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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6763114
(24)【登録日】2020年9月14日
(45)【発行日】2020年9月30日
(54)【発明の名称】オオフトモモ抽出物を含むＰＡＲＰ阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/216 20060101AFI20200917BHJP
A61K 36/61 20060101ALI20200917BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20200917BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20200917BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20200917BHJP
A61K 127/00 20060101ALN20200917BHJP
【ＦＩ】
A61K31/216
A61K36/61
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P15/00
A61K127:00
【請求項の数】3
【全頁数】14
(21)【出願番号】特願2016-111383(P2016-111383)
(22)【出願日】2016年6月2日
(65)【公開番号】特開2017-218382(P2017-218382A)
(43)【公開日】2017年12月14日
【審査請求日】2019年5月21日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．学会（ポスターセッションプログラム）での発表による公開 第３８回日本分子生物学会年会、第８８回日本生化学会大会 合同大会 公開日：平成２７年１２月２日 学会開催日：平成２７年１２月１〜４日 ２．卒業研究発表会での発表による公開 国立大学法人琉球大学医学部保健学科卒業研究発表会 公開日：平成２７年１２月１８日 ３．卒業研究論文集の頒布による公開 国立大学法人琉球大学医学部保健学科「平成２７年度卒業研究論文集Ｎｏ．４３」 公開日：平成２８年２月２２日
(73)【特許権者】
【識別番号】504145308
【氏名又は名称】国立大学法人 琉球大学
(74)【代理人】
【識別番号】100152180
【弁理士】
【氏名又は名称】大久保 秀人
(74)【代理人】
【識別番号】100174791
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 敬義
(73)【特許権者】
【識別番号】595102178
【氏名又は名称】沖縄県
(74)【代理人】
【識別番号】100152180
【弁理士】
【氏名又は名称】大久保 秀人
(72)【発明者】
【氏名】田中 康春
(72)【発明者】
【氏名】鎌田 靖弘
(72)【発明者】
【氏名】市場 俊雄
(72)【発明者】
【氏名】前泊 智恵
【審査官】
春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１０−１３２５６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−１３２５６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−２２７６１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００５／０５６０３１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１５／１０８９８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Chang, W.-C. et al.，Protective effects of vescalagin from pink wax apple [Syzygium samarangense (Blume) Merrill and Perry] fruit against methylglyoxal-induced inflammation and carbohydrate metabolic disorder in rats，Journal of Agricultural and Food Chemistry，２０１３年 ７月 ２日，No. 61, No. 29，pp. 7102-7109
【文献】
Peralta-Leal, A. et al.，PARP inhibitors: New partners in the therapy of cancer and inflammatory diseases，Free Radical Biology and Medicine，２００９年，Vol. 47, No. 1，pp. 13-26
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８
Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０
Ａ６１Ｋ ８／００−０８／９９
Ａ６１Ｑ １／００−９０／００
ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
医中誌ＷＥＢ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Castalagin、Vescalaginのいずれか又は両方を含むことを特徴とするPARP阻害剤。
【請求項2】
Castalagin、Vescalaginのいずれか又は両方が，オオフトモモの葉から得られたものであることを特徴とする請求項１に記載のPARP阻害剤。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のPARP阻害剤を有効成分とすることを特徴とするBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は，レンブ（オオフトモモ；Syzygium samarangense）抽出物を含むポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリADPリボース合成酵素（poly（ADP-ribose）polymerase；PARP）ファミリーのうち，PARP1およびPARP2は，DNA切断部位に結合することで活性化され，ポリADPリボシル化反応（PARylation）を司る酵素である。これらのPARPは，その反応を介してDNA修復の遂行に密接に関係していると考えられており，2014年12月には，PARP阻害薬オラパリブ（Olaparib)が生殖細胞系BRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣がんの治療薬として，米国FDAにより承認された。
また，2016年1月，FDAは，あるタイプの遺伝子変異型前立腺癌患者に対して，オラパリブが画期的治療薬になると提唱している。
特に，PARP1は，塩基除去修復による単鎖切断（SSB)領域の修復および相同組換え（HR）による二本鎖切断領域の修復のいずれの過程においても，他の修復関連因子とともに必要とされる因子である。
二本鎖切断の修復過程には，BRCA1/2も関与し，これらの遺伝子に変異がみられる癌に対しては，DNA損傷を誘導する抗癌剤とPARP阻害薬の併用が，高い治療効果をもたらすとされており，近年，PARP1はBRCA1/2遺伝子変異陽性の卵巣癌の治療標的として注目されている（非特許文献１）。
しかしながら，オラパリブは，貧血症，疲労感，心臓に影響が出る悪心，嘔吐等，グレード３以上の重い有害事象が54％起きているとの報告もある。
また，細胞内部で損傷したDNAを修復するために，重要な2種類のタンパク質をコードするBRCA1遺伝子とBRCA2遺伝子に変異が生じると，BRCA遺伝子が胸や卵巣に癌を発達させる可能性（乳癌にかかるリスクが87％，卵巣癌にかかるリスクが50％であるといわれている。）が高くなり，最初の診断から10年以内に癌が再発するリスクも高くなる。
そのため，副作用が少なく効果が高いPARP阻害薬の開発が求められていた。
【0003】
一方，オオフトモモは，亜熱帯もしくは熱帯気候で栽培される東南アジア原産の常緑樹である。オオフトモモは，主にその果実が生食として利用されており，独特な見た目と酸味があり，リンゴのような味わいがある。
また，オオフトモモの葉は，長さ20ｃｍ程度の楕円形であるが，特段，利用の用途がないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Andreina Peralta-Lear et al.：PARP inhibitors：New partners in the therapy of cancer and inflammatory diseases，Free Radical Biology & Medicine 47,13-26,2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
発明者らは，沖縄の自生植物の有効活用に関する研究を長年取り組んでおり，沖縄の自生植物を用いたPARP阻害を可能とする有用成分の提供を課題としてきた。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そして，発明者らは，およそ160種類もの沖縄の自生植物の中から，PARP阻害活性を有する有用成分を含む植物を見出すとともに，その有用成分に含まれるPARP阻害化合物の特徴を明らかにすることにより，発明を完成させたものである。
【0007】
本発明は，次の構成からなる。本発明の第一の構成は，オオフトモモの葉抽出物を含むことを特徴とするPARP阻害剤である。
本発明の第二の構成は，前記抽出物が，５つの没食子酸ならびに開環した六炭糖の構造単位を有することを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第三の構成は，前記抽出物が，C-配糖体型エラジタンニンを有することを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第四の構成は，前記抽出物が，Castalagin，Vescalaginのいずれか又は複数からなることを特徴とする第一の構成に記載のPARP阻害剤である。
本発明の第五の構成は，第一から第四の構成に記載のPARP阻害剤を有効成分とすることを特徴とするBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤である。
【発明の効果】
【0008】
本発明のポリADPリボースポリメラーゼ阻害剤の特徴は，化学合成薬剤に比べて効き目が穏やかであり，沖縄では長年，食資源として親しまれてきた自生植物であるレンブから同定した成分であるため，副作用を含む安全性が比較的高い。本発明により，BRCA1/2変異乳癌や卵巣癌で苦しんでいる患者を，一刻も早く完治させるべく有益で安全なPARP阻害剤を提供できる。
すなわち，本発明のオオフトモモの葉から抽出した成分は，PARP阻害を可能とするものであり，また，そのメカニズムから，BRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤としても期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】沖縄自生植物からの有用成分の抽出・保存方法を示した図
【図2】PARP阻害活性を調べるためのスクリーニングアッセイの実験方法ならびに解析方法を示した図
【図3】162種類の葉または実からの抽出成分のPARP阻害活性を比較検討した結果を一部抜粋して示した図
【図4】オオフトモモ葉からの有用成分の抽出方法及びPARP阻害活性を示す画分（Castalagin：AQ2）の精製方法を示した図
【図5】オオフトモモ葉からの有用成分の抽出方法及びPARP阻害活性を示す画分（Vescalagin：AQ1）の精製方法を示した図
【図6】AQ2のESI-MS分析結果を示した図
【図7】AQ1及びAQ2のESI-MS分析結果を示した図（上段：AQ2，下段：AQ1）
【図8】AQ2のNMR分析結果を示した図
【図9】メチル化の前処理を行ったAQ2のNMR分析結果を示した図
【図10】AQ1及びAQ2の推定構造を示した図
【図11】酸もしくはアルカリ処理による，AQ2のPARP阻害活性への影響を検討した結果を示した図
【図12】ポリADPリボシル化反応の生成物（ポリADPリボシル化タンパク；PAR化タンパク）の解析手順を示したフローチャート
【図14】既存のPARP阻害剤であるオラパリブのIC50値を調べた図
【図15】AQ2と，既存のPARP阻害剤のPARP阻害活性を比較検討した実験結果を示した図
【図16】生理的条件下における培養細胞（SH-SY5Y）のポリADPリボシル化反応に対するAQ1ならびにAQ2の阻害効果を検討した実験結果を示した図
【図17】UV照射によりDNA損傷を惹起した細胞（U937）のポリADPリボシル化反応に対するAQ1ならびにAQ2の阻害効果を検討した実験結果を示した図
【図18】AQ2の前処理がPARPの阻害作用を惹起するか検討した実験結果を示した図
【図19】AQ2のZn2+キレート効果についてアルカリホスファターゼ（ALP）を用いて検討を行った実験結果を示した図
【図20】AQ1ならびにAQ2のMg2+キレート効果について制限酵素を用いて検討を行った実験結果を示した図
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明のPARP阻害剤等について説明を行う。
【0011】
本発明のPARP阻害剤は，162種類もの沖縄自生植物の葉ないしは実から，その成分の抽出を行い，オオフトモモの葉に，PARP阻害を示す成分が含まれることを発明者が見出したことによるものである。
【0012】
オオフトモモからの有用成分の抽出については，有用成分の抽出が可能である限り特に限定する必要はなく，種々の抽出方法を用いることができる。一例をあげると，オオフトモモの葉，もしくは乾燥などの前処理を行った原料試料について，有機溶媒による抽出を行うなどである。
この場合の有機溶媒として特に限定する必要はなく，種々の有機溶媒を用いることができ，典型的には，エタノールを用いることができる。
抽出した後の有効成分を含む有機溶媒については，必要に応じ遠心による夾雑物の除去や濃縮，分液などの粗精製作業を行い，液体のまま，もしくは凍結乾燥などにより固体として保存すればよい（以下，「有効成分試料」という。）。
【0013】
有効成分試料を用いる際には，５つの没食子酸ならびに開環した六炭糖の構造単位を有する画分を含むことが望ましい。すなわち，有効成分中に含まれるPARP阻害を示す有効成分（以下，「PARP阻害化合物」）は，MSないしはNMRによる分析上，下記の構造的特徴を有するものである。
(1) 炭素原子数41，酸素原子数26以上，分子量934の化合物であり，15個の酸性水酸基を有する。
(2) NMR分析を行った際に，δ60-80に6本のシグナルが観測されるとともに，δ90-100にはシグナルが観測されない。
(3) NMR分析を行った際に，δ105-175に35本のシグナルが観測され，そのうち5本がδ165-175のカルボニル領域である。
【0014】
これらのことから，PARP阻害化合物は，５つの没食子酸ならびに開環した六炭糖の構造単位を有することが強く推定されるものである。しかるに，PARP阻害化合物は，必ずしも，これに限定する趣旨ではない。
すなわち，前述の(1)から(3)の特徴は，本願における実験例において確認された有効成分試料に含まれるPARP阻害化合物の一つに過ぎず，また，構造として別の異なる構造体を含む余地を残すものだからである。
【0015】
有効成分試料について，有効成分試料からPARP阻害化合物を精製して用いることができ，また，有効成分試料をそのままの形でPARP阻害剤として用いてもかまわない。有効成分試料からのPARP阻害化合物の精製については，PARP阻害化合物の精製が可能である限り特に限定する必要はなく，種々の精製方法を用いることができる。
典型的には，HPLCにより，PARP阻害化合物を含む画分を分取し，これを必要に応じ有機溶媒の蒸散や脱塩などを行い，さらに精製を行えばよい。
【0016】
PARP阻害化合物について，具体的な化合物として，Castalagin，Vescalaginを用いることができ，これらのいずれかもしくは複数を含んだPARP阻害化合物，もしくはBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤として構成することができる。
【0017】
本発明においてBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤とは，CastalaginやVescalaginをはじめとするPARP阻害化合物により生体内においてPARP阻害効果を発揮することで，BRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガンの治療効果を示す薬剤として定義される。かかる薬剤については，PARP阻害化合物そのものが有効成分として機能する場合に加え，本発明の趣旨に鑑み，投与後，生体内において分子形を変化させてPARP阻害化合物が有効成分として機能する，いわゆるDDS化された場合も含まれるものである。また，これらPARP阻害化合物は，オオフトモモ葉を原料として抽出・精製したものを用いることができるが，本発明の趣旨を鑑み，化学構造を明らかにしたうえで，オオフトモモ葉からの抽出物ではなく，化学的に合成したものを用いても構わない。
【0018】
本発明のBRCA1/2遺伝子変異陽性進行卵巣ガン治療薬剤の剤形について，特に限定する必要はなく，経口剤，錠剤，カプセル剤，散剤，経皮吸収型製剤など種々の形態を採用することができる。好ましくは，経口剤が挙げられ，実験例３（図１１）に示すように，本発明の有効成分の例であるAQ1やAQ2は，酸に対して安定であることから，取扱性や服薬コンプライアンスの観点から，経口剤として構成することが好ましい。
【実施例】
【0019】
以下，本発明におけるPARP阻害剤について，実験例を用いて説明を行う。
【0020】
＜＜実験例１，沖縄自生植物からのスクリーニング＞＞１．162種類の沖縄自生植物の葉，実を用いて，これらからPARP阻害活性を有する成分を見出すことを目的に実験を行った。
２．図１に葉や実からの有用成分の抽出方法，図２にPARP阻害活性のアッセイ方法を示す。
【0021】
３．PAR合成のアッセイ法PAR合成反応液（10μＭ NAD+，15μg/ml nicked DNA，50ｍＭ Tris-HCl buffer pH8.0，10ｍＭ MgCl2，0.25μg PARP1）を25℃，30分間反応させ，２ＭＫＯＨ，20％アセトフェノン（50μl）添加し，4℃，10分暗室で冷却後88％formic acid（225μl）を添加し，110℃で5分間熱処理して残存NAD+を蛍光誘導体化し，その蛍光強度を測定した。
４．PARP阻害活性の定義
上記PAR合成反応系を用いてPARP阻害活性を求めた。
PAR合成が進むとNAD+が消費されて蛍光強度が弱まる。
仮にPARP阻害物質を加えた場合，PARP活性が抑制され，NAD+の消費が抑えられ，結果として蛍光強度が強くなる。
そこで，PARP未添加と添加の両反応系の反応後の蛍光強度差を求め，その差をPARP活性100％（仮にA）とする。
一方，PARPとPARP阻害物質の共存下における反応後の蛍光強度と，PARP存在下の反応後の蛍光強度との差をBとする。
PARP阻害活性を便宜上B/A×100とした（図２）。
【0022】
５．図３にPARP阻害アッセイの結果の一部を示す。これら一連の実験により，比較的高いPARP阻害活性を示す３種類の抽出成分（63番，67番，103番）が見出され，そのうちの一つ（図３中，63番）が，オオフトモモの葉であり，以降，オオフトモモの葉に関して実験を行った。
【0023】
＜＜実験例２，オオフトモモ葉抽出物の構造解析＞＞１．図４及び５に，オオフトモモ葉からの成分抽出方法，ならびに有効成分の精製方法を示す。
この精製方法により，PARP阻害活性を有する画分として，2つの成分（AQ1，AQ2）を得た。
そして，2つの成分（AQ1，AQ2）についてMass，NMRによる分析を行い，その構造を明らかにすることを目的に実験を行った。
その結果，AQ1，AQ2は，それぞれVescalagin，Castalaginであることが推定されたが，AQ1，AQ2の単離は，次のとおり行った（以下，「Castalagin」はAQ2を，「Vescalagin」はAQ1を意味する。）。
（１）Castalaginの単離
レンブ（別名：オオフトモモ）の葉は，2014年に沖縄市の民家で採集し，60℃で乾燥後，粉砕（IKA社MF10，3000rpm カッターミル φ1mm篩）したものを使用した。
抽出は高速溶媒抽出装置（DIONEX社ASE-350）により，抽出試料90g（試料/セライト45:45）を100mLセル2本に45gずつ充填し，水を溶媒に，85℃，1500psi，静置時間10分，フラッシュ容量60%，パージ時間300秒で行った。
得られた水抽出液（250mL）は，室温に戻したのちODS（YMC社YMC-Pack ODS-AQ 120-S50）を充てんしたカラム（φ50mm×L100mm）で粗分離（溶媒系：0.1%ギ酸→0.1%ギ酸／アセトニトリル 80：20，流速27mL/分）を行った。
得られたcastalaginを含む画分（426mg）をゲルろ過（東ソー社TOYOPEARL HW40F，φ30mm×L300mm）により分離（水／アセトニトリル 75：25，流速6mL/分）し，粗castalagin （153mg）を得た。
この粗castalaginは最終的に向流クロマトグラフ（三鬼社CPC-LLB-M）により精製（1100rpm，水／n-ブタノール／n-プロパノール 100:45:55，上層移動相，流速2.5mL/分）し，106mgのcastalaginを薄褐色のアモルファスとして得た。
（２）Vescalaginの単離
レンブ（別名：オオフトモモ）の葉は2014年に沖縄市の民家で採集し，60℃で乾燥後，粉砕（IKA社MF10，3000rpm カッターミル φ1mm篩）したものを使用した。
試料70gを700mLのアセトン／水7：3で抽出（1日静置）したのち，遠心分離（3000rpm，30分）により固液分離した。
固体はさらに2回，700mLのアセトン／水7：3で抽出（1日静置）したのち，遠心分離（3000rpm，30分）による固液分離を行った。
3回の抽出操作により合わせて約2000mLの抽出液を得た。
この抽出液をろ過（東洋濾紙社 GA-100）後，減圧下アセトンを除去し，さらに濃縮を行い約500mLの水溶性抽出液を得た。
これを酢酸エチル500mLで分液を行い，その下相（水相）を減圧下で酢酸エチルを除去し，さらに濃縮を行い約250mLの抽出液を得た。
この抽出液をODS（YMC社YMC-Pack ODS-AQ 120-S50）を充てんしたカラム（φ50mm×L100mm）で粗分離（0.1%ギ酸→0.1%ギ酸／アセトニトリル 80：20，流速27mL/分）を行った。
得られたvescalaginを含む画分（463mg）をゲルろ過（東ソー社TOYOPEARL HW40F，φ30mm×L300mm）により分離（水／アセトニトリル 75：25，流速6mL/分）し，粗vescalagin （236mg）を得た。
この粗vescalaginは最終的にゲルろ過（東ソー社TOYOPEARL HW40F，φ30mm×L300mm）により精製（水／アセトニトリル 75：25，流速2.5mL/分）し，205mgのvescalaginを薄褐色のアモルファスとして得た。
【0024】
２．図６にAQ2のESI-MS分析結果，図７にAQ1とAQ2のESI-MS分析結果（上段：AQ2，下段：AQ1）を示す。これらの分析結果から，AQ1，AQ2，いずれもその分子量は，934であると考えられる。
【0025】
３．図８にAQ2のNMR分析結果を示す。δ60-80に6本のシグナル，δ90-100にシグナルが観測されないことから，AQ2は，開環した六炭糖の構造を有すると考えられる（図８，下）。
δ105-175に35本のシグナルが観測され，そのうち5本がδ165-175のカルボニル領域であることから，AQ2は，没食子酸の構造単位を5つ有すると考えられる（図８，下）。
炭素原子数41，酸素原子数26以上，分子量934であることから，AQ2の分子式はC41H26O26であると推定される。
【0026】
４．図９にAQ2のメチル化化合物のNMR分析結果を示す。水酸基をメチル化するジアゾメタン処理によるNMRの分析結果から，AQ2は，酸性の水酸基（フェノール性またはカルボン酸）が15あると推定される（図９，上）。
【0027】
これらの結果から，AQ2は，castalaginもしくはvescalaginであることが推定された。また，AQ1は，MSスペクトルがAQ2のそれとほぼ一致していることから，AQ2と異性体の関係にあるvescalaginもしくはcastalaginである可能性が高いと考えられた。
【0028】
そこで，このことを確認するために，AQ2のNMRスペクトルデータ（表１），比旋光度（[α]24D=−94.5°）及びUVスペクトルデータ（UV λ 224nm 285nm(Sh)）を基にcastalaginのそれと比較したところ一致した。
【0029】
【表1】
【0030】
したがって，AQ2は，castalaginであると同定した（図１０）。また，AQ1についてもAQ2と同様に，NMRスペクトルデータ，比旋光度及びUVスペクトルデータを基にcastalaginの異性体であるvescalaginのそれと比較したところ一致した。
したがって，AQ1は，vescalaginであると同定した（図１０）。
なお，vescalagin及びcastalaginは，いずれもC-配糖体型エラジタンニンである。
【0031】
＜＜実験例３，AQ2のPARP阻害アッセイ＞＞１．AQ2について，その構造の安定性を知ることで，経口薬としての可能性を検討することを目的に実験を行った。
表に，各前処理の方法を簡潔に示す。
【0032】
【表2】
【0033】
２．図１１に，AQ2について前処理を行った後，PARP阻害アッセイを行った結果を示す。(1) AQ2は，酸の前処理を行ってもPARP阻害活性は中性処理の時とほとんど変わらず，AQ2は，酸に対して安定であることが分かった。
(2) 一方，アルカリ処理の場合は，その活性が著しく低下しており，AQ2自体がアルカリ処理によりその構造が変化していることが考えられ，アルカリに対しては，不安定であることが分かった。
３．これらの結果より，AQ2は，少なくとも酸に対しては安定であることから，経口薬剤としての設計が可能であることが示唆された。
【0034】
＜＜実験例４，AQ2と既存化合物とのPARP阻害能の比較＞＞１．AQ2が，既存のPARP阻害剤と比較して，どの程度のPARP阻害能を有しているかを確認することを目的に実験を行った。
【0035】
２．図２に示したPARP活性阻害の検定方法以外のPARP阻害を調べる方法の概要を図１２に示す。本方法は，ポリADPリボシル(PAR）化反応の生成物であるPAR化タンパクを免疫化学的に測定する方法である。３．図２のPARP阻害活性の測定方法に基づいて，AQ1，AQ2の阻害活性を調べるとともに，AQ2，既存のPARP阻害剤であるオラパリブのIC50値の算出を行った。
(1) AQ1，AQ2ともに同様の阻害活性を示し，IC50値は，0.8μg/mL（856nM）であった（図１３，左）。
(2) 一方，同じ実験系にてオラパリブのIC50値を算出したところ，およそ15nMであった（図１４）。
(3) なお，AQ1，AQ2の構造単位として没食子酸を有する可能性が高いことを述べたが，この没食子酸についても検討を行ったところ，10μMでもPARP阻害活性を示さなかった（図１４）。
【0036】
４．AQ2，オラパリブ，3-アミノベンズアミド，没食子酸，これらの化合物を用いたPARP阻害アッセイの結果を図１５に示す。(1) AQ2は，オラパリブよりは低く，3-アミノベンズアミドを超える阻害能を有していた。
(2) なお，没食子酸は，前述の結果（図１４）と同様，PARP阻害活性を示さなかった。
【0037】
＜＜実験例５，神経細胞芽腫細胞SH-SY5Yを用いた，AQ1，AQ2によるPARP阻害活性の確認＞＞１．神経細胞芽腫細胞SH-SY5Yを対象細胞として用い，AQ1，AQ2によるPARP阻害を行った際，PAR合成がどのように変化するか調べることを目的に実験を行った。
【0038】
２．AQ1およびAQ2を添加したDMEM+10%FCS培地でSH-SY5Y細胞を一晩培養し，回収した細胞から可溶性タンパクを調製し，SDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）の試料とした。電気泳動後，タンパクをPVDF膜に転写し，一次抗体に抗ポリADPリボース抗体を用いてタンパクに共有結合しているPAR鎖を検出した。
なお，PARP阻害剤のポジティブコントロールとしてオラパリブを用いた。
【0039】
３．図１６に結果を示す。(1) コントロールである一番左の濃いラダー上に示されたバンドと比較して，3μg/mL濃度のAQ1ならびにAQ2の前処理によるバンドは薄くなっており，このことからPAR合成が阻害されていることが分かった。
(2) また，3μg/mL濃度と比較して，15μg/mL濃度のAQ1ならびにAQ2のバンドは濃くなっており，PARP阻害効果は，逆に抑制されている結果となっていた。この原因については，不明である。
(3) なお，10μMのオラパリブでは，PAR合成は強く阻害されていた。
【0040】
＜＜実験例６，損傷DNA依存的なPAR合成に対するAQの阻害効果＞＞１．紫外線照射によりDNA損傷を惹起し，このDNA損傷により誘発されるPAR合成が，AQ1等によりどのような影響を受けるかを明らかにすることを目的に実験を行った。
【0041】
２．AQ等を添加したRPMI1640+10%FCS培地でU937細胞を2時間培養し，紫外線（10mJ総量/cm2）を照射した。回復時間2時間経過後，回収した細胞から可溶性タンパクを調製し，実験例５の方法に従ってタンパク結合PAR鎖を検出した。
【0042】
３．図１７に結果を示す。(1) DNA損傷のコントロールである左から2番のバンドと比較して，AQ1，AQ2による処理については，PAR合成は抑制されていなかった。
(2) 一方，オラパリブは，PAR合成を強く抑制していた。
【0043】
＜＜実験例７，AQ2のPARP阻害メカニズムに関する検討＞＞１．AQ2が，どのような機序でPARP阻害を行っているかを明らかにすることを目的に実験を行った。
【0044】
２．図１８は，PARPをAQ2で前処理を行った後，AQ2による阻害活性を調べた結果を示す。(1) AQ2を予めPARPと反応させる前処理の有無でAQ2の阻害活性を比較しても，その阻害活性効果はほとんど変わらなかった。
(2) また，いずれについてもAQ2の濃度依存的な阻害活性効果は変わっていなかった。
(3) これらの結果より，AQ2がPARP分子そのものに不可逆的に結合するなどの構造変化をもたらし阻害活性効果を発揮している可能性はないものと考えられた。
【0045】
３．図１９は，AQ2のZnキレート能について検討を行った結果である。すなわち，PARPは，Znを必要とする酵素（Zn酵素）であることから，AQ2がZnをキレートにより捕捉し，PARP活性を低下させている可能性について，Znを必要とする酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）を対象として検討を行ったものである。
(1) 陰性対象であるDMSOと比較して，AQ2添加によるALP活性はほとんど変化しておらず，また，濃度を変更してもその影響は全く見られなかった。
(2) なお，オラパリブの添加を行っても，ALP活性は，変化していないことが分かった。
(3) これらの結果から，AQ2が，ZnをキレートすることでPARP阻害効果を発揮している可能性はないものと考えられた。
【0046】
４．図２０は，pcDNA3/HA-DNp73αを基質として，2種類の制限酵素NheIとXhoIによるインサートの切り出しに対して，AQ1等が阻害効果を示すのかを調べた結果である。すなわち，PARPは，その活性の発揮に，10mM程度のMg2+を必要とする。
関与する反応は異なるものの，NheI，XhoIは，PARP同様，その活性の発揮に，10mM程度のMg2+を必要とすることから，これらを対象として検討を行ったものである。
(1) AQ1については，3μg/mL，15μg/mL，いずれの濃度でも，阻害作用は見られなかった。
(2) 一方，AQ2について，3μg/mLでは阻害作用は見られなかったものの，15μg/mLでは，部分的な阻害作用が見られた。
(3) なお，オラパリブについて，5μMの濃度で検討を行ったが，阻害作用は見られなかった（不図示）。