特許 6763529 抗クローディン−２モノクローナル抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6763529

(24)【登録日】2020年9月14日

(45)【発行日】2020年9月30日

(54)【発明の名称】抗クローディン−２モノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20200917BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20200917BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20200917BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200917BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20200917BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20200917BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   A61K39/395 N

   A61P1/04

   A61P35/00

   !C12P21/08

   !C12N15/13

【請求項の数】10

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2018-559444(P2018-559444)

(86)(22)【出願日】2017年12月25日

(86)【国際出願番号】JP2017046389

(87)【国際公開番号】WO2018123949

(87)【国際公開日】20180705

【審査請求日】2019年6月7日

(31)【優先権主張番号】特願2016-256352(P2016-256352)

(32)【優先日】2016年12月28日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】597128004

【氏名又は名称】国立医薬品食品衛生研究所長

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】近藤 昌夫

(72)【発明者】

【氏名】八木 清仁

(72)【発明者】

【氏名】渡利 彰浩

(72)【発明者】

【氏名】深澤 征義

(72)【発明者】

【氏名】多田 稔

(72)【発明者】

【氏名】國澤 純

【審査官】 坂井田 京

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１３２３０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０７２７２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１３２６４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０８７９７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 KRAUSE，Gerd et al.，Structure and function of claudins，Biochimica et Biophysica Acta，２００７年１０月２５日，Vol.1778，p.631−645，特に、p.631 Abstract, p.634 左欄下から6−8行目

【文献】 小林岳史，DNA免疫法による抗体の作製，生物工学，2008，第86巻, 第８号，p.384−386，特に、p.385 右欄 DNA免疫法の特徴

【文献】 ZEISSIG，S. et al.，Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions a，Gut，２００６年 ７月 ５日，Vol.56，p.61-72，特に、p.70右欄下から１行目−p.71 左欄上から３行目

【文献】 KINUGASA，Tetsushi et al.，Selective Up-regulation of Claudin-1 and Claudin-2 in Colorectal Cancer，Anticancer Research，２００７年，Vol.27，p.3729-3734，特に、p.3729 Abstract, p.3731 Table2

【文献】 AI-SADI, Rana et al.，Interleukin-6 Modulation of Intestinal Epithelial Tight Junction Permeability Is Mediated by JNK Pat，PLOS ONE，２０１４年 ３月，Vol.9, No.3，e85345，p.1−15，特に、p.1 Abstract, p.12 左欄下から1行目〜右欄上から5行目

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、クローディン−２の細胞外領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、モノクローナル抗体。

【請求項2】

配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、クローディン−２の細胞外領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、モノクローナル抗体。

【請求項3】

クローディン−２の細胞外領域の立体構造を認識する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

前記細胞外領域が、クローディン−２の細胞外第１ループ領域である、請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はこれらを組み合わせた構造である、請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体。

【請求項6】

キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。

【請求項8】

炎症性腸疾患治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

癌治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、クローディン−２発現細胞に対する物質送達用運搬体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗クローディン−２モノクローナル抗体に関する。より詳細には、本発明は、クローディン−２の細胞外領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体及び当該抗体の用途（当該抗体を含む医薬組成物、及び当該抗体を含むクローディン発現細胞に対する物質送達用運搬体等）に関する。

【背景技術】

【0002】

クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）は、１９９８年にタイトジャンクション（ＴＪ）構成タンパク質として同定された分子量約２３ｋＤａの４回膜貫通タンパク質であり、これまでに２７種類のタイプが発見されている（特許文献１、非特許文献１）。

【0003】

クローディンファミリーのひとつであるクローディン−２（Ｃｌａｕｄｉｎ−２）のうち、ヒトクローディン−２では、全長２３０アミノ酸残基であり、２８番目から７８番目のアミノ酸が細胞外領域の第１ループであり、１４４番目から１６２番目のアミノ酸が細胞外領域の第２ループであることが知られている。細胞外領域の第１ループは５１アミノ酸残基であり、細胞外領域の第２ループは１９アミノ酸残基であるように、クローディン−２の細胞外領域はいずれも小さいことが知られている。

【0004】

また、クローディン−２は、種間でアミノ酸配列の相同性が非常に高いことが知られている。例えば、ヒトクローディン−２とマウス相同タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ０５７８８４）との間では、全長アミノ酸配列の相同性が９１．３％、細胞外領域の第１ループのアミノ酸配列の相同性が９６．１％、及び細胞外領域の第２ループのアミノ酸配列の相同性が１００％であり、また、ヒトクローディン−２とラット相同タンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ００１１００３１６）との間では、全長アミノ酸配列の相同性が９１．７％、細胞外領域の第１ループのアミノ酸配列の相同性が９６．１％、及び細胞外領域の第２ループのアミノ酸配列の相同性が１００％である。

【0005】

さらに、クローディン−２は、これまでに、上皮細胞層における物質透過性を亢進させること（非特許文献２及び３）、炎症性腸疾患において発現量が増加していること（非特許文献４）、腎癌、結腸癌、肺癌、肝癌等において発現量が亢進していること（非特許文献５及び６）などが報告されていることから、創薬ターゲットとして注目を集めている。

【0006】

一般に、膜タンパク質を標的とした抗体医薬の創薬では細胞外領域を認識する抗体の作製が行われる。しかしながら、クローディン−２は、上記の通り、細胞外領域が小さく、さらに、種間のホモロジーが高いことから、最初に同定されたクローディンのうちの１つであるにも関わらず、未だクローディン−２の細胞外領域を認識する抗体は存在しない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０００−３２９８４号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Compr. Physiol., 2, 1819, 2012

【非特許文献2】J. Cell Biol., 153, 236, 2001

【非特許文献3】J. Cell Biol., 141, 1539, 1998

【非特許文献4】Lab. Invest., 88, 1110, 2008

【非特許文献5】Anticancer Res., 34, 4181, 2014

【非特許文献6】Cancer Manag. Res., 5, 367, 2013

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、クローディン−２の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体、及び当該抗体の新規な用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決すべく、ヒトクローディン−４（ｈＣＬ−４）発現細胞を自己免疫疾患マウスに投与することでｈＣＬ−４抗体を作製したとの報告（Cancer Sci., 100, 1623, 2009）をもとに、ヒトクローディン−２（ｈＣＬ−２）発現細胞を自己免疫疾患マウスに免疫することによりｈＣＬ−２抗体の作製を行うことを試みた。しかしながら、ｈＣＬ−２抗体の作製には至らなかった。

【0011】

また、本発明者らはこれまでに、ＤＮＡ免疫法によってヒトクローディン−１（ｈＣＬ−１）抗体及びヒトクローディン−４（ｈＣＬ−４）抗体を作製することに成功している（国際公開第２０１４／１３２３０７及び国際公開第２０１４／１３２６４７）。

【0012】

本発明者らは、上記のｈＣＬ−１抗体及びｈＣＬ-４抗体の作製における経験を踏まえ、ＤＮＡ免疫法によってｈＣＬ−２抗体の作製を行うことを検討した。しかしながら、上記の通り、ｈＣＬ−２の場合、最も大きな細胞外領域である第１ループは５１のアミノ酸残基と短いこと、当該第１ループのげっ歯類相同タンパク質とのアミノ酸配列の相同性が９６．１％と極めて高いのに対して、ｈＣＬ−１では９３．９％、ｈＣＬ−４では９０．５％と比較的低いこと、及び一般的に宿主タンパク質とホモロジーが高い抗原では抗体が取得しにくいこと等の理由から、ｈＣＬ−１抗体及びｈＣＬ-４抗体の作製の結果をもってＤＮＡ免疫によってｈＣＬ−２抗体の作製できると推測することはできない。

【0013】

さらに、ＤＮＡ免疫法の受託会社の資料によれば、複数回膜貫通タンパク質では２８例中１６例しか抗体の作製に成功していないこと、ＤＮＡ免疫法によるｈＣＬ−１抗体の作製は報告されている（Gastroenterology, 139, 953, 2010）が、ｈＣＬ−２の細胞外領域を認識する抗体については何ら報告されていないこと等を鑑みると、ＤＮＡ免疫法を単に用いただけではｈＣＬ−２抗体を作製できないことが強く示唆される。

【0014】

ＤＮＡ免疫法は非変性（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の抗原タンパク質に対する抗体を作製する基盤技術であり、基本的にタンパク質全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを免疫原としている。抗原タンパク質のトランケーションにより、しばしばｉｎ ｖｉｖｏでの抗原発現量が増加し、結果として抗体価が上がりやすくなることが多い。しかしながら、作製した抗体が非変性の抗原を認識しない例が多く認められること、複数回膜貫通タンパク質をターゲットとする場合、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に余分なタグ配列を付加することによってもターゲットタンパク質の膜配向性や細胞内局在が非変性のターゲットのそれと変ってしまうことが観察されている。

【0015】

このような状況の中、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡ免疫法及びスクリーニング法に工夫を凝らすことにより、クローディン−２の細胞外領域を特異的に認識する抗体を作製することができることを見出した。具体的には、抗原タンパク質として、Ｎ末端又はＣ末端に余分なタグ配列を付加せず、タンパク質全長アミノ酸配列からなる免疫コンストラクトを用い、免疫動物としてマウスに比して抗体価が上がりやすいラットを用いるという手法を採用することにより、クローディン−２の細胞外領域を特異的に認識する抗体の作製に成功した。本発明者らは、かかる知見をもとに、さらなる研究を重ねることにより本発明を完成させるに至った。

【0016】

即ち、本発明は、代表的には以下の項に記載の主題を包含する。

【0017】

項１．
クローディン−２の細胞外領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体。
項２．
クローディン−２の細胞外領域の立体構造を認識する、上記項１に記載のモノクローナル抗体。
項３．
前記細胞外領域が、クローディン−２の細胞外領域第１ループである、上記項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
項４．
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３又は４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、上記項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
項５．
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、又はこれらを組み合わせた構造である、上記項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
項６．
キメラ抗体又はヒト化抗体である、上記項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
項７．
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＹである、上記項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
項８．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
項９．
炎症性腸疾患治療用である、上記項８に記載の医薬組成物。
項１０．
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びセリアック病からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項９に記載の医薬組成物。
項１１．
癌治療用である、上記項８に記載の医薬組成物。
項１２．
前記癌が、腎癌、結腸癌、肺癌、及び肝癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１１に記載の医薬組成物。
項１３．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、炎症性腸疾患の診断用マーカー。
項１４．
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びセリアック病からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１３に記載のマーカー。
項１５．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、癌の診断用マーカー。
項１６．
前記癌が、腎癌、結腸癌、肺癌、及び肝癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１５に記載のマーカー。
項１７．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の炎症性腸疾患の診断用マーカーとしての使用。
項１８．
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びセリアック病からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１７に記載の使用。
項１９．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の癌の診断用マーカーとしての使用。
項２０．
前記癌が、腎癌、結腸癌、肺癌、及び肝癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項１９に記載の使用。
項２１．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、炎症性腸疾患の検査用組成物。
項２２．
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、及びセリアック病からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項２１に記載の組成物。
項２３．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、癌の検査用組成物。
項２４．
前記癌が、腎癌、結腸癌、肺癌、及び肝癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記項２３に記載の組成物。
項２５．
上記項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、クローディン−２発現細胞に対する物質送達用運搬体。
項２６．
（ａ）免疫動物にクローディン−２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程、
（ｂ）前記免疫動物から抗体産生能を有する細胞を回収した後、細胞融合することによりハイブリドーマを調製する工程、及び
（ｃ）前記ハイブリドーマから抗体を回収する工程を含み、
前記クローディン−２をコードするポリヌクレオチドが、クローディン−２の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、かつ
前記免疫動物が、抗体価の上昇しやすい免疫動物であることを特徴とする、
上記項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
項２７．
前記免疫動物がラットである、上記項２６に記載の方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、クローディン−２の細胞外領域に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を提供することができる。さらに、当該抗体を含む医薬組成物及び当該抗体を含むクローディン−２発現細胞に対する物質送達用運搬体等の用途を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】実施例１で行ったＦＣＭ解析の結果を示す図である。

【図2】実施例２で行ったＦＣＭ解析の結果を示す図である。

【図3】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図4】実施例５で行ったＦＣＭ解析の結果を示す図である。

【図5】実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図6】実施例７で行ったＦＣＭ解析の結果を示す図である。

【図7】実施例８で行ったウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図8】実施例９で行ったＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。

【図9】実施例９で行ったＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。

【図10】実施例１０で行ったＴＥＥＲ値の測定結果（Ａ）及びウエスタンブロッティング解析の結果（Ｂ）を示す図である。

【図11】実施例１１で行ったＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。

【図12】実施例１１で行ったＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。

【図13】実施例１２で行ったＴＥＥＲ値の測定結果を示す図である。

【図14】実施例１３で行った細胞生存率の算出結果を示す図である。

【図15】実施例１４で行った細胞生存率の算出結果を示す図である。

【図16】実施例１５で行ったルシフェラーゼ活性の測定結果（Ａ及びＢ）を示す図である。

【図17】実施例１５で行ったルシフェラーゼ活性の測定結果（Ａ及びＢ）を示す図である。

【図18】実施例１６で行った細胞生存率の算出結果を示す図である。

【図19】実施例１７で行った蛍光強度の測定結果を示す図である。

【図20】実施例１８で行った腫瘍サイズ（Ａ）及びマウスの体重（Ｂ）の測定結果を示す図である。

【図21】実施例１９で行った炎症性腸疾患に対する治療効果を測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、クローディン−２を「ＣＬ−２」と記載する場合がある。

【0021】

本発明のモノクローナル抗体は、クローディン−２に対する抗体（本明細書において、「抗クローディン−２抗体」又は「抗ＣＬ−２抗体」と記載する場合がある。）であり、より詳細には、クローディン−２の細胞外領域に特異的に結合する抗体である。クローディン−２には、２つの細胞外領域が存在しており、２８番目から７８番目のアミノ酸が細胞外領域第１ループであり、１４４番目から１６２番目のアミノ酸が細胞外領域の第２ループであることが知られている。本発明のモノクローナル抗体は、これらの細胞外領域のうち、細胞外領域第１ループである、２８番目から７８番目のアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する。また、本発明のモノクローナル抗体は、当該細胞外領域第１ループの１次構造ではなく、二次構造や三次構造等の立体構造を特異的に認識する抗体である。

【0022】

本発明のモノクローナル抗体は、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子だけではなく、クローディン−２細胞外領域に結合する生物学的に活性なモノクローナル抗体断片をも包含する。このような断片としては、重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含んでいるものであればよく、このような断片を適宜再構成したものであってもよい。断片の具体的な構造としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖなどが挙げられる。また、これらを組み合わせた構造であってもよい。

【0023】

また、本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプは特に限定的ではなく、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹなどが挙げられる。中でも、ＩｇＧ及びＩｇＭが好ましく、ＩｇＧが特に好ましい。ＩｇＧのサブクラスとしては特に限定的ではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。中でも、ＩｇＧ２ｂであることが好ましい。

【0024】

本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３又は４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１又は１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体である。

【0025】

さらに、本発明のモノクローナル抗体は、より好ましくは、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体、又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体である。

【0026】

上記した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体は、更にフレームワーク領域（ＦＲ）又はその準領域を含んでいてもよい。ＦＲを構成するアミノ酸配列は公知の方法によって適宜決定することができる。

【0027】

このようなＦＲを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体としては、例えば、
配列番号１３又は１４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１５又は１６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体を例示することができ、好ましくは、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体、又は
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体である。

【0028】

本発明のモノクローナル抗体は、その機能等を損なわない範囲において、上記した配列番号１〜１６で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸の同一性は、公知の方法により計算することができる。

【0029】

本発明のモノクローナル抗体は、その機能等を損なわない範囲において、上記した配列番号１〜１６で示されるアミノ酸配列に任意の変異が存在していてもよい。変異とは具体的には、置換、欠失、挿入等である。上記した配列番号１〜１６で示されるアミノ酸配列に導入され得る変異数は本発明のモノクローナル抗体の機能等を損なわない限り特に限定的ではなく、例えば、変異導入前のアミノ酸配列と変異導入後のアミノ酸配列との同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であればよい。変異導入の方法は特に限定的ではなく公知の方法を採用することができる。

【0030】

アミノ酸配列に導入される変異が置換である場合には、当該置換は保存的置換であることが好ましい。本明細書において「保存的置換」とは、あるアミノ酸を当該アミノ酸の側鎖と類似の性質を有する側鎖を有するアミノ酸に置換することを意味する。具体的な保存的置換としては、リジン、アルギニン、及びヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；アスパラギン酸、及びグルタミン酸等の酸性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン等の非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン等の非極性側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；スレオニン、バリン、及びイソロイシン等のβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン等の芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士の置換；などを例示することができる。

【0031】

また、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体であってもよいし、ヒト化抗体であってもよい。なお、キメラ抗体とは、定常領域がヒト由来のアミノ酸配列であり、可変領域がヒト以外の生物種に由来するアミノ酸配列である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、定常領域及び可変領域のＦＲがヒト由来のアミノ酸配列であり、それ以外の部分がヒト以外の生物種に由来するアミノ酸配列である抗体を意味する。上記したヒト以外の生物種としては特に限定的ではなく、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ダチョウ、サル、チンパンジー、ウマ、ロバ等が挙げられる。

【0032】

本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、（ａ）免疫動物にクローディン−２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程、（ｂ）前記免疫動物から抗体産生能を有する細胞を回収した後、細胞融合することによりハイブリドーマを調製する工程、（ｃ）前記ハイブリドーマから抗体を回収する工程を含む。

【0033】

なお、ＤＮＡ免疫法は、非変性（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の抗原タンパク質に対する抗体を作製する基盤技術であり、一般的にタンパク質全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを免疫原としている、ＤＮＡ免疫法では、抗原タンパク質のトランケーションにより、しばしばｉｎ ｖｉｖｏでの抗原発現量が増加し、結果として抗体価が上がりやすくなることが多い。しかしながら、作製した抗体が、非変性の抗原タンパク質を認識しない例が多く認められること、及び複数回膜タンパク質をターゲットとする場合には、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に余分なタグ配列等を付加することなどによってターゲットタンパク質の膜配向性や細胞内局在が非変性のものとは変わってしまうことなどが観察されている。そのため、本発明のモノクローナル抗体の製造方法では、クローディン−２のタンパク質全長アミノ酸配列をコードするポリペプチド（例えば、免疫原としてＮ末端又はＣ末端に余分なタグ配列等を付加していないクローディン−２のタンパク質全長アミノ酸配列をコードするポリペプチド）を含む発現ベクターを用いること、及び免疫動物として抗体価の上昇しやすい免疫動物を用いることを特徴とする。なお、抗体価の上昇しやすい免疫動物としては、マウスよりも抗体価の高い動物であることが好ましく、このような動物としては、例えば、ラットなどが挙げられる。また、免疫動物は非ヒト哺乳動物であることが好ましい。

【0034】

上記（ａ）〜（ｃ）の各工程については、公知の方法により行うことができる。また、上記（ｂ）工程における抗体産生能を有する細胞としては、例えば、リンパ細胞などが挙げられ、細胞融合のパートナーとしては、例えば、ミエローマ細胞などが挙げられる。

【0035】

本発明のモノクローナル抗体の製造方法の具体例としては、Ｎ末端又はＣ末端に余分なタグ配列等を付加していないクローディン−２の全長アミノ酸配列をコードするポリぺプチドを含む発現ベクターを抗体価の上昇しやすいラットに免疫した後、当該ラットからリンパ細胞を回収し、これと例えばミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、当該ハイブリドーマが産生する抗体を回収した後にスクリーニングに供する方法を例示することができる。より具体的な方法としては、例えば、下記の実施例に記載の方法を採用することができる。

【0036】

本発明のモノクローナル抗体は、医薬組成物として用いることができる。換言すると、本発明は、上記したモノクローナル抗体を含む医薬組成物を包含する。本発明の医薬組成物は、上記したモノクローナル抗体の他、必要に応じて、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定的ではなく、例えば、基材、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、溶剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤などが挙げられる。

【0037】

本発明の医薬組成物の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与など）のいずれかとすることができる。

【0038】

本発明の医薬組成物を経口投与する場合、その剤型については特に限定的ではなく、例えば、錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、チュアブル剤、ソフト錠剤などが挙げられる。

【0039】

本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、その剤型については特に限定的ではなく、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、経肺剤、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体又は細胞を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。

【0040】

本発明の医薬組成物におけるモノクローナル抗体の含有量は特に限定的ではなく、例えば、本発明の医薬組成物全体を基準として、０．０００５〜１００質量％、好ましくは０．００１〜９０質量％、より好ましくは０．０１〜８０質量％とすることができる。

【0041】

本発明の医薬組成物の投与量は特に限定的ではなく、例えば、投与形態、剤型、対象とする疾患の種類、患者の年齢、患者の症状の重篤度などを考慮して適宜決定することができる。例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、あるいは０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で適宜決定することができる、また、本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定的ではなく、例えば、投与形態、剤型、対象とする疾患の種類、患者の年齢、患者の症状の重篤度などを考慮して適宜決定することができる。例えば、上記した投与量を１日に一回投与してもよいし、数回（例えば、２〜５回）に分けて投与してもよい。また、投与間隔についても特に限定的ではなく、例えば、毎日、隔日、毎週、隔週、２〜３週毎、毎月、隔月または２〜３ヶ月毎とすることができる。

【0042】

なお、クローディン−２は、炎症性腸疾患及び癌において発現量が増加していることが知られている。クローディン−２は上皮細胞間の接着を弱め、細胞間隙を介した物質透過性を高める作用を有しており、クローディン−２の発現上昇により腸管上皮から食物未消化物、腸内細菌由来の起炎症性物質などの吸収が亢進することで炎症性腸疾患の病態が悪化する。また、クローディン−２は癌の増殖や癌転移に寄与する。本発明のモノクローナル抗体は、クローディン−２の細胞間接着を弱める作用を阻害することで炎症性腸疾患の病態の悪化を抑制する作用を有する。また、抗体依存性細胞障害活性による抗腫瘍効果を有する。従って、本発明の医薬組成物は、炎症性腸疾患治療用又は癌治療用として好ましく用いることができる。

【0043】

本発明の医薬組成物を炎症性腸疾患治療用又は癌治療用として用いる場合、本発明の医薬組成物を投与する対象は、炎症性腸疾患又は癌を患った対象、これらの疾患の疑いの強い対象であることが好ましい。当該対象としては、ヒトのみならず、その他の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）であってもよい。このような非ヒト哺乳動物としては、ペットや家畜として飼育されている哺乳動物が挙げられ、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなどを例示することができる。

【0044】

炎症性腸疾患としては、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病などが挙げられる。また、癌としては、腎癌、結腸癌、肺癌、肝癌、線維肉腫などが挙げられる。

【0045】

本発明の医薬組成物を炎症性腸疾患の治療に用いる場合、本発明の医薬組成物には、本発明のモノクローナル抗体以外の炎症性腸疾患の治療効果を有する成分（以下、「その他の炎症性疾患の治療効果を有する成分」と記載する。）が含まれていてもよい。また、本発明の医薬組成物を、その他の炎症性腸疾患の治療効果を有する成分を含む医薬と併用して用いてもよい。さらには、上記した本発明のモノクローナル抗体とその他の炎症性腸疾患の治療効果を有する成分とを公知の方法により結合させることにより複合体を形成し、当該複合体を含む医薬組成物であってもよい。その他の炎症性腸疾患の治療効果を有する成分としては、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴル、５−アミノサリチル酸、ステロイド、アザチオプリン、タクロリムスなどが挙げられる。

【0046】

本発明の医薬組成物を癌の治療に用いる場合、本発明の医薬組成物には、本発明のモノクローナル抗体以外の癌の治療効果を有する成分（以下、「その他の癌の治療効果を有する成分」と記載する。）が含まれていてもよい。また、本発明の医薬組成物を、その他の癌の治療効果を有する成分を含む医薬と併用して用いてもよい。さらには、上記した本発明のモノクローナル抗体とその他の癌の治療効果を有する成分とを公知の方法により結合させることにより複合体を形成し、当該複合体を含む医薬組成物であってもよい。

【0047】

その他の癌の治療効果を有する成分としては、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、５−フルオロウラシル、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチン、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、ジアフェニルスルホン、メソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、ペントスタチン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、シタラビン、ゲムシタビン、イリノテカン、ノギテカン、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンなどが挙げられる。

【0048】

また、本発明のモノクローナル抗体は、クローディン−２の細胞外領域に特異的に結合することから、クローディン−２発現細胞を捕捉するために好ましく用いることができる。換言すると、本発明は、上記したモノクローナル抗体を含むクローディン−２発現細胞捕捉剤を包含する。例えば、本発明のモノクローナル抗体に蛍光ラベル修飾等を施したものを用いることにより、クローディン−２発現細胞を視覚的に識別することなどが可能となる。また、クローディン−２は炎症性腸疾患及び癌において発現量が増加することから、上記した本発明のモノクローナル抗体のクローディン−２発現細胞捕捉作用によれば、本発明のモノクローナル抗体は、炎症性腸疾患又は癌の診断マーカー、検査用組成物などとしても好ましく使用することができる。換言すると、本発明は、上記した本発明のモノクローナル抗体を含む炎症性腸疾患又は癌用診断マーカー、上記した本発明のモノクローナル抗体の炎症性腸疾患又は癌の診断用マーカーとしての使用、及び上記した本発明のモノクローナル抗体を含む炎症性腸疾患又は癌の検査用組成物をも包含する。

【0049】

さらに、本発明のモノクローナル抗体は、下記実施例１３に示すように、クローディン−２の細胞外領域に特異的に結合した後、細胞内に取り込まれることが強く示唆されている。そのため、本発明のモノクローナル抗体は、クローディン−２発現細胞内に物質を送達する運搬体（キャリア）として利用することができる。換言すると、本発明は、上記したモノクローナル抗体を含むクローディン−２発現細胞に対する物質送達用運搬体をも包含する。例えば、本発明のモノクローナル抗体に、上記したその他の炎症性疾患の治療効果を有する成分やその他の癌の治療効果を有する成分等の薬剤などを公知の方法により結合させて複合体を形成し、当該複合体を用いることにより、クローディン−２発現細胞内にのみ当該薬剤を送達することができる。

【実施例】

【0050】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。

【0051】

実施例１：抗ＣＬ−２抗体の作製
ＤＮＡ免疫法は、非変性（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の抗原タンパク質に対する抗体を作製する基盤技術であり、一般的にタンパク質全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを免疫原としている、ＤＮＡ免疫法では、抗原タンパク質のトランケーションにより、しばしばｉｎ ｖｉｖｏでの抗原発現量が増加し、結果として抗体価が上がりやすくなることが多い。しかしながら、作製した抗体が、非変性の抗原タンパク質を認識しない例が多く認められること、及び複数回膜タンパク質をターゲットとする場合には、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に余分なタグ配列等を付加することなどによってターゲットタンパク質の膜配向性や細胞内局在が非変性のものとは変わってしまうことなどが観察されている。

【0052】

そこで、ＣＬ−２に対するモノクローナル抗体（以下、「抗ＣＬ−２抗体」と記載する。）の作製にあたっては、Ｎ末端又はＣ末端に余分なタグ配列等を付加していないタンパク質全長アミノ酸配列からなる免疫コンストラクトを抗原として用い、さらに、マウスに比して抗体価が上昇しやすいラットを免疫動物として用いた。

【0053】

１）免疫
２０匹のＷｉｓｔｅｒ系ラットにヒトＣＬ−２発現プラスミドを皮下免疫し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析により血清中の抗体価を測定し、抗体価の上昇が確認されたラット７匹に対し最終免疫（ブースティング）を行った。

【0054】

２）細胞融合
最終免疫後、ラットからリンパ細胞を回収し、マウスミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と細胞融合を行うことによりハイブリドーマを作製した。その後、９６ウェルプレート５枚に播種し、下記の組成を有する培養培地にて３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で１４日間培養した。

【0055】

（培養培地の組成）
D-MEM（Wako, 044-29765） + 10% FCS（Hyclone）, 10% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement（Roche, 1088947）, 1 × HAT supplement（Invitrogen, 21060017）, 1×Penicillin/Streptomycin（Wako, 168-23191）, 1×L-Glutamine（Wako, 073-05391）

【0056】

３）１次スクリーニング
培養後、全てのプレートウェルから培養上清を回収した。１次スクリーニングには、ヒトＣＬ−２発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-2/HT1080細胞）及びコントロール用ＨＴ１０８０細胞（mock/HT1080細胞）を用いた。なお、これらの細胞及びその作製法は、Li et al., J Pharmacol Exp Ther, 351, pp.206-213, 2014において報告されている。細胞培養プレート上で培養していたhCL-2/HT1080細胞及びmock/HT1080細胞をトリプシン処理により回収し、これらの細胞に対して、回収したハイブリドーマの培養上清を添加し、二次抗体としてＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色した後、ＦＣＭ解析を行った。

【0057】

４）２次スクリーニング
１次スクリーニングで陽性の確認された１８クローンを９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに拡大し、３７℃、１０％ＣＯ_２の環境下で培養した。培養後、全てのウェルから培養上清を回収した。その後、hCL-2/HT1080細胞及びmock/HT1080細胞を用い、培養上清及びＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体で染色し、ＦＣＭ解析を行った。

【0058】

５）限界希釈及び３次スクリーニング
２次スクリーニングで陽性の確認された５ウェルからそれぞれハイブリドーマを回収し、各ハイブリドーマを１．２ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレート１枚（合計５プレート）に播種し、３７℃、１０％ ＣＯ_２の環境下で１２日間培養した。また、同時に、限界希釈前のハイブリドーマについても６ウェルプレートにて上記と同条件にて培養し、バックアップとした。培養後、各プレートのシングルコロニー形成ウェルから１０クローンずつ選定し、hCL-2/HT1080細胞及びmock/HT1080細胞を用い、培養上清及びＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体で染色し、ＦＣＭ解析を行った。

【0059】

６）アイソタイプ解析
３次スクリーニングで陽性であることが確認された３クローン（それぞれ、１Ａ２、２Ｇ８及び３Ｂ２と命名）を２４ウェルプレート及び６ウェルプレートに３７℃、１０％ ＣＯ_２の環境下で順次拡大し、培養を行った。培養後、全てのウェルから培養上清を回収し、ｒａｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＢＤ）を用いて培養上清中の抗体のクラス及びサブクラスを決定した。アイソタイプ解析の結果を下記表１に示す。

【0060】

【表1】

【0061】

７）最終スクリーニング
サブクラス決定後、３次スクリーニングでシフト強度が強く、かつ単一サブクラスのウウェルを１ウェル選択し、下記の組成を有する培養培地にて１５０ｍｍディッシュへ拡大培養を行った。

【0062】

（培養培地の組成）
D-MEM(Wako, 044-29765)+10%FCS(Hyclone), 3% BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement(Roche, 1088947), 1XHAT supplement(Invitrogen, 21060017), 1×Penicillin/Streptomycin (Wako, 168-23191)

【0063】

培養後、各ハイブリドーマを回収し、セルバンカー（血清タイプ）にて細胞ストックを３本作製し、−８０℃で保管した。また、拡大培養と同時に、１５０ｍｍディッシュでオーバーグロースになるまで培養後、各培養上清（約２０ｍＬ）を回収し、−２０℃で保管した。

【0064】

以下、これらの操作により保管した各ハイブリドーマ、及び各ハイブリドーマ培養上清を、それぞれ「実施例１で作製したハイブリドーマ」及び「実施例１で調製したハイブリドーマ培養上清」と記載する。また、これらをクローン名と共に記載する場合には、「クローン１Ａ２」を例にとると、「実施例１で作製したハイブリドーマ１Ａ２」及び「実施例１で作製したハイブリドーマ培養上清１Ａ２」などと記載する。

【0065】

hCL-2/HT1080細胞及びmock/HT1080細胞を用い、上記で調製した各ハイブリドーマ培養上清（１Ａ２、２Ｇ８及び３Ｂ２）及びＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体で染色し、ＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析の結果を図１に示す。

【0066】

図１から明らかなように、上記で調製した３つのハイブリドーマ培養上清１Ａ２、２Ｇ８及び３Ｂ２の全てにおいて陽性を示すシフトが確認された。

【0067】

実施例２：抗ＣＬ−２抗体の結合特異性の解析
ヒトＣＬ−１発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-1/HT1080細胞）、ヒトＣＬ−２発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-2/HT1080細胞）、ヒトＣＬ−３発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-3/HT1080細胞）、ヒトＣＬ−４発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-4/HT1080細胞）、ヒトＣＬ−６発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-6/HT1080細胞）、ヒトＣＬ−７発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-7/HT1080細胞）、及びヒトＣＬ−９発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-9/HT1080細胞）、並びにマウスＣＬ−２発現Ｌ細胞（mCL-2/L細胞）をそれぞれ、５．０×１０^５ ／ｓａｍｐｌｅとなるように９６ウェルプレートに播種し、実施例１で調製した各ハイブリドーマ培養上清（１Ａ２、２Ｇ８、及び３Ｂ２）をそれぞれ添加して撹拌した後、氷上で１時間静置した。次いで、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ抗体（ＫＰＬ）を添加して撹拌し、氷上で３０分間静置した。その後、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように希釈したＰＩ（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、ＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析の結果を図２に示す。

【0068】

図２から明らかなように、実施例１で調製した３つのハイブリドーマ培養上清１Ａ２、２Ｇ８、及び３Ｂ２の全てにおいて、hCL-1/HT1080細胞、hCL-3/HT1080細胞、hCL-4/HT1080細胞、hCL-6/HT1080細胞、hCL-7/HT1080細胞、及びhCL-9/HT1080細胞には結合性を示さず、hCL-2/HT1080細胞に特異的に結合性を示すことが確認された。

【0069】

さらに、実施例１で調製した３つのハイブリドーマ培養上清１Ａ２、２Ｇ８、及び３Ｂ２は、いずれもmCL-2/L細胞にも結合性を示すことが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体は、ヒトＣＬ−２及びマウスＣＬ−２に交叉性を有しており、マウスを用いた実験系（例えば、抗体の有効性や安全性の評価）においても使用し得るものと考えられる。

【0070】

実施例３：抗ＣＬ−２抗体の可変領域の配列の解析
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、実施例１で作製したハイブリドーマ１Ａ２及び２Ｇ８からｍＲＮＡをそれぞれ回収及び精製した。回収したｍＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲを行い、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の遺伝子をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を電気泳動により分離・精製し、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ｐＵＣ１１８ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰにライゲーションした。ライゲーション産物によりコンピテントセルＤＨ−５αをトランスフォーメーションし、形成した独立大腸菌クローンを回収した。なお、大腸菌クローンの選別に際して、ＬＡプレートにＸ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを塗布することでＢｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎを行い、ＰＣＲ産物が挿入されているクローンを効率よく選別した。回収した大腸菌クローンを培養し、プラスミドＤＮＡを回収した後、シークエンス解析により目的遺伝子配列を解析した。当該解析結果から得られた可変領域のアミノ酸配列を下記表２及び表３に示す。

【0071】

【表2】

【0072】

【表3】

【0073】

実施例４：抗ＣＬ−２ヒト−ラットキメラ抗体の作製
１）発現ベクターの作製
抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８の軽鎖可変領域にＡｇｅＩサイト及びＢｓｉＷＩサイトを、重鎖可変領域にＥｃｏＲＩサイト及びＮｈｅＩサイトをそれぞれ付加するように抗体の可変領域のＶＬ及びＶＨをそれぞれＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を電気泳動により分離・精製し、制限酵素（ＶＬ：ＡｇｅＩ及びＢｓｉＷＩ、ＶＨ：ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ）により処理した。ヒト定常領域をもつクローニングベクター（ＶＬ：ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋ，ＶＨ：ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１）のマルチクローニングサイト上にあるＡｇｅＩサイト、ＢｓｉＷＩサイト、ＥｃｏＲＩサイト、及びＮｈｅＩサイトをそれぞれ制限酵素（ＶＬ：ＡｇｅＩ及びＢｓｉＷＩ、ＶＨ：ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ）で切断し、制限酵素で切断したＰＣＲ産物とライゲーションした。ライゲーション産物によりコンピテントセルＤＨ−５αをトランスフォーメーションさせた。形成した独立大腸菌クローンを培養し、プラスミドＤＮＡを回収した後、制限酵素解析とシークエンス解析によりＶＬ：ｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋ−ａｎｔｉ−ＣＬ−２、及びＶＨ：ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−ａｎｔｉ−ＣＬ−２を得た。

【0074】

２）抗ＣＬ−２キメラ抗体の作製及び精製
フラスコに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣＨＯ−Ｓ細胞を１５０ｍＬ入れ、３７℃、８％ ＣＯ_２の環境下で一晩培養した。また、上記１）で作製したｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋ−ａｎｔｉ−ＣＬ−２、及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−ａｎｔｉ−ＣＬ−２をそれぞれ９３、７５μｇ混合し、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭを加え３ｍＬに調製し撹拌した。別のマイクロチューブにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１８７．５μＬとＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ２８１２．５μＬを加え転倒混和し、上記発現ベクターの溶液に加え、１０分間常温静置した後、ＣＨＯ−Ｓ細胞の入ったフラスコに上記の混合液全量を加えた。その後６日間、３７℃、８％ ＣＯ_２環境下で培養し、上清を回収した。

【0075】

回収した上清を１００× g、５分間遠心にかけ、０．４５μｍフィルターを通した。ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＭｉｌｌｉＱ水５ｍＬで 洗浄後、０．０２Ｍリン酸バッファー１０ｍＬでカラムの平衡化を行った。サンプルをカラムに通した後、０．０２Ｍリン酸バッファー２０ｍＬで洗浄、５ｍＬの０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌで溶出した。溶出の際は、あらかじめマイクロチューブに３７．５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを入れておいたものに０．５ｍＬずつ回収した。溶出後のサンプルはＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー置換した。

【0076】

上記した方法により得られたタンパク質溶液を非還元条件下及び還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を確認した。また、吸光度法によりタンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。

【0077】

以下、これらの操作により得られた抗体溶液を、「実施例４で作製した抗ＣＬ−２キメラ抗体」、「抗ＣＬ−２ヒト−ラットキメラ抗体」、あるいは単に「抗ＣＬ−２キメラ抗体」と記載する。また、これらをクローン名と共に記載する場合には、「クローン１Ａ２」を例にとると、「実施例４で作製した抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２」、「実施例４で作製した抗ＣＬ−２ヒト−ラットキメラ抗体１Ａ２」、及び「抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２」などと記載する。

【0078】

図３から明らかなように、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２、及び抗ＣＬ−２キメラ抗体２Ｇ８のいずれにおいても、非還元条件化では高分子量側（約２００ｋＤａ付近）にバンドが確認され、還元条件下では約５０ｋＤａ及び約２５ｋＤａのバンドが確認された。当該結果より、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２及び２Ｇ８の精製が確認できた。

【0079】

実施例５：抗ＣＬ−２ヒト‐ラットキメラ抗体の結合特異性の確認
hCL-1/HT1080細胞、hCL-2/HT1080細胞、hCL-3/HT1080細胞、hCL-4/HT1080細胞、ヒトＣＬ―５発現ＨＴ１０８０細胞（hCL-5/HT1080細胞）、hCL-6/HT1080細胞、hCL-7/HT1080細胞、及びhCL-9/HT1080細胞、並びにマウスＣＬＤＮ１発現Ｌ細胞（mCL-1/L細胞）、mCL-2/L細胞、及びマウスＣＬ４発現Ｌ細胞（mCL-4/L細胞）をそれぞれトリプシン処理により回収した。各細胞５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｓａｍｐｌｅに対して実施例４で作製した抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２及び２Ｇ８（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ１００μＬ添加して撹拌し、氷上で１時間静置した。次いで、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ抗体（Jackson ImmunoResearch）を添加して撹拌し、氷上で３０分間静置した。その後、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように希釈したＰＩを加え、ＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析の結果を図４に示す。

【0080】

図４から明らかなように、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２及び２Ｇ８は、hCL-1/HT1080細胞、hCL-3/HT1080細胞、hCL-4/HT1080細胞、hCL-5/HT1080細胞、hCL-6/HT1080細胞、hCL-7/HT1080細胞、及びhCL-9/HT1080細胞には結合性を示さず、hCL-2/HT1080細胞に特異的に結合性を示すことが確認された。また、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２及び２Ｇ８は、mCL-1/L細胞及びmCL-4/L細胞には結合性を示さず、mCL-2/L細胞に結合性を示すことが確認された。以上の結果から、当該抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２及び２Ｇ８が抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８の有する結合特異性をそれぞれ保持していること、並びにクローニングしたＣＤＲ領域がＣＬ−２との結合に関与していることが分かった。

【0081】

実施例６：抗ＣＬ−２抗体の精製
１）マウス腹水の調製
ヌードマウス腹腔内に実施例１で作製した各ハイブリドーマ１Ａ２及び２Ｇ８を０．５〜１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／匹で移植した。なお、腹水形成を促進させるために、ハイブリド−マの移植の前日までにプリスタン５００μＬ／匹を投与した。ハイブリドーマ移植後１０日目から１４日目までに１回又は複数回にわたり腹水を回収した。回収した腹水を遠心分離し、回収した上清にＮａＮ_３（最終濃度：０．０５％）を添加し、精製に使用するまで４℃で保存した。

【0082】

２）ＩｇＧ精製
ＩｇＧ２ｂであったクローン（１Ａ２及び２Ｇ８）について回収した腹水の精製を行った。予めリン酸バッファーで前処理したｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム (ＧＥ) に、腹水をアプライした。その後、リン酸バッファーにてカラムを洗浄し、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ ３．０）で目的タンパク質を溶出した。溶出後の溶液には、直ちに少量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にて中和した。更に中和後の溶液をリン酸バッファーにて透析し、バッファーを置換した。透析後、０．２μｍフィルターにてろ過後、無菌的に分注した。得られた目的タンパク質溶液の一部を常法に従い、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を確認した。また、吸光度法によりタンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。

【0083】

以下、これらの操作により得られた抗体溶液を、「実施例６で調製した抗ＣＬ−２抗体」、あるいは単に「抗ＣＬ−２抗体」と記載する。また、これらをクローン名と共に記載する場合には、「クローン１Ａ２」を例にとると、「実施例６で調製した抗ＣＬ−２抗体１Ａ２」及び「抗ＣＬ−２抗体１Ａ２」などと記載する。

【0084】

図５から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８のいずれにおいても、重鎖（約５０ｋＤａ）及び軽鎖（約２５ｋＤａ）のバンドが確認された。

【0085】

実施例７：抗ＣＬ−２抗体のエピトープの解析
hCL-2/HT1080細胞、hCL-2の細胞外領域の第１ループ（２８〜７８番目のアミノ酸）をhCL-4の細胞外領域の第１ループに置換したHT1080細胞（CL-2 EL1-CL-4/HT1080細胞）、hCL-2の細胞外領域の第２ループ（１４４〜１６２番目のアミノ酸）をhCL-4の細胞外領域の第２ループに置換したHT1080細胞（CL-2 EL2-CL-4/HT1080細胞）、並びにhCL-2の細胞外領域の第１ループ及び第２ループをそれぞれhCL-4の細胞外領域の第１ループ及び第２ループに置換したHT1080細胞（hCL-2 EL1,2-CL-4/HT1080細胞）をそれぞれトリプシン処理により回収した。５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｓａｍｐｌｅに対し、実施例６で調製したＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８（５μｇ／ｍＬに調製）をそれぞれ１００μＬ添加して撹拌した後、氷上で１時間静置した。次いで、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ抗体（ＫＲＬ）を添加して撹拌し、氷上で３０分間静置した。その後、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１回洗浄し、ＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析の結果を図６に示す。なお、本実施例では、ポジティブコントロールとしてhCL-2及びhCL-4に結合する分子（CL-2, -4 binder）を用い、CL-2, -4 binderの検出には、ａｎｔｉ−６ ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）及びＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ抗体（ａｂｃａｍ）を用いた。なお、当該CL-2, -4 binderは、分子量約１４ｋＤａのポリペプチド（m19）であり、その作製法は、Takahashi et al., Biomaterials, 33, pp.3464-3474, 2012において報告されている。

【0086】

図６から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８のいずれにおいても、hCL-2 EL1-CL-4/HT1080細胞では結合性が消失したのに対して、hCL-2 EL2-CL-4/HT1080細胞では結合性を保持していることが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８は、ＣＬ−２の細胞外領域の第１ループに特異的に結合することが示唆された。

【0087】

実施例８：抗ＣＬ−２抗体の変性ＣＬ−２タンパク質に対する結合性の解析
hCL-2/HT1080細胞、hCL-4/HT1080細胞、及びmock/HT1080細胞を回収し、作製した細胞可溶化液を用いて、ウエスタンブロッティング解析を行った。なお、細胞可溶化液は、細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳで懸濁後、超音波処理で破砕することにより調製した。細胞可溶化液及びｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により２４０ｍＡ、２０分間処理することで、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜上に転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜を５％ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ−Ｔ−ＴＢＳに浸し、室温で２時間振盪しブロッキングを行った。Ｔ−ＴＢＳで洗浄し、一次抗体：市販のマウス抗ＣＬ−２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２、抗ＣＬ−２抗体２Ｇ８、及び市販のマウス抗ＣＬ−４抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とそれぞれ２時間反応させた後、二次抗体：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と１時間反応させた。なお、上記で使用した各種抗体は、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ−Ｔ−ＴＢＳの溶液である。Ｔ−ＴＢＳで洗浄した後、Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｌ（Ｎａｋｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）又はＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｋｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を用いて発光させ、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ）により検出を行った。ウエスタンブロッティング解析の結果を図７に示す。

【0088】

図７から明らかなように、市販のマウス抗ＣＬ−２抗体ではＣＬ−２のバンドが確認されたのに対して、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び抗ＣＬ−２抗体２Ｇ８ではＣＬ−２のバンドが検出されなかった。本実施例で用いたマウス抗ＣＬ−２抗体は、ＣＬ−２の細胞内領域の一次構造を認識する抗体であることから、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び抗ＣＬ−２抗体２Ｇ８は、ＣＬ−２の細胞外領域の１次構造ではなく、立体構造を認識することが示唆された。

【0089】

実施例９：抗ＣＬ−２抗体のＴＪバリア制御活性の解析
ヒト腸管上皮モデルとして汎用されるＣａｃｏ−２細胞をｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ （ＣＯＲＮＩＮＧ） のｔｏｐ ｗｅｌｌに８×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬで播種し、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには７００μＬの培地を加え、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養した。１日おきにＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で、上皮バリア機能の指標である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値を測定し、培地交換を行った後、培養を続けた。ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地を加え、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２又は２Ｇ８を培地で１０μｇ／ｍＬに調製した抗ＣＬ−２抗体溶液、ラットＩｇＧ抗体を培地で１０μｇ／ｍＬに調製したラットＩｇＧ抗体溶液、２０μｇ／ｍＬのＴＪ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（タイトジャンクション（ＴＪ）バリア機能を低下させることが知られている分子（m19）：Takahashi et al., Biomaterials, 33, pp.3464-3474, 2012）溶液、及び培地をそれぞれ６００μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養し、各種溶液添加後０、６、１２、１８、及び２４時間後のＴＥＥＲ値をそれぞれ測定した。その後、ｔｏｐ ｗｅｌｌの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌの抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｔｏｐ ｗｅｌｌは１００μＬの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌ は６００μＬの培地にそれぞれ交換し、１２時間後にＴＥＥＲ値を測定した。ＴＥＥＲ値の測定結果を図８のＡに示す。

【0090】

また、同様にして、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地を加え、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２を培地で０．０１、０．１、１及び１０μｇ／ｍＬにそれぞれ調製した抗ＣＬ−２抗体溶液、２０μｇ／ｍＬのＴＪ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、並びに培地をそれぞれ６００μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養し、各種溶液添加後０、６、１２、２４、３６及び４８時間後のＴＥＥＲ値をそれぞれ測定した。その後、ｔｏｐ ｗｅｌｌの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌの抗体希釈液を除去し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔｏｐ ｗｅｌｌは１００μＬの培地、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌ は６００μＬの培地にそれぞれ交換し、６時間後にＴＥＥＲ値を測定した。ＴＥＥＲ値の測定結果を図８のＢに示す。

【0091】

さらに、同様にして、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地を加え、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、培地で１０μｇ／ｍＬに調製した抗ＣＬ−１抗体溶液（７Ａ５）、抗ＣＬ−２抗体溶液（１Ａ２）、抗ＣＬ−４抗体溶液（４Ｄ３）、及びラットＩｇＧ抗体を培地で１０μｇ／ｍＬに調製したラットＩｇＧ抗体溶液をそれぞれ６００μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養し、各抗体溶液添加後０、６、１２、１８、及び２４時間後のＴＥＥＲ値をそれぞれ測定した。その後、ｔｏｐ ｗｅｌｌの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌの抗体希釈液を除去し、ＰＢＳで洗浄し、Ｔｏｐ ｗｅｌｌは１００μＬの培地、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌ は６００μＬの培地にそれぞれ交換し、１２時間後にＴＥＥＲ値を測定した。ＴＥＥＲ値の測定結果を図９に示す。なお、図９では、抗体溶液添加０時間におけるＴＥＥＲ値を１００とした時の各時間におけるＴＥＥＲ値の割合を示している。

【0092】

図８から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体は、濃度依存的にＴＥＥＲ値を上昇させており、ＴＪバリア機能を増強することが分かった。

【0093】

また、図９からも明らかなように、抗ＣＬ−１抗体を添加してもＴＥＥＲ値は減少しないことから、抗ＣＬ−１抗体はＴＪバリア機能には影響を与えないと考えられる。一方、抗ＣＬ−４抗体を添加することによりＴＥＥＲ値が減少していたことから、抗ＣＬ−４抗体はＴＪバリア機能を低下させることが示唆された。これに対して、上記の通り、抗ＣＬ−２抗体を添加することでＴＥＥＲ値が上昇しており、ＴＪバリア機能を増強することが分かった。以上の結果から、抗ＣＬ−２抗体がＴＪバリア機能増強活性を有していることが分かった。

【0094】

実施例１０：ＴＮＦ−αのＴＪバリア機能への影響の解析
実施例９と同様の方法により、ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに播種したＣａｃｏ−２細胞の培養を行い、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を培地で１０ｎｇ／ｍＬに調製し、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには６００μＬのＴＮＦ−α溶液を加え、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養し、ＴＮＦ−α添加後０、２４、及び４８時間後にＴＥＥＲ値をそれぞれ測定した。さらに、４８時間経過後に細胞を回収し、実施例６と同様の方法によりウエスタンブロッティング解析を行った。

【0095】

ＴＥＥＲ値及びウエスタンブロッティング解析の結果を図１０に示す。なお、図１０中、ＡはＴＥＥＲ値の測定結果を示す図であり、Ｂはウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【0096】

図１０から明らかなように、Ｃａｃｏ−２細胞にＴＮＦ−αを添加することにより、ＴＥＥＲ値が減少し、ＣＬ−２の発現量が増加することが確認された。

【0097】

実施例１１：ＴＮＦ−α存在下における抗ＣＬ−２抗体のＴＪバリア機能への影響の解析 実施例９と同様の方法により、ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに播種したＣａｃｏ−２細胞の培養を行い、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００ μＬの培地を加え、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）と抗ＣＬ−２抗体１Ａ２を含む培地（１０μｇ／ｍＬ）、もしくはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）とラットＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を含む培地６００μＬを添加して、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養した。培地等を添加前（０時間）及び添加２４時間後にＴＥＥＲ値を測定した。ＴＥＥＲ値の測定結果を図１１に示す。

【0098】

さらに、実施例１０と同様の方法により、ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに播種したＣａｃｏ−２細胞の培養を行い、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）溶液６００μＬを添加して３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で２４時間培養した後、ＴＥＥＲ値を測定した。その後、培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地を加え、ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌにはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）と抗ＣＬ−２抗体１Ａ２を含む培地（１０μｇ／ｍＬ）、もしくはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）とラットＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を含む培地６００μＬを添加して、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で培養した。培地等を添加前（０ｈ）及び添加２４時間後にＴＥＥＲ値を測定した。ＴＥＥＲ値の測定結果を図１２に示す。なお、図１２では、ＴＮＦ−α溶液と抗ＣＬ−２抗体を含む培地等の添加時点を「０ｈ」としている。従って、「−２４ｈ」はＴＮＦ−α溶液添加時点を、「２４ｈ」はＴＮＦ−α溶液と抗ＣＬ−２抗体を含む培地等を添加し２４時間経過後をそれぞれ示している。

【0099】

図１１から明らかなように、ラットＩｇＧ抗体添加群では、ＴＥＥＲ値が減少したのに対して、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２添加群では、ＴＥＥＲ値の上昇が確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体の添加により、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインによるＴＪバリア機能の低下を防止できるだけではなく、ＴＪバリア機能を向上できることが分かった。

【0100】

さらに、図１２から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２添加群では、ＴＮＦ−α処理により低下したＴＥＥＲ値が上昇することが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体の添加により、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインにより低下したＴＪバリア機能を改善することができることが分かった。

【0101】

実施例１２：既存薬との併用効果の解析
実施例９と同様の方法により、ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌに播種したＣａｃｏ−２細胞の培養を行い、ＴＥＥＲ値が安定した細胞播種１０日後に、前培養していた細胞の培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）溶液６００μＬを添加して３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で２４時間培養した後、ＴＥＥＲ値を測定した。その後、培地を除き、ｔｏｐ ｗｅｌｌに１００μＬの培地、及びｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌには、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）と下記の各種抗体溶液との混合溶液６００μＬを添加して３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で２４時間及び４８時間培養し、ＴＥＥＲ値を測定した。なお、上記した抗体溶液としては、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２溶液（１０μｇ／ｍＬ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ；抗ＴＮＦ−α抗体）溶液（１０μｇ／ｍＬ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；抗ＴＮＦ−α抗体）溶液（１０μｇ／ｍＬ）、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２溶液（５μｇ／ｍＬ）とインフリキシマブ溶液（５μｇ／ｍＬ）との混合溶液、ラットＩｇＧ抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）とインフリキシマブ溶液（５μｇ／ｍＬ）との混合溶液、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２溶液（５μｇ／ｍＬ）とアダリムマブ溶液（５μｇ／ｍＬ）との混合溶液、及びラットＩｇＧ抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）とアダリムマブ溶液（５μｇ／ｍＬ）との混合溶液を用いた。また、コントロールとしてｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌにラットＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍＬ）溶液６００μＬを添加して同様に培養を行った。ＴＥＥＲ値の測定結果を図１３に示す。なお、図１３では、ＴＮＦ−α溶液と各種抗体溶液との混合溶液の添加時点を「０ｈ」としている。従って、「−２４ｈ」はＴＮＦ−α溶液添加時点を、「２４ｈ」及び「４８ｈ」はＴＮＦ−α溶液と各種抗体溶液との混合溶液の添加後２４時間、４８時間経過後をそれぞれ示している。

【0102】

図１３から明らかなように、ラットＩｇＧ抗体添加群では、ＴＥＥＲ値が減少したのに対して、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２添加群、及び抗ＴＮＦ-α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）添加群では、ＴＥＥＲ値の上昇が確認された。さらに、抗ＣＬ−２抗体と抗ＴＮＦ−α抗体（インフリキシマブ又はアダリムマブ）とを共に添加した群では、相加的なＴＥＥＲ値の上昇が観察された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体は既存の抗ＴＮＦ−α抗体と併用することで、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインにより低下したＴＪバリア機能を相加的に改善できることが分かった。

【0103】

実施例１３：抗ＣＬ−２抗体の細胞内取込みの検討
９６ウェルプレートにヒト小腸上皮モデルであるＴ８４細胞を２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、一晩培養した。次いで、細胞の培養上清を除き、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び２Ｇ８をそれぞれ０（抗体非添加）、０．１、及び０．５μｇ／ｍＬに調製した抗体溶液を１００μＬ添加し、２日間培養した。その後、細胞の培養上清を除き、新鮮な培地９０μＬに交換した後、１０．０μｇ／ｍＬなるようにＰＢＳで調製したサポニン標識抗ラット抗体Ｒａｔ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）溶液１０μＬを培地に添加し、７２時間培養した。なお、Ｒａｔ−Ｚａｐは、細胞内に取り込まれると細胞障害性を発揮する抗体であり、単独で細胞内に取り込まれることはない。７２時間経過後、ＷＳＴ−８試薬（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を１０μＬ添加し、３７℃で１時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、抗体非添加群の吸光度を基準として各抗体濃度における吸光度の相対値を求め、細胞生存率を算出した。結果を図１４に示す。

【0104】

図１４から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２添加群及び抗ＣＬ−２抗体２Ｇ８添加群では、抗体非添加群に対して濃度依存的に生存率が低下していることが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体は、ＣＬ−２に結合することにより細胞内に取り込まれるものと考えられる。従って、抗ＣＬ−２抗体は、ＣＬ−２発現細胞に対して薬物などを送達する運搬体（キャリア）として利用可能であることが示唆された。

【0105】

実施例１４：抗ＣＬ−２ヒト‐ラットキメラ抗体のＣＤＣ活性の評価
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で懸濁した１０％ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）及びhCL-2/HT1080細胞（１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）９０μＬを播種し、実施例４で作製した抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２をそれぞれ０（抗体非添加）、１、１０及び１００μｇ／ｍＬに調製した抗体溶液を１０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ−８試薬（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を１０μＬ添加し、３７℃で１時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、抗体非添加群の吸光度を基準として各抗体濃度における吸光度の相対値を求め、細胞生存率を算出した。結果を図１５に示す。

【0106】

図１５から明らかなように、抗ＣＬ−２キメラ抗体添加群では、抗体非添加群に対して濃度依存的に生存率が低下していることが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２キメラ抗体は、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を有することが分かった。

【0107】

実施例１５：抗ＣＬ−２キメラ抗体のＦｃγ受容体活性化能の評価
以下の方法により、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）の指標の一つであるＦｃγ受容体活性化能を評価した。なお、本実施例では、Ｆｃγ受容体の活性化をルシフェラーゼの発現によりモニターできる細胞系を用いた（Tada et al., PLoS One, 9, e95787, 2014）。

【0108】

hCL-2/HT1080細胞（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートにそれぞれ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で１日培養した後、上清を除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａで懸濁したＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ及びＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃをそれぞれ１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／９０μＬ播種した後、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２、ラットＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体をそれぞれ１０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で５時間共培養した。培養後、ＯＮＥ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定結果を図１６に示す。なお、図１６中、ＡはＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃを用いた場合のルシフェラーゼ活性の測定結果を、ＢはＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃを用いた場合のルシフェラーゼ活性の測定結果をそれぞれ示している。

【0109】

さらに、上記と同様にして、mCL-2/L細胞（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートにそれぞれ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で１日培養した後、上清を除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａで懸濁したＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ及びＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃをそれぞれ１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／９０μＬ播種した後、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２、ラットＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体をそれぞれ１０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で５時間共培養した。培養後、ＯＮＥ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定結果を図１７に示す。なお、図１７中、ＡはＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃを用いた場合のルシフェラーゼ活性の測定結果を、ＢはＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃを用いた場合のルシフェラーゼ活性の測定結果をそれぞれ示している。

【0110】

図１６及び１７から明らかなように、hCL-2/HT1080細胞の存在下、又はmCL-2/L細胞の存在下において、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２はいずれも濃度依存的にＦｃγＩＩＩａ受容体及びＦｃγＩＩａ受容体を活性化していることが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及び抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２は、共に、hCL-2発現細胞存在下において、Ｆｃγ受容体を発現するＮＫ細胞、好中球、マクロファージ等の活性化能を有していることが分かった。

【0111】

実施例１６：抗ＣＬ−２キメラ抗体のＡＤＣＣ活性の評価
末梢血単核細胞球（ＰＢＭＣ）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ）を３７℃で溶かし、ＰＢＭＣ １ｖｉａｌ（≧１０×１０^６ｃｅｌｌｓ）をＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。ＲＰＭＩ１６４０で懸濁したhCL-2/HT1080細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／９０μＬ、及びＰＢＭＣを２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／９０μＬ、９６ウェルプレートに播種し、抗ＣＬ−２キメラ抗体１Ａ２をそれぞれ終濃度が０（抗体非添加）、０１、０．１及び１μｇ／ｍＬとなるように調製した培地もしくは抗体溶液を２０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境下で４時間培養した。４時間経過後、ＷＳＴ−８試薬（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を１０μＬ添加し、３７℃で１時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、抗体非添加群の吸光度を基準として各抗体濃度における吸光度の相対値を求め、細胞生存率を算出した。結果を図１８に示す。

【0112】

図１８から明らかなように、抗ＣＬ−２キメラ抗体添加群では、抗体非添加群に対して濃度依存的に生存率が低下していることが確認された。当該結果から、抗ＣＬ−２キメラ抗体は、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を有することが分かった。

【0113】

実施例１７：抗ＣＬ−２抗体の腫瘍集積性の評価
ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＣＦ蛍光標識キット（Ｃａｌｉｐｅｒ）のプロトコールに準じて、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及びラットＩｇＧ抗体の定常領域のリジン残基をＣＦ７５０（蛍光物質）で化学修飾した蛍光ラベル抗体を作製した。具体的には、１ｍｇの各抗体と０．０５μｍｏｌのＣＦ７５０と混合し、室温で１時間反応させた。フィルターつき遠心チューブでサンプルを回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で三回洗浄した後、１ｍｌのＰＢＳに溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、吸光度法によりタンパク質濃度を測定した。以下において、当該操作により作製した蛍光ラベル抗体を「ＣＦ７５０標識抗ＣＬ−２抗体１Ａ２」及び「ＣＦ７５０標識ラットＩｇＧ抗体」と記載する。

【0114】

ＢＡＬＢ／ｃ Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（雌性、７週齢）にhCL-2/HT1080細胞（１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を皮下投与した。４週間経過後、腫瘍が十分大きくなってから、上記で作製したＣＦ７５０標識抗ＣＬ−２抗体１Ａ２及びＣＦ７５０標識ラットＩｇＧ抗体（各２０μｇ／ｍｏｕｓｅ）をそれぞれ静脈内投与し、投与から６時間、２４時間、及び７２時間経過後、マウスの全体像をイメージング装置（Ｍａｅｓｔｒｏ ＥＸ）にて蛍光強度を撮影した。その後、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸、及び腫瘍を単離し、上記したイメージング装置にて蛍光強度を測定し、ソフトウェア（Ｍａｅｓｔｒｏ ２．１０．０）にて解析した。なお、各臓器の蛍光強度は％ＩＤ／ｇ（％Ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｄｏｓｅ／ｇ）で求めた。その結果を図１９に示す。

【0115】

図１９から明らかなように、抗ＣＬ−２抗体１Ａ２は投与６時間後には腫瘍組織に集積していることが分かった。当該結果から、抗ＣＬ−２抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＬ−２発現細胞をターゲティングする能力を有することが分かった。

【0116】

実施例１８：抗ＣＬ−２抗体の抗腫瘍効果の評価
ＢＡＬＢ／ｃ Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（雌性、7週齢）にhCL-2/HT1080細胞（１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を皮下投与した。移植日から４週間、週２回、ｃｏｎｔｏｌ ｒａｔ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１ ｍｇ/ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、及び抗ＣＬ−２抗体１Ａ２（１ｍｇ/ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）をそれぞれ腹腔内投与した。毎投与前に、マウスの体重及び腫瘍サイズの測定を行った。なお、腫瘍サイズは下記式［１］に基づいて算出した。
Tｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ^３）＝ｌｅｎｇｔｈ×ｗｉｄｔｈ^２／２ ［１］

【0117】

移植日から４週間経過後までのマウスの体重変化及び腫瘍サイズの変化を図２０に示す。

【0118】

図２０のＡから明らかなように、抗ＣＬ−２抗体投与群では、ラットＩｇＧ抗体投与群に対して有意な腫瘍増殖抑制効果が確認された。さらに、図２０のＢから明らかなように、抗ＣＬ−２抗体投与群では、体重減少の副作用は確認されなかった。

【0119】

実施例１９：抗ＣＬ−２抗体の炎症性腸疾患に対する治療効果の評価
Claudin-2は無機イオンなどの受動輸送を促進する、すなわち漏れを促進するclaudinとして知られている。このような特性を持つclaudin-2は炎症性腸疾患において発現が上昇し、それに伴い腸管バリアが破綻することが知られている。また、炎症性サイトカインであるTNF-αを抑制することでclaudin-2の発現抑制に伴い、腸管バリアが維持されることからも、claudin-2を抑制することで腸管バリアを維持することが炎症性腸疾患の治療戦略の一つになると考えられる。そこで、claudin-2抗体1A2による炎症性腸疾患に対する治療効果をCD4⁺ CD45RB^high T細胞移入モデルを用いて検証した。

【0120】

（１）脾臓CD4⁺ CD45RB^high T細胞の精製
8週齢、♀、BALB/cマウス (SLC)から脾臓を摘出し、赤血球溶血バッファーを用いることで脾臓細胞から赤血球を除去した。2% NCS-PBSを加え、400 g, 5分間遠心後、Purified anti-mouse CD16/32抗体 (BioLegend: clone 93)を室温で15分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g, 5分間遠心後、Rat anti-mouse CD4-APC (BioLegend: clone RM4-5)およびRat anti-mouse CD45RB-FITC (BD Bioscience: clone 16A)を氷上で30分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g, 5分間遠心後、7-AAD Viability Staining Solution (BioLegend)を氷上で10分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g、5分間遠心後、FACSAriaII(BD Bioscience)を用いて、CD4⁺ CD45RB^high T細胞を採取した。

【0121】

（２）T細胞移入腸炎モデルの作製
採取したCD4⁺ CD45RB^high T細胞を8週齢、♀、SCIDマウス (SLC)に4.0×10⁵ cells/mouse腹腔内投与することにより移植した。移植マウスにcontrol IgGもしくはclaudin-2抗体1A2 (300 μg/time)を週3回、計24回、腹腔内投与した。各マウスの体重は週1回測定した。

【0122】

（３）大腸マクロファージ、好中球の測定
CD4⁺ CD45RB^high T細胞移入8週後のSCIDマウスの大腸を摘出し、腸内内容物をRPMIで洗浄した。大腸を1% EDTA-2% NCS-RPMIに入れ、37℃, 15分間撹拌した。その後、1 mg/mlコラゲナーゼ-2% NCS-RPMIに大腸を入れ、細かく切り刻んだのちに37℃, 20分間撹拌した。上清を回収後、再度同じ操作を行った。回収した上清を820 g, 20分間遠心した。ペレットを4 mlの40%パーコールで懸濁し、4 mlの75%パーコールに重層し、820 g, 20分間遠心した。中間層に集積した細胞を回収し、Purified anti-mouse CD16/32抗体 (BioLegend: clone 93)を室温で15分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g、5分間遠心後、Rat anti-mouse CD11b-APC-Cy7 (BioLegend: clone M1/70)、Rat anti-mouse Ly6G-FITC (BioLegend: clone 1A8)、Rat anti-mouse F4/80-Pacific Blue (BioLegend: clone BM8)を氷上で30分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g, 5分間遠心後、7-AAD Viability Staining Solution (BioLegend)を氷上で10分間作用させた。2% NCS-PBSを加え、400 g, 5分間遠心後、FACSAriaII(BD Bioscience)を用いて、マクロファージおよび好中球を測定した。

【0123】

（４）大腸組織の蛍光免疫染色
CD4⁺ CD45RB^high T細胞移入8週後のSCIDマウスの大腸を摘出し、腸内内容物をRPMIで洗浄した。大腸をOptimal Cutting Temperature compound (sakura-finetek)に包埋し、液体窒素で凍結させた。その後、クリオスタットを用いて6 μmの切片を作製した。切片を99.5%エタノールで30分間、100%アセトンで1分間作用させることで固定した。PBSで5分間×2回洗浄後、 2% NCS-PBSを添加し、室温で30分間反応させた。PBSで5分間×2回洗浄後、Rabbit anti-claudin-2 (abcam)を添加し、4℃で一晩反応させた。PBSで5分間×2回洗浄後、Rat anti-mouse CD11b-APC (BioLegend: clone M1/70)、Rat anti-mouse Ly6G-FITC (BioLegend: clone 1A8)、anti-rabbit Cy3を添加し、室温で30分間作用させた。PBSで5分間×2回洗浄後、Fluoro-KEEPER Antifade Reagent (nacalai tesque)を1滴滴下し、封入した。

【0124】

（５）大腸組織のHematoxylin-Eosin (HE)染色
CD4⁺ CD45RB^high T細胞移入8週後のSCIDマウスの大腸を摘出し、腸内内容物をRPMIで洗浄した。大腸をOptimal Cutting Temperature compound (sakura-finetek)に包埋し、液体窒素で凍結させた。その後、クリオスタットを用いて6 μmの切片を作製した。切片を99.5%エタノールで30分間、100%アセトンで1分間作用させることで固定した。流水で10分間洗浄後、ヘマトキシリンを室温で10分間作用させた。流水で30分間洗浄後、エオシンを室温で1分間作用させた。その後、70%，80%，90% エタノールにそれぞれ10、15、20秒ずつ浸し、99.5％ エタノールに1分間×2回浸した。その後、キシレンに1分間×3回浸した。Permount Fisher (Fisher Scientific)を1滴滴下し、封入した。

【0125】

（６）結果
claudin-2抗体1A2投与群ではcontrol IgG投与群に比べて体重減少や炎症性腸疾患の増悪に関わるマクロファージ・好中球の抑制傾向が認められた (control IgG投与群内1匹は5週目時点で死亡) (図21A-C)。同様に、組織学的な解析からもclaudin-2抗体1A2投与群では好中球の粘膜固有層への浸潤抑制が認められた (図21D)。さらに、claudin-2抗体1A2投与によりclaudin-2発現の抑制も認められた (図21D)。これらの結果及び上述の他の実施例の結果を踏まえれば、claudin-2抗体1A2によりclaudin-2のタイトジャンクション形成が阻害され、腸管バリアの破綻を抑制し、炎症性腸疾患に対する治療効果が認められたものと考えられる。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D-1】

【図21D-2】

【図21D-3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]