特許 6754966 始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6754966

(24)【登録日】2020年8月27日

(45)【発行日】2020年9月16日

(54)【発明の名称】始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/075 20100101AFI20200907BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/075

【請求項の数】4

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2016-33905(P2016-33905)

(22)【出願日】2016年2月25日

(65)【公開番号】特開2017-147993(P2017-147993A)

(43)【公開日】2017年8月31日

【審査請求日】2019年1月30日

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100138955

【弁理士】

【氏名又は名称】末次 渉

(72)【発明者】

【氏名】堀内 浩幸

(72)【発明者】

【氏名】江崎 僚

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５１１７３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５０４７２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２３２４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０４０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２９４８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−０９９６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１２９８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biol. Reprod.，２０００年，vol.63，p.887-897

【文献】 J. Biol. Chem.，２００９年１２月，vol.284, No.49，p.34054-34064

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カスパーゼ阻害剤を含む培地で始原生殖細胞を培養する培養ステップを含む、
始原生殖細胞の培養方法。

【請求項2】

前記カスパーゼ阻害剤は、
ｚＶＡＤ−ＦＭＫである、
請求項１に記載の始原生殖細胞の培養方法。

【請求項3】

前記培養ステップで培養する始原生殖細胞は、
鳥類の初期胚の胚血液から分離される始原生殖細胞である、
請求項１又は２に記載の始原生殖細胞の培養方法。

【請求項4】

カスパーゼ阻害剤を含む、
始原生殖細胞の培養用培地添加物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物に関する。

【背景技術】

【0002】

ニワトリ等の鳥類では、一羽から１個しか受精卵（一細胞期受精卵）が得られない。しかも受精卵が卵管にあるため、遺伝子組換え等の遺伝子操作で改変された鳥類を作成することが困難であった。そこで、鳥類の改変研究では、生殖細胞へ分化することのできる始原生殖細胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ、以下単に「ＰＧＣ」ともいう）に対して遺伝子操作が行われてきた。

【0003】

遺伝子操作の標的とするＰＧＣは、例えば、非特許文献１に開示されたように、ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ（ＢＲＬ）細胞等の支持細胞を用いて培養することができる。また、非特許文献２には、塩基性線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いた、支持細胞を使用しない培養方法が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｄａｉｃｈｉ Ｍｉｙａｈａｒａ、外８名、「Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、５１、８７−９５

【非特許文献2】Ｊｉｎ Ｗｏｎ Ｃｈｏｉ、外８名、「Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＭＥＫ／ＥＲＫ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌｓ」、ＰＬｏＳＯｎｅ、２０１０年、５（９）、ｅ１２９６８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、非特許文献１に開示された支持細胞を用いた培養方法の場合、支持細胞の動物種がＰＧＣの動物種と異なる異種細胞となるため、コンタミネーションが避けられなかった。また、非特許文献２に開示された支持細胞を使用しない培養方法では、ＰＧＣを安定に増殖させられず、効率が良くないという不都合があった。

【0006】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、支持細胞を使用せずに極めて簡便かつ安定に始原生殖細胞を増殖させることができる始原生殖細胞の培養方法及び始原生殖細胞の培養用培地添加物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

ニワトリ及びマウス等のＰＧＣは、発生早期から血流に乗って生殖隆起へ移動する。移動の間に本来の経路から外れてしまったＰＧＣ、及び生殖隆起に到達してもストローマ細胞と細胞間シグナルをやりとりできなかったＰＧＣは速やかにアポトーシスする。当該知見に着目した本発明者は鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。すなわち、本発明の第１の観点に係る始原生殖細胞の培養方法は、
カスパーゼ阻害剤を含む培地で始原生殖細胞を培養する培養ステップを含む。

【0014】

また、前記カスパーゼ阻害剤は、
ｚＶＡＤ−ＦＭＫである、
こととしてもよい。

【0015】

また、前記培養ステップで培養する始原生殖細胞は、
鳥類の初期胚の胚血液から分離される始原生殖細胞である、
こととしてもよい。

【0016】

本発明の第２の観点に係る始原生殖細胞の培養用培地添加物は、
カスパーゼ阻害剤を含む。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、支持細胞を使用せずに極めて簡便かつ安定に始原生殖細胞を増殖させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】精製したＰＧＣの顕微鏡画像を示す図である。（Ａ）は培養開始直後のＰＧＣを示す図である。（Ｂ）は４５日間培養後のＰＧＣを示す図である。

【図2】アポトーシス阻害剤存在下でのＰＧＣの増殖活性を示す図である。

【図3】長期培養したＰＧＣにおけるＮａｎｏｇ及びＣｖｈの発現と核の局在を示す図である。

【図4】長期培養したＰＧＣの生殖腺への移動能アッセイの結果を示す図である。

【図5】ニワトリ肝細胞‐馴化培地を含む培地におけるＰＧＣの増殖活性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。

【0020】

（実施の形態）
本実施の形態に係るＰＧＣの培養方法は、アポトーシス阻害剤を含む培地でＰＧＣを培養する培養ステップを含む。本実施の形態では、ニワトリのＰＧＣを例に培養方法を説明する。培養するニワトリのＰＧＣは、特に限定されないが、例えば、Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ ａｎｄ Ｋｏｃｈａｖの発生ステージ（Ｉ〜ＸＩＶ）のステージＸの胚盤葉上層に含まれる。ニワトリの胚盤葉は、ニワトリの受精卵から公知の方法で分離できる。

【0021】

好適には、ＰＧＣは、ニワトリの初期胚の胚血液から分離される。初期胚の胚血液は、孵卵開始から４８〜６０時間、好ましくは５０〜５８時間、特に好ましくは５５時間経過後の受精卵から採取できる。特に、ニワトリの初期胚の胚血液は、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ−Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ＨＨ）ステージ１３〜１５のニワトリ胚から採取するのが好ましい。

【0022】

ＰＧＣは、例えば、密度勾配遠心法により胚血液から単離精製できる。密度勾配遠心法では、高濃度の密度勾配遠心分離媒体を含む培地、該培地よりも低濃度の密度勾配遠心分離媒体を含む培地に続いて、胚血液を含む培地の順に遠沈管内に重層し、該遠沈管を遠心する。遠心によって、高濃度の密度勾配遠心分離媒体を含む培地と低濃度の密度勾配遠心分離媒体を含む培地との界面にＰＧＣが分離される。したがって、界面の培地を回収することでＰＧＣを精製できる。

【0023】

上記ニワトリの種類は特に限定されず、例えば、Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂｒｏｗｎ Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂａｒｒｅｄ Ｒｏｃｋ、Ｓｕｓｓｅｘ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ、Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ、Ｍｉｎｏｒｃａ、Ａｍｒｏｘ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｒａｙ、Ｉｔａｌｉａｎ Ｐａｒｔｉｄｇｅ ｃｏｌｏｒｅｄ及びＫｏｒｅａｎ Ｏｇｅ等が挙げられる。

【0024】

アポトーシス阻害剤は、アポトーシスを阻害できれば特に限定されない。アポトーシスの阻害では、例えば、アポトーシスシグナル経路に関与する酵素等を阻害すればよい。特に細胞間接着を失った単一細胞におけるアポトーシスシグナル経路の阻害が好ましい。アポトーシス阻害剤は、例えば、ミオシンII阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、以下単に「ＲＯＣＫ」ともいう）阻害剤及びカスパーゼ阻害剤等である。

【0025】

ミオシンII阻害剤としては、ブレビスタチン等が好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２、Ｈ１１５２及びリパスジル等が好ましい。カスパーゼ阻害剤としては、ｚＶＡＤ−ＦＭＫ等が好ましい。

【0026】

培養ステップでは、例えば、アポトーシス阻害剤を添加した培地でＰＧＣを培養すればよい。アポトーシス阻害剤の培地における濃度は、特に限定されないが、０．０１μＭ以上１００μＭ以下、０．１μＭ以上２０μＭ以下、又は０．５μＭ以上１０μＭ以下が好ましい。

【0027】

アポトーシス阻害剤として、好ましくはブレビスタチンが用いられる。ブレビスタチンの培地における濃度は、０．１５μＭ以上１２μＭ以下、好ましくは２μＭ以上１１μＭ以下、特に好ましくは、２．５μＭ以上１０．０μＭ以下である。好適には、ブレビスタチンの培地における濃度は、５．０μＭである。

【0028】

上記培地の組成は、ＰＧＣを培養できれば特に限定されない。例えば培地は、ラット、ニワトリ等の肝細胞の馴化培地及びダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、以下単に「ＤＭＥＭ」ともいう）に、ニワトリ血清、各種アミノ酸、幹細胞用試薬及び線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下単に「ＦＧＦ」ともいう）等を含む。

【0029】

好ましくは、ＦＧＦは培地中で徐放されるように培地に加えられる。ＦＧＦを培地中で徐放させるには、例えば、乳酸とグリコール酸との共重合体であるＰＬＧＡ等のポリマーにＦＧＦを封入すればよい。ＰＬＧＡポリマーに封入されたＦＧＦは、所定期間、持続的に培地中に徐放されるため、ＦＧＦが培地に安定的に供給される。

【0030】

本実施の形態に係る培養方法では、支持細胞ではなく、細胞基底膜様の基材上でＰＧＣを培養できる。当該基材としては、例えば、細胞外マトリックスタンパク質を含む基材及びゼラチンが挙げられる。好ましくは、当該基材には、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン及びヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ及び組織プラスミノーゲン活性化因子等が含まれる。基材を用いる場合、培養器の表面を基材で被覆すればよい。

【0031】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る培養方法によれば、下記実施例３に示すように、支持細胞を使用せずに安定にＰＧＣを増殖させることができる。本培養方法は、支持細胞を調製する必要がないため、極めて簡便にＰＧＣを増殖させることができる。

【0032】

また、本実施の形態に係る培養方法の培養ステップでは、ニワトリの初期胚の胚血液から分離されるＰＧＣを培養してもよいこととした。胚血液に含まれるＰＧＣは浮遊しているため、例えば、胚盤葉上層から分離する場合のプロテアーゼ処理をすることなく簡便に分離することができる。また、プロテアーゼ処理が不要であるため、プロテアーゼがＰＧＣに及ぼす影響を懸念しなくてよい。

【0033】

本実施の形態に係る培養方法で培養したＰＧＣは、長期培養しても生体内でのＰＧＣの特性を維持している。また、当該ＰＧＣは、生殖腺への移動能を保持している。このため、当該ＰＧＣは、ゲノム編集等の対象として有用であり、遺伝子改変動物の作出が容易となる。

【0034】

なお、本実施の形態に係るＰＧＣの培養方法は、ニワトリ以外の鳥類のＰＧＣの培養にも適用できる。鳥類は、特に限定されず、例えば、アヒル、シチメンチョウ、カモ、ガン、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、ダチョウ、エミュー及びヒクイドリ等である。また、本実施の形態に係るＰＧＣの培養方法は、げっ歯類等の鳥類以外の動物種のＰＧＣの培養にも適用できる。

【0035】

なお、上述のアポトーシス阻害剤は、塩酸塩等の塩であってもよい。例えば、アポトーシス阻害剤として、Ｙ−２７６３２、Ｈ１１５２及びリパスジルの塩を使用してもよい。また、アポトーシス阻害剤は、アポトーシスに関与するタンパク質の遺伝子発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ等であってもよいし、アポトーシスに関与するタンパク質の機能を阻害するアプタマー等であってもよい。

【0036】

また、本実施の形態に係るＰＧＣの培養方法は、培地の成分として、ＢＲＬの馴化培地のみならずニワトリ肝細胞の馴化培地を用いることができる。下記実施例５に示すように、ＢＲＬの馴化培地よりも少量の１０％程度のニワトリ肝細胞の馴化培地を培地に加えることで、ＰＧＣの十分な増殖活性が得られる。

【0037】

別の実施の形態では、ＰＧＣの培養用培地添加物が提供される。該培養用培地添加物は、上記アポトーシス阻害剤を含む。当該培養用培地添加物は、アポトーシス阻害剤に加え、上述の各種培地成分を含んでもよい。ＰＧＣの培養用培地添加物が、例えば、２．５μＭ以上１０．０μＭ以下、好ましくは５．０μＭとなるように、ＰＧＣの培地に添加されることで、支持細胞を使用せずに安定にＰＧＣを増殖させることができる。

【0038】

また、別の実施の形態では、ＰＧＣの培養キットが提供される。該培養キットは、少なくともアポトーシス阻害剤を含む。必要に応じて、当該培養キットは、細胞基底膜様の基材と、各種培地成分と、を含んでもよい。

【実施例】

【0039】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0040】

（実施例１：ＰＧＣの分離方法）
ＨＨステージ１３〜１５の横斑プリマスロック胚（祓川エッグファーム社製）から採取したＰＧＣを含む胚血液を、５００μｌの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有ＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）へ懸濁した。ＰＧＣの精製は、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（商標、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社製）を用いた密度勾配遠心法により行った。詳細には、まず、１５ｍｌ遠沈管の中に、１１％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ及び１０％ＦＢＳを含有する５ｍｌのＤＭＥＭ、５．５％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ及び１０％ＦＢＳを含有する５ｍｌのＤＭＥＭ、続いて胚血液及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭの順に重層し、８００×ｇで１５分間、遠心操作を行った。遠心操作後、Ｎｙｃｏｄｅｎｚの濃度差で生じた界面を中心に５ｍｌの密度勾配遠心溶液を回収し、精製ＰＧＣを回収した。

【0041】

（実施例２：ＰＧＣの培養）
まず、ＰＧＣの培養に用いるＢＲＬ−馴化培地を次のように調製した。１５０ｍｍのディッシュに約８０〜９０％コンフルエントの状態に培養したＢＲＬを準備し、３０ｍｌの５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有ＤＭＥＭにて５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で３日間培養した。この培養上清を回収し、一次バッチ馴化培地とした。新たに５％ＫＳＲ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ含有ＤＭＥＭを添加しさらに培養を行い、この培養上清を回収し、二次バッチ馴化培地とした。同様に三次バッチ馴化培地まで回収を行い、一〜三次バッチ馴化培地を混合し、０．２μｍのポアサイズのＮａｌｇｅｎｅ（商標）Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ（商標）ＰＥＳメンブレンフィルターユニット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でろ過した後、ＰＧＣの培養に使用した。

【0042】

ＰＧＣの培養には、５０倍希釈マトリゲル（商標）基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）又は０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）水溶液でコートした培養器を用いた。密度勾配遠心法により精製したＰＧＣを、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに１００個加え、培養を開始した。培養は、表１に示す基本培地を用いて３８℃、５％ＣＯ_２、３％Ｏ_２環境下で行った。細胞の増殖に合わせて２〜４日おきに継代培養を行った。アポトーシス阻害剤として、ブレビスタチン、Ｙ−２７６３２、Ｈ１１５２及びＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（すべて和光純薬工業社製）を添加した培地を用いて培養した。

【0043】

【表1】

【0044】

（結果）
密度勾配遠心法で精製したＰＧＣの培養開始直後の観察像を図１（Ａ）に示す。矢印がＰＧＣを指している。観察されたＰＧＣは、球形で、細胞質の一部にグリコーゲン顆粒を有するという典型的なＰＧＣの特徴を有していた。また、継代１９回、４５日間培養後のＰＧＣの観察像を図１（Ｂ）に示す。一部の細胞は接着細胞へ変化しているものの、長期培養後でも多くの細胞が上述したＰＧＣの特徴を有したまま増殖していることが確認された。なお、図１（Ａ）、（Ｂ）中のスケールバーは、それぞれ１００μｍに相当する。

【0045】

（実施例３：ＰＧＣの増殖活性の評価）
培養したＰＧＣの増殖活性を次のように測定することで各アポトーシス阻害剤の効果を比較した。ファルコン９６ウェルホワイトプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で、１ウェル当たり５０００個のＰＧＣ（継代１８回、４６日間培養）の培養を、３８℃、５％ＣＯ_２、３％Ｏ_２環境下で開始した。培地には、ブレビスタチン、Ｙ−２７６３２、Ｈ１１５２及びＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫをそれぞれ０．１６〜１０μＭで添加した。各アポトーシス阻害剤存在下で培養したＰＧＣについて、培養３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて増殖活性を測定した。本キットで得られる化学発光の検出には、２０３０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ ＡＲＶＯ Ｘ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた。

【0046】

（結果）
各アポトーシス阻害剤存在下での増殖活性を比較した結果を図２に示す。全てのアポトーシス阻害剤がＰＧＣの増殖活性に影響した。各アポトーシス阻害剤の至適濃度（ブレビスタチンが５又は１０μＭ、Ｙ−２７６３２が５μＭ、Ｈ１１５２が１．２５μＭ及びｚＶＡＤ−ＦＭＫが１０μＭ）の条件では、アポトーシス阻害剤を添加していない培地での培養に比べ、高い増殖活性を示した。最も増殖活性が高かったブレビスタチンにおいてはアポトーシス阻害剤を添加していない培地での培養に比べ、３．６倍高い増殖活性を示した。

【0047】

５μＭのブレビスタチン存在下での上記実施例２に係る培養方法と、Ｌａｖｏｉｒらにより確立された上記非特許文献１に記載の従来法とで、ダブリングタイムを比較した。ダブリングタイムは、Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｕｂｌｉｎｇ−ｔｉｍｅ．ｃｏｍ／ｃｏｍｐｕｔｅ．ｐｈｐ）で算出した。

【0048】

ＢＲＬを支持細胞として用いて、かつアポトーシス阻害剤を培地に加えない従来法のダブリングタイムは６．２５日で、約１００個の細胞が４０日間で８．４×１０^３個まで増殖した。一方、実施例２に係る培養方法のダブリングタイムは４．０１日で、約１００個の細胞が４８日間で４．０×１０^５個まで増殖した。したがって、上記実施例２に係る培養方法は、従来法より約１．６倍速くダブリングすることが示された。

【0049】

（実施例４：培養ＰＧＣの特性評価）
上記実施例３で選定した培養条件で培養したＰＧＣの特性を、免疫染色及び生殖腺への移動能アッセイにより評価した。５×１０^５個のＰＧＣ（継代１９回、４８日間培養）を１５ｍｌチューブに回収し、２００×ｇ、５分間遠心した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、日水製薬社製）で３回洗浄した（以降、各操作の間に同様に遠心操作を行った）。洗浄したＰＧＣを４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業社製）含有ＰＢＳで３０分間、室温で固定し、１ｍＭグリシン（和光純薬工業社製）及び１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ナカライテスク社製）含有ＰＢＳを加え５分間、室温で透過処理を行った。

【0050】

透過処理したＰＧＣを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて３回洗浄後、５０倍希釈抗ニワトリＮａｎｏｇウサギポリクローナル抗体を含む抗ニワトリｖａｓａ ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｃｖｈ）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ培養上清を加え１時間、３７℃にて一次抗体反応を行った。

【0051】

なお、上記抗ニワトリＮａｎｏｇウサギポリクローナル抗体は、ニワトリＮａｎｏｇ組換え体（ｒｃｈＮａｎｏｇ）をウサギに免疫することで取得した。より詳細には、まず、ｒｃｈＮａｎｏｇを、メルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子を含むｐＭＡＬ−ｃ２Ｘプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子を含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で、製造者の説明書に従って、融合タンパク質であるＭＢＰ−ｒｃｈＮａｎｏｇ又はＧＳＴ−ｒｃｈＮａｎｏｇとして発現させた。３００μｇのＭＢＰ−ｒｃｈＮａｎｏｇを、同量の完全フロイントアジュバントとともに雌ＮＺＷウサギの皮下に２週おきに計４回注射した。ウサギから採取した抗血清を、ＧＳＴ−ｒｃｈＮａｎｏｇ結合アガロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することで抗ニワトリＮａｎｏｇウサギポリクローナル抗体を得た。

【0052】

また、抗Ｃｖｈマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマに関しては、Ｃｖｈ組換え体（ｒＣｖｈ）をｒｃｈＮａｎｏｇと同様にＭＢＰ−ｒＣｖｈ又はＧＳＴ−ｒＣｖｈとして発現させた。次に５０μｇのＧＳＴ−ｒＣｖｈを、同量の完全フロイントアジュバントとともに８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。２週おきに計３回、同じ抗原を含む０．１ｍｌのＰＢＳでブーストした。当該マウスに５０μｇのＧＳＴ−ｒＣｖｈを含むＰＢＳを静脈内投与することでブーストし、３日後に、当該マウスの脾細胞をＳＰ２／９ Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させ、抗Ｃｖｈマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。当該ハイブリドーマを無血清培地又は１０％ＦＢＳ−ＩＭＤＭで培養し、コンフルエントになった段階で培養上清を回収した。回収した培養上清を、孔径が０．４５μｍのフィルターで濾過し、上述の一次抗体反応に用いた。

【0053】

一次抗体反応後のＰＧＣを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄し、２００倍希釈Ａｌｅｘａ５９４標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体及び１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（共にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、１時間、３７℃にて二次抗体反応を行った。二次抗体反応後のＰＧＣを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄し、１０μｌ ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）へ懸濁してスライド標本化した。得られたスライド標本を蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で観察した。

【0054】

生殖腺への移動能アッセイを次の方法で行った。ＺｓＧｒｅｅｎ１レンチウイルスベクターを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を利用して作製し、ＰＧＣへの感染に用いた。ＰＧＣへのＺｓＧｒｅｅｎ１レンチウイルスベクターの感染は、本ベクターを含む４μｇ／ｍｌポリブレン溶液（タカラバイオ社製）を用いて４時間、３７℃でインキュベートすることで行った。ＺｓＧｒｅｅｎ１にて蛍光標識したＰＧＣを、１０００個ずつステージＸ白色レグホン胚（アキタ社製）の胚盤葉下腔へインジェクションし、Ｐｅｒｒｙ及びＮａｉｔｏらにより確立された全胚培養系を用いて７日胚まで培養した。培養した７日胚より生殖腺を回収し、蛍光実体顕微鏡ＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）にてＺｓＧｒｅｅｎ１により蛍光標識されたＰＧＣの局在を観察した。

【0055】

（結果）
多能性マーカーであるＮａｎｏｇ及び生殖細胞マーカーであるＣｖｈの発現を、長期培養したＰＧＣにおいて免疫染色によって確認した結果を図３に示す。図３において核の位置を示すＤＡＰＩの位置とＮａｎｏｇの位置とが重なっているため、ＰＧＣは、核でＮａｎｏｇを発現し、細胞質でＣｖｈを発現していることが観察された。この結果、長期培養したＰＧＣは生体内でのＰＧＣの特性を維持している可能性が示された。なお、図中のスケールバーは、それぞれ５０．０μｍを示す。

【0056】

長期培養したＰＧＣの生殖腺への移動能アッセイの結果を図４に示す。回収した生殖腺の中で緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ１により標識されたＰＧＣが生殖腺の中に散在していることが観察された（図４右）。この結果、培養したＰＧＣも本来ＰＧＣが持つ生殖腺への移動能を保持している可能性が示唆された。

【0057】

（実施例５：ニワトリ肝細胞−馴化培地を用いたＰＧＣの培養）
まず、上記実施例２のＢＲＬ−馴化培地のＢＲＬの代わりにレグホン雄肝細胞（ｌｅｇｈｏｒｎ−ｍａｌｅ ｈｅｐａｔｏｍａ、ＬＭＨ）を用いて、ＬＭＨ−馴化培地を調製した。ＬＭＨとして医薬基盤・健康・栄養研究所の細胞番号ＪＣＲＢ０２３７を用いた。

【0058】

ＰＧＣの培養には、５０倍希釈マトリゲル（商標）基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）又は０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）水溶液でコートした培養器を用いた。ＨＨステージ１３〜１５の横斑プリマスロック胚（祓川エッグファーム社製）から採取したＰＧＣを含む胚血液を、リン酸緩衝液にて洗浄した。表１のＢＲＬ−馴化培地の代わりに、ＬＭＨ−馴化培地を９．２〜５４．６％とした基本培地を用いて、２４ウェルプレートの１ウェル当たりに、洗浄した胚血液から１胚を加え、３８℃、５％ＣＯ_２、３％Ｏ_２環境下で培養した。細胞の増殖に合わせて２〜４日おきに継代培養を行った。

【0059】

Ｆａｌｃｏｎ ９６ウェルホワイトプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の１ウェル当たり１０００個のＰＧＣ（継代１５回、４５日間培養）を、ＬＭＨ−馴化培地を９．２〜５４．６％とした表１に示す基本培地において、３８℃、５％ＣＯ_２、３％Ｏ_２環境下で培養開始した。培養したＰＧＣは、培養３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて増殖活性を測定した。本キットで得られる化学発光の検出には、２０３０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ ＡＲＶＯ Ｘ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた。

【0060】

（結果）
図５は、様々な濃度のＬＭＨ−馴化培地を含む基本培地におけるＰＧＣの増殖活性を示す図である。ＬＭＨ−馴化培地を、９．２％から２２．４％の濃度で用いた場合に、ＰＧＣの増殖活性が亢進した。ＬＭＨ−馴化培地を、１１．４％の濃度で用いた時に最も高い増殖活性を示した。増殖活性を比較すると、ＬＭＨ−馴化培地は約１０％と比較的低濃度で、４０％ＢＲＬ−馴化培地と同等の増殖活性を示した。

【0061】

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明は、始原生殖細胞、特にはニワトリの始原生殖細胞の生産に好適である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】