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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6770269
(24)【登録日】2020年9月29日
(45)【発行日】2020年10月14日
(54)【発明の名称】経口腫瘍ワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20201005BHJP
C07K 14/82 20060101ALI20201005BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20201005BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20201005BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20201005BHJP
A61K 35/745 20150101ALI20201005BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20201005BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20201005BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20201005BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21ZNA
C07K14/82
C07K14/195
A61K39/00 H
A61K39/39
A61K35/745
A61P35/00
A61K38/16
!C12N15/09 Z
【請求項の数】11
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2017-524786(P2017-524786)
(86)(22)【出願日】2016年5月30日
(86)【国際出願番号】JP2016065922
(87)【国際公開番号】WO2016208332
(87)【国際公開日】20161229
【審査請求日】2019年4月1日
(31)【優先権主張番号】特願2015-128034(P2015-128034)
(32)【優先日】2015年6月25日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(72)【発明者】
【氏名】白川 利朗
(72)【発明者】
【氏名】片山 高嶺
(72)【発明者】
【氏名】橋井 佳子
(72)【発明者】
【氏名】大薗 惠一
【審査官】
小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１１／０３４１８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１４／１２９４１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１４／１７３５４２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１３／１０６８３４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第２００７／０４７７６４（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡと、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ビフィズス菌表層に抗原としてのＷＴ１タンパク質を提示するよう設計された形質転換ビフィズス菌。
【請求項2】
細胞表層に提示されるタンパク質が、ＷＴ１タンパク質とＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質との融合タンパク質（ＧＬ−ＢＰ−ＷＴ１融合タンパク質）である、請求項１に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項3】
ＷＴ１タンパク質が、配列番号１、配列番号１４、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列のうちいずれかで特定されるタンパク質である、請求項１または２に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項4】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号２、１５および配列番号１７に示される塩基配列のうちいずれかで特定されるＤＮＡである、請求項１に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項5】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡとビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードするＤＮＡの間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載の形質転換ビフィズス菌。
【請求項6】
請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌をワクチンの有効成分として含む製剤。
【請求項7】
製剤が腫瘍ワクチン製剤である、請求項６に記載の製剤。
【請求項8】
製剤が経口製剤である請求項６又は７に記載の製剤。
【請求項9】
請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌より産生されるビフィズス菌表層提示タンパク質。
【請求項10】
請求項９に記載のビフィズス菌表層提示タンパク質を有効成分として含有する、腫瘍ワクチン。
【請求項11】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡと、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ビフィズス菌表層に抗原としてのＷＴ１タンパク質を提示するよう設計されたプラスミドまたはシャトルベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗原としてのWT1タンパク質を発現・提示しうる形質転換ビフィズス菌に関し、さらには当該形質転換ビフィズス菌を有効成分とする腫瘍ワクチンに関する。【0002】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2015-128034号優先権を請求する。【背景技術】
【0003】
WT1（Wilms tumor 1）遺伝子は、小児の腎腫瘍であるウィルムス（Wilms）腫瘍の原因遺伝子の1つとして単離された遺伝子である。Wilms腫瘍では、この遺伝子の欠損や突然変異があり、Wilms腫瘍由来の細胞株に正常なWT1遺伝子を導入すると細胞増殖が抑制され、WT1遺伝子はがん抑制遺伝子と考えられていた。しかしながらその後の研究により、WT1タンパク質は白血病や種々の固形がんで高発現していることが確認され、WT1遺伝子はがん抑制遺伝子というよりも、がん遺伝子の機能を果たしていると考えられている（非特許文献１：Jpn J Clin Oncol 2010; 40: 377-387）。【0004】
がんの免疫療法は、1980年代に自然免疫によるLAK療法にはじまり、NK細胞療法などの自然免疫療法、がん抗原のタンパク質の断片を構成するペプチドを標的としたペプチド療法や、樹状細胞にがんペプチドを認識させて体内に戻す樹状細胞ワクチン療法など獲得免疫を利用した治療が行われている。【0005】
WT1ペプチドでマウスを免疫したりヒトの末梢血単核球より分化させた樹状細胞をWT1ペプチドで刺激すると、WT1特異的細胞障害性T細胞（CTL）を誘導し得る樹状細胞ワクチンとして利用できることが確認された。また、WT1ペプチドを用いた臨床試験も進められている。従来のWT1ペプチドは、ある特定のHuman Leukocyte Antigen（HLA）に適合するように作製されているため、DNAタイピングによって患者のHLAアリル確認する必要があった（特許文献１：特許第5714619号公報）。その後の研究により、WT1タンパク質の全配列をカバーする全配列型ワクチンを用いてのがんの治療が試みられている。当該ワクチンも様々なHLAタイプの患者に適応可能である。当該ワクチンは、がん抗原に特異的なキラーT細胞や免疫反応を促進するヘルパーT細胞も活性化する。【0006】
WT1ワクチンの投与経路としては皮下または皮内注射が最も一般的であるが、これ以外にも様々な投与経路、例えば経皮投与、頬側投与、経鼻投与、舌下投与等の粘膜投与による免疫誘導が試みられている。しかしながら、経口投与については今まで報告されていない。【0007】
細胞の細胞膜は、細胞の内外を隔てる生体膜であり、細胞膜表面には細胞の情報を提供する機能や細胞内外の物質を輸送する機能を有する膜タンパク質が多数存在している。特定の抗原を膜蛋白と融合させて微生物の細胞表層に提示して、抗原抗体反応を人為的に誘導するための経口ワクチンとして使用するという概念が提唱されている。例えば、ポリ-γ-グルタミン酸合成酵素などの酵素蛋白の膜結合部をコードする遺伝子を有するベクターを利用して、宿主微生物の細胞表層に提示する例がある（特許文献２：特表2005-50054号公報）。また、感染症を起こす細菌に由来するフラジェリンタンパク質をワクチンとして使用する技術に関し、フラジェリンを発現する形質転換微生物をカプセル内容物として含有する経口ワクチンについて報告がある（特許文献３：5187642号公報）。ここでは、フラジェリンを生産させる菌としてビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する微生物（これらを総称して「ビフィズス菌」という）や乳酸菌などのいわゆる善玉菌といわれる腸内細菌を用いて形質転換微生物を調製することが報告されている。【0008】
ビフィズス菌は、ヒトや他の動物の小腸の下流または大腸で見られる常在菌であり、偏性嫌気性のグラム陽性菌であるため、培養における選択性が高い。そして、生体親和性も高く、グラム陰性菌にあるエンドトキシンが存在しないため、安全性が高い。したがって、ビフィズス菌は食品の安全性に関する審査制度による基準によりGRAS認証されている。また、ビフィズス菌は腸管を覆うムチンからなる粘液との結合性を有しているとの報告もあるため、腸において他の菌より腸壁への付着性が高いと考えられている。係るビフィズス菌の表層にタンパク質またはペプチドを発現させ提示させる技術、およびこの技術を使用したビフィズス菌による新規ワクチンに関する技術が既に開発され、報告されている（特許文献４：特許第5561681号公報）。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Jpn J Clin Oncol 2010; 40: 377-387
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】特許第5714619号公報
【特許文献2】特表2005-50054号公報
【特許文献3】特許第5187642号公報
【特許文献4】特許第5561681号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、経口投与可能な腫瘍ワクチンを提供することを課題とする。さらに、本発明は特定のHLAの型に拘束されない腫瘍ワクチンを提供することを課題とする。【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、WT1タンパク質を発現・提示しうる形質転換ビフィズス菌によれば、腫瘍ワクチンを経口投与しうることを見出し本発明を完成した。形質転換ビフィズス菌に発現・提示されたWT1タンパク質は、ある特定のHLAに拘束されるWT1ペプチドワクチンとは異なり、WT1タンパク質のほぼ全配列をカバーし、当該形質転換ビフィズス菌を有効成分とする腫瘍ワクチンは、様々なHLAタイプの患者に適応可能である。【0013】
すなわち本発明は、以下よりなる。１．WT1タンパク質をコードするDNAと、ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードするDNAを含み、ビフィズス菌表層に抗原としてのWT1タンパク質を提示するよう設計された形質転換ビフィズス菌。
２．細胞表層に提示されるタンパク質が、WT1タンパク質とGNB/LNB基質結合膜タンパク質との融合タンパク質（GL-BP-WT1融合タンパク質）である、前項１に記載の形質転換ビフィズス菌。
３．WT1タンパク質が、以下の１）〜３）のいずれかである、前項１または２に記載の形質転換ビフィズス菌：
１）配列番号１で特定されるアミノ酸配列で特定されるタンパク質；
２）配列番号１で特定されるアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列を基にして特定されるタンパク質であって、ワクチンとして免疫原性を有するタンパク質；
３）配列番号１で特定されるアミノ酸配列と60％以上の相同性を有するアミノ酸配列を基にして特定されるタンパク質であって、ワクチンとして免疫原性を有するタンパク質。
４．WT1タンパク質をコードするDNAが、以下の１）〜４）のいずれかである、前項１〜３のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌：
１）配列番号２で特定される塩基配列からなるDNA；
２）配列番号１で特定されるアミノ酸配列情報に基づいて得られるタンパク質をコードするDNA；
３）上記１）または２）で特定される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；
４）上記１）〜３）のいずれかで特定される塩基配列と60％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA。
５．WT1タンパク質をコードするDNAとビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードするDNAを含む、前項１〜４のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌。
６．WT1タンパク質をコードするDNAとビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードするDNAの間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む、前項１〜５のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌。
７．前項１〜６のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌をワクチンの有効成分として含む製剤。
８．製剤が腫瘍ワクチン製剤である、前項７に記載の製剤。
９．製剤がアジュバントをさらに含む、前項８に記載の製剤。
１０．製剤が経口製剤である前項７〜９のいずれかに記載の製剤。
１１．前項１〜６のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌又は前項７〜１０のいずれかに記載の製剤を患者に投与することを含む、腫瘍を予防又は治療する方法。
１２．前項１〜４のいずれかに記載の形質転換ビフィズス菌より産生されるビフィズス菌表層提示タンパク質。
１３．前項１２に記載のビフィズス菌表層提示タンパク質を有効成分として含有する、腫瘍ワクチン。
１４．WT1タンパク質をコードするDNAと、ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードするDNAを含み、ビフィズス菌表層に抗原としてのWT1タンパク質を提示するよう設計されたプラスミドまたはシャトルベクター。
【発明の効果】
【0014】
本発明の形質転換ビフィズス菌によれば、ビフィズス菌の細胞表層にWT1タンパク質を発現・提示することができる。ビフィズス菌の表層にWT1抗原タンパク質を提示させることにより、WT1タンパク質を発現する腫瘍に対して有効な経口ワクチンとして利用できる。経口ワクチンの場合、小児や高齢者でも摂取しやすく、また通常の注射によるワクチン接種に伴う痛みもない。特に、本発明の経口ワクチンは、食経験のあるビフィズス菌を使用するため、安全性が高い。また、本発明の経口ワクチンは、ある特定のHLAに拘束されるWT1ペプチドワクチンとは異なり、WT1タンパク質のほぼ全配列をカバーするタンパク質を発現しうるビフィズス菌であり、HLAの拘束性は低い。当該形質転換ビフィズス菌を有効成分とする腫瘍ワクチンは様々なHLAタイプの患者に適応可能である。【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】GL-BP遺伝子の下流にWT1遺伝子を有するシャトルベクターおよびビフィズス菌表面に発現したGL-BP-WT1融合タンパク質を示す概念図である。（実施例１）
【図2】形質転換ビフィズス菌に導入されたWT1をコードするDNAを確認した結果を示す写真図である。（実施例１）
【図4】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例３）
【図5】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例３）
【図6】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を確認した結果を示す写真図である。（実施例３）
【図7】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を経時的に確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図8】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図9】本発明の形質転換ビフィズス菌の細胞免疫応答誘導効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例４）
【図10】本発明の形質転換ビフィズス菌を投与した場合のマウスの体重への影響を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図11】本発明の形質転換ビフィズス菌のサイトカイン産生能への影響を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図12】本発明の形質転換ビフィズス菌の活性化T細胞誘導能への影響を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図13】本発明の形質転換ビフィズス菌のWT1特異的CTL誘導能を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図14】本発明の形質転換ビフィズス菌のWT1特異的細胞傷害活性化能を確認した結果を示す図である（実施例４）
【図15】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例５）
【図16】本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を確認した結果を示す図である。（実施例５）
【図17】アジュバント併用時の本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例６）
【図18】アジュバント併用時の本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を確認した結果を示す図である。（実施例６）
【図19】アジュバント併用時の本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を、マウスを用いて確認するための実験プロトコールを示す図である。（実施例７）
【図20】アジュバント併用時の本発明の形質転換ビフィズス菌の抗腫瘍効果を確認した結果を示す図である。（実施例７）
【図21】本発明の形質転換ビフィズス菌において、WT1タンパク質をコードするDNAを遺伝子レベルで確認した結果を示す図である。（実施例８）
【発明を実施するための形態】
【0016】
（WT1タンパク質）WT1タンパク質は、小児の腎腫瘍であるウィルムス（Wilms）腫瘍の原因遺伝子の1つとして単離されたWT1遺伝子によりコードされるタンパク質である。WT1タンパク質には、種々のHLAタイプに対して複数のT細胞エピトープが確認されている。本発明のWT1タンパク質は、少なくとも２以上（好ましくは３以上、より好ましくは４以上）のT細胞エピトープを含むものであればよく、全長であってもよいし、N末端やC末端が欠失した部分ペプチドであってもよい。WT1タンパク質の全長として、以下のものが例示される。
【0017】
WT1タンパク質の全長 GenBank Accession No.P22561.1（配列番号２２）：MGSDVRDLNALLPAVSSLGGGGGGCGLPVSGARQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTLHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGYSTVTFDGAPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGMAAGSSSSVKWTEGQSNHGIGYESENHTAPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVSGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWHSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLHVAL
【0018】
WT1タンパク質の全長 GenBank Accession No.P19544.2（配列番号２３）：MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL
【0019】
本明細書において、ビフィズス菌上に提示されうる抗原としてのWT1タンパク質は、以下のいずれかで特定される。１）配列番号１で特定されるアミノ酸配列で特定されるタンパク質。
２）配列番号１で特定されるアミノ酸配列のうち、1個または複数個、例えば1〜120個、好ましくは1〜60個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜9個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列を基にして特定されるタンパク質であって、ワクチンとして免疫原性を有するタンパク質。
３）配列番号１で特定されるアミノ酸配列と60％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列を基にして特定されるタンパク質であって、ワクチンとして免疫原性を有するタンパク質。
【0020】
WT1タンパク質（配列番号１）：PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPTIRNQGYSTVTFDGAPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGMAAGSSSSVKWTEGQSNHGIGYESENHTAPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVSGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWHSCQKKFARSDELVRHHNMHQ
【0021】
上記WT1タンパク質（配列番号１）に含まれるT細胞エピトープを、以下の表１に示す。本発明のWT1タンパク質は、表１に示すnp332、np126、np187、np235に相当するT細胞エピトープを２以上含むことが好ましい。より好ましくは３以上、さらに好ましくは４個全てを含む。これらのT細胞エピトープは、T細胞により認識され細胞免疫応答を誘導し得るものであればよく、アミノ酸配列のうち1個または複数個、例えば1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個のアミノ酸が置換、欠失、付加、導入されてなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。【表1】
【0022】
また本明細書におけるWT1タンパク質として、以下の配列番号１４で特定されるWT1タンパク質も含まれる。WT1タンパク質（配列番号１４）：
PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQ
【0023】
また上記WT1タンパク質（配列番号１４）において、HLA-A*2402拘束性CTLエピトープにおいて、M236Yの置換を導入したアミノ酸配列を有する変異型WT1タンパク質を以下に示す。本明細書におけるWT1タンパク質には、以下の変異型WT1タンパク質も含まれる。変異型WT1タンパク質（配列番号１６）：
PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECYTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQ
【0024】
本明細書においてWT1タンパク質には、改変型WT1タンパク質も包含される。ここにおいて改変型WT1タンパク質は、上記特定されたWT1タンパク質の全部または一部のアミノ酸が置換や修飾等により改変されたタンパク質をいう。改変型WT1タンパク質には、例えば上記１）〜３）で特定されるアミノ酸配列において、全部または一部のアミノ酸、例えば1個または複数個、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個または12個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。改変WT1タンパク質が有し得るアミノ酸の「修飾」としては、これらに限定されないが、例えば、アセチル化、メチル化などのアルキル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、アルデヒド化、リン酸化、スルホニル化、ホルミル化、ミリストイル化やパルミトイル化やステアロイル化のような脂肪鎖付加修飾、オクタノイル化、エステル化、アミド化、脱アミド化、シスチン修飾やグルタチオン修飾やチオグリコール酸修飾のようなジスルフィド結合形成修飾、糖化、ユビキチン化、スクシンイミド形成、グルタミル化、プレニル化等が挙げられる。改変型WT1タンパク質は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加と、1個以上のアミノ酸の修飾を組み合わせて含むものであってもよい。【0025】
（ビフィズス菌）本明細書において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・パーブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム（B. pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナル（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・セクラル（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカードビ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B. thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム（B. thermophilum）が挙げられる。
【0026】
この中でも、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、およびビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）が好ましく用いられる。【0027】
また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。これらの菌株は、いずれも市販されているか、または寄託機関等から容易に入手できる。例えば、B. longum JCM1217（ATCC15707）、B. bifidum ATCC11863等が挙げられる。【0028】
（GNB/LNB基質結合膜タンパク質）GNB/LNB基質結合膜タンパク質（GL-BP：Galacto-n-biose-lacto-n-biose I-binding Protein）は、ビフィズス菌が有するラクト-N-ビオース（即ち、N-Acetyl-3-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucosamine）およびガラクト-N-ビオース（即ち、N-Acetyl-3-O-(β-D-galactopyranosyl)-α-D-galactosamine）を輸送するABCタンパク質（ATP Binding Cassette protein）ファミリーに属する膜タンパク質である。以下、GNB/LNB基質結合膜タンパク質を単に「GL-BP」ともいう。ABCタンパク質とは、ATP（アデノシン３リン酸）をエネルギーとして使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のABCタンパク質が存在している。そのため、ABCタンパク質の一種であるGL-BPは、GL-BP表層発現のための細胞機能が備わっているビフィズス菌において、適切なプロモーターを利用すれば普遍的に発現する。本明細書において、GL-BPの構造は天然に存在するGL-BPに限定されず、ビフィズス菌の細胞表層に発現する能力を有していれば、当該GL-BPを構成するアミノ酸に1以上の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。
【0029】
（ビフィズス菌表層提示融合タンパク質）本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示されるWT1タンパク質は、GL-BPとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、N末端からGL-BPおよびWT1タンパク質の順に連結されている。必要に応じて、GL-BPとWT1タンパク質との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質を含んでいてもよい。
【0030】
（形質転換ビフィズス菌の調製）WT1タンパク質をビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順について、操作の順に説明する。
【0031】
１．各タンパク質をコードするDNAの取得GL-BPをコードするDNAおよびWT1タンパク質をコードするDNAは、各公知の遺伝子情報またはアミノ酸配列情報に基づいて入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムDNAまたはcDNAを鋳型とし、該ビフィズス菌のGL-BPの構造遺伝子のゲノム情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅し、取得することができる。一般に1つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。B. longumのGL-BPをコードするDNAは例えば、Acta Crystallographica Section F.，2007年，F63巻，p.751にて特定されるB. longumのGL-BPの遺伝子情報に基づいて入手することができる。B. longumの染色体DNAまたはcDNAを鋳型とし、遺伝子情報に基づいて作製したプライマー対を用いてPCRで増幅し、B. longumのGL-BPをコードするDNAを入手することができる。WT1タンパク質をコードするDNAは、上記WT1タンパク質について特定したアミノ酸配列情報に基づいて、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法により作製することができ、入手することができる。上記のWT1タンパク質以外の各タンパク質をコードするDNAも同様に自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法により作製することができ、入手することができる。
【0032】
上記の各タンパク質をコードするDNAは、上記のようにして取得したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとは、上記DNAをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにより得られるDNAを意味する。具体的には、コロニーまたはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、約0.7〜1.0Mの塩化ナトリウム存在下、約65℃にてハイブリダイゼーションを行った後、約0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAが挙げられる。上記ハイブリダイズ可能なDNAとして、具体的には、上記公知塩基配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードするDNAの塩基配列と、少なくとも約80％以上の相同性を有するDNA、好ましくは約90％以上の相同性を有するDNA、さらに好ましくは約95％以上の相同性を有するDNAが挙げられる。アミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードするDNAは、アミノ酸をコードするのであれば、異なったコドンであってもよい。【0033】
具体的よりには、WT1タンパク質をコードするDNAは、以下のいずれかで特定される。１）配列番号２で特定される塩基配列からなるDNA。
２）配列番号１で特定されるアミノ酸配列情報に基づいて得られるタンパク質をコードするDNA。
３）上記１）または２）で特定される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
４）上記１）〜３）のいずれかで特定される塩基配列と60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA。
【0034】
WT1タンパク質をコードするDNA（配列番号２）CTCGAGCCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGACGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCGCCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCATGACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAATGGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACGGCATCGGCTACGAGTCCGAGAACCACACCGCGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCTCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCACAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAAGCATGC
【0035】
また、WT1タンパク質をコードするDNAとして、以下の配列番号１５又は配列番号１７で特定される塩基配列からなるDNAが例示される。WT1タンパク質をコードするDNA（配列番号１５）
CCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGGCGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCACCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCATGACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAGTCGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACTCCACCGGCTACGAGTCCGACAACCACACCACGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCCCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCCCAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAA
WT1タンパク質をコードするDNA（配列番号１７）
CCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGGCGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCACCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCTACACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAGTCGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACTCCACCGGCTACGAGTCCGACAACCACACCACGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCCCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCCCAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAA
【0036】
２．ビフィズス菌形質転換用ベクターの調製上記１．で調製された各タンパク質をコードするDNAを有する組換え体DNAの調製について説明する。本明細書において、組換え体DNAは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター（例えば、相同組換え型ベクター）を用いることができる。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限なく、自体公知のプラスミドまたは今後開発されるあらゆるプラスミドであっても良い。例えばビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、pTB6、pBL67、pBL78、pNAL8H、pNAL8M、pNAC1、pBC1、pMB1、pGBL8bなどを使用することができる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドを用いてもよく、例えばpBLES100、pKKT427、pRM2などを用いることができる。発現の安定性および形質転換株の調製のためのDNAの調製の容易さという観点から、上記プラスミドの中でも、B. longumのプラスミドと大腸菌のプラスミドとから合成された複合プラスミドが好適である。
【0037】
発現ベクターは、形質転換株を選択する観点から、自体公知の方法により抗生物質耐性、アミノ酸要求性などの選択マーカーを有することが好適である。発現ベクターは、GL-BPとWT1タンパク質との融合タンパク質の発現のために、または発現に有利となるように、調節配列を付加したものが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが挙げられる。これらの調節配列は、ビフィズス菌で発現するものであれば、その由来は特に制限はない。プロモーター配列としては、ビフィズス菌で発現するものであれば特に制限はない。発現効率の観点からは、B. longumのヒストン様蛋白（HU）のプロモーター配列、LDHプロモーターなどが好ましく用いられる。また、発現効率を高める観点からは、ターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列としては、上記HU遺伝子のターミネーター配列が好ましく用いられる。また、GL-BPをコードするDNAとWT1タンパク質をコードするDNAとの間に適切な長さのリンカーをコードするDNAを配置してもよい。【0038】
このように、上記のプラスミドに、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列などの調節配列、および選択マーカー遺伝子を導入して、クローニングベクターが調製される。選択マーカーとしては、スペクチノマイシン（SPr）、アンピシリン（Ampr）、テトラサイクリン（TETr）、カナマイシン（KMr）、ストレプトマイシン（STr）、ネオマイシン（NEOr）などの抗生物質耐性マーカー；緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光タンパク質（REP）などの蛍光マーカー；LacZなどの酵素などが挙げられる。クローニングベクターのプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトを有するリンカーなどを備えていることが好ましい。このようなリンカーを用いることにより、上記融合タンパク質をコードするDNAがプロモーターの下流に、かつ、インフレームで融合タンパク質を発現することができるように、組み込まれる。クローニングベクター用のプラスミドとしては、代表的には、pBLES100、pBLEM100などを使用することができる。【0039】
このプラスミドpBLES100に上記取得したHUプロモーター配列、GL-BPをコードするDNA、およびWT1タンパク質をコードするDNAをインフレームで組み込むことにより、融合タンパク質をビフィズス菌の表層に発現するベクターを作製することができる。このような方法で作製される発現ベクターは、ビフィズス菌の形質転換に用いられる。【0040】
３．融合タンパク質を発現する形質転換ビフィズス菌の調製組換え体DNA、例えば、発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入する。形質転換方法は、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、0.5〜20kV／cm、0.5μsec〜10msecの条件で行うことが可能である。より好ましくは、2〜10kV／cm、50μsec〜5msecで行うことが望ましい。
【0041】
形質転換株は、融合タンパク質発現ベクターが有する選択マーカーを指標として選択することができる。形質転換株を培養する培地としては、宿主微生物それぞれに適した培地、例えば、ブドウ糖血液肝臓（BL）寒天培地、デ・マン−ロゴサ−シャープ（MRS）寒天培地、岐阜大学嫌気性（GAM）寒天培地、改良GAM（TGAM）寒天培地、ブリッグス（Briggs）寒天培地、および酵母エキスブドウ糖ペプトン（YGP）寒天培地が挙げられる。【0042】
形質転換体の培養は、ビフィズス菌が培養可能な嫌気培養条件で行うことが好ましい。嫌気性条件下で培養することにより、好気性菌の増殖を防ぐことができる。嫌気性条件とは、ビフィズス菌が増殖可能な程度の嫌気度を保てる密閉容器中での培養であり、例えば、嫌気チャンバーまたは嫌気ボックスなどにおいて可能な条件が挙げられる。培養温度は、ビフィズス菌を培養可能な温度であればよく、通常、4℃〜45℃、好ましくは15℃〜40℃、より好ましくは24℃〜37℃である。【0043】
得られた形質転換ビフィズス菌の融合タンパク質の発現は、遺伝子組み換え技術で適用される自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法で確認することができ、例えば、ウエスタンブロッティング法により確認することができる。ウエスタンブロッティング法も自体公知の方法により行うことができる。特に、WT1タンパク質がビフィズス菌表層に提示されていることは、形質転換ビフィズス菌に対して例えば、WT1タンパク質に対する抗体とFITC標識抗IgG抗体とを用いる免疫抗体法によって容易に確認することができる。なお、GL-BPとアジュバント機能を有するタンパク質とWT1タンパク質との融合タンパク質を発現する場合、アジュバント機能を有するタンパク質とWT1タンパク質とがビフィズス菌の表層に提示されているため、確認に用いる抗体は、いずれのタンパク質に対する抗体であってもよい。【0044】
WT1タンパク質の表層提示が確認された形質転換ビフィズス菌は、当業者が通常用いる方法により培養し、回収して、そのまま製剤の製造に用いてもよい。得られたビフィズス菌は加熱殺菌処理、あるいは放射線照射等により不活化して用いても良い。 形質転換ビフィズス菌は、公知の方法で後処理を行ってもよい。例えば、遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または乳酸配合リンゲル液などの当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。【0045】
（形質転換ビフィズス菌含有製剤）本発明の形質転換ビフィズス菌は、表層に提示しているWT1タンパク質が疾患の治療または予防目的で投与することが好ましい場合、任意の製剤の形態で投与することができる。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与を行うことができるが、本発明の目的により経口投与が好適である。
【0046】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などが挙げられる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などが挙げられる。【0047】
経口投与用の液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。【0048】
（経口ワクチン）本発明のWT1タンパク質が提示された形質転換ビフィズス菌は、経口ワクチンとして好適に利用することができる。例えば、WT1タンパク質が腸管壁で抗原として認識されて、抗体が産生される。したがって有効な経口ワクチンとなる。例えば、以下に記載の耐酸性カプセル製剤（シームレスカプセル製剤、軟カプセル製剤、および硬カプセル製剤）は、経口投与されると、pH1〜3の胃内で溶解せずに通過して、腸に到達し、腸で溶解する。カプセルの溶解により製剤から放出された形質転換ビフィズス菌は、腸内環境でも大部分のタンパク構造を保持し、その表層にWT1タンパク質を提示する。
【0049】
形質転換ビフィズス菌が経口投与されることにより、当該ビフィズス菌の表層に発現するWT1タンパク質は、腸管関連リンパ組織（GALT）に取り込まれ、GALT内の抗原提示細胞（APC）により適切なエピトープで処理される。さらにGALT内でプロセッシングされたペプチドはMHCクラスII又はMHCクラスIと一緒にAPCに提示され、当該ペプチドに特異的なT細胞受容体を持つCTLを誘導すると考えられる。APCにより、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞が活性化され、CD4陽性T細胞から放出されるIL-2等の各種サイトカインの作用により、腫瘍細胞に特異的なCD8陽性T細胞（細胞傷害性T細胞（CTL））が増殖すると考えらている。本発明のWT1タンパク質は、CD8陽性T細胞及びCD4陽性T細胞のいずれも活性化することから、効率良くWT1発現腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮するものと考えられる。【0050】
また本発明の形質転換ビフィズス菌を有効成分として含む経口ワクチンは、アジュバントを含んでいてもよい。アジュバントはワクチンの効果を増強させる作用を有するものである。本発明の経口ワクチンに用いられるアジュバントとしては、粘膜免疫の誘導を増強し得るものが好ましく、水酸化アルミニウムとその無機塩類、スクワレンやオイルなどの炭化水素類、コレラトキシン、大腸菌易熱性毒素のＢサブユニット（LTB）、サルモネラからのリピドＡ（MPLA）などの細菌毒素、キトサンやイヌリンなどの多糖類、及びこれらの組合せがあげられるが、これらに限定されない。【0051】
本発明は、本発明の経口ワクチンを対象者に投与する工程を含む、対象者における腫瘍を予防又は治療する方法に関する。有効成分の投与量は、対象者の体重や年齢、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。本発明の経口ワクチンにより予防又は治療される腫瘍は、WT1タンパク質が発現し得るものであればいずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍などの固形癌を含む。【0052】
（形質転換ビフィズス菌を含有する耐酸性カプセル製剤の製造）本発明の経口ワクチンは、カプセル製剤の形態であることが好ましい。本明細書中では、内容物をその中に含むカプセルを「カプセル製剤」という。本発明におけるカプセル製剤は、カプセル皮膜とWT1タンパク質を表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成され、このカプセル皮膜は耐酸性である。耐酸性であるカプセル皮膜とWT1タンパク質を表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成されるカプセル製剤とは、耐酸性のカプセル皮膜を有し、そしてWT1タンパク質を表層に発現する形質転換ビフィズス菌をカプセル内容物として含有する限り、任意の構成および形状をとり、当該カプセル製剤が、さらなる構成要素を含んでいることを除外しない。したがって、WT1タンパク質を表層に発現する形質転換ビフィズス菌が、耐酸性のカプセル皮膜によって包含されている、または封じ込められている（すなわち、耐酸性の皮膜によって形成されるカプセルの内部領域に含有されている）。本発明の形質転換ビフィズス菌に適用可能なカプセル製剤は自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法を製造することができる。
【0053】
WT1タンパク質を表層に発現する形質転換ビフィズス菌が経口ワクチンとして機能するためには、この形質転換ビフィズス菌が胃を通過し、腸に到達し、そこでもWT1抗原タンパク質やビフィズス菌細胞壁のタンパク質が保持されている必要がある。ところで、胃のpHは1〜3であり、この著しく低いpHのため、経口摂取されたビフィズス菌は、その大部分のタンパク質が変性する。したがって、本発明で用いる形質転換ビフィズス菌がヒトの腸内に各種のタンパク構造を保持したまま到達し、WT1タンパク質を提示するためには、形質転換ビフィズス菌が胃酸による影響を極力受けないようにすることが好ましい。【0054】
そのため、本発明においては、好適には、耐酸性のカプセル皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含されまたは封じ込められている、すなわち、耐酸性の皮膜のカプセルの内側に形質転換ビフィズス菌が含有されている、カプセル製剤とする。カプセル製剤の構成、形状などは、皮膜が胃酸に対して耐性を有する限り、特に制限がない。すなわち、胃酸がカプセル内に浸入し、形質転換ビフィズス菌と接触しないように構成することが望ましい。カプセル皮膜は、pH4以下、好ましくはpH1〜3で溶解しない皮膜であっても良い。カプセル化法も特に制限はない。【実施例】
【0055】
以下に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。【0056】
（実施例１：GL-BP-WT1表層提示ビフィズス菌の作製）Ａ．GL-BP遺伝子の単離
Bifidobacterium longum JCM1217（ATCC15707）ゲノム（Accession：EU193949）より、プライマーglt-f：5'-ggggtgctgatatattggtttg-3'（配列番号３）および終止コドンがXhoIに置換されるようにしたglt-r：5'-gctcgagctcggaaacagacaggccgaagtt-3'（配列番号４）とKOD -Plus-（TOYOBO社製）とを用いてPCR反応を行ってGL-BP遺伝子を増幅させた。増幅させたGL-BP遺伝子を含むPCR産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、1989bpのPCR産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いてGL-BP遺伝子増幅断片のみを単離精製した。
【0057】
Ｂ．単離したGL-BP遺伝子を有するpMW118プラスミドの構築単離精製したGL-BP遺伝子増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）を有するpMW118（株式会社ニッポンジーン製）のSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。なお、ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（42℃、30秒）にて大腸菌DH5α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地（Difco社製）に塗布し、37℃にて一晩培養し、GL-BP遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、GL-BP遺伝子の導入された組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをpJT101と命名した。
【0058】
Ｃ．WT1遺伝子の単離マウスWT1の117番目から439番目までのアミノ酸配列をコードするDNA（配列番号２）を全合成した（フナコシ株式会社）。なお、合成の際にはビフィズス菌において使用頻度の高いコドンを用いた。また、N末端側にはXhoI認識配列（CTCGAG：配列番号５）を、C末端側には終止コドンおよびそれに引き続いてSphI認識配列（GCATGC：配列番号６）を付加した。これをpUC18ベクターのSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（42℃、30秒）にて大腸菌DH5α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地（Difco社製）に塗布し、37℃にて一晩培養し、マウスWT1(117〜439)をコードするDNAを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行った。得られた組換えプラスミドをpTK2875-1と命名した。
【0059】
合成したマウスWT1遺伝子の配列（配列番号２）CTCGAGCCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGACGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCGCCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCATGACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAATGGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACGGCATCGGCTACGAGTCCGAGAACCACACCGCGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCTCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCACAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAAGCATGC
【0060】
マウスWT1の117番目から350番目までのアミノ酸配列をコードするDNAを有するプラスミドの作製は、以下のように行った。すなわち上記で得られたpTK2875を鋳型にして、プライマーWT1-f （5'-CGCTCGAGCCGTCCCAGGCGTCGT-3'：配列番号７）およびプライマーWT1-r2（5'-GCGCATGCTCACTCGCCGGTGTGCTTCCGG-3'：配列番号８）とKOD -Plus-（TOYOBO社製）とを用いてPCR反応を行ってマウスWT1(117〜350)をコードするDNA断片を増幅させた。なお、C末端側には終止コドンおよびそれに引き続いてSphI認識配列（GCATGC：配列番号６）を付加した。増幅させたPCR産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、721bpのPCR産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて単離精製した。これをpUC18ベクターのSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（42℃、30秒）にて大腸菌DH5α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地（Difco社製）に塗布し、37℃にて一晩培養し、マウスWT1(117〜350)をコードするDNAを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行った。得られた組換えプラスミドをpTK2875-2と命名した。【0061】
Ｄ．GL-BP遺伝子の下流にWT1遺伝子を有するプラスミドの構築上記Ｃ．にて得られたWT1遺伝子を保持するプラスミドpTK2875-1およびpTK2875-2を制限酵素XhoIおよびSphIで処理し、アガロースゲル電気泳動を行い、それぞれ986bpおよび718bpのDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて単離精製した。これらのWT1遺伝子増幅断片を、DNA Ligation kit Ver. 2を用いて、同じく制限酵素XhoIおよびSphIで処理した上記pJT101プラスミドへそれぞれ導入し、プラスミドの構築を行った。構築したプラスミドをそれぞれ、ヒートショック法にて大腸菌DH5αに導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩培養し、GL-BP遺伝子とWT1遺伝子との融合遺伝子（図１）を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、GL-BP遺伝子の下流にWT1遺伝子を連結した組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをそれぞれpTK2895（GLBP-WT1(117〜439)）およびpTK2896（GLBP-WT1(117〜350)）と命名した。
【0062】
Ｅ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターの構築大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターとして、Vaccine. 28:6684-6691 (2010)に開示する大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターpJW241を使用した。
【0063】
Ｆ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターpJW241へのGL-BP遺伝子とWT1遺伝子とが連結された遺伝子の組込みGL-BP遺伝子とWT1遺伝子とが連結された融合遺伝子（以下「当該融合遺伝子」という。）を有するベクターpTK2895（GLBP-WT1(117〜439)）およびpTK2896（GLBP-WT1(117〜350)）をそれぞれテンプレートとして、プライマーInfusion-F（5'-ggaaaactgtccatagatggcgaggcgaacgccacg-3'：配列番号９） およびプライマーInfusion-R（5'-tttcatctgtgcatagtgctgcaaggcgattaagtt-3'：配列番号１０）を用いてPCRを行った。PCR増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行って当該融合遺伝子を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて単離精製した。また、これとは別に、大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターpJW241（Vaccine. 28:6684-6691 (2010)）を制限酵素NdeIで処理した。精製した当該融合遺伝子とpJW241とを、それぞれIn-Fusion HD Cloning kit（Clontech社製）を用いてライゲートし、得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌DH5αに導入し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩培養して、大腸菌複製開始点ori領域、スペクチノマイシン耐性遺伝子（SPr）、ビフィズス菌の複製開始点ori領域、および当該融合遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、当該融合遺伝子の配列の存在を確認した。得られた組換えプラスミドをそれぞれpTK2897（GLBP-WT1(aa117〜439)）およびpTK2898（GLBP-WT1(aa117〜350)）と命名した。
【0064】
Ｇ．宿主ビフィズス菌液の調製Bifidobacterium longum 105-A（Matsumura H.ら，Biosci. Biotech. Biochem.，1997年，61巻，pp.1211-1212：東京大学名誉教授 光岡知足氏より供与）をGAM培地（日水製薬株式会社製）50mlに植菌し、アネロパック(R)ケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用いて37℃にて培養した。培養中、波長600nmでの吸光度を測定し、吸光度が0.4〜0.8に達した時点で培養を止めた。培養終了後、高速遠心分離機で遠心分離（6000×g、10分間）し、菌体を集めた。集めた菌体に10％（v/v）グリセロール溶液10mlを加えて懸濁し、高速遠心分離機で遠心分離して、菌体を2〜3回洗浄した。
【0065】
Ｈ．組換えプラスミドpTK2897およびpTK2898のビフィズス菌への形質転換によるGL-BP-WT1融合タンパク質表層提示ビフィズス菌の作製上記Ｇ．で得た宿主ビフィズス菌液に、10％(v/v)グリセロール溶液500μlを加えて懸濁した。別のチューブに、この懸濁液200μlをとり、上記Ｆ．で得た組換えプラスミドpTK2897およびpTK2898をそれぞれ含む溶液5μlを加えて混合し、氷上に5分間放置した。次いで、エレクトロポレーション・キュベット0.2cm（Bio-Rad社製）に混合液を入れ、Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Rad社製）を用いて2kV、2.5μF、200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後直ちに、予め37℃にしておいたGAM培地0.8mlを加え、アネロパック(R)ケンキを用いて37℃にて3時間培養した。次いで、スペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗布し、アネロパック(R)ケンキを用いて37℃にて培養し、形質転換ビフィズス菌を得た。得られた形質転換ビフィズス菌をスペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM培地に植菌し、アネロパック(R)ケンキを用いて37℃で培養した。培養終了後、1.5mlチューブに培養液を分注し、等量の50％(v/v)グリセロール溶液を加えて懸濁した。得られた懸濁液を-80℃で保存してフリーズストックを作製し、これを、GL-BP-WT1融合タンパク質表層提示ビフィズス菌（「形質転換ビフィズス菌」という場合がある）のマスターセルとした（それぞれTK2900（GLBP-WT1(aa117〜439)）およびTK2903（GLBP-WT1(aa117〜350)））。
【0066】
図２は、組換えビフィズス菌の遺伝子（DNA）を、下記プライマーを用いてPCRにより増幅して得られた増幅断片の長さを電気泳動により確認した結果を示す図である。フォワードプライマー410, 420：ACGATCCGCAACCAGGGCTACTC（配列番号１１）
リバースプライマー410：ggtgcgagagcttgaagtagcgc（配列番号１２）
リバースプライマー420：gtcgctgcgggcgaacttcttc（配列番号１３）
410とはB. longum 410であり、マウスWT1(aa170〜350)をコードするDNAを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌であり、上記TK2903（GLBP-WT1(aa117〜350)）に該当する。420とはB. longum 420であり、マウスWT1(aa117〜439)をコードするDNAを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌であり、上記TK2900（GLBP-WT1(aa117〜439)）に該当する。2012とはB. longum 2012であり、マウスWT1をコードするDNAが挿入されていないGLBP遺伝子のみを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌である。410と示すプライマーはマウスWT1(aa117〜350)をコードするDNAを増幅し、420と示すプライマーはマウスWT1(aa117〜439)をコードするDNAを増幅する。
図２の結果から、WT1をコードするDNAが確かに組換えビフィズス菌に導入されたことが確認された。
【0067】
（実施例２：形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質表層提示の確認）（１）上記実施例１で得た形質転換ビフィズス菌を高速遠心機で遠心し、菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を3回行った。菌体に、PBS、1MのTris-HCl（pH8.0）（株式会社ニッポンジーン製）、およびTriton X-100（和光純薬工業株式会社製）を含む溶液を加え、30分間氷上に放置した。この溶液に、等量の2×SDSゲル泳動緩衝液を加え、95℃で5分間放置して電気泳動用サンプルを得た。次いで、8％(w/v)アクリルアミドゲルを泳動装置（アトー株式会社製）にセットし、得られたサンプルをアプライし、分子量マーカーと共に20mAの電流にて1.5時間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをニトロセルロースメンブレン（アトー株式会社製）に重ね、ブロッティング装置（Bio-Rad社製）に20mAの電流をかけてブロッティングを行った。ブロッティング後、ニトロセルロースメンブレンを4％(w/v)スキムミルク（BD社製）を含む緩衝液であるTBS（株式会社ニッポンジーン製）に1時間浸漬してブロッキングを行った。ブロッキング後、ニトロセルロースメンブレンをTBSで2回洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを、0.5％(w/v)の一次抗体（WT1 抗体(C-19): sc-192：SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製）を添加したTBSに1.5時間浸漬し、TBSで3回洗浄した。次いで、ニトロセルロースメンブレンを、0.5％(w/v)の二次抗体（goat anti-rabbit IgG-HRP: sc-2004：SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製）を添加したTBSに３時間浸漬した。次いで、ニトロセルロースメンブレンをTBSで3回洗浄し、1-Steptm NBT/BCIP plus Suppressorキット（PIERCE社製）を用いて遮光下で30分間発色させ、純水ですすいだ後、発色によりGL-BP-WT1融合タンパク質の表層発現を確認した。
【0068】
ウエスタンブロッティングの結果を図３のＡに示した。図３のＡから明らかなように、B. longum 420にはWT1(aa117〜439)とGL-BPの融合タンパク質の分子量の合計に相当する82.9kDaに明確なバンドが認められた。したがって、形質転換ビフィズス菌（B. longum 420）が、GL-BP-WT1融合タンパク質を発現していることを確認した。【0069】
（２）培養した上記実施例１にて得た形質転換ビフィズス菌を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体に緩衝液であるPBS（株式会社ニッポンジーン製）を加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を３回行った。次いで、1％(w/v)BSAを含むPBSに一次抗体（WT1 抗体(C-19): sc-192：SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、37℃にて30分間放置した。30分間放置した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った。次いで、1％(w/v)BSAを含むPBSに二次抗体Alexa FluorTM 488 Rabbit Anti-Mouse IgG antibody（Molecular Probes社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、37℃にて30分間放置した。30分間放置した菌液を、高速遠心分離機で遠心分離して菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った後、蛍光顕微鏡（KEYENCE社製）で観察した。【0070】
蛍光顕微鏡で観察した結果を図３のＢに示した。図３Ｂの左図は、上記実施例１で得た形質転換ビフィズス菌であるB. longum 420の蛍光顕微鏡写真であり、図３Ｂの右図は、B. longum 2012の蛍光顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡写真から、B. longum 420の細胞表面にWT1が存在することを確認した。【0071】
（実施例３：形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与による抗腫瘍効果の確認）上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌をマウスに経口投与したときの抗腫瘍効果を確認した。実験プロトコールは、図４および図５に示した。
C57BL/6（メス, 6〜8週齢）に、マウスWT1発現C1498細胞（マウス白血病細胞）を右横腹へ皮下移植した。細胞は、マウス一匹あたり1×106 cells /200μl RPMI1640およびマトリゲルで移植し、移植した日をDay0とした。４日ごとに腫瘍の大きさを確認した。
【0072】
腫瘍接種19日目（Day19）の代表的な皮下腫瘍の写真を図６に示した。また、腫瘍の大きさの経日変化を図７に示し、および腫瘍接種29日目（Day29）の腫瘍の大きさを図８に示した。B. longum 420の単独投与群では、PBS投与群に対して有意に腫瘍増殖を抑制できることがわかった（*：p<0.05、**：p<0.001）。またB. longum 420とIL-2の併用により、Day19以降、PBS投与群に対して有意に腫瘍増殖を抑制できること（p<0.01）、Day29にはB. longum 420単独投与群に対して有意に腫瘍増殖を抑制できることがわかった（p<0.01）。IL-2との併用により、B. longum 420の抗腫瘍効果が増強された。【0073】
（実施例４：形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与による細胞免疫応答誘導効果の確認）上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌をマウスに経口投与したときの細胞免疫応答誘導効果を確認した。実験プロトコールは、図９に示した。なお、Day0からDay29の観察期間中、B. longum 420投与群の平均体重は他の群と同様に推移し（図１０）、B. longum 420投与による下痢、行動不良等の副作用は見られなかった。
【0074】
（１）Day27にマウスから脾臓を回収して脾細胞を調製して培養し、脾細胞培養上清中の細胞性免疫系各種サイトカイン濃度を測定した。脾細胞を刺激する抗原として、マウスWT1タンパク質を発現するようにマウスWT1遺伝子の導入を行ったC1498マウス白血病細胞株（C1498-WT1細胞）、対照としてマウスWT1遺伝子を挿入していない空ベクターを導入したC1498細胞（C1498-Mock細胞）を用いた。マイトマイシンC処理C1498-WT1細胞又はC1498-Mock細胞（各4×104 cells/well）を用いて、4×105 cells/wellのマウス脾細胞を96ウェルプレートで37℃、3日間刺激培養した（n=5）。培養後、細胞培養液を回収し、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay（ELISA）法により各種サイトカイン（インターフェロンγ（IFN-γ）、インターロイキン2（IL-2）、腫瘍壊死因子α（TNF-α））の濃度を測定した。各種サイトカインの濃度の測定は、Mouse IFN-gamma Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN), Mouse TNF-alpha Quantikine (R&D Systems), および Mouse IL-2 ELISA Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA)を用いて、キットのマニュアルに準拠した方法により行った。
【0075】
結果を、図１１に示す。B. longum 420投与群においては、C1498-WT1細胞による再刺激により、非刺激群と比較して、IFN-γ、IL-2、TNF-α産生量が有意に増加した（*：p<0.01）。B. longum 420投与群におけるIFN-γ産生量は、PBS投与群およびB. longum 2012投与群と比較し、有意に増加した（*：p<0.01）。従って、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与により、WT1特異的抗腫瘍免疫に重要な各種サイトカイン産生がWT1タンパク質の刺激により増強されることが示された。【0076】
（２）上記（１）と同様にして調製した脾細胞について、細胞内サイトカイン染色(ICCS)を行い、CD4陽性T細胞又はCD8陽性T細胞中のサイトカイン産生T細胞の比率を確認した。マウス脾細胞（2×106 cells/well、n=5）を、2×105 cells/wellのC1498-WT1細胞と混合し、24ウェルプレートにて37℃、5％ CO2条件下で42時間培養した。ここでGolgiStopまたはGolgiPlug（BD社）を各ウェルに添加し、さらに6時間培養した。細胞を回収し、BD/Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit（BD社）を用いて細胞内サイトカイン染色を行った。FITC標識抗CD3モノクローナル抗体、FITC標識抗CD8モノクローナル抗体、又はFITC標識抗CD4モノクローナル抗体を添加し、混合した。染色用バッファーで細胞を洗浄した。各種の抗サイトカイン抗体を細胞に加えて穏やかに懸濁した後、室温の暗所にて静置した。細胞を洗浄した後、染色用バッファーに再懸濁した。その後、細胞をフローサイトメーターを用いて付属の解析ソフトウェアを用いて解析した。具体的な方法はキットのマニュアルに準じて行った。
【0077】
結果を図１２に示す。B. longum 420投与群において、脾細胞中のIFN-γ、IL-2およびTNFを産生するCD4+T細胞、CD8+T細胞のいずれもが、他の投与群と比較して有意に増加した（*:p<0.05）。従って、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与により、WT1特異的細胞性免疫に関与するサイトカインを産生するCD4+T細胞およびCD8+T細胞が増加することが示された。【0078】
（３）上記（１）と同様にして調製した脾細胞について、WT1テトラマーを用いて、CD8陽性T細胞中のWT1（Db126ペプチド）特異的CD8+T細胞の比率を確認した。2×106 cells/wellのマウス脾細胞（n=5）を2×105 cells/wellのC1498-WT1細胞と混合し、24ウェルプレートにて37℃、5％ CO2条件下で７日間培養した。培養１日目、３日目に20 IU/ml IL-2を添加し、CTLを誘導した。培養後、FITC標識抗CD3モノクローナル抗体、FITC標識抗CD8モノクローナル抗体を用いてCD8陽性T細胞を検出し、H-2Db WT1 Tetramer-RMFPNAPYL （MBL社） を用いてWT1ペプチド特異的CD8+T細胞（CTL）を検出した。細胞はフローサイトメーターを用いて付属の解析ソフトウェアを用いて解析した。
【0079】
結果を図１３に示す。形質転換ビフィズス菌が経口投与されることにより、当該ビフィズス菌の表層に発現するGL-BP-WT1融合タンパク質が腸管関連リンパ組織（GALT）に取り込まれ、GALT内の抗原提示細胞（APC）により適切なエピトープで処理される。さらにGALT内でプロセッシングされたペプチドはMHCクラスIIと一緒にAPCに提示され、当該ペプチドに特異的なT細胞受容体を持つCTLを誘導すると考えられる。H-2Db WT1 Tetramer-RMFPNAPYLは、WT1タンパク質に含まれるエピトープの１つであるCD8エピトープ（a.a.126-134：RMFPNAPYL（配列番号１９））に特異的なT細胞受容体に結合して蛍光を発することから、当該CD8エピトープに特異的なCTLの誘導を確認することができる。図１３の結果から、B. longum 420投与群における脾細胞中のWT1テトラマー陽性CTLの比率が、他の投与群と比較して有意に増加したことがわかった（*;p<0.05）。したがって、経口投与した形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパクが適切に処理され、抗腫瘍効果に重要な役割を担うWT1ペプチド特異的CTLが誘導されることが示された。【0080】
（４）上記（１）と同様にして調製した脾細胞について、WT1特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の活性の測定を行った。3×107 cells/wellのマウス脾細胞（n=5）を3×106 cells/wellのC1498-WT1細胞と混合し、6ウェルプレートにて37℃、5％ CO2条件下で６日間培養した。培養１日目、３日目に20 IU/ml IL-2を添加し、CTLを誘導した。脾細胞を回収し、96ウェルプレートにて脾細胞と、1×104cells/ウェルのC1498-WT1細胞またはC1498-Mock細胞とを、20：1、10：1、または5：1の比率で混合した後、37℃、5％CO2条件下で8時間培養した。培養上清を回収し、Cytotox 96 Non-radioactive Citotoxicity Assay Kit（Promega社）を用いて、培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定し、これを基に細胞傷害活性を算出した。乳酸デヒドロゲナーゼは細胞質に存在する酵素で、通常は細胞膜を透過しないが、細胞膜が障害を受けると培地中に放出されることから、細胞傷害活性の指標として使用されている。
【0081】
結果を図１４に示す。全ての細胞混合比率において、B. longum 420投与群におけるWT1特異的な細胞傷害活性が有意に上昇した（p<0.01）。従って、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与により、WT1特異的細胞傷害活性を有するCTLが誘導されることがわかった。【0082】
（実施例５：形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与による抗腫瘍効果の確認２）上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌をマウスに経口投与したときの抗腫瘍効果を確認した。実験プロトコールは、図１５に示した。
C57BL/6Nマウス（メス, 6週齢）（n=25）に、1×106 cells C1498-WT1細胞またはC1498-Mock細胞を皮下接種した。２日後、マウスを３つの群（n=5）に分け、形質転換ビフィズス菌の経口投与を開始した。経口投与毎に、B. longum 420投与群については、1×109 CFU in 100 μL PBSを、B. longum 2012投与群については、1×109 CFU in 100 μL PBSを、PBS投与群については、100 μL PBSを投与した。また、抗腫瘍効果の評価は下記の腫瘍体積の算出値をもとに行った。
（式） 腫瘍体積（mm3） = 長径×短径2×1/2
【0083】
結果を図１６に示す。Day25において、B. longum 420投与群の腫瘍体積はPBS投与群、およびB. longum 2012投与群と比較して有意に抑制された。また、B. longum 420投与群において、C1498-Mock細胞に対する抗腫瘍効果は認められなかったことから、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与による抗腫瘍効果はWT1発現細胞に特異的であることが示された。【0084】
（実施例６：アジュバントによる、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与の抗腫瘍効果への影響の確認）上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を、コレラトキシンを粘膜免疫アジュバントとして使用して、マウスに経口投与したときの抗腫瘍効果を確認した。実験プロトコールは、図１７に示した。
6週齢メスC57BL/6Nマウスに、1×106 cells C1498-WT1細胞を右背側に皮下接種した。７日後に腫瘍形成を確認し、マウスを３つの群（n=3）に分け、形質転換ビフィズス菌の経口投与を開始した。経口投与毎に、B. longum 420投与群については、6.4×109 CFU in 200 μL PBSを、B. longum 420＋コレラトキシン投与群については、6.4×109 CFU ＋ 10 μg コレラトキシン（Wako）in 200 μL PBSを、PBS投与群については、200 μL PBSを投与した。ワクチン投与は腫瘍接種日をDay0として、 Day 7、14、21の計３回行った。Day0からDay27の期間、腫瘍径を測定した。抗腫瘍効果の評価は、実施例５と同様に、腫瘍体積の算出値をもとに行った。
【0085】
結果を図１８に示す。週１回の投与で、Day18以降、B. longum 420とコレラトキシンの併用により、PBS群と比較して有意な抗腫瘍効果を認めた（p<0.05）。なお、腫瘍未接種のマウスに同様の経口投与を行った結果、コレラトキシン併用群で平均体重は他の群と同様に推移した（図１８右）。投与による下痢、行動不良等の副作用は見られなかった。コレラトキシンとの併用により、低頻度の投与で安全に抗腫瘍効果が増強可能であることがわかった。【0086】
（実施例７：各種粘膜免疫アジュバントによる、形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与の抗腫瘍効果への影響の確認）上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を、各種粘膜免疫アジュバントを使用して、マウスに経口投与したときの抗腫瘍効果を確認した。実験プロトコールは、図１９に示した。
6週齢メスC57BL/6Nマウスを次の５つの群（n=3）に分け、形質転換ビフィズス菌の経口投与を開始した：、B. longum 420 + 20 μg/dose LTB （Heat-Labile Enterotoxin B subunit（Sigma社））、B. longum 420 + 20 μg/dose MPLA（Monophosphoryl Lipid A（Sigma社）、B. longum 420 + 100 μg/dose Chitosan（Chitosan low molecular weight（Sigma社）、B. longum 420 + 10 μg/dose CpG 1585（Invivogen社）、PBS。
各ビフィズス菌投与液6.4×109 CFU/200 μL またはPBS 200 μLを、ゾンデを用いてマウスに経口投与した。Day 49にC1498-WT1細胞を右背側に皮下接種し、Day76までの期間、腫瘍径を測定した。抗腫瘍効果の評価は、実施例６と同様に腫瘍体積の算出値をもとに行った。
【0087】
結果を図２０に示す。Day 67において、全てのアジュバント併用群の腫瘍増殖は、PBS投与群と比較して有意に抑制された（p<0.05）。Day70ではLTB及びChitosan併用群において、Day73ではLTB、ChitosanおよびCpG1585併用群において、PBS群に対して有意な腫瘍抑制が認められた（p<0.05） 。形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質経口投与により、予防的な抗腫瘍効果を示すことがわかった。なお、Day0からDay49の経口投与期間中、全てのアジュバント併用群で平均体重はPBS群と同様に推移した。投与による下痢、行動不良等の副作用は認められなかった。【0088】
（実施例８：GL-BP-WT1表層提示ビフィズス菌の作製２）Ａ．GL-BP遺伝子の単離、Ｂ．単離したGL-BP遺伝子を有するpMW118プラスミドの構築は、実施例１と同様の手法により行った。
【0089】
Ｃ．WT1遺伝子の単離ヒトWT1の117番目から439番目までのアミノ酸配列をコードするDNA（配列番号１５）を全合成した（フナコシ株式会社）。なお、合成の際にはビフィズス菌において使用頻度の高いコドンを用いた。また、N末端側にはXhoI認識配列（CTCGAG：配列番号５）を、C末端側には終止コドンおよびそれに引き続いてSphI認識配列（GCATGC：配列番号６）を付加した。これをpUC18ベクターのSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（42℃、30秒）にて大腸菌DH5α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地（Difco社製）に塗布し、37℃にて一晩培養し、ヒトWT1タンパク質(117〜439)をコードするDNAを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行った。
【0090】
合成したヒトWT1遺伝子の配列（配列番号１５）CCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGGCGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCACCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCATGACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAGTCGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACTCCACCGGCTACGAGTCCGACAACCACACCACGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCCCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCCCAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAA
【0091】
またヒトWT1の117番目から439番目までのアミノ酸配列において、HLA-A*2402拘束性CTLエピトープにM236Yの置換を導入したアミノ酸配列を有する変異型WT1タンパク質をコードするDNAを、上述と同様にして全合成して、組換えプラスミドを作製した。【0092】
合成したヒトWT1遺伝子の配列（配列番号１７）CCGTCCCAGGCGTCGTCGGGCCAGGCGAGGATGTTCCCGAACGCGCCCTACCTGCCCAGCTGCCTGGAGTCCCAGCCGGCGATCCGCAACCAGGGCTACTCCACCGTGACGTTCGACGGCACCCCGTCCTACGGCCACACGCCCAGCCACCACGCCGCCCAGTTCCCGAACCACAGCTTCAAGCACGAAGACCCCATGGGCCAGCAGGGCAGCCTCGGCGAACAGCAGTACAGCGTGCCGCCGCCGGTCTACGGCTGCCACACCCCGACCGACTCCTGCACGGGCTCCCAGGCCCTGCTCCTGCGTACGCCGTACTCCTCCGACAACCTCTACCAGATGACCTCCCAGCTGGAGTGCTACACCTGGAACCAGATGAACCTGGGCGCCACGCTGAAGGGAGTCGCCGCGGGGTCGTCGAGCTCCGTCAAGTGGACCGAAGGCCAGTCCAACCACTCCACCGGCTACGAGTCCGACAACCACACCACGCCGATCCTGTGCGGAGCCCAGTACCGCATCCACACGCACGGCGTCTTCCGCGGCATCCAGGACGTCCGGCGCGTCCCCGGCGTCGCGCCGACCCTGGTGCGGTCCGCCTCCGAGACCTCCGAGAAGCGCCCGTTCATGTGCGCCTACCCGGGCTGCAACAAGCGCTACTTCAAGCTCTCGCACCTGCAGATGCACTCCCGGAAGCACACCGGCGAGAAGCCGTACCAGTGCGACTTCAAGGACTGCGAACGCCGCTTCTCGCGCAGCGACCAGCTGAAGCGCCACCAGCGTAGGCACACCGGCGTGAAGCCCTTCCAGTGCAAGACCTGCCAGCGCAAGTTCTCCCGCAGCGACCACCTCAAGACGCACACCCGCACCCACACCGGCAAGACGTCCGAGAAGCCGTTCTCGTGCCGCTGGCCCAGCTGCCAGAAGAAGTTCGCCCGCAGCGACGAGCTCGTGCGCCACCACAACATGCACCAGTGAA
【0093】
Ｄ．GL-BP遺伝子の下流にWT1遺伝子を有するプラスミドの構築、Ｅ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターの構築、Ｆ．大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターpJW241へのGL-BP遺伝子とWT1遺伝子とが連結された遺伝子の組込み、Ｇ．宿主ビフィズス菌液の調製は実施例１と同様にして、２種類の形質転換ビフィズス菌を作製した。【0094】
図２１は、図２１右側に示す特異的プライマーを用いて、２種類の形質転換ビフィズス菌を遺伝子レベルで識別したことを示す図である。なお、430とはB. longum 430であり、ヒトWT1タンパク質(117〜439)をコードするDNAを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌である。440とはB. longum 440であり、アミノ酸置換M236YのあるヒトWT1タンパク質(117〜439)をコードするDNAを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌である。2012は、実施例１と同様にB. longum 2012であり、WT1をコードするDNAが挿入されていないGLBP遺伝子のみを挿入したシャトルベクターで形質転換したビフィズス菌である。430と示すプライマーはヒトWT1タンパク質(117〜439)をコードするDNAを増幅し、440と示すプライマーはアミノ酸置換M236YのあるヒトWT1タンパク質(117〜439)をコードするDNAを増幅する。【0095】
（実施例９：形質転換ビフィズス菌のGL-BP-WT1融合タンパク質表層提示の確認）上記実施例８で得た形質転換ビフィズス菌について、実施例２と同様の手法により、GL-BP-WT1融合タンパク質の表層発現を確認した。
【0096】
ウエスタンブロッティングの結果を図２２Ａ、蛍光免疫染色の結果を図２２Ｂに示した。図２２から明らかなように、B. longum 430及びB. longum 440には、B. longum 420と同様に、WT1とGL-BPの融合タンパク質の分子量の合計に相当する約82.5kDaのバンドが認められた。また、蛍光顕微鏡写真から、B. longum 430及びB. longum 440の細胞表面にWT1が存在することを確認した。したがって、形質転換ビフィズス菌が、GL-BP-WT1融合タンパク質を発現していることを確認した。【産業上の利用可能性】
【0097】
以上詳述したように、本発明の形質転換ビフィズス菌によれば、ビフィズス菌の細胞表層にWT1タンパク質を発現・提示することができる。ビフィズス菌の表層にWT1抗原タンパク質を提示させることにより、WT1タンパク質を発現する腫瘍に対して有効な経口ワクチンとして利用できる。経口ワクチンの場合、小児や高齢者でも摂取しやすく、また通常の注射によるワクチン接種に伴う痛みもない。特に、本発明の経口ワクチンは、食経験のあるビフィズス菌を使用するため、安全性が高い。また、本発明の抗原WT1タンパク質は、ある特定のHLAに拘束されるWT1ペプチドとは異なり、WT1の大部分の配列をカバーするWT1タンパク質を発現しうるビフィズス菌であり、当該形質転換ビフィズス菌を有効成分とする腫瘍ワクチンは様々なHLAタイプの患者に適応可能である。【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
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【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]