にも、これら４種類のジペプチドの各々がＬ−アルギニンよりも強いＡＣＥ阻害活性を有することを発見した。このため、本発明者らは、発見した有用な生物活性物質を含有する組成物、及びその製造方法を提供できることを見出した。

【0010】

すなわち、前述した課題を解決するために、本発明に係る組成物は、アンジオテンシン変換酵素I（ＡＣＥ）阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物であって、ＡＣＥ阻害活性を有する、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物を含有し、
前記ジペプチド化合物の含有量が０．１０ｍｇ／Ｌ以上である組成物である。

【0011】

あるいは、本発明に係る組成物は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物であって、ＡＣＥ阻害活性を有する、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物を含有し、ユーグレナの細胞から分離された水溶性成分を含んで成り、前記細胞に由来する脂質を実質的に除去された組成物である。

【0012】

本発明に係る組成物は、さらに、前記細胞に由来するタンパク質を実質的に除去された組成物であり得る。

【0013】

本発明に係る組成物は、さらに、前記細胞に由来する遊離アミノ酸およびその塩を実質的に除去された組成物であり得る。

【0014】

本発明に係る組成物において、前記細胞は、アンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育したか、または、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上でありアンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育した細胞であり得る。

【0015】

もしくは、本発明に係る組成物は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物であって、ＡＣＥ阻害活性を有する、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物を含有し、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上でありアンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育して乾燥させられたユーグレナの細胞を含んで成るか、または、前記細胞が破砕された破砕処理物を含んで成るか、もしくは、当該細胞から脂質が実質的に除去されたことにより当該細胞から分離された水溶性成分を含んで成る組成物である。

【0016】

本発明に係る組成物は、高血圧の予防または改善に用いられる食品組成物であり得る。

【0017】

本発明に係る組成物の製造方法は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物の製造方法であって、乾燥させられたユーグレナの細胞、又は前記細胞が破砕された破砕処理物を準備する工程と、前記細胞または前記破砕処理物から脂質を実質的に除去することにより、当該細胞から分離された水溶性成分を含有する溶液を得る工程と、を含む、前記水溶性成分を含んで成る組成物の製造方法である。

【0018】

または、本発明に係る組成物の製造方法は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる組成物の製造方法であって、ユーグレナの細胞、並びに、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上でありアンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地を準備する工程と、前記細胞を前記培地で培養して生育させる工程と、生育した前記細胞を乾燥させる工程と、を含む、前記培地で生育して乾燥させられた前記細胞を含んで成るか又は当該細胞が破砕された破砕処理物を含んで成るか若しくは当該細胞から脂質が実質的に除去されたことにより当該細胞から分離された水溶性成分を含んで成る組成物の製造方法である。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る組成物によれば、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるジペプチド化合物を０．１０ｍｇ／Ｌ以上含有する場合には、Ｌ−アルギニンよりも強いＡＣＥ阻害活性を有するジペプチド化合物の含有量が多いため、ジペプチド化合物をＡＣＥ阻害作用または血圧上昇抑制作用もしくは血圧降下作用の有効成分として活用可能である。

【0020】

あるいは、本発明に係る組成物によれば、ユーグレナ細胞から分離された水溶性成分を含んで成る場合には、この水溶性成分に上記したジペプチド化合物が含まれており、ユーグレナ細胞に由来する脂質（例えば、ｎ−３系ＰＵＦＡ）が実質的に除去されたことにより相対的に含有率を高められたジペプチド化合物を、ＡＣＥ阻害作用または血圧上昇抑制作用もしくは血圧降下作用の有効成分として活用可能である。

【0021】

または、本発明に係る組成物によれば、培地で生育して乾燥させられたユーグレナ細胞を含んで成るか又は前記細胞の破砕処理物を含んで成る場合には、この培地でのＬ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、この培地でユーグレナ細胞が生育したことにより上記したジペプチド化合物の含有量が多くなっており、生育後にユーグレナ細胞が乾燥させられてその水分が減少して相対的に含有率を高められたジペプチド化合物を、ＡＣＥ阻害作用または血圧上昇抑制作用もしくは血圧降下作用の有効成分として活用可能である。

【0022】

本発明に係る組成物の製造方法によれば、乾燥させられたユーグレナ細胞か又は前記細胞が破砕された破砕処理物から脂質を除去することにより、前記細胞から分離された水溶性成分を含んで成る場合の本発明に係る組成物を製造可能である。あるいは、本発明に係る組成物の製造方法によれば、培地でユーグレナ細胞を培養する場合には、この培地において、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることにより、上記したジペプチド化合物を多く含蓄するようにユーグレナ細胞を生育させやすく、この生育後に乾燥させたユーグレナ細胞または前記細胞が破砕された破砕処理物もしくは当該細胞から脂質が実質的に除去された水溶性成分を含んで成る場合の本発明に係る組成物を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明に係る組成物の製造方法の第１実施態様を説明するフローチャートである。

【図2】本発明に係る組成物の製造方法の第２実施態様を説明するフローチャートである。

【図3】ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）により、実験例１から実験例３に係る試料および標準試料（ＱＲとＲＱ）の各々から得られたトータルイオンクロマトグラムである。図３から図６において、縦軸は検出強度を、横軸は保持時間（分）を表す。図３から図７において、ＱＲはＬ−グルタミニル−Ｌ−アルギニンを意味し、ＲＱはＬ−アルギニル−Ｌ−グルタミンを意味する。

【図4】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（タンデム四重極質量分析計を用いた液体クロマトグラフィー質量分析）により、実験例１から実験例３に係る試料および標準試料（ＱＲとＲＱ）の各々から得られた、ｍ／ｚ＝７０での選択イオンモニタリングのクロマトグラムである。

【図5】ＲＱに起因するピークの面積を計測するために、図４から更にノイズを除いたクロマトグラムである。ＲＱに由来するピークの範囲を黒色に塗りつぶして示している。

【図6】ＬＣ／ＭＳにより、実験例１から実験例３に係る試料および標準試料（ＮＲとＲＮ）の各々から得られたトータルイオンクロマトグラムである。図６及び図７において、ＮＲはＬ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニンを意味し、ＲＮはＬ−アルギニル−Ｌ−アスパラギンを意味する。

【図7】ＲＱ、ＱＲ、ＲＮ、又はＮＲによるＡＣＥ阻害率を示すグラフである。縦軸はＡＣＥ阻害率（％）を、横軸はジペプチドの含有量（ｍｇ／Ｌ）を表す。ｎ＝２。

【図8】（ａ）は、生理食塩水を自由に摂取させた対照群の雄性ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（ＳＨＲラット）と、ユーグレナ細胞から分離され精製されたジペプチド化合物を含有する試料水を自由に摂取させた実験群のＳＨＲラットについて、実験開始時（対照群ラットが生理食塩水を自由に摂取可能になり、実験群ラットが試料水を自由に摂取可能になった時点）、並びに、実験開始時から５週、６週、及び７週経過時での拡張期血圧と収縮期血圧を示すグラフである。（ａ）において縦軸は血圧（ｍｍＨｇ）を示し、♯は一元配置分散分析においてｐ＜０．０７で有意差あり、ａｂ間はテューキー＝クレーマー法においてｐ＜０．０５で有意差あり。（ｂ）は、実験開始から７週経過時における対照群のラット及び実験群のラット各々でのアンジオテンシンIIの血中濃度を示すグラフであり、縦軸は前記血中濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。（ａ）及び（ｂ）共に、ｎ＝６であり、＊は一元配置分散分析においてｐ＜０．０５で有意差あり。

【発明を実施するための形態】

【0024】

＜組成物の第１実施形態＞
以下「ペプチド」とは、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合でつながって成る化合物のうちで、分子質量が４．０ｋＤａ未満であるものである。本発明に係る組成物の第１実施形態（以下「本組成物１」という。）は、ユーグレナ細胞から分離された水溶性成分（以下「ユーグレナ水性成分」という。）を含んで成る組成物である。本組成物１は、ユーグレナ水性成分を含んで成るため、この水性成分の一部であるアルギニン包含ペプチド（分子内にアルギニン残基を有するペプチド）を含有する。

【0025】

本組成物１の原料であるユーグレナは、動物学の分類上でユーグレナ属（ミドリムシ属）に属する種、及びその変異種からなる群より選ばれた１種類以上の原生動物である。ユーグレナとして、例えば、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、そのＺ株（Euglena gracilis Z）、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス変種（Euglena gracilis var. bacillaris）、又はユーグレナ・ビリディス（Euglena viridis）等が挙げられる。本組成物１の原料であるユーグレナは、適した培養条件が詳しく研究されており培養しやすい観点から、ユーグレナ・グラシリス、そのＺ株、及びユーグレナ・グラシリス・バシラリス変種からなる群より選ばれた１種以上の原生動物であるのが好ましい。

【0026】

ユーグレナ細胞には、例えばＬ−アルギニンのように、分子内に複数の窒素原子を有する遊離アミノ酸が含蓄されている。また、ユーグレナ細胞には、アルギニン包含ペプチドの一種として、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン（以下「ＲＱ」という。）又はその塩が含蓄されている。非特許文献１及び非特許文献２の記載から考慮すれば、これらの遊離アミノ酸やＲＱは、ユーグレナ細胞内に取り込まれた窒素化合物が代謝されて生合成されたものである。ＲＱは水溶性であるため、本組成物１は、ユーグレナ水性成分を含んで成ることにより、ユーグレナ細胞に由来するＲＱを含有する。

【0027】

ユーグレナ細胞には、上記したＲＱの他にもアルギニン包含ペプチドとして、Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アルギニン（以下「ＱＲ」という。）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−アスパラギン（以下「ＲＮ」という。）、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−アルギニン（以下「ＮＲ」という。）、及びこれらジペプチドの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物が含蓄される場合がある。ＱＲ、ＲＮ、及びＮＲも水溶性である。以下、ＲＱ、ＱＲ、ＲＮ、ＮＲ、及びこれらジペプチドの塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を「本ジペプチド化合物」という。ここでのジペプチドの塩は、薬理学的に許容される塩であり、例えば、アルカリ金属塩、又はアルカリ土類金属塩などが挙げられる。ジペプチドの塩は、析出しにくく扱いやすい観点から、ナトリウム塩、及びカリウム塩からなる群より選ばれた１種以上のアルカリ金属塩であるのが好ましい。

【0028】

ジペプチドは、経口摂取されると、刷子縁のＨ^＋依存性輸送担体により水素イオンと共に体内に吸収されることや、その吸収速度が遊離アミノ酸よりも速いことが知られている。また、本ジペプチド化合物は、Ｌ−アルギニンよりも強いＡＣＥ阻害活性を有する。このため、本組成物１を経口摂取すると、本組成物１に含有される本ジペプチド化合物が、体内に吸収されて血中へ移行してＡＣＥ阻害作用を奏するものと推察される。本組成物１を継続的に経口摂取すると、おそらくはＡＣＥ阻害作用に起因して、血圧の上昇を抑制する作用や、高い血圧を降下させる作用を奏する。以下、ＡＣＥ阻害作用、血圧上昇抑制作用、及び血圧降下作用をまとめて「ＡＣＥ阻害作用等」という。

【0029】

本組成物１は、少なくとも、ユーグレナ細胞に由来する脂質が実質的に除去された組成物である。脂質は、生物由来であり無極性溶媒に可溶な物質である。ユーグレナ細胞に由来する脂質として、例えばｎ−３系ＰＵＦＡが挙げられる。ここでの「実質的に」とは、除去される成分が分離操作の精度の問題等により本組成物１に微量に残存していても、本組成物１の内容や本質において本組成物１が奏するＡＣＥ阻害作用等に寄与していないと認められる程度に除去されていれば、許容されることを意味する。本組成物１では、夾雑物である脂質が実質的に除去されて、ＡＣＥ阻害作用等の有効成分である本ジペプチド化合物の含有率が相対的に高められている。以上に説明した理由により、本組成物１は、経口摂取により、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いることができる。本組成物１では、ＡＣＥ阻害作用等の有効成分として本ジペプチド化合物が活用されている。

【0030】

本組成物１は、例えば、ユーグレナ細胞を油相と水相に分離して採取した水相の溶液そのものでも良い。つまり、本組成物１は、ユーグレナ水性成分と薬理学的に許容される親水溶性溶媒から実質的に成る組成物でも良い。本組成物１は、親水溶性溶媒を除いて取扱いを容易にしたり本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高めたりする観点から、この水相の溶液を濃縮した濃縮物から成るものであるのが好ましい。同様の観点に加えてＡＣＥ阻害作用等を発揮させやすい観点により、本組成物１は、この濃縮物から更に本ジペプチド化合物の含有率が相対的に高まるように精製された精製物であるのがさらに好ましい。本組成物１は、ここで挙げた水相の溶液、濃縮物、又は精製物に、薬理学的に許容される公知の添加剤もしくは公知の食品素材が混合されて成る組成物でも良い。

【0031】

本組成物１は、ユーグレナ細胞に由来する脂質を実質的に除去されただけでなく、本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高める観点から、さらに、ユーグレナ細胞に由来する分子質量が４．０ｋＤａ以上であるタンパク質を実質的に除去する処理（以下「除タンパク処理」という。）を施された組成物であるのが好ましい。この場合の本組成物１では、分子量が小さい本ジペプチド化合物は残存している。ジペプチドと比べて分子量が大きいポリペプチドほど、除タンパク処理された場合の本組成物１に残存しにくい。同様の観点から、本組成物１は、例えばゲルろ過クロマトグラフィー等の分子篩により、ユーグレナ細胞に由来する分子量が１，０００以上であるタンパク質やポリペプチドやオリゴペプチドが実質的に除去された組成物であるのがさらに好ましく、ユーグレナ細胞に由来する分子量が５００以上であるタンパク質やポリペプチドやオリゴペプチドが実質的に除去された組成物であるのがさらにより好ましい。

【0032】

Ｌ−アルギニンよりも強いＡＣＥ阻害活性を有する本ジペプチド化合物の含有率を高める観点から、本組成物１は、ユーグレナ細胞に由来する、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−ホモシステイン、タウリン、及びこれら遊離アミノ酸の塩が実質的に除去されるように精製された組成物であるのが好ましい。同様の観点から本組成物１は、上記した遊離アミノ酸の例に限らず、遊離アミノ酸およびその塩が除去された組成物であるのが、さらに好ましい。同様の観点に加えて夾雑物を除去する観点から、本組成物１は、ユーグレナ細胞に由来する脂質を実質的に除去されただけでなく、除タンパク処理されて、遊離アミノ酸およびその塩も実質的に除去するように精製された組成物であるのが、さらにより好ましい。

【0033】

ＡＣＥ阻害作用等を発揮させやすい観点から、本組成物１における本ジペプチド化合物の含有量は、好ましくは０．１０ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．４０ｍｇ／Ｌ以上、さらにより好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以上である。本組成物１の摂取量が少量でもＡＣＥ阻害作用等を発揮させやすい観点から、本組成物１における本ジペプチド化合物の含有量は、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは３０ｍｇ／Ｌ以上、さらにより好ましくは６０ｍｇ／Ｌ以上である。精製に要するコストを安く抑える観点から、本組成物１における本ジペプチド化合物の含有量は、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１００ｇ／Ｌ以下、さらにより好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。ここでの「含有量」は、本ジペプチド化合物に該当する化合物が２種以上含有されている場合には合計の含有量を意味する。「ｇ」は、質量グラムである。

【0034】

本組成物１における本ジペプチド化合物の含有量を測定する方法として、本組成物１から少なくとも脂質およびタンパク質を実質的に除去する等して精製した分析用試料を、液体クロマトグラフィー質量分析（以下「ＬＣ／ＭＳ」という。）又はタンデム四重極質量分析計を用いた液体クロマトグラフィー質量分析（以下「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ」という。）に供して、この分析用試料に含有される本ジペプチド化合物に由来して検出されるピークの面積を測定する方法が挙げられる。分析用試料でのこのピーク面積と、本ジペプチド化合物の標品を同様に分析にかけて検出されるピークの面積と、を比較して、その他にも精製や分析のために行った希釈倍率を考慮することにより、分析用試料のもとになった本組成物１での本ジペプチド化合物の含有量を算出可能である。後述する実験例１から実験例３の説明において、この測定方法の詳細な例を説明する。ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳでの分析結果として、例えば、分析用試料のもとになった本組成物１における本ジペプチド化合物の含有量が０．１０ｍｇ／Ｌ未満であると算出された場合には、ＡＣＥ阻害作用等を発揮させやすくする観点から、本ジペプチド化合物の含有量が０．１０ｍｇ／Ｌ以上となるように、必要に応じて本組成物１を濃縮したり精製したりして本ジペプチド化合物の含有率を高めるのが好ましい。

【0035】

本組成物１は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる医薬組成物であっても良い。ここでの「医薬組成物」は、内服される医薬製剤、又はこれに配合される原材料である。医薬組成物である場合の本組成物１は、その取り扱いを容易にする観点から、本発明の目的に反しない限り、ユーグレナ水性成分に、薬理学的に許容される公知の添加剤が１種以上混合されて成るものであっても良い。公知の添加剤として、例えば、賦形剤、甘味料、抗酸化剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、又は着色剤などが挙げられる。例えば、医薬組成物である場合の本組成物１は、ユーグレナ水性成分と賦形剤が混合されて一定の形状に成形された固形製剤でも良い。医薬組成物である場合の本組成物１は、液体製剤またはその原料でも良いし、固形製剤またはその原料でも良い。医薬組成物として用いる場合の本組成物１の形態として、例えば、タブレット状、錠剤、顆粒、懸濁液、シロップ、又は乾燥粉末などの経口投与できる形態が挙げられる。

【0036】

液体製剤またはこれに配合される原材料である場合の本組成物１の剤形として、例えば、乳剤、液剤、又はシロップ剤などが挙げられる。例えば、水、エタノール、グリセリン、シロップ、又はこれらの混液に、ユーグレナ水性成分を溶解または分散させて、液体製剤である場合の本組成物１を調製可能である。あるいは、固形製剤またはこれに配合される原材料である場合の本組成物１の剤形として、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、又はチュアブル剤などが挙げられる。固形製剤である場合の本組成物１を調製するためには、ユーグレナ水性成分と、例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、デンプン、又はマンニット等の賦形剤を混合したり、アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はメチルセルロース等の結合剤を混合したり、カルメロースまたはデンプン等の崩壊剤を混合したり、無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、又はグリセロール等の安定剤を混合したりしても良い。固形製剤として用いる場合の本組成物１は、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、又はカルナバロウ等により被覆されていても良いし、カプセル化されていても良い。

【0037】

本組成物１は、本ジペプチド化合物の含有率が高まるように精製されてユーグレナ細胞由来の脂質やタンパク質といった夾雑物を実質的に除去された場合には、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる輸液組成物であっても良い。ここでの「輸液組成物」は、血中投与される輸液製剤またはこれに配合される原材料である。特許文献３に例示されるようにジペプチドを含有する公知の輸液製剤を製造する際に、精製された場合の本組成物１を他のジペプチドと同様に水や電解質等と混合することにより、輸液製剤である場合の本組成物１を製造可能である。血中投与される観点から、輸液組成物である場合の本組成物１は、加熱滅菌されたものが良い。

【0038】

本ジペプチド化合物は、人工的に有機合成されたＡＣＥ阻害薬（例えば、ぺリンドプリル等）ほどに強いＡＣＥ阻害活性を有していない。ＡＣＥ阻害薬を経口摂取した場合には血圧が短時間で劇的に降下し得るのに対して、本組成物１を継続的に経口摂取し続けた場合には血圧上昇が緩やかに抑えられるか又は血圧が緩やかに降下し得る。このため、ＡＣＥ阻害薬を経口摂取する場合に生じ得る副作用は、本組成物１を継続的に経口摂取し続ける場合では実質的に生じるおそれがないと考えられる。経口摂取するのであれば、ユーグレナ水性成分を高度に精製しなくて済む。これらの観点から、本組成物１は、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いられる食品組成物であるのが好ましい。ここでの「食品組成物」は、加工食品、調味料、食品添加物、サプリメント、及びこれらに配合される原材料からなる群より選ばれた１種以上の組成物である。食品組成物である場合の本組成物１は、ユーグレナ水性成分と、公知の食品素材１種以上と、が混合された形態でも良い。加工食品である場合の本組成物１は、例えば、漬物、乾物、練り製品、粉類、缶詰、冷凍食品、インスタント食品、乳製品、菓子類、嗜好品、又は飲料等の形態をとり得る。

【0039】

食品組成物に関して上記したのと同様の観点から、本組成物１は、高血圧の予防または改善に用いられる食品組成物であるのがさらに好ましい。高血圧は、血圧が正常範囲を超えて高く維持されている状態である。ヒトでは、収縮期血圧（Systolic Blood Pressure：以下「ＳＢＰ」という。）が１４０ｍｍＨｇ以上であり及び／又は拡張期血圧（Diastolic Blood Pressure：以下「ＤＢＰ」という。）が９０ｍｍＨｇ以上であれば、高血圧と診断され得る。高血圧の予防または改善に用いられる食品組成物である場合の本組成物１は、特定保健用食品、栄養機能食品、病者用食品、及び高齢者用食品からなる群より選ばれた１種以上の健康食品として販売され得る。消費者にとって分かりやすい観点から、この健康食品には、本組成物１を継続的に経口摂取することによりＡＣＥ阻害作用等に起因して発揮される機能を説明する表示が付されているのが好ましい。この機能を表示する文言は、特に限定されないが、例えば、「血圧を下げる」、「血圧低下を期待する」、「血圧の上昇を抑える」、「血圧の上昇を緩やかにする」、「高血圧を予防する」、又は「高血圧の改善に役立つ」等の文言が挙げられる。

【0040】

上記した高血圧の予防または改善と同様の観点から、本組成物１は、高血圧に起因する疾患の予防に用いられる食品組成物であるのも、さらに好ましい。高血圧に起因する疾患は、特に限定されないが、例えば、脳出血、脳梗塞、大動脈瘤、腎硬化症、心筋梗塞、心肥大、又は眼底出血等が挙げられる。高血圧に起因する疾患の予防に用いられる食品組成物である場合の本組成物１も、前述した健康食品として販売されても良く、この販売に際して例えば「腎機能を保護する」等のＡＣＥ阻害作用等に起因して発揮される機能を説明する表示が付されているのが好ましい。

【0041】

市場で流通させやすい観点から、本組成物１は、ＡＣＥ阻害剤、血圧上昇抑制剤、又は血圧降下剤であるのも好ましい。ここでの「ＡＣＥ阻害剤、血圧上昇抑制剤、又は血圧降下剤」は、食品組成物、医薬組成物、又は輸液組成物に配合される原材料として用いられる組成物である。この場合の本組成物１は、前述した水相の溶液、濃縮物、又は精製物の形態でも良いし、これらに薬理学的に許容される公知の添加剤もしくは公知の食品素材が混合されて成る組成物の形態でも良い。本組成物１を継続的に経口摂取すると緩やかにＡＣＥ阻害作用等を奏するため、ここで挙げたＡＣＥ阻害剤、血圧上昇抑制剤、又は血圧降下剤は、食品組成物に配合される原材料として用いられる組成物であるのがさらに好ましく、例えば、市場で流通する食品に添付された小袋に収容された乾燥粉末の形態が挙げられる。消費者が、小袋を開けてこの乾燥粉末を食品に振り掛けて、食品ごと乾燥粉末を食べることにより、この消費者の体内でＡＣＥ阻害作用等が奏される。

【0042】

本組成物１は、以上に説明した事項に限らず、後述する製造方法により得られたものであるのが好ましい。例えば、本ジペプチド化合物の含有量を多くする観点から、本組成物１におけるユーグレナ細胞は、アンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育した細胞であるのが好ましい。同様の観点から、本組成物１におけるユーグレナ細胞は、Ｌ−グルタミン酸およびその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物（以下「グルタミン酸化合物」という。）の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、かつ、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育した細胞であるのが好ましい。なお、アンモニア態窒素は、アンモニア、及びアンモニウム塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物に含まれているＮＨ_３やＮＨ_４^＋の窒素原子である。例えば、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物（（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）の１．０ｍｏｌ当量は、アンモニア態窒素としては６．０ｍｏｌ当量に相当する。

【0043】

＜組成物の第２実施形態＞
本発明に係る組成物の第２実施形態（以下「本組成物２」という。）について、前述した本組成物１と共通する事項の説明を適宜省略して、本組成物１と異なる事項を主に説明する。本組成物２は、培地で生育して乾燥させられたユーグレナ細胞を含んで成る組成物である。このため、本組成物２は、培地で生育したユーグレナ細胞に由来する本ジペプチド化合物を含有する。本組成物１と同様、本組成物２におけるユーグレナは、動物学の分類上でユーグレナ属に属する種、及びその変異種からなる群より選ばれた１種類以上の原生動物である。本組成物２におけるユーグレナ細胞は、グルタミン酸化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、かつ、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地で生育したものである。

【0044】

培地にアンモニア態窒素を含有させるためには、例えば、アンモニア水、及びアンモニウム塩からなる群より選ばれた１種以上を配合して培地を調製するのが良い。あるいは、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である水を有する池やプールがあれば、その水を採取して培地として利用するか、又はその池やプールの水にグルタミン酸化合物を添加して池やプールでユーグレナ細胞を培養しても良い。アンモニウム塩として、硫酸アンモニウム（硫安）、リン酸アンモニウム（例えば燐安）、硝酸アンモニウム（硝安）、炭酸アンモニウム、又は塩化アンモニウム等が挙げられる。

【0045】

グルタミン酸化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地でユーグレナ細胞を培養する場合には、一般的な培地でユーグレナ細胞を培養する場合と比べて、細胞数が増加しやすく、細胞がＬ−アルギニンを本ジペプチド化合物の形態で含蓄するように生育しやすい。このため、本組成物２は、経口摂取により、ＡＣＥ阻害、血圧上昇抑制、又は血圧降下に用いることができ、その有効成分として本ジペプチド化合物が活用される。したがって、前述した本組成物１と同様の用途で本組成物２を活用することができる。ユーグレナ細胞は、亜硝酸レダクターゼ、硝酸レダクターゼ、及びウレアーゼを有しないため、亜硝酸態窒素（ＮＯ_２⁻）、硝酸態窒素（ＮＯ_３⁻）、及び尿素（ＣＯ（ＮＨ_２）_２）を代謝して窒素源として利用することができない。一方、ユーグレナ細胞では、培地からアンモニア態窒素やグルタミン酸化合物が取り込まれて代謝されることにより、分子内に窒素原子を複数有する遊離アミノ酸（例えばＬ−アルギニン）が生合成されやすい。ユーグレナ細胞内でこの遊離アミノ酸の含有量が増すことにより、この遊離アミノ酸から本ジペプチド化合物が生合成されて細胞内で含蓄されやすいものと推察される（非特許文献１及び非特許文献２を参照）。

【0046】

本組成物２における培地で生育したユーグレナ細胞は、生育後に加熱により乾燥させられたものでも良いが、望ましくない加熱変性を避ける観点から、生育後に凍結乾燥されたものが好ましい。水分の減少により本ジペプチド化合物の含有率が相対的に高まるため、ＡＣＥ阻害作用等を発揮しやすい。乾燥により細胞内液が減少したり細胞膜が壊れたりすると、ユーグレナ細胞での代謝が抑えられて本ジペプチド化合物が分解されにくくなり、本組成物２を長期保管しやすくなると考えられる。あるいは、更に代謝による分解を避けて長期保管しやすい観点から、本組成物２における培地で生育したユーグレナ細胞は、生育後に乾燥させられ破砕された細胞であるのが好ましい。または、更に本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高める観点から、ユーグレナ細胞は、生育後または破砕後に例えば無極性溶媒により脱脂されたものであるのが好ましい。

【0047】

本組成物２は、培地で生育したユーグレナ細胞の乾燥粉末であっても良いが、この乾燥粉末と薬理学的に許容される公知の添加剤１種以上が混合されて成る医薬組成物であっても良い。予防医学の観点から、本組成物２は、この乾燥粉末と公知の食品素材１種以上が混合されて成る食品組成物であるのが好ましい。その他、本組成物２に施され得る処理、本組成物２がとり得る形態や用途、本組成物２における本ジペプチド化合物の含有量やその測定方法等について、前述した本組成物１と同様である。本組成物２は、以上に説明した事項に限らず、後述する製造方法により得られたものであるのが好ましい。

【0048】

＜組成物の第３実施形態＞
本発明に係る組成物の第３実施形態（以下「本組成物３」という。）について、前述した本組成物１と共通する事項の説明を適宜省略して、本組成物１と異なる事項を主に説明する。本組成物３は、ユーグレナ細胞に由来しない本ジペプチド化合物を含有する組成物である。本組成物３は、ＡＣＥ阻害活性を有するアルギニン包含ペプチドとして、本ジペプチド化合物を０．１０ｍｇ／Ｌ以上含有している。

【0049】

本組成物３における本ジペプチド化合物は、例えば、Ｌ−アルギニンとＬ−アスパラギン、Ｌ−アルギニンとＬ−グルタミン、又はＬ−アルギニンとＬ−アスパラギンとＬ−グルタミン、を原料として、これらのアミノ酸を公知のペプチド合成法によりペプチド結合させて得ることができる。その上で、本組成物３は、得られた本ジペプチド化合物と薬理学的に許容される公知の添加物１種以上が混合されて成る医薬組成物、または、得られた本ジペプチド化合物と水と電解質が混合されて成る輸液組成物であっても良い。予防医学の観点から、本組成物３は、得られた本ジペプチド化合物と公知の食品素材１種以上が混合されて成る食品組成物であるのが好ましい。

【0050】

あるいは、本組成物３は、ユーグレナ以外の生物由来でありＲＮ、ＲＱ、ＮＲ、及びＱＲのうちの１種以上と同じアミノ酸配列を分子内に多く有するポリペプチド又はタンパク質を、ペプチダーゼにより加水分解して、更に本ジペプチド化合物の含有量が０．１０ｍｇ／Ｌ以上となるように精製することによっても、製造可能と考えられる。この場合の本組成物３は、夾雑物を実質的に除去して本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高める観点から、ペプチダーゼによる酵素処理物が更に除タンパク処理されたもの、酵素処理物から脂質を抽出して実質的に除去したもの、遊離アミノ酸及びその塩を実質的に除去したもの、及びこれらの処理を組み合わせて施されたものからなる群より選ばれた処理物であるのが好ましい。

【0051】

本組成物３は、本ジペプチド化合物の含有量が多いため、ＡＣＥ阻害、血圧上昇の予防、又は血圧降下に用いることができ、その有効成分として本ジペプチド化合物が活用される。その他、本組成物３に施され得る処理、本組成物３がとり得る形態や用途、本組成物３における本ジペプチド化合物の含有量やその測定方法等について、ユーグレナ細胞や培地に関する事項を除いて、前述した本組成物１と同様である。

【0052】

＜組成物の製造方法の第１実施態様＞
本発明に係る組成物の製造方法の第１実施態様（以下「本製法１」という。）について、前述した本組成物１と共通する事項の説明を適宜省略して説明する。本製法１は、ユーグレナ水性成分（ユーグレナ細胞から分離された水溶性成分）を含んで成る組成物（本組成物１）の製造方法である。図１に示すように、本製法１は、準備工程Ｓ１１、培養工程Ｓ１２ａ、収集工程Ｓ１６、乾燥工程Ｓ１７、破砕工程Ｓ１８、除タンパク工程Ｓ２１、脂質除去工程Ｓ２２、濃縮工程Ｓ３０、及び精製工程Ｓ４０を含む。

【0053】

準備工程Ｓ１１では、ユーグレナの生細胞を準備する。このためには、例えば、屋外で日当たりの良い水たまり等から野生のユーグレナを採取しても良いが、研究機関から実験用のユーグレナ細胞株の提供を受けるのが効率良い。準備するユーグレナ細胞の分類上の種については、本組成物１の説明で前述したとおりである。

【0054】

培養工程Ｓ１２ａでは、培地でユーグレナの生細胞を培養して生育させることにより、その細胞数を増やしつつもユーグレナ細胞に本ジペプチド化合物を生合成させる。このためには、従来からユーグレナを培養するのに用いられている培地を用いても良い。例えば、次の表１に組成を示すクレイマー・マイヤー培地（以下「ＣＭ培地」という。非特許文献６を参照）、表２に組成を示すハットナー培地（非特許文献７を参照）、表３に組成を示すコーレン・ハットナー培地（以下「ＫＨ培地」という。非特許文献８を参照）を用いても良い。培地は、液体培地であっても良いし、斜面培地などの固体培地であっても良い。

【0055】

【表1】

【0056】

【表2】

【0057】

【表3】

【0058】

培養工程Ｓ１２ａで用いる培地は、表１から表３に示した組成に類似する組成の培地であっても良い。培地には、本発明の目的に反しない限り、キレート剤や、ｐＨ調整剤が含有されているのが好ましい。例えば、前述した表１から表３において、ＥＤＴＡ−Ｎａ_２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）はキレート剤として作用する。リン酸塩やクエン酸はｐＨ調整剤として作用する。培地には、ペプチドを含有する組成物や、アンモニア水が配合されても良い。ペプチドを含有する組成物として、例えば、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。培地には、１種または複数種の遊離アミノ酸やその塩が配合されても良い。

【0059】

培養工程Ｓ１２ａでは、本ジペプチド化合物を多く含蓄するようにユーグレナ細胞を生育させやすい観点から、培地におけるアンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましい。同様の観点から、培地におけるグルタミン酸化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましい。これらの培地は、例えば、表１から表３のいずれかの配合に更にグルタミン酸化合物やアンモニウム塩を追加で配合して調製することができる。同様の観点に加えて、細胞数を効率よく増やす観点から、アンモニア態窒素の含有量が１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地でのグルタミン酸化合物の含有量が、２４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましい。一方、含有量が多すぎて細胞数の増加が妨げられるのを避ける観点から、培地におけるアンモニア態窒素の含有量が、好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。同様に細胞数の増加が妨げられるのを避ける観点から、培地におけるグルタミン酸化合物の含有量は、好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。

【0060】

培養工程Ｓ１２ａでは、培地を用いて、従来からユーグレナの細胞数を増やす目的で行われている培養方法によりユーグレナ細胞を生育させることができる。例えば、培養容器を厚手の黒布で覆い、培地を暗黒下に保ってユーグレナ細胞を生育させても良い。あるいは、培地に光を照射する明期、及び培地を暗黒下に保つ暗期、を含む明暗周期を設けてユーグレナ細胞を生育させても良い。培養工程Ｓ１２ａでは、光合成により得られる栄養素によってユーグレナ細胞を生育させて細胞数を効率よく増やす観点から、培地に光を照射し続けてユーグレナ細胞を生育させるのが好ましい。

【0061】

培養工程Ｓ１２ａでの培養温度は、例えば２０℃以上かつ３４℃未満であり、良好に生育させる観点から２８℃以上かつ３０℃以下であるのが好ましい。同様の観点から、培地に照射する光の強さは、２，０００ｌｕｘ以上かつ８，０００ｌｕｘ以下であるのが好ましい。同様の観点から、例えば、スターラーにより培地を攪拌しながら培養するのが好ましく、振とう機により培地に１分間に８０回以上かつ１２０回以下の振とうをしながら培養するのも好ましい。同様の観点から、除菌フィルターを通した空気、又は二酸化炭素を１質量％以上かつ５質量％以下含有する空気を、培地に通気させるのが好ましい。培地の初発ｐＨは、例えば２．０以上かつ７．０以下であり、細胞数を効率よく増やす観点から３．０以上かつ５．０以下であるのが好ましい。初発ｐＨを調整するために、培地に少量の希硫酸を添加しても良い。例えば、これらの好ましい培養条件によりＫＨ培地に光を照射し続けてユーグレナ細胞を生育させた場合には、培養開始から２〜３日で対数増殖期に至り、４〜５日で定常期に達することがある。

【0062】

収集工程Ｓ１６では、次の乾燥行程Ｓ１７で処理の効率を良くするために、培養期間の終了後に、培地で生育したユーグレナ細胞を収集して、この細胞の密度が高められた収集物を得る。例えば、培地を加熱濃縮して培地における細胞の密度を高めるのでも良いが、望ましくない加熱変性を避けて短時間で効率よく収集する観点から、培地を遠心分離して形成される沈殿物（細胞のペレット）を採取するのが好ましい。例えば、培地を３００ｍＬずつチューブに分注して、約４℃で２，０００×Ｇ程度の遠心力をかけて、チューブ内底に形成されるペレットを採取する。「Ｇ」は標準重力加速度（９．８０６６５ｍ／ｓ^２）である。

【0063】

乾燥工程Ｓ１７では、後の工程（Ｓ１８からＳ２２等）での処理の効率を良くし、ユーグレナ細胞内で本ジペプチド化合物が代謝により分解されるのを避けるために、この細胞の収集物（例えば、濃縮された培地、又は細胞のペレット）を乾燥させて、乾燥させられたユーグレナ細胞を含有する乾燥物を得る。収集物を加熱乾燥させても良いが、望ましくない加熱変性を避ける観点から、収集物を凍結乾燥させるのが好ましい。

【0064】

破砕工程Ｓ１８では、後の行程（Ｓ２１及びＳ２２等）で脂質等を除去しやすくするために、乾燥物に含有されているユーグレナ細胞を破砕して、破砕されたユーグレナ細胞を含有する破砕処理物を得る。このためには、細胞からタンパク質を抽出する目的で行われる公知の細胞破砕法を採り得る。例えば、浸透圧ショック法、酵素消化法、超音波処理、フレンチプレス、乳棒による粉砕、ホモジナイザーによる破砕、及びガラスビーズによる破砕からなる群より選ばれた１種または２種以上を組み合わせた細胞破砕法が挙げられる。破砕時の望ましくない変性を避ける観点から、乾燥物を少量の緩衝液に懸濁した細胞懸濁液を破砕処理に供するのが好ましい。なお、浸透圧ショック法は、乾燥物を滅菌水などの低張液に懸濁して細胞を破裂させる手法である。酵素消化法は、細胞懸濁液に各種の酵素を添加して細胞を消化する手法である。ただし、本ジペプチド化合物を分解し得るジペプチダーゼを添加するのは、避けるのが好ましい。超音波処理は、超音波のせん断力により細胞を破砕する手法である。フレンチプレスは、高圧下で細胞懸濁液を小孔から強制的に押し出して、せん断力により細胞を破砕する手法である。乳棒による粉砕は、乳棒により乳鉢上で細胞をすり潰す手法である。ホモジナイザーによる破砕は、ホモジナイザーにより細胞懸濁液をホモジナイズして、得られたライセートをろ過または遠心分離して不溶物を除去し、上清を採取する手法である。ガラスビーズによる破砕は、細胞懸濁液にガラスビーズを加えて、冷却しながらボルテックスミキサーにより攪拌する操作を繰り返して、得られたライセートをろ過または遠心分離して不溶物を除去し、上清を採取する手法である。

【0065】

除タンパク工程Ｓ２１では、夾雑物を除いて本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高めるために、破砕処理物に除タンパク処理を施して除タンパク処理物を得る。このためには、破砕処理物からタンパク質を除去する目的で従来から行われている公知の除タンパク処理法を採り得る。例えば、タンパク質変性沈殿法、液体クロマトグラフィーによりタンパク質を分離させて除去する方法、及び限外ろ過からなる群より選ばれた１種または２種以上の組み合わせが挙げられる。分子量が大きいポリペプチドやタンパク質ほど除かれやすく、分子量が小さい本ジペプチド化合物は除タンパク処理物に残存する。

【0066】

除タンパク工程Ｓ２１でタンパク質変性沈殿法を行う場合には、破砕処理物と沈殿剤を混合して、遠心分離によりタンパク質を沈殿させてから、沈殿物（タンパク質）が混入しないように水層を採取して除タンパク処理物として扱う。例えば、破砕処理物１．０質量部と沈殿剤０．２質量部以上かつ４質量部以下を混合して攪拌し、冷所に１５分以上静置してタンパク質を析出させてから、２０，０００×Ｇ程度の遠心力を１５分程度かけてタンパク質を沈殿させて、沈殿物（タンパク質）が混入しないように水層（除タンパク処理物）を採取するのが好ましい。沈殿剤として、例えば、エタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリル、トリクロロ酢酸、及び過塩素酸からなる群より選ばれた１種または２種以上の混合物が挙げられる。

【0067】

除タンパク工程Ｓ２１で限外ろ過を行う場合には、破砕処理物を、限外分子量が３０，０００以下である限外ろ過膜に通して、膜を通過したろ液を採取して除タンパク処理物として扱う。限外ろ過膜として、例えば、アミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（メルク社製、アミコンは登録商標）が挙げられる。タンパク質や分子量が大きいポリペプチドは、膜を通過できないため除去される。

【0068】

除タンパク工程Ｓ２１で液体クロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）によりタンパク質を分離させる場合には、例えば、予備実験として、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質の標準試料をカラムに通して、クロマトグラムにより各々の標品の保持時間を記録しておく。その上で、カラムを洗浄して、破砕処理物を洗浄後のカラムに通して、アミノ酸、ジペプチド、及びトリペプチドが含有されている保持時間の画分をそれぞれ採取して混合して、除タンパク処理物として扱う。ポリペプチドやタンパク質が含有された画分を採取しないことにより、ポリペプチドやタンパク質は除去される。

【0069】

脂質除去工程Ｓ２２では、夾雑物を除いて本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高めるために、除タンパク処理物から脂質を除去して、ユーグレナ水性成分を含有する水溶液を得る。例えば、除タンパク処理物を遠心分離にかけるか又は冷暗所に静置して、成分を比重ごとに分離させて、形成される脂質の層を除去してユーグレナ水性成分を得ても良い。あるいは、除タンパク処理物を液体クロマトグラフィー（例えば、逆相クロマトグラフィー）の分離カラムに通して、カラムを通過した水溶性成分が含有されている画分を採取して、ユーグレナ水性成分として扱っても良い。

【0070】

脂質除去工程Ｓ２２では、簡易迅速に脂質を除去する観点から、除タンパク処理物を極性溶媒と混合するのが好ましい。極性溶媒は、例えばメタノールでも良い。極性溶媒は、脂質の混入を避けて効率良く水溶性成分を抽出する観点から、２０℃での誘電率が３５以上である溶媒が好ましく、例えば、アセトニトリル、ギ酸、及び水からなる群より選ばれた１種の溶媒または２種以上の溶媒の混合液が挙げられる。これらの場合、脂質は抽残層（油層）及び沈殿物に留まるのに対して、水溶性成分は極性溶媒（例えば水）に抽出される。混合後に形成される極性溶媒の層（例えば水層）を採取して、ユーグレナ水性成分として扱うことができる。

【0071】

あるいは、脂質除去工程Ｓ２２では、簡便迅速に脂質を除去する観点から、除タンパク処理物を無極性溶媒と混合させるのが好ましい。無極性溶媒は、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、又はこれらの混合液でも良い。効率良く脂質を抽出して除去する観点から、無極性溶媒は２０℃での誘電率が４．５以下である溶媒が好ましく、例えば、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、及びジエチルエーテルからなる群より選ばれた１種の溶媒または２種以上の溶媒の混合液が挙げられる。これらの場合、脂質は無極性溶媒に抽出されるのに対して、水溶性成分は抽残層（水層）及び沈殿物に残存する。混合後に形成される抽残層（水層）を採取して、ユーグレナ水性成分として扱うことができる。または、脂質除去工程Ｓ２２では、簡便迅速に脂質を除去する観点から、除タンパク処理物を極性溶媒および無極性溶媒と混合して、形成される極性溶媒の層（例えば水層）を採取するのが好ましい。

【0072】

脂質除去工程Ｓ２２で極性溶媒や無極性溶媒を用いる場合には、効率よく抽出する観点から、除タンパク処理物を乾燥させた後に溶媒と混合するのが好ましく、除タンパク処理物を凍結乾燥させた後に溶媒と混合するのがさらに好ましい。夾雑物を除去して本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高める観点から、極性溶媒の層（例えば水層）を採取する際に、無極性溶媒の層（油層）との界面や沈殿物に近接する部分を避けて採取するのが好ましい。界面に存する両親媒性の成分（例えば、リン脂質、糖脂質）や、沈殿物に存する不溶性成分をも除去することができる。

【0073】

濃縮工程Ｓ３０では、溶媒（例えば水）を除いて本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高めるために、ユーグレナ水性成分を濃縮して濃縮物を得る。このためには、加熱により水溶液を乾燥させても良いが、望ましくない加熱変性を避ける観点から、凍結乾燥により濃縮物を得るのが好ましく、遠心濃縮機（遠心エバポレーター）を用いて遠心濃縮により濃縮物を得るのも好ましい。

【0074】

精製工程Ｓ４０では、夾雑物を除いて本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高めるために、濃縮物を精製して精製物を得る。このためには、分子篩（例えば、限外ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、及び吸着クロマトグラフィーからなる群より選ばれた１種または２種以上の組み合わせにより、遊離アミノ酸、分子量が１，０００以上であるオリゴペプチドやポリペプチド、タンパク質、炭水化物、及びこれらの塩からなる群より選ばれた１種以上の夾雑物を除去するのが好ましい。あるいは、濃縮物に除タンパク処理を施しても良い。濃縮物から、遊離アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及びこれらの塩を除去する場合には、濃縮物をゲルろ過クロマトグラフィーのカラムに通して一定の保持時間ごとに分画して、ジペプチドやトリペプチドを含有する保持時間の画分を採取して、精製物として扱うのが好ましい。

【0075】

以上に説明した本製法１において、準備工程Ｓ１１、培養工程Ｓ１２ａ、収集工程Ｓ１６、乾燥工程Ｓ１７、及び破砕工程Ｓ１８の組み合わせは、培地で生育して乾燥させられたユーグレナ細胞が破砕された破砕処理物を準備する工程Ｓ１０として機能する。除タンパク工程Ｓ２１と脂質除去工程Ｓ２２の組み合わせは、破砕処理物から脂質を実質的に除去して、ユーグレナ細胞に由来する水溶性成分を含有する水溶液を得る工程Ｓ２０として機能する。精製工程Ｓ４０で得られた精製物を、ユーグレナ水性成分（ユーグレナ細胞から分離された水溶性成分）を含んで成る組成物（本組成物１）として扱うことができる。

【0076】

＜組成物の製造方法の第２実施態様＞
本発明に係る組成物の製造方法の第２実施態様（以下「本製法２」という。）について、前述した本製法１と共通する事項の説明を適宜省略して、本製法１と異なる事項を主に説明する。本製法２は、培地で生育して乾燥させられたユーグレナ細胞を含んで成る組成物（本組成物２）の製造方法である。図２に示すように本製法２は、準備工程Ｓ１１、培養工程Ｓ１２ｂ、収集工程Ｓ１６、及び乾燥工程Ｓ１７を含む。

【0077】

本製法２における準備工程Ｓ１１は、本製法１と同様である。本製法２における培養工程Ｓ１２ｂでは、グルタミン酸化合物の含有量が３．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、アンモニア態窒素の含有量が１３ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地を用いる。ユーグレナの細胞数を効率良く増やす観点から、アンモニア態窒素の含有量が１４ｍｍｏｌ／Ｌ以上である培地でのグルタミン酸化合物の含有量が、２４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましい。これらの組成の培地で培養されて生育したユーグレナ細胞は、本ペプチド化合物を多く含蓄しやすい。培養工程Ｓ１２ｂについて、その他の事項は本製法１における培養工程Ｓ１２ａと同様である。

【0078】

本製法２での収集工程Ｓ１６及び乾燥工程Ｓ１７は、本製法１と同様である。収集工程Ｓ１６と乾燥工程Ｓ１７の組み合わせは、培地で生育したユーグレナ細胞を乾燥させる工程Ｓ１５として機能する。乾燥工程Ｓ１７により得られた乾燥物を、培地で生育して乾燥させられたユーグレナ細胞を含んで成る組成物（本組成物２）として扱うことができる。

【0079】

＜組成物の製造方法のその他の実施態様＞
本発明に係る組成物の製造方法は、その目的に反しない限り、図１に示す本製法１や図２に示す本製法２を、以下に例示するように変更した態様でも良い。

【0080】

準備工程Ｓ１１で本ジペプチド化合物を多く含蓄しているユーグレナ細胞を大量に準備可能な場合には、工程を簡略化させる観点から、培養工程（Ｓ１２ａ又はＳ１２ｂ）を省略可能である。この場合には、既に乾燥されたユーグレナ細胞、又は既に脱脂されたユーグレナ細胞を準備するのでも良く、細胞が死んでいても良い。準備工程Ｓ１１で本ジペプチド化合物を多く含蓄しているユーグレナ細胞を高密度で含有する乾燥物または懸濁液を大量に準備可能な場合には、培養工程（Ｓ１２ａ又はＳ１２ｂ）だけでなく、収集工程Ｓ１６及び乾燥工程Ｓ１７も省略可能である。

【0081】

培養工程（Ｓ１２ａ又はＳ１２ｂ）において、培養中に培地から水分が蒸発して培地における細胞の密度が高くなった場合には、収集工程Ｓ１６を省略しても良い。あるいは、本製法１において、破砕工程Ｓ１８、除タンパク工程Ｓ２１、脂質除去工程Ｓ２２、及び濃縮工程Ｓ３０の各工程において処理の効率が悪くなっても問題ない場合には、工程を簡略化させる観点から、収集工程Ｓ１６及び乾燥工程Ｓ１７を省略しても良い。

【0082】

培養工程（Ｓ１２ａ又はＳ１２ｂ）で用いた培地が少量（例えば１．０Ｌ以下）である場合には、収集工程Ｓ１６及び乾燥工程Ｓ１７をまとめて行なうことができる。この場合、培養後の培地を加熱により乾固させても良いが、望ましくない加熱変性を避ける観点から、培養後の培地を凍結乾燥するのが好ましく、培養後の培地を遠心濃縮するのも好ましい。

【0083】

図１に示す本製法１での破砕工程Ｓ１８では、次の除タンパク工程Ｓ２１の効率を高める観点から、破砕処理物を濃縮してから除タンパク工程Ｓ２１に供するのが好ましい。このための手法として、破砕処理物を遠心分離して形成される下層を採取する、破砕処理物を凍結乾燥する、又は破砕処理物を遠心濃縮する、等が例示される。同様の観点から、除タンパク工程Ｓ２１では、除タンパク処理物を濃縮して次の脂質除去工程Ｓ２２に供するのが好ましい。

【0084】

あるいは、本製法１では、破砕工程Ｓ１８と脂質除去工程Ｓ２２をまとめて行い工程を簡略化させる観点から、ユーグレナ細胞を含有する乾燥物または細胞懸濁液を、無極性溶媒と混合して、混合後に形成される抽残層（水層）を採取するのが好ましい。ユーグレナは微小な単細胞生物であり、細胞を乾燥させたときに細胞膜などが幾らか壊れるため、乾燥されたユーグレナ細胞を無極性溶媒と混合させることにより、この細胞から時間をかけて脂質を除去することが可能である。この場合、採取した抽残層（水層）に除タンパク処理を施すのが好ましい。

【0085】

または、本製法１では、除タンパク工程Ｓ２１と脂質除去工程Ｓ２２をまとめて行い工程を簡略化させる観点から、破砕されたユーグレナ細胞を含有する破砕処理物と、タンパク質沈殿剤として機能する極性溶媒とを混合して、混合後に形成される抽出層（極性溶媒の層または水層）を採取するのが好ましい。もしくは、本製法１では、破砕工程Ｓ１８、除タンパク工程Ｓ２１、及び脂質除去工程Ｓ２２をまとめて行うことにより工程を更に簡略化させる観点から、ユーグレナ細胞を含有する乾燥物または細胞懸濁液と、タンパク質沈殿剤として機能する極性溶媒とを混合して、混合後に形成される抽出層（極性溶媒の層または水層）を採取するのが好ましい。タンパク質沈殿剤として機能する極性溶媒として、例えばアセトニトリル水溶液が挙げられる。もしくは、乾燥されたユーグレナ細胞を含有する乾燥物から脂質を除去して、得られる水溶液に対して除タンパク処理を施して、得られる除タンパク処理物をユーグレナ細胞に由来する水溶性成分を含有する水溶液として扱っても良い。

【0086】

本製法１では、精製工程Ｓ４０で除タンパク処理を行う場合に、除タンパク工程Ｓ２１を省略しても、タンパク質や分子量が１，０００以上であるペプチドが除去された本組成物１を得ることができる。本組成物１において、本ジペプチド化合物の含有率が低くても問題ない場合や、本ジペプチド化合物以外に夾雑物が多く含有されていて問題ない場合には、本製法１から除タンパク工程Ｓ２１、濃縮工程Ｓ３０、及び精製工程Ｓ４０からなる群より選ばれた１つ以上の工程を省略しても良い。この場合には、脂質除去工程Ｓ２２で採取された水溶液そのものを、ユーグレナ水性成分を含んで成る組成物（本組成物１）として扱うことができる。

【0087】

図２に示す本製法２では、夾雑物を除いて本ジペプチド化合物の含有率を相対的に高める観点から、ユーグレナ細胞の収集物を無極性溶媒と混合して幾らか脱脂された細胞を乾燥工程Ｓ１７に供しても良い。同様の観点から、乾燥されたユーグレナ細胞を含有する乾燥物を無極性溶媒と混合して、幾らか脱脂された細胞を含んで成る組成物を得ても良い。

【0088】

本組成物１を医薬組成物または食品組成物として用いる場合には、図１に示す脂質除去工程Ｓ２２、濃縮工程Ｓ３０、及び精製工程Ｓ４０からなる群より選ばれた１つ以上の工程の後に、さらに、薬理学的に許容される公知の添加剤または公知の食品素材を混合するのが好ましい。本組成物１を輸液製剤として用いる場合には、直に血中に投与されるため、精製工程Ｓ４０で得られた精製物を水や電解質と混合して輸液製剤を製造するのが好ましい。本組成物２を医薬製剤または加工食品として用いる場合には、図２に示す乾燥工程Ｓ１７の後に、さらに、薬理学的に許容される公知の添加剤または公知の食品素材を混合するのが好ましい。

【実施例】

【0089】

＜ユーグレナ細胞に含蓄されたジペプチドの分析＞
本発明者らは、公立大学法人大阪府立大学の食品代謝栄養学研究室から、この研究室で管理されている実験用のユーグレナ・グラシリス細胞株の提供を受けた。このユーグレナ細胞を培養して生育させるために、実験例１に係る培地として、前述したＫＨ培地（表３）１５０ｍＬをフラスコ内で調製した。また、実験例１に係る培地（ＫＨ培地）と比べて、次の表４に示すようにＬ−グルタミン酸、硫安（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、及び燐安（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４）を多く配合された他は、同じ組成である実験例２に係る培地および実験例３に係る培地を、各々１５０ｍＬずつ別個のフラスコ内で調製した。

【0090】

【表4】

【0091】

実験例１から実験例３の各々に係る培地について、フラスコの口部に綿栓を詰めて、オートクレーブにより２気圧、１２１℃で１５分間かけて加圧滅菌した。滅菌した培地をクリーンベンチ内に置いて培地が冷えてから、雑菌が混入しないようにして、培地ごとに１．０×１０^４個以上かつ３．０×１０^４個以下程度のユーグレナ細胞が含有されるように細胞の懸濁液を少量添加した。２８℃以上かつ３０℃以下に保たれた培養室内で、細胞を添加された培地を振とう機により８０ｒｐｍ程度で振とうしながら、この培地に５，０００ｌｕｘ程度の強さの光を照射し続けて、７日間かけて細胞を培養して生育させた。

【0092】

培養後の実験例１から実験例３の各々に係る培地を、凍結乾燥機により凍結乾燥させて、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物２００ｍｇをチューブ内で８０質量％アセトニトリル水溶液５．０ｍＬに懸濁させて、細胞懸濁液を調製した。チューブごと細胞懸濁液を氷冷しながら、超音波破砕機（株式会社トミー精工製、型名：ＵＲ−２１Ｐ）により細胞懸濁液に超音波の振動を１０秒間加える処理を３回繰り返して、細胞の破砕処理液を得た。遠心分離機により破砕処理液に４℃で６，０００×Ｇの遠心力を１０分間かけて、遠心分離により形成された上清を約５ｍＬ採取した。この上清が２００μＬ以下になるまで遠心濃縮機（株式会社トミー精工製、型名：ＣＣ−１０５）により遠心濃縮して、濃縮物を得た。

【0093】

上記した濃縮物から本ジペプチド化合物の含有率が高まるように精製するために、カラム平衡化バッファーとして１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸を調製した。このバッファーを固相抽出カラム（ウォーターズ コーポレーション製、Ｏａｓｉｓ ＭＣＸ Ｃｏｌｕｍｎ、Ｏａｓｉｓは登録商標）に注入して平衡化させた。また、実験例１から実験例３の各々に係る濃縮物を、１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸８００μＬと混合して、得られた混合液を平衡化されたカラムに注入した。さらに、メタノールを注入してカラム内を洗浄した後に、アンモニアを５００ｍｍｏｌ／Ｌ含有するメタノールを注入してカラムから溶出された水溶液を採取した。採取した水溶液を遠心濃縮により乾固させることにより、精製物を得た。

【0094】

ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（タンデム四重極質量分析計を用いた液体クロマトグラフィー質量分析）を行うために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ウォーターズ コーポレーション製、ＬＣの型番：Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ ２９６５、ＭＳ／ＭＳの型番：Ｘｅｖｏ ＴＱＤ）を準備した。実験例１から実験例３の各々に係る精製物を２．０質量％モノフルオロ酢酸水溶液に溶解させて、ＬＣ／ＭＳ用の試料とした。また、標準試料として、ＱＲとＲＱを各々１．０μｍｏｌ／Ｌずつ含有するか、又はＮＲとＲＮを各々１．０μｍｏｌ／Ｌずつ含有する、２．０質量％モノフルオロ酢酸水溶液を調製した。移動相Ａとして、ギ酸を０．１質量％含有するアセトニトリル溶液を調製した。移動相Ｂとして、ギ酸アンモニウムを１００ｍｍｏｌ／Ｌ含有する水溶液を調製した。アミノ酸分析用カラム（インタクト株式会社製、Ｉｎｔｒａｄａ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ、内径２．０ｍｍ×カラム長５０ｍｍ）のカラム温度を４０℃に保ち、このカラムにＬＣ／ＭＳ用の試料および標準試料のいずれか２０μＬを注入して、更に移動相Ａ及び移動相Ｂを次の表５に示すように濃度勾配を制御してこのカラムに流速０．３ｍＬ／分で送液して各成分を分離させることにより、ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。

【0095】

【表5】

【0096】

ＬＣ／ＭＳにより標準試料（ＱＲとＲＱ）から得られたトータルイオンクロマトグラムでは、図３に示すように、保持時間６．４９分でＱＲに由来するピークが認められ、保持時間６．８８分でＲＱに由来するピークが認められた。また、ＱＲやＲＱをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにかけると、分子内に有するアルギニン残基に由来して、Ｈ_２ＮＣ（：ＮＨ）ＮＨＣＨ_２⁻イオンが生じる。このプロダクトイオンの質量電荷比は、約７０である。このため、図４に示すｍ／ｚ＝７０での選択イオンモニタリングのクロマトグラムにおいても、同様の保持時間において、ＱＲに由来するピークと、ＲＱに由来するピークが認められた。

【0097】

図４に示すように、実験例１から実験例３の各々に係る試料では保持時間６．８８分前後で大きなピークが認められたため、いずれの試料もＲＱを多く含有していることが示唆された。また、図４の保持時間６．４９分前後において、実験例１及び実験例２ではピークが認められなかったが、実験例３では微小なピークが認められた。このため、実験例１及び実験例２と比べて、実験例３に係る試料ではＱＲが検出可能な程度に多く含有されていることが示された。

【0098】

図４に示すように、実験例１ではＱＲ及びＲＱ以外のペプチドに由来する微小なピークが多数認められたことに対して、実験例２及び実験例３で同様のピークはほとんど認められなかった。このことと前述した表３及び表４を考慮すると、実験例１に係る培地（ＫＨ培地）と比べて実験例３に係る培地では、グルタミン酸化合物やアンモニア態窒素の含有量が多いことに起因して、培地で生育したユーグレナ細胞においてＬ−アルギニンがＱＲやＲＱの形態で含蓄されやすいものと考えられる。

【0099】

ＭａｓｓＬｙｎｘ質量分析（ＭＳ）用ソフトウェア（ウォーターズ コーポレーション製、ｖｅｒｓｉｏｎ４．１）により、図４に示すクロマトグラムからノイズを除き、図５に示すクロマトグラムを得た。図５での標準試料におけるＲＱに由来するピークの面積が１．０μｍｏｌ／Ｌ相当であることに基づいて、実験例１から実験例３の各々に係る試料においてＲＱに由来するピークの面積から各々の試料におけるＲＱの含有量を算出した。

【0100】

【表6】

【0101】

表６に示すように、実験例２に係る試料および実験例３に係る試料では、実験例１に係る試料と比べてＲＱの含有量が８倍を超えて多かった。このため、実験例１に係る培地（ＫＨ培地）で生育して乾燥されたユーグレナ細胞と比べて、実験例２に係る培地又は実験例３に係る培地で生育して乾燥されたユーグレナ細胞では、ＲＱが多く含有されていることが示唆された。ＫＨ培地よりもグルタミン酸化合物およびアンモニア態窒素の含有量が多い培地でユーグレナ細胞が生育したことに起因して、この細胞内でグルタミン酸化合物やアンモニア態窒素からＲＱが多く生合成されたものと考えられる。

【0102】

標準試料（ＮＲとＲＮ）からＬＣ／ＭＳにより得られたトータルイオンクロマトグラムでは、図６に示すように、保持時間６．１５分でＮＲに起因するピークが認められ、保持時間６．７９分でＲＮに起因するピークが認められた。このＮＲに起因するピークは、実験例１に係る試料では認められたが、実験例２及び実験例３に係る試料では認められなかった。また、このＲＮに起因するピークは、実験例２に係る試料では認められたが、実験例１及び実験例３に係る試料では認められなかった。このため、ＮＲやＲＮは、ユーグレナ細胞を生育させる培地の組成によって、含蓄されやすい場合と含蓄されにくい場合があるものと考えられる。

【0103】

＜アミノ酸およびジペプチドの各々が有する、ＡＣＥ阻害活性の評価＞
ＡＣＥ阻害活性を有する遊離アミノ酸として、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、及びＬ−アルギニン（全て協和発酵キリン株式会社製）をそれぞれ準備した。また、これらの遊離アミノ酸５種を等質量ずつ混合して、遊離アミノ酸の混合組成物を調製した。ＡＣＥ阻害活性測定用の基質溶液や酵素溶液など一式として、株式会社同仁化学研究所製のＡＣＥ Ｋｉｔ−ＷＳＴを準備した（非特許文献９を参照）。

【0104】

１８ｍΩのミリＱ水に、上記した遊離アミノ酸５種のうちのいずれか１種または混合組成物を溶解させて、比較試験用の溶液を調製した。非特許文献９に記載された測定操作の方法に従って、比較試験用の溶液２０μＬ、基質溶液２０μＬ、及び酵素溶液２０μＬを混合して、混合液６０μＬを調製した。この混合液において、遊離アミノ酸の含有量が例えば５００ｍｇ／Ｌ、又は１，０００ｍｇ／Ｌになるように調製した。また、ＡＣＥ阻害物質を含有していない対照群として、比較試験用の溶液の代わりにミリＱ水を混合した混合液を調製した。ＡＣＥを含有していない対照群として、酵素溶液の代わりにミリＱ水を混合した混合液を調製した。これらの混合液それぞれを３７℃で１０分間保ってから、波長４５０μｍの光に対する吸光度（以下「ＯＤ_４５０」という。）を測定した。ＡＣＥ阻害物質を含有していない対照群でのＯＤ_４５０の測定値がＡＣＥ阻害率０％を示すものとみなし、ＡＣＥを含有していない対照群でのＯＤ_４５０の測定値がＡＣＥ阻害率１００％を示すものとみなした上で、ＯＤ_４５０の測定結果に基づいて混合液それぞれでのＡＣＥ阻害率を算出した。算出結果の平均値を次の表７に示す。

【0105】

【表7】

【0106】

また、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のペプチド合成受託サービスに依頼して、ＲＱ、ＱＲ、ＲＮ、及びＮＲを準備した。これらのジペプチド４種は、Ｌ−アルギニン及びＬ−アスパラギン、または、Ｌ−アルギニン及びＬ−グルタミンを原料として用いて、ペプチド合成により調製されたものである。これらジペプチド４種の各々によるＡＣＥ阻害率を測定するにあたり、混合液においてＲＱ、ＱＲ、ＲＮ、及びＮＲのいずれか１種のジペプチドが０．１２ｍｇ／Ｌ、０．６２ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、又は７７ｍｇ／Ｌのいずれかの濃度で含有されるようにした他は、前述した遊離アミノ酸でのＡＣＥ阻害率の測定と同様の手法により測定してＡＣＥ阻害率を算出した。算出結果の平均値を、図７及び次の表８に示す。

【0107】

【表8】

【0108】

図７及び表８に示すように、ジペプチド４種のうちのいずれか１種を含有する混合液において、ジペプチドの含有量が多いほどＡＣＥ阻害率の値が大きくなった。表７と表８を比較すると、遊離アミノ酸よりもジペプチドの方が、少量でもＡＣＥ阻害率の値が高い。この実験結果により、本発明者らは、ＲＱ、ＱＲ、ＲＮ、及びＮＲの各々が、Ｌ−アルギニン等の遊離アミノ酸よりも強いＡＣＥ阻害活性を有するジペプチドであることを発見した。表８に示すように、ジペプチドの含有量が３．１ｍｇ／Ｌから７７ｍｇ／Ｌである混合液でのＡＣＥ阻害率の値が大きいため、「Ｎ．Ｄ．」と記載した部分について再実験を行えば、小さい値ながらもＡＣＥ阻害活性を有するという実験データを得ることができるであろうと考えられる。

【0109】

＜ユーグレナ水性成分を含んで成る組成物の試作＞
前述した実験例１と同様に、ユーグレナ・グラシリスの細胞株の提供を受けた。ユーグレナを培養して生育させるために、実験例４に係る培地として、前述したＣＭ培地（表１）から組成の一部を変更して、次の表９に示す組成の培地１５０ｍＬをフラスコ内で調製した。また、実験例４に係る培地（表９）と比べて、表１０に示すようにＬ−グルタミン酸または燐安（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４）の含有量が多いことを除けば、同じ組成である実験例５から実験例１０の各々に係る培地を１５０ｍＬずつ別個のフラスコ内で調製した。

【0110】

【表9】

【0111】

【表10】

【0112】

前述した実験例１と同様に、実験例４から実験例１０の各々に係る培地を加圧滅菌して冷えてからユーグレナ細胞の懸濁液を添加し、振とうしながら光を照射して７日間かけて培養することにより細胞を生育させた。培養期間の終了時に、各々の培地を攪拌して少量を採取して、血球計算盤上に滴下して、液滴上にカバーガラスを貼り付けた。顕微鏡で観察して、血球計算盤上における１．０ｍｍ×１．０ｍｍの区画内に存する細胞数を数えて、次の数式１により培地１．０ｍＬあたりのユーグレナ細胞数を算出した。

【0113】

【数1】

Ｎ_Ｃ：培地１．０ｍＬあたりの細胞数
Ｎ_Ｎ：１．０ｍｍ^２あたりに存する細胞数の平均値
１０^４：１．０ｍｍ^２に対する容量の変換値

【0114】

培養後の実験例４から実験例１０の各々に係る培地をチューブに分注して、遠心分離機により４℃で２，０００×Ｇの遠心力をかけた。遠心分離により形成された細胞のペレットを採取して、このペレットを少量のトリス塩酸緩衝液に懸濁させることにより、ユーグレナ細胞を高密度で含有する細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液および超音波破砕機の発振棒をビーカーに入れ、ビーカーを氷冷しながら２０ｋＨｚの振動を繰り返し加えて、ユーグレナ細胞の破砕処理液を得た。この破砕処理液を新たなチューブ内に移して４℃で６，０００×Ｇの遠心力をかけて、形成された上清を回収した。この上清とトリクロロ酢酸を混合して、４℃で６，０００×Ｇの遠心力をかけてタンパク質を沈殿させて、除タンパク処理された上清を得た。この上清とジエチルエーテルを混合することにより、上清に含有されている脂質をジエチルエーテルに抽出させた。形成されたジエチルエーテルの層を除去して、形成された水層を採取した。この水層を凍結乾燥機により乾燥させて、実験例４から実験例１０の各々に係る凍結乾燥物（ユーグレナ水性成分を含んで成る組成物）を得た。これらの凍結乾燥物の各々の総質量を量った。

【0115】

＜試作した組成物におけるＡＣＥ阻害活性の評価＞
実験例４から実験例１０の各々について上記した凍結乾燥物のうちの２００μｇを採取して、ｐＨ５．０である酢酸緩衝液２０μＬに溶解させて、更に０．５質量％ニンヒドリン試液４０μＬと混合した。凍結乾燥物と酢酸緩衝液とニンヒドリン試液の混合液を、沸騰湯浴中で１５分間熱してから、室温（２０℃前後）で３０分間放置して冷やした。３０分放置した混合液に、５０体積％エタノール水溶液２６０μＬを混合して、得られた溶液について分光光度計により波長５９５μｍの光に対する吸光度（ＯＤ_５９５）を測定した。Ｌ−アルギニンの標品による検量線に基づいて（このことを以下「アルギニン換算」という。）、各々の実験例に係る凍結乾燥物におけるアミノ酸の絶対量（遊離アミノ酸とペプチド構成アミノ酸との合計量）を算出した。

【0116】

別途、実験例４から実験例１０の各々に係る凍結乾燥物の一部を採取して、ミリＱ水と混合することにより、ＡＣＥ阻害活性を測定するための試料溶液を調製した。前述したＡＣＥ Ｋｉｔ−ＷＳＴを用いて、非特許文献９に記載された測定操作の方法に従って、試料溶液２０μＬ、基質溶液２０μＬ、及び酵素溶液２０μＬを混合した。この混合により、アルギニン換算でのアミノ酸の絶対量が４５ｍｇ／Ｌとなるように、実験例４から実験例１０の各々に係る凍結乾燥物のいずれかを含有する混合液６０μＬを調製した。この混合液を３７℃で１０分間保ってからＯＤ_４５０を測定して、前述したようにＡＣＥ阻害率を算出した。算出結果の平均値を次の表１１に示す。

【0117】

【表11】

【0118】

表１１に示すように、実験例４から実験例１０のいずれも、「アミノ酸の絶対量が４５ｍｇ／Ｌである混合液でのＡＣＥ阻害率」の値が３８％以上であった。前述した表７および表８に示したＡＣＥ阻害率の値も考慮すると、実験例４から実験例１０の各々に係る凍結乾燥物は、Ｌ−アルギニンを、遊離アミノ酸というよりも本ジペプチド化合物の形態で多量に含有しているものと推察される。

【0119】

また、表１１に示す実験例４から実験例７の比較により、「培地におけるアンモニア態窒素の含有量」が増すほど、「７日間培養した培地１．０ｍＬあたりに存するユーグレナ細胞数」が減少することが示された。一方、実験例４及び実験例５と比較して、実験例６および実験例７では、「培地におけるアンモニア態窒素の含有量」が増すほど、「アミノ酸の絶対量が４５ｍｇ／Ｌである混合液でのＡＣＥ阻害率」の値が大きくなった。このため、培地におけるアンモニア態窒素の含有量が３８ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると、アンモニア態窒素の含有量が増すほど細胞数が増えにくくなるが、個々の細胞で本ジペプチド化合物が多量に含蓄されやすくなるものと考えられる。

【0120】

表１１に示す実験例４、及び実験例８から実験例１０の比較により、培地におけるアンモニア態窒素の含有量が１５．１ｍｍｏｌ／Ｌである場合には、培地におけるＬ−グルタミン酸の含有量が多くなる程、「７日間培養した培地１．０ｍＬあたりに存するユーグレナ細胞数」が増して、「アミノ酸の絶対量が４５ｍｇ／Ｌである混合液でのＡＣＥ阻害率」の値が大きくなることが示された。また、実験例４から実験例７と比べて、実験例８と実験例１０では、「凍結乾燥物１，０００ｍｇあたりの原料となったユーグレナ細胞数」が多かった。このため、培地におけるアンモニア態窒素の含有量が１５．１ｍｍｏｌ／Ｌである場合には、培地におけるＬ−グルタミン酸の含有量が多くなると細胞数が増加しやすくなることにより、凍結乾燥物に本ジペプチド化合物が多く集められたものと推察される。

【0121】

＜動物実験＞
本発明に係る組成物を経口摂取して発揮されるＡＣＥ阻害作用等について検証するために、動物実験を行うこととした。動物実験に供する組成物（実験例１１に係る凍結乾燥物）を試作するために、ゲルろ過クロマトグラフィー用担体としてＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０を準備して、直径１．５ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラムに充填した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０の排除限界は、７００Ｄａである。排除限界は、カラム内を通される分子が固定相（担体）に捕捉されて分画され得る分子量の上限値である。このため、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０は、本ジペプチド化合物のように分子量が比較的に小さいペプチドを分画するのに適した担体である。予備実験として、約２０℃の室温下において、ＱＲ、Ｌ−グルタミン酸、及びＬ−アルギニンを含有する溶液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０充填カラムに通して、ＱＲを含有するがＬ−グルタミン酸やＬ−アルギニンを実質的に含有しない画分がカラムから流出した保持時間を調べた。また、前述した実験例１と同様に、ユーグレナ・グラシリス細胞株の提供を受けた。前述したＫＨ培地（表３）から組成の一部を変更して、次の表１２に示す組成である実験例１１に係る培地１５０ｍＬをフラスコ内で調製した。

【0122】

【表12】

【0123】

上記した実験例１１に係る培地を用いた他は前述した実験例１と同様にして、ユーグレナ細胞を培養して生育させ、培養後の培地を凍結乾燥させて、細胞懸濁液を調製して超音波破砕にかけて、破砕処理液を得た。この破砕処理液を約２０℃の室温下においてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０充填カラムに注入して分画し、前述した予備実験で本ジペプチド化合物が流出したのと同じ保持時間においてカラムから流出した画分を得た。ここで得られた画分は、ユーグレナ細胞に由来する脂質、タンパク質、遊離アミノ酸及びその塩、並びに分子量が比較的に大きいポリペプチドやオリゴペプチドを実質的に含有しておらず、本ジペプチド化合物の含有率が高まるように精製されたユーグレナ水性成分を含有する溶液である。この画分を凍結乾燥させて、実験例１１に係る凍結乾燥物を得た。実験例１１に係る凍結乾燥物におけるアミノ酸の絶対量（遊離アミノ酸とペプチド構成アミノ酸との合計量）を、前述した実験例４から実験例１０と同様にして測定した。その上で、実験例１１に係る凍結乾燥物を、アミノ酸の絶対量が２．０ｍｇ／Ｌとなるように生理食塩水と混合して、試料水を調製した。

【0124】

日本チャールス・リバー株式会社から、ＳＰＦ（Specific Pathogen Free）化された１２週齢の雄性ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（以下「ＳＨＲラット」という。）を１２匹購入した。ＳＨＲラットは、加齢に伴い高血圧を自然発症する系統の実験動物である。動物実験は、アメリカ国立衛生研究所の「動物実験の管理と使用に関する指針」に従って実施した。２０℃以上かつ２６℃以下であり相対湿度５０％ＲＨ以上かつ７０％ＲＨ以下に保たれた飼育室内において、１２匹のＳＨＲラットを６匹の対照群ラットと６匹の実験群ラットに分けて、次の表１３に示す配合の飼料（以下「飼育用飼料」という。）を自由に摂取させて６日間かけて予備飼育してから、１２時間にわたり絶食させた。

【0125】

【表13】

【0126】

非観血法によるラット用の血圧計（株式会社ソフトロン製、型番：ＢＰ−９８Ａ−Ｌ、非特許文献１０を参照）を準備した。前述した１２時間の絶食を済ませた時点を実験開始時として、この時点において飼育室内の雰囲気下でラット用の血圧計を用いて、ラットごとに尾の付け根部分での収縮期血圧（ＳＢＰ）と拡張期血圧（ＤＢＰ）を測定した。実験開始時での血圧測定後から、対照群ラットには生理食塩水と飼育用飼料を自由に摂取させて、実験群ラットには前述した試料水と飼育用飼料を自由に摂取させて、それぞれ飼育室内で７週間にわたり飼育した。なお、予備飼育およびその後の７週間にわたる飼育中に、いずれのラットも、外観や体重増加に異常は見当たらなかった。対照群ラットでの生理食塩水の摂取量と実験群ラットでの試料水の摂取量について、ラットごとに個体差が若干見られたものの、対照群ラット６匹での平均値と実験群ラット６匹での平均値は同程度であった。同様に、飼育用飼料の摂取量についても個体差が若干見られたが、対照群ラット６匹での平均値と実験群ラット６匹での平均値は同程度であった。実験開始から５週、６週、及び７週経過時に、実験開始時と同様にしてＳＢＰ及びＤＢＰを測定した。７週経過時でＳＢＰ及びＤＢＰを測定後に、ラットごとに尾静脈から採血し、得られた血液を遠心分離して血清を得た。この血清とラット用アンジオテンシンII定量キット（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．ＷＵＨＡＮ社製、型番：ＫＳＡ００５Ｒａ１１）を用いて、このキットの説明書（非特許文献１１を参照）に従ってアンジオテンシンIIの血中濃度を測定した。測定結果を、図８（ａ）、図８（ｂ）、及び次の表１４に示す。

【0127】

【表14】

【0128】

図８（ａ）及び表１４に示すように、実験開始時でのＳＢＰ及びＤＢＰについて、対照群ラットと実験群ラットでの差は実質的に認められなかった。一方、実験開始から５週、６週、及び７週経過時においてＳＢＰ及びＤＢＰ共に、対照群ラットよりも実験群ラットの方が低い値を示した。６週経過時でのＳＢＰ及びＤＢＰでは、対照群ラットよりも実験群ラットの方が有意に低い値を示した。図８（ｂ）及び表１４に示すように、実験開始から７週経過時におけるアンジオテンシンIIの血中濃度について、対照群ラットよりも実験群ラットの方が有意に低い値を示した。この動物実験の結果から、実験例１１に係る凍結乾燥物を継続的に経口摂取させた実験群ラットでは、実験開始時からの加齢に伴う血圧上昇が緩やかに抑えられたことが示唆された。この血圧上昇抑制作用は、実験群ラットの体内において実験例１１に係る凍結乾燥物に含有される本ジペプチド化合物がＡＣＥ阻害作用を奏したことにより、アンジオテンシンIIの生成量が少なく抑えられたことに起因するものと考えられる。この作用機序を考慮すると、実験群１１に係る凍結乾燥物は、ＳＨＲラットに限らず、ヒトを含む哺乳動物において高血圧の予防または改善に用いられる食品組成物として適していると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】