特許 6775223 蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6775223

(24)【登録日】2020年10月8日

(45)【発行日】2020年10月28日

(54)【発明の名称】蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20201019BHJP

   G01N 21/03 20060101ALI20201019BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20201019BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20201019BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/64 B

   G01N21/64 F

   G01N21/03 Z

   G01N37/00 101

   C12M1/34 B

【請求項の数】4

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2018-547122(P2018-547122)

(86)(22)【出願日】2017年7月20日

(86)【国際出願番号】JP2017026180

(87)【国際公開番号】WO2018078967

(87)【国際公開日】20180503

【審査請求日】2019年4月25日

(31)【優先権主張番号】特願2016-211121(P2016-211121)

(32)【優先日】2016年10月27日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000005049

【氏名又は名称】シャープ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】飯塚 邦彦

(72)【発明者】

【氏名】藤本 義久

(72)【発明者】

【氏名】金 秀▲弦▼

(72)【発明者】

【氏名】藤井 輝夫

【審査官】 吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０３４７８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５０４４７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５０３０２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０５５５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−３５０３４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０６６６８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Soo Hyeon Kim，Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules，Lab on a Chip，２０１２年１２月 ７日，Iss.23，PP.4986-4991

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／００−８３

３３／５４３

３７／００

Ｃ１２Ｍ １／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

検査対象に励起光を照射する励起用光源と、
フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、
上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層と、
保持された上記検査対象に上記励起用光源にて励起光を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光の消光後に、上記光子検知部にて検知させる制御部とを備え、
上記保持層の対向位置には、隔壁部を有する蓋が上記保持層の方向に向かって移動可能に設けられていると共に、上記蓋を移動して上記隔壁部を上記保持層に接触させることによって、上記隔壁部を有する蓋によって形成される凹部、及び上記保持層の貫通孔にて上記検査対象を隔離する隔離室が形成されることを特徴とする蛍光検査システム。

【請求項2】

検査対象に励起光を照射する励起用光源と、
フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、
上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層と、
保持された上記検査対象に上記励起用光源にて励起光を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光の消光後に、上記光子検知部にて検知させる制御部とを備え、
上記シリコン集積回路は、ヒーターと温度センサとを内蔵していることを特徴とする蛍光検査システム。

【請求項3】

請求項２に記載の蛍光検査システムを用いて、複数の隔離室にて並列的に遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする分子検査方法。

【請求項4】

検査対象に励起光を照射する励起用光源と、
フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、
上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層と、
保持された上記検査対象に上記励起用光源にて励起光を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光の消光後に、上記光子検知部にて検知させる制御部とを備え、
上記貫通孔は、上記フォトダイオードの上に、複数個設けられている蛍光検査システムを用いた蛍光検査方法であって、
励起光の照射中にフォトダイオードに入射する該励起光の光子を検知する光子検知工程と、
上記励起光を照射した後、上記検査対象から放射される蛍光を上記励起光の消光後に検知する蛍光検知工程と、
検査対象である生体又は非生体の微粒子を含む液体を上記蛍光検査システムの上に形成されたマイクロ流体路に流す流液工程と、
上記光子検知工程で検知された励起光の光子の情報に基づいて、フォトダイオードの上に形成されている貫通孔のうち、何個の貫通孔に上記微粒子が捕捉されているかを推定する推定工程とを含んでいることを特徴とする蛍光検査方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微小な生体又は非生体試料等の検査対象からの蛍光現象を観察することによって、特定の検査対象を検出する蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

従来、蛍光検査によって多数の細胞を一括して検査する手法として、例えば非特許文献１に開示された方法が知られている。

【0003】

非特許文献１に開示されたバイオ分子検出方法は、検体溶液を極めて多数の微小溶液に分割し、各微小溶液から出射される蛍光信号を２値化し、「検出バイオ分子が存在するか又は存在しないか」だけを判別して、検体溶液中のバイオ分子の分子濃度を推定する方法である。この方法は、既存のアナログ計測による方法と比較した場合、検出感度及び定量性の点で格段に優れている。

【0004】

しかしながら、各微小溶液から蛍光信号を検出するためには、蛍光顕微鏡を用いて、該蛍光信号を出力している微小溶液の数を数え上げることが必要である。そのため、装置が大型、複雑化するという課題がある。

【0005】

ところで、ＤＮＡ（deoxy ribo nucleic acid：デオキシリボ核酸）を高感度に検出するために、例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）により特定の遺伝子を増幅するＰＣＲ法がよく使われている。ＰＣＲで増幅したＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法等により定量化される。

【0006】

ＰＣＲ法を用いてＤＮＡ（deoxy ribo nucleic acid：デオキシリボ核酸）を高精度及び高感度に検出するために、例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載されているような、多数のチャンバーに試料溶液を分取して、各チャンバーにてＰＣＲを行い、ＰＣＲが確認されたチャンバー数から、試料中の初期ＤＮＡの分子数を推定するデジタルＰＣＲ法も使われている。

【0007】

デジタルＰＣＲ法は、多数のチャンバーでのＰＣＲ後の反応を確認することによって、ポジティブチャンバーの割合から、平均サンプル数を推定するものである。ポジティブ反応を示したチャンバーの全チャンバーに対する割合をｐとし、各チャンバーに初期状態で存在したＤＮＡの平均数をλとすると、平均数λは、ポワソン分布に基づいて、
λ＝−ｌｎ（１−ｐ）
となることが知られている。例えば、図８の（ａ）に示すように、９６個のチャンバーのうち、白丸以外がポジティブチャンバーであり、その数は９６−３５＝６１である。その結果、ｐ＝６１／９６＝０．６３５であり、図８の（ｂ）に示すように、１−ｐ＝３５／９６＝０．３６５である。

【0008】

この結果、例えば、λが７の場合、ネガティブセルの割合が０．１％未満となり、その数が有意に検出できるためには、数千個以上のセルが必要になる。１万セルを使った場合、推定できるλの上限は１０程度になる。それ以上のλに対しては、ネガティブセルの確率が有意に検出できなくなり、λの推定が不可能になる。

【0009】

一方、上記蛍光プローブ法を使うリアルタイムＰＣＲにおいては、蛍光を観測しながら増幅過程を進め、検出閾値への到達時間から初期サンプル数を推定するため、推定できるλの範囲を格段に広げることができる。ただし、その精度は、一般にデジタルＰＣＲと比較して劣る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Monya Baker, “Digital PCR hits its stride,” Nature Methods VOL.9,JUNE2012, P.541-544

【非特許文献2】野地博行,「バイオ分子の１分子デジタル係数法」、physics News, 2011, パリティ Vol27 No.01 2012-01,P.75-77

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

しかしながら、上記従来の非特許文献１・２に開示された蛍光検査システムでは、多数の微小検体からの蛍光信号を一括検出するデジタル計測において、蛍光顕微鏡を使用するので、蛍光検査システムが大型化、複雑化するという問題点を有している。

【0012】

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の一態様における蛍光検査システムは、上記の課題を解決するために、検査対象に励起光を照射する励起用光源と、フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層と、保持された上記検査対象に上記励起用光源にて励起光を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光の消光後に、上記光子検知部にて検知させる制御部とを備え、上記保持層の対向位置には、隔壁部を有する蓋が上記保持層の方向に向かって移動可能に設けられていると共に、上記蓋を移動して上記隔壁部を上記保持層に接触させることによって、上記隔壁部を有する蓋によって形成される凹部、及び上記保持層の貫通孔にて上記検査対象を隔離する隔離室が形成されることを特徴としている。

【0014】

本発明の一態様における分子検査方法は、上記の課題を解決するために、前記記載の蛍光検査システムを用いて、複数の隔離室にて並列的に遺伝子増幅反応を行うことを特徴としている。

【0015】

本発明の一態様における蛍光検査方法は、上記の課題を解決するために、検査対象に励起光を照射する励起用光源と、フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層と、保持された上記検査対象に上記励起用光源にて励起光を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光の消光後に、上記光子検知部にて検知させる制御部とを備え、上記貫通孔は、上記フォトダイオードの上に、複数個設けられている蛍光検査システムを用いた蛍光検査方法であって、励起光の照射中にフォトダイオードに入射する該励起光の光子を検知する光子検知工程と、上記励起光を照射した後、前記検査対象から放射される蛍光を上記励起光の消光後に検知する蛍光検知工程と、検査対象である生体又は非生体の微粒子を含む液体を上記蛍光検査システムの上に形成されたマイクロ流体路に流す流液工程と、上記光子検知工程で検知された励起光の光子の情報に基づいて、フォトダイオードの上に形成されている貫通孔のうち、何個の貫通孔に上記微粒子が捕捉されているかを推定する推定工程とを含んでいることを特徴としている。

【発明の効果】

【0016】

本発明の一態様によれば、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法を提供するという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の実施形態１における蛍光検査システムの構成を示すものであって、シリコン集積回路上のマイクロ流体路を検査対象を含む溶液が流れ、検査対象が、マイクロウェルに保持された状態を示す断面図である。

【図2】上記蛍光検査システムの一例の構成を示す断面図である。

【図3】本発明の実施形態２における蛍光検査システムの構成を示すものであって、蛍光検査システムの構成を示す断面図である。

【図4】上記蛍光検査システムを用いて検査対象を測定する状態を示すものであって、透明板が保持層側に移動して検査対象を隔離するマイクロチャンバーが形成された状態を示す断面図である。

【図5】本発明の実施形態３の蛍光検査システムを示すものであって、蛍光検査システムの構成を示す断面図である。

【図6】本発明の実施形態４の分子検査方法を示すものであって、蛍光検査システムの構成を示す断面図である。

【図7】（ａ）は本発明の実施形態５の蛍光検査システムを示すものであって、保持層を省略した蛍光検査システムの構成を示す平面図であり、（ｂ）は蛍光検査システムの構成を示すものであって、マイクロウェルの直下部を除く領域に遮光用メタルを配したシリコン回路基板を示す断面図である。

【図8】（ａ）（ｂ）は、従来のデジタルＰＣＲ法による試料中の初期ＤＮＡの分子数を推定する方法を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

〔実施の形態１〕
本発明の一実施形態について図１及び図２に基づいて説明すれば、以下のとおりである。

【0019】

（蛍光検査システムの構成）
本実施の形態の蛍光検査システムの構成について、図２に基づいて説明する。図２は、本実施の形態の蛍光検査システムの一例の構成を示す断面図である。

【0020】

本実施の形態の蛍光検査システム１は、図２に示すように、フォトダイオード１２により光を検知する光子検知部１３を備えたシリコン集積回路１０と、フォトダイオード１２上に検査対象としての例えばタンパク質を保持する保持層３０と、励起用光源２３と、励起用光源２３の発光動作と光子検知部１３の検知動作とを同期的に制御する制御部２４とを備えている。

【0021】

上記シリコン集積回路１０は、シリコン回路基板１１の上側に配線埋設層１５が積層されてなっている。

【0022】

シリコン回路基板１１には、フォトダイオード１２、及びフォトダイオード１２を用いて光を検知する光子検知部１３からなる回路が形成されている。フォトダイオード１２としては、例えば、シングル・フォトン・アバランシェ・ダイオード（ＳＰＡＤ）を用いることができる。

【0023】

上記配線埋設層１５には、図示しない配線が埋設されている。

【0024】

また、シリコン集積回路１０における配線埋設層１５の上側には、保持層３０が設けられており、保持層３０には貫通孔としてのマイクロウェル３１が設けられている。

【0025】

上記保持層３０は、例えば、ポリイミド、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）等の材料で形成されている。保持層３０は、不透明体であることが好ましい。

【0026】

上記マイクロウェル３１は、例えば水平断面が円形であると共に、縦断面は保持層３０において底部が狭まった逆円錐台の形状となっている。これによって、マイクロウェル３１には、数個の検査対象であるタンパク質が保持可能な容量となっている。

【0027】

次に、上記保持層３０の上方には蓋としての透明板２１が設けられており、その結果、保持層３０と透明板２１との間には流路であるマイクロ流体路２２が形成されている。このマイクロ流体路２２には、検査対象であるタンパク質が流されるようになっている。

【0028】

また、本実施の形態では、この透明板２１は、保持層３０側に移動するようになっている。

【0029】

上記透明板２１の上方には、上記励起用光源２３が設けられている。上記励起用光源２３は、フォトダイオード１２に向けて透明板２１を介して励起光を照射させる。励起用光源２３は、例えば、半導体発光素子（ＬＥＤ）や有機ＥＬ、半導体レーザ等の種々の光源を使用することができる。複数の光源を用いることも可能である。

【0030】

本実施の形態では、励起用光源２３により検査対象である例えばタンパク質に励起光を照射してタンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブから蛍光を放出させる。このため、励起用光源２３は、例えば紫外光、近紫外光又は可視光が使用されている。すなわち、蛍光は、紫外光、近紫外光又は可視光を吸収したタンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブの分子・イオンが励起され、次いで、その分子・イオンが中間励起状態に遷移し、そこから励起光よりも長波長の光を放出して基底状態に戻る現象である。したがって、励起用光源２３によりタンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブに照射される励起光の波長は、タンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブから放出される蛍光の波長よりも低波長の成分を含むことが要求される。

【0031】

制御部２４は、励起用光源２３の点滅と光子検知部１３の駆動とを制御する。

【0032】

ところで、従来のこの種の蛍光検査システムでは、励起光の波長と蛍光の波長とが異なることを利用して、光学的なフィルタにより両者を分離して、蛍光のみを検知していた。このため、組み込んだフィルタに適した蛍光物質しか検査に使えないということになり、蛍光の種類の適用範囲が限定されるという問題点を有していた。

【0033】

ここで、励起状態から基底状態に戻るまでの平均時間を蛍光寿命と呼ぶ。換言すれば、蛍光寿命は、蛍光強度が１／ｅに低下するのに要する時間である。尚、その時間を超えると蛍光が無くなるわけではない。実用的にはともかく、理論的には、励起光消光後に蛍光を検知することはいつでも可能である。実用的観点からは、励起光消光後、できるだけ早い時期に検知した方が蛍光が強いので検出し易くなる。目安としては、蛍光寿命の数倍の期間以内で検知することが望ましい。

【0034】

この結果、蛍光寿命を利用すると、励起光と蛍光とを波長により分離する光学フィルタを使わず、励起光の消光後に、放出される蛍光を観測することが可能になる。

【0035】

そこで、本実施の形態の制御部２４は、保持層３０のマイクロウェル３１に保持された検査対象としてのタンパク質に対して励起用光源２３に励起光を照射するように制御する。そして、その後、励起用光源２３の点灯を停止させる。次いで、光子検知部１３を駆動させて、検査対象としてのタンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブから放出される蛍光を測定させる。

【0036】

詳細には、制御部２４は励起用光源２３がパルス的に励起光を照射するように制御する。この励起光のパルスの消灯期間中に光子検知部１３を駆動させるように予め設定されている。この結果、光子検知部１３が駆動される期間は、検査対象であるタンパク質又はタンパク質に付加された蛍光プローブからの蛍光のみが放出されるので、光学フィルタを使わず、光子検知部１３は励起光消光後の蛍光を検知するものとなる。

【0037】

（蛍光検査システムの測定動作）
上記構成の蛍光検査システム１を用いて検査対象を測定する場合の具体的動作について、図１及び図２に基づいて説明する。図１は、本実施の形態における蛍光検査システム１において、シリコン集積回路１０上のマイクロ流体路２２を検査対象であるタンパク質、及びタンパク質に付加された蛍光プローブを含む溶液が流れ、タンパク質及び蛍光プローブが、マイクロウェル３１に保持された状態を示す断面図である。尚、本実施の形態では、検査対象が、例えば、蛍光プローブが付着した特定のタンパク質であるとして説明する。

【0038】

図２に示すように、配線埋設層１５とその上方に設けられた透明板２１との間のマイクロ流体路２２に検査対象である蛍光プローブが付加されたタンパク質を供給する。これによって、蛍光プローブが付加されたタンパク質が保持層３０のマイクロウェル３１に保持される。

【0039】

この状態から、図１に示すように、透明板２１を押し下げてマイクロウェル３１に蓋をしたチャンバーを形成する。これによって、蛍光プローブが付加された複数のタンパク質が保持層３０のマイクロウェル３１に充填された状態となる。

【0040】

次に、制御部２４は、励起用光源２３を点灯させ、一定期間後に消灯させ、その後、減衰しながら発光が継続している蛍光を検知するよう、光子検知部１３を駆動する。具体的には、励起用光源２３はマイクロウェル３１に向けて励起光Ｌ１をパルス的にオンオフして照射する。そして、励起用光源２３のオン期間において、測定対象である特定のタンパク質に付加された蛍光プローブは励起用光源２３からの励起光Ｌ１を吸収する。これにより、蛍光プローブは蛍光を放出する。このとき、励起光Ｌ１も照射されている。そこで、本実施の形態では、励起用光源２３は、パルス的に励起光Ｌ１を照射しているので、励起光Ｌ１が消光するときがある。これにより、励起光Ｌ１が消光しているときであって蛍光が継続している期間中に光子検知部１３が駆動され、光子検知部１３には蛍光のみが受光され、この蛍光のみを検出することができる。

【0041】

このように、本実施の形態の蛍光検査システム１では、検査対象である蛍光プローブが付加されたタンパク質に励起光Ｌ１を照射する励起用光源２３と、フォトダイオード１２により光を検知する光子検知部１３を備えたシリコン集積回路１０と、フォトダイオード１２上に設けられて蛍光プローブが付加されたタンパク質を保持する貫通孔としてのマイクロウェル３１を備えた保持層３０と、保持された蛍光プローブが付加されたタンパク質に励起用光源２３にて励起光Ｌ１を照射させ、蛍光プローブが付加されたタンパク質から放出される蛍光を励起光Ｌ１の消光後に、光子検知部１３にて検知させる制御部２４とを備えている。

【0042】

この結果、励起光Ｌ１の消光後では、蛍光のみが光子検知部１３にて検知される。したがって、励起光Ｌ１と蛍光とを光学的なフィルタにより分離することなく蛍光プローブ付加されたタンパク質から放出された蛍光のみを測定することができる。したがって、蛍光の種類に対応する光学的フィルタを使用する必要がなくなるので、蛍光検査システム１が複雑化するのを防止することができる。

【0043】

また、本実施の形態の蛍光検査システム１では、フォトダイオード１２による光子検知部１３をシリコン集積回路１０に集積し、フォトダイオード１２上に微小なマイクロウェル３１からなるチャンバーを構成し、チャンバーに保持した蛍光プローブが付加されたタンパク質からの蛍光信号の検出を自動化することができる。

【0044】

この結果、蛍光検査システム１を大型化及び複雑化させる蛍光顕微鏡や観察した蛍光像からの検出数の数え上げのための画像処理が不要になり、所望検査対象のカウント等のデジタル計測が容易にできるようになる。

【0045】

したがって、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システム１を提供することができる。

【0046】

〔実施の形態２〕
本発明の他の実施の形態について図３及び図４に基づいて説明すれば、以下のとおりである。尚、本実施の形態において説明すること以外の構成は、前記実施の形態１と同じである。また、説明の便宜上、前記の実施の形態１の図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。

【0047】

本実施の形態の蛍光検査システム２は、前記実施の形態１の蛍光検査システム１の構成に加えて、複数の第１光子検知部１３ａ及び第２光子検知部１３ｂを備えている点と、透明板４２が蓋部４２ａと隔壁部４２ｂとからなっている点と、保持層４０の一部が二酸化珪素（ＳｉＯ_２）で形成されている点が異なっている。

【0048】

（蛍光検査システムの構成）
本実施の形態の蛍光検査システム２の構成について、図３に基づいて説明する。図３は、本実施の形態における蛍光検査システム２の構成を示す断面図である。尚、図３においては、励起用光源２３及び制御部２４を省略している。

【0049】

本実施の形態の蛍光検査システム２は、図３に示すように、前記前記実施の形態１の蛍光検査システム１の構成に加えて、複数の第１光子検知部１３ａ及び第２光子検知部１３ｂをそれぞれ備えている。これにより、保持層４０には、第１光子検知部１３ａ及び第２光子検知部１３ｂの上方にそれぞれマイクロウェル４１・４１が形成されている。これにより、複数箇所の第１光子検知部１３ａ及び第２光子検知部１３ｂにて検査対象を同時に検査することが可能となる。尚、本実施の形態では、第１光子検知部１３ａ及び第２光子検知部１３ｂは２つとなっているが、必ずしもこれに限らず、より多くの複数とすることが可能である。

【0050】

また、保持層４０は、本実施の形態では、その一部が二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなっている。具体的には、保持層４０はフォトダイオード１２の近傍が二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなっている。これにより、保持層４０は蛍光以外の外光等の迷光を遮断して該迷光がフォトダイオード１２に入射するのを防止すると共に、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）は自家蛍光が少ないので、検査対象から放射される以外の蛍光がフォトダイオード１２に入射するのを防止することができる。

【0051】

また、本実施の形態では、保持層４０の上方に設けられた蓋としての透明板４２は、蓋部４２ａと隔壁部４２ｂとからなっている。この結果、蓋部４２ａと隔壁部４２ｂとによって、凹部としての窪み４２ｃが形成されている。そして、本実施の形態では、透明板４２は保持層４０に向けて移動可能となっている。この結果、後述する図４に示すように、透明板４２を移動して隔壁部４２ｂを保持層４０に接触させることによって、窪み４２ｃと保持層４０のマイクロウェル４１とによって検査対象を隔離する隔離室としてのマイクロチャンバー４３が形成されるようになっている。

【0052】

（蛍光検査システムの測定動作）
上記構成の蛍光検査システム２における測定動作について、図３及び図４に基づいて説明する。図４は、蛍光検査システム２用いて検査対象を測定する状態を示すものであって、透明板４２が保持層４０側に移動して検査対象を隔離するマイクロチャンバー４３が形成された状態を示す断面図である。尚、図４においては、励起用光源２３及び制御部２４を省略している。

【0053】

上記構成の蛍光検査システム２では、図３に示すように、配線埋設層１５とその上方に設けられた透明板４２との間のマイクロ流体路２２に図示しない検査対象である蛍光プローブが付加されたタンパク質を供給する。そして、この状態において、図４に示すように、透明板４２を押し下げて、隔壁部４２ｂの底面を、マイクロウェル４１が形成された２酸化珪素（ＳｉＯ２）からなる保持層４０に密着させる。これによって、窪み４２ｃとマイクロウェル４１とによって、マイクロチャンバー４３が形成される。この結果、マイクロチャンバー４３の内部に図示しない蛍光プローブが付加されたタンパク質が充填される。

【0054】

ここで、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなる保持層４０は、蛍光を発しないため、タンパク質に付加された蛍光プローブからの蛍光と混同する虞れがなく、蛍光検出の精度の向上が見込まれる。また、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなる保持層４０に深いマイクロウェル４１を形成するのは困難であるが、透明板４２の方に形成した窪み４２ｃと合わせて、マイクロチャンバー４３の深さを大きくすることが可能になる。

【0055】

このように、本実施の形態における蛍光検査システム２は、保持層４０の少なくとも一部は、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）を用いて形成されている。

【0056】

例えば、保持層４０が蛍光を発する物質で形成されている場合には、検査対象からの蛍光と保持層４０からの蛍光との両方がフォトダイオード１２に入射するので、検査対象からの蛍光の正確な検出ができなくなる。

【0057】

この点、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）は蛍光を発しないため、検査対象に含まれる蛍光からの蛍光と混同する虞れがなく、蛍光検出の精度の向上を図ることができる。

【0058】

また、本実施の形態における蛍光検査システム２は、隔壁部４２ｂを有する蓋としての透明板４２保持層４０の方向に向かって移動可能に設けられていると共に、透明板４２を移動して隔壁部４２ｂの底面を保持層４０に接触させることによって、隔壁部４２ｂを有する透明板４２によって形成される窪み４２ｃ、及び保持層４０のマイクロウェル４１にて検査対象を隔離する隔離室としてのマイクロチャンバー４３が形成される。

【0059】

これにより、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなる保持層４０に深いマイクロウェル４１を形成するのは困難であるが、保持層４０に対向する、隔壁部４２ｂを有する透明板４２によって形成される窪み４２ｃと合わせて、隔離室であるチャンバーとしてのマイクロチャンバー４３の深さを大きくすることが可能になる。

【0060】

〔実施の形態３〕
本発明のさらに他の実施の形態について図５に基づいて説明すれば、以下のとおりである。尚、本実施の形態において説明すること以外の構成は、前記実施の形態１・２と同じである。また、説明の便宜上、前記の実施の形態１・２の図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。

【0061】

本実施の形態の蛍光検査システム３では、前記実施の形態１・２の構成に加えて、シリコン集積回路１０には、ヒーター５２と温度センサ５３とが設けられている点が異なっている。

【0062】

（蛍光検査システムの構成）
本実施の形態の蛍光検査システム３の構成ついて、図５に基づいて説明する。図５は、本実施の形態の蛍光検査システム３の構成を示す断面図である。尚、図５においては、励起用光源２３及び制御部２４を省略している。

【0063】

本実施の形態の蛍光検査システム３は、図５に示すように、シリコン集積回路１０にヒーター５２と温度センサ５３とが内蔵されている。

【0064】

すなわち、マイクロチャンバー５１においてＰＣＲ（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いてＤＮＡ（deoxy ribo nucleic acid：デオキシリボ核酸）を増幅するためのＰＣＲサイクルは、マイクロチャンバー５１内の溶液を９４℃程度、６０℃程度、及び７２℃程度に設定する３つのサイクルが必要になる。

【0065】

そこで、本実施の形態の蛍光検査システム３では、シリコン集積回路１０内にヒーター５２と温度センサ５３とを組み込むことによって、マイクロチャンバー５１に含まれる試料溶液を含む限定された領域の温度制御を行うようになっている。この結果、従来のデバイスを含む環境温度を制御する場合と比較して、より高速に、正確な制御が可能になる。

【0066】

上記ヒーター５２は、例えば、抵抗素子に周期的に電圧を印加し、そのデューティを変更することによって、発熱量を制御するようになっている。

【0067】

（蛍光検査システムの測定動作）
本実施の形態の蛍光検査システム３による測定動作について、図５に基づいて説明する。

【0068】

まず、検査対象、ポリメラーゼ、プライマー、蛍光プローブを混釈した溶液をマイクロ流体路２２に流し、透明板２１にて蓋をして、マイクロチャンバー５１に蛍光プローブを付加した検査対象を保持する。この状態にて、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅を行う。

【0069】

具体的には、以下の工程を行う。

【0070】

（１）（熱変性）温度センサ５３にて温度をモニターしながらヒーター５２で加熱を行い、マイクロチャンバー５１内の溶液が９４℃程度になるように温度を制御する。これによって、ＤＮＡ二本鎖の熱変性が起こり、一本鎖に解離する。

【0071】

（２）（アニーリング）ヒーター５２の発熱量を下げて、マイクロチャンバー５１内の溶液温度を６０℃程度に下げる。これにより、プライマーが一本鎖ＤＮＡに結合する。

【0072】

（３）（伸長反応）ヒーター５２の発熱量を増やし、マイクロチャンバー５１内の溶液温度を７２℃程度に変更する。これにより、ポリメラーゼにより元のＤＮＡの塩基配列を基にして相補鎖が合成される。

【0073】

上記の（１）（２）（３）の一連の過程を繰り返すことによって、ＤＮＡが倍に増幅される。この一連の過程を一回のＰＣＲ増幅過程と呼ぶ。

【0074】

一回のＰＣＲ増幅過程を行う度に、実施の形態１の場合と同様に、蛍光検査を行い、それぞれのマイクロチャンバー５１の蛍光量が、予め定めた閾値を超えるまでに要したＰＣＲ増幅過程の数を計測する。

【0075】

一方、段階希釈したスタンダートサンプルに対して、ＰＣＲ増幅過程を繰り返し、一回毎の蛍光反応の強度を計測する。

【0076】

これにより、蛍光出力が閾値を超えるまでに要したＰＣＲ増幅過程数と初期ＤＮＡ数との関係が推定できる。

【0077】

最後まで反応がネガティブなマイクロチャンバー５１が、例えば１％以上存在するときは、ネガティブなマイクロチャンバー５１の割合をｎとして、
λ＝−ｌｎ（ｎ）
として、初期ＤＮＡ数λを推定する。

【0078】

全てのマイクロチャンバー５１がポジティブの場合、各マイクロチャンバー５１で推定された初期ＤＮＡ数の平均として初期ＤＮＡ数を推定する。

【0079】

通常のリアルタイムＰＣＲ法と比較して、本実施の形態の蛍光検査システム３では、多数のマイクロチャンバー５１での計測値を平均化するため、高精度に初期ＤＮＡ数を推定することが可能である。また、従来のデジタルＰＣＲ法と比較して、ネガティブチャンバーが無くても初期ＤＮＡ数の推定が可能であり、検査対応できるＤＮＡ濃度のレンジ（ダイナミックレンジ）を拡大することができる。

【0080】

このように、本実施の形態における分子検査方法は、蛍光検査システム１・２を用いて、複数のマイクロチャンバー５１にて並列的にポリメラーゼ連鎖反応等の遺伝子増幅反応を行う。

【0081】

この結果、通常の ポリメラーゼ連鎖反応等の遺伝子増幅反応を用いた特定の遺伝子を増幅する遺伝子増幅反応と比較して、多数のチャンバーでの計測値を平均化するため、初期ＤＮＡ数の推定を高精度に行うことが可能である。

【0082】

また、従来のデジタルＰＣＲ法と比較して、ネガティブチャンバーが無くても初期ＤＮＡ数の推定が可能である。この結果、検査対応できるＤＮＡ濃度のダイナミックレンジを拡大することができる。

【0083】

したがって、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システムを用いた分子検査方法を提供することができる。

【0084】

〔実施の形態４〕
本発明のさらに他の実施の形態について図６に基づいて説明すれば、以下のとおりである。尚、本実施の形態において説明すること以外の構成は、前記実施の形態１と同じである。また、説明の便宜上、前記の実施の形態１の図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。

【0085】

本実施の形態では、前記実施の形態１に示した蛍光検査システム１を用いて、特定タンパク質の検出及び定量を、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、より高感度、高精度に実施する分子検査方法について説明する。

【0086】

本実施の形態の分子検査方法について、図６に基づいて説明する。図６は、本実施の形態の分子検査方法を説明するための蛍光検査システム１の断面図である。

【0087】

本実施の形態の分子検査方法は、図６に示すように、実施の形態１に示した蛍光検査システム１を用いる。

【0088】

具体的には、捕捉抗体を付けたマイクロビーズと検出抗体とを混釈し、捕捉されたターゲット分子にさらに検出抗体を結合させる。検出抗体は、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ：Alkaline Phosphatase）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：peroxidase）、βガラクトシダーゼ等の酵素標識で予め標識されている。

【0089】

この溶液をマイクロ流体路２２に流し、次に、マイクロ流体路２２に図示しない蛍光基質を流すと、酵素標識と反応して図示しない蛍光物質が生成される。次に、マイクロ流体路にオイルを流すと、マイクロウェル３１がオイル層により蓋をされ、各マイクロウェル３１が独立したマイクロチャンバーを形成する。その結果、ターゲット分子を捕捉しているマイクロビーズが捕捉されているマイクロチャンバー下部のフォトダイオード１２からは蛍光が検知され、蛍光検知されたフォトダイオードでの光量数から、ターゲット分子の数が推定される。

【0090】

蛍光物質の生成がマイクロチャンバーの限られた領域で行われるため、蛍光がフォトダイオード１２の上に集中して発生し、数少ないターゲット分子でも検出が可能になる。

【0091】

従来、このような分子検査方法は、蛍光顕微鏡を用いて行われていたが、本実施の形態によれば、蛍光顕微鏡及びその撮像画像を画像処理する必要がない。そのため、蛍光基質と酵素標識との反応により、蛍光物質が生成されていく過程において、蛍光が増加していく様子をリアルタイムで観測することもでき、蛍光検知されたフォトダイオード１２の数だけでなく、蛍光量が予め定めた閾値を超えた時刻を計測することができる。これにより、各マイクロチャンバーに捕捉されたターゲット分子の量が推定でき、ターゲット分子の濃度のより正確な推定が可能となる。

【0092】

このように、本実施の形態における分子検査方法は、捕捉抗体を付けたマイクロビーズと検出抗体とを混釈し、捕捉されたターゲット分子にさらに検出抗体を結合させ、そのマイクロビーズを含む溶液を蛍光検査システム１に設けられたマイクロ流体路２２に流す第１工程と、マイクロ流体路２２に蛍光基質を流す第２工程と、マイクロ流体路にオイルを流す第３工程と、蛍光基質が酵素標識と反応して生成された蛍光物質を、蛍光検査システム１により検出する第４工程とを含む。

【0093】

この結果、特定タンパク質の検出及び定量を、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、より高感度、高精度に実施する分子検査方法を提供することができる。さらに、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システムを用いた分子検査方法を提供することができる。

【0094】

〔実施の形態５〕
本発明のさらに他の実施の形態について図７に基づいて説明すれば、以下のとおりである。尚、本実施の形態において説明すること以外の構成は、前記実施の形態４と同じである。また、説明の便宜上、前記の実施の形態４の図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。

【0095】

本実施の形態の蛍光検査システム４及び蛍光検査方法は、前記実施の形態１〜４の蛍光検査システム１〜３と同様に、励起光の消光後に蛍光を検知するという構成及び工程を備えている。その上で、本実施の形態の蛍光検査システム４及び蛍光検査方法は、さらに、新たに、励起光の照射中にフォトダイオード１２に入射する励起光の光子を検知する構成及び工程を備えている点が異なっている。

【0096】

本実施の形態の蛍光検査システム４について、図７の（ａ）（ｂ）に基づいて説明する。図７の（ａ）は、本実施の形態の蛍光検査システム４を示すものであって、保持層６０を省略した蛍光検査システム４の構成を示す平面図である。図７の（ｂ）は、蛍光検査システム４の構成を示すものであって、マイクロウェル６１の直下部を除く領域に遮光用メタル６２を配したシリコン回路基板１１を示す断面図である。

【0097】

本実施の形態の蛍光検査システム４は、図７の（ａ）（ｂ）に示すように、各フォトダイオード１２の上に複数のマイクロウェル６１が形成される。マイクロウェル６１のサイズは、実施の形態４で説明したマイクロビーズが、一個は捕捉され得るが、複数個が捕捉されることは困難であるようなサイズとなっている。

【0098】

また、本実施の形態の蛍光検査システム４では、フォトダイオード１２の上に、貫通孔としてのマイクロウェル６１の直下部を除いて、遮光用の金属層としての遮光用メタル６２が形成されている。

【0099】

本実施の形態における蛍光検査システム４及びそれを用いた蛍光検査方法は、励起光の消光後に蛍光を検知するという構成及び工程に加えて、新たに、励起光の照射中にフォトダイオード１２に入射する励起光の光子を検知する光子検知工程を有している。

【0100】

すなわち、本実施の形態では、一個のマイクロビーズを捕捉するマイクロウェル６１が複数形成されており、マイクロウェル６１以外は、遮光用メタル６２にて遮光されている。このため、フォトダイオード１２の上に存在する複数のマイクロウェル６１の一部にマイクロビーズが捕捉されていれば、その一部のマイクロウェル６１では、励起光がマイクロビーズにより遮光される。

【0101】

その結果、励起光の照射中に、光子検知部１３で励起光の光子を検知すると、マイクロビーズが捕捉されるマイクロウェル６１が増加することによって、フォトダイオード１２に入射する光子数が少なくなる。

【0102】

ここで、本実施の形態では、マイクロウェル６１の直下以外の部分を遮光しているので、フォトダイオード１２への入射光は全て、マイクロウェル６１を通過してフォトダイオード１２に入ることになる。そして、複数のマイクロウェル６１のうち、マイクロビーズを捕捉しているマイクロウェル６１の占める割合と入射光の光子数とは強い相関がある。この結果、励起光の入射光量を測定することによって、各フォトダイオード１２上のマイクロウェル６１のうち、マイクロビーズを捕捉しているマイクロウェル６１の割合を推定することができる。

【0103】

前記実施の形態４で説明したターゲット分子推定方法においては、検知され得る最小のターゲット濃度は、分子検査システムにおいて検査できる総マイクロビーズ数で決まる。

【0104】

すなわち、前記実施の形態４で説明したターゲット分子推定方法においては、図６に示すように、マイクロウェル３１のマイクロチャンバー内に、ターゲット分子を捕捉しているマイクロビーズ及びターゲット分子を捕捉していないマイクロビーズが捕捉される。そして、蛍光検知されたフォトダイオードでの光量数から、ターゲット分子の数が推定される。したがって、マイクロチャンバーに捕捉されたマイクロビーズの数が多いほど、検知され得る最小のターゲット濃度は、小さくなる。つまり、小さい濃度のターゲット分子を測定することが可能となる。

【0105】

例えば、検査可能な総ビーズ数が１万個であれば、１万個のうちの一つのマイクロビーズで捕捉されたターゲット分子が検知され得る。一方、総ビーズ数が１０万個であれば、１０万個のうちの一つのマイクロビーズで捕捉されたターゲット分子が検知され得る。したがって、小さい濃度のターゲット分子を測定することが可能となる。

【0106】

ここで、検知されたターゲット分子の濃度の定量化のためには、実際に検査したマイクロビーズの総数を算出することが必要になる。例えば、検査可能な総マイクロビーズ数が１万個であっても、実際に捕捉されていたマイクロビーズ数が１０００個であり、そのうち１個のマイクロビーズを捕捉したマイクロチャンバーから蛍光が検出される場合がある。その場合には、マイクロビーズ１０００個のうち、一つがターゲット分子を捕捉したことを示す濃度となる。しかし、その濃度は、１万個のマイクロビーズのうちの一つがターゲット分子を捕捉したことを示す濃度とは異なる。

【0107】

本実施の形態においては、マイクロウェル６１の大きさをマイクロビーズが一つだけ捕捉されるように最適化すると共に、フォトダイオード１２に入射する励起光の光量を測定している。そして、この構成によって、フォトダイオード１２上のマイクロウェル６１のうち、マイクロビーズを捕捉しているマイクロウェル６１の割合を推定できるようにしている。これにより、各フォトダイオード１２上に捕捉されているマイクロビーズの数を推定し、検査している総マイクロビーズの数を推定することができる。これにより、検査の定量化を高めることが可能となる。

【0108】

また、本実施の形態においては、各フォトダイオード１２上に複数のマイクロウェル６１を形成することによって、検査可能な総マイクロビーズの数を増やすことができる。このことは、検出可能なターゲット分子濃度を低くすることにつながる。

【0109】

このように、本実施の形態における蛍光検査システム４では、貫通孔としてのマイクロウェル６１は、フォトダイオード１２の上に、複数個設けられている。尚、各マイクロウェル６１は、１個の検査対象を保持ずる大きさを有することが好ましい。

【0110】

これにより、マイクロウェル６１に保持する検査対象の個数を増加することができ、検出可能なターゲット濃度を低くすることが可能となる。特に、各マイクロウェル６１が１個の検査対象を保持ずる大きさを有することによって、正確な検査対象の濃度を求めることが可能となる。

【0111】

また、本実施の形態における蛍光検査システム４は、フォトダイオード１２の上に、マイクロウェル６１の直下部を除いて、遮光用の金属層としての遮光用メタル６２が形成されている。

【0112】

これにより、フォトダイオード１２への入射光を、マイクロウェル６１を通過した励起光Ｌ１のみとすることが可能となる。この結果、外部からの迷光がフォトダイオード１２に入射されるのを防止することができる。

【0113】

また、本実施の形態雄における蛍光検査方法は、本実施の形態の蛍光検査システム４を用いた蛍光検査方法であって、励起光Ｌ１の照射中にフォトダイオード１２に入射する励起光Ｌ１の光子を検知する光子検知工程と、励起光Ｌ１を照射した後、検査対象から放射される蛍光を励起光Ｌ１の消光後に検知する蛍光検知工程とを含む。

【0114】

これにより、蛍光検知工程によって、励起光Ｌ１と蛍光とを光学的なフィルタにより分離することなく検査対象から放出された蛍光のみを測定することができる。

【0115】

また、本実施の形態では、マイクロウェル６１は、フォトダイオード１２の上に、複数個設けられている。このため、マイクロウェル６１に検査対象が保持されている場合には、励起光Ｌ１の光子は検査対象によって遮蔽される一方、マイクロウェル６１に検査対象が保持されていない場合には、励起光Ｌ１の光子がフォトダイオード１２に入射される。この結果、励起光Ｌ１の照射中にフォトダイオード１２に入射する励起光Ｌ１の光子を検知する光子検知工程を設けることによって、検査対象の個数を推定することが可能となる。

【0116】

また、本実施の形態における蛍光検査方法は、検査対象である生体又は非生体の微粒子を含む液体を蛍光検査システム４の上に形成されたマイクロ流体路２２に流す流液工程と、光子検知工程で検知された励起光Ｌ１の光子の情報に基づいて、フォトダイオード１２の上に形成されているマイクロウェル６１のうち、何個のマイクロウェル６１に微粒子が捕捉されているかを推定する推定工程とを含んでいる。

【0117】

これにより、推定工程によって、光子検知工程で検知された励起光Ｌ１の光子の情報に基づいて、フォトダイオード１２の上に形成されているマイクロウェル６１のうち、何個のマイクロウェル６１に微粒子が捕捉されているかを推定することが可能となる。

【0118】

したがって、検査対象の正確な濃度を求めることが可能となる。

【0119】

〔まとめ〕
本発明の態様１における蛍光検査システム１〜４は、検査対象に励起光Ｌ１を照射する励起用光源２３と、フォトダイオード１２により光を検知する光子検知部１３を備えたシリコン集積回路１０と、上記フォトダイオード１２上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔（マイクロウェル３１・４１・６１）を備えた保持層３０・４０・６０と、保持された上記検査対象に上記励起用光源２３にて励起光Ｌ１を照射させ、上記検査対象から放出される蛍光を上記励起光Ｌ１の消光後に、上記光子検知部１３にて検知させる制御部２４とを備えていることを特徴としている。

【0120】

上記発明の態様によれば、蛍光検査システムは、検査対象に励起光を照射する励起用光源と、フォトダイオードにより光を検知する光子検知部を備えたシリコン集積回路と、上記フォトダイオード上に設けられて上記検査対象を保持する貫通孔を備えた保持層とを備えている。

【0121】

従来のこの種の蛍光検査システムでは、励起光の波長と蛍光の波長とが異なることを利用して、光学的なフィルタにより両者を分離して、蛍光のみを検知していた。このため、組み込んだフィルタに適した蛍光物質しか検査に使えないということになり、蛍光の種類の適用範囲が限定される欠点があった。

【0122】

ここで、蛍光とは、紫外光又は可視光等を吸収した分子・イオンが励起され、その後、中間励起状態に遷移し、そこから励起光よりも長波長の光を放出して基底状態に戻る現象であり、励起状態から基底状態に戻るまでの平均時間を蛍光寿命と呼ぶ。このため、蛍光寿命を利用すると、励起光と蛍光とを波長により分離する光学フィルタを使わず、励起光の消光後に、放出される蛍光を観測することが可能になる。

【0123】

そこで、本発明では、蛍光を発する検査対象を検出する場合には、検査対象に励起用光源にて励起光を照射させ、検査対象から放出される蛍光を励起光の消光後に、光子検知部にて検知させる。

【0124】

この結果、励起光の消光後では、蛍光のみが光子検知部にて検知される。したがって、励起光と蛍光とを光学的なフィルタにより分離することなく検査対象から放出された蛍光のみを測定することができる。したがって、蛍光の種類に対応する光学的フィルタを使用する必要がなくなるので、蛍光検査システムが複雑化するのを防止することができる。

【0125】

また、本発明の態様の蛍光検査システムでは、フォトダイオードによる光子検知部をシリコン集積回路に集積し、フォトダイオード上に微小な貫通孔からなるチャンバーを構成し、各チャンバーに保持した検査対象からの蛍光信号の検出を自動化することができる。

【0126】

この結果、蛍光検査システムを大型化及び複雑化させる蛍光顕微鏡や観察した蛍光像からの検出数の数え上げのための画像処理が不要になり、所望検査対象のカウント等のデジタル計測が容易にできるようになる。

【0127】

したがって、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システムを提供することができる。

【0128】

本発明の態様２における蛍光検査システム２は、態様１における蛍光検査システムにおいて、前記保持層４０の少なくとも一部は、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）を用いて形成されている。尚、少なくとも一部とは、保持層におけるフォトダイオード近傍の部分をいう。

【0129】

例えば、保持層が蛍光を発する物質で形成されている場合には、検査対象からの蛍光と保持層からの蛍光との両方がフォトダイオードに入射するので、検査対象からの蛍光の正確な検出ができなくなる。

【0130】

この点、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）は蛍光を発しないため、検査対象に含まれる蛍光からの蛍光と混同する虞れがなく、蛍光検出の精度の向上を図ることができる。

【0131】

本発明の態様３における蛍光検査システム２は、態様１又は２における蛍光検査システムにおいて、隔壁部４２ｂを有する蓋（透明板４２）が上記保持層４０の方向に向かって移動可能に設けられていると共に、上記蓋（透明板４２）を移動して上記隔壁部４２ｂを上記保持層４０に接触させることによって、上記隔壁部４２ｂを有する蓋（透明板４２）によって形成される凹部（窪み４２ｃ）、及び上記保持層４０の貫通孔（マイクロウェル４１）にて前記検査対象を隔離する隔離室（マイクロチャンバー４３）が形成されることが好ましい。

【0132】

これにより、二酸化珪素（ＳｉＯ_２）からなる保持層に深い貫通孔を形成するのは困難であるが、保持層に対向する隔壁部を有する蓋によって形成される窪みと合わせて、隔離室であるチャンバーの深さを大きくすることが可能になる。

【0133】

本発明の態様４における蛍光検査システム３は、態様１、２又は３における蛍光検査システムにおいて、前記シリコン集積回路１０は、ヒーター５２と温度センサ５３とを内蔵していることが好ましい。

【0134】

これにより、チャンバーに含まれる検査対象を含む限定された領域の温度制御が可能となる。この結果、従来のデバイスを含む環境温度を制御する場合と比較して、より高速に、正確な温度制御が可能になる。

【0135】

本発明の態様５における分子検査方法は、前記記載の蛍光検査システムを用いて、複数の隔離室にて並列的に遺伝子増幅反応を行うことを特徴としている。

【0136】

上記の発明の形態によれば、通常の遺伝子増幅反応を用いた特定の遺伝子を増幅する遺伝子増幅反応と比較して、多数のチャンバーでの計測値を平均化するため、初期ＤＮＡ数の推定を高精度に行うことが可能である。

【0137】

また、従来のデジタルＰＣＲ法と比較して、ネガティブチャンバーが無くても初期ＤＮＡ数の推定が可能である。この結果、検査対応できるＤＮＡ濃度のダイナミックレンジを拡大することができる。

【0138】

したがって、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システムを用いた分子検査方法を提供することができる。

【0139】

本発明の態様６における分子検査方法は、態様１における蛍光検査システム１を用いた分子検査方法であって、捕捉抗体を付けたマイクロビーズと検出抗体を混釈し、捕捉されたターゲット分子にさらに上記検出抗体を結合させ、そのマイクロビーズを含む溶液を態様１における蛍光検査システム１に設けられたマイクロ流体路２２に流す第１工程と、上記マイクロ流体路２２に蛍光基質を流す第２工程と、上記マイクロ流体路２２にオイルを流す第３工程と、上記蛍光基質が酵素標識と反応して生成された蛍光物質を上記蛍光検査システム１により検出する第４工程とを含む。

【0140】

これにより、特定タンパク質の検出及び定量を、従来のＥＬＩＳＡ法と比較して、より高感度、高精度に実施する分子検査方法を提供することができる。また、大型化及び複雑化を回避し得る蛍光検査システム１を用いた分子検査方法を提供することができる。

【0141】

本発明の態様７における蛍光検査システム４では、前記貫通孔（マイクロウェル６１）は、前記フォトダイオード１２の上に、複数個設けられている。尚、各貫通孔は、１個の検査対象を保持ずる大きさを有することが好ましい。

【0142】

これにより、貫通孔に保持する検査対象の個数を増加することができ、検出可能なターゲット濃度を低くすることが可能となる。特に、各貫通孔が１個の検査対象を保持ずる大きさを有することによって、正確な検査対象の濃度を求めることが可能となる。

【0143】

本発明の態様８における蛍光検査システム４は、前記フォトダイオード１２の上に、前記貫通孔（マイクロウェル６１）の直下部を除いて、遮光用の金属層（遮光用メタル６２）が形成されている。

【0144】

これにより、フォトダイオードへの入射光を、貫通孔を通過した励起光のみとすることが可能となる。この結果、外部からの迷光がフォトダイオードに入射されるのを防止することができる。

【0145】

本発明の態様９における蛍光検査方法は、前記記載の蛍光検査システム４を用いた蛍光検査方法であって、励起光Ｌ１の照射中にフォトダイオード１２に入射する該励起光Ｌ１の光子を検知する光子検知工程と、上記励起光Ｌ１を照射した後、前記検査対象から放射される蛍光を上記励起光Ｌ１の消光後に検知する蛍光検知工程とを含むことを特徴としている。

【0146】

これにより、蛍光検知工程によって、励起光と蛍光とを光学的なフィルタにより分離することなく検査対象から放出された蛍光のみを測定することができる。

【0147】

また、本発明の一態様では、貫通孔は、フォトダイオードの上に、複数個設けられている。このため、貫通孔に検査対象が保持されている場合には、励起光の光子は検査対象によって遮蔽される一方、貫通孔に検査対象が保持されていない場合には、励起光の光子がフォトダイオードに入射される。この結果、励起光の照射中にフォトダイオードに入射する該励起光の光子を検知する光子検知工程を設けることによって、検査対象の個数を推定することが可能となる。

【0148】

本発明の態様１０における蛍光検査方法は、前記記載の蛍光検査方法において、検査対象である生体又は非生体の微粒子を含む液体を前記蛍光検査システム４の上に形成されたマイクロ流体路２２に流す流液工程と、前記光子検知工程で検知された励起光Ｌ１の光子の情報に基づいて、フォトダイオード１２の上に形成されている貫通孔（マイクロウェル６１）のうち、何個の貫通孔（マイクロウェル６１）に前記微粒子が捕捉されているかを推定する推定工程とを含んでいることが好ましい。

【0149】

これにより、推定工程によって、光子検知工程で検知された励起光の光子の情報に基づいて、フォトダイオードの上に形成されている貫通孔のうち、何個の貫通孔に微粒子が捕捉されているかを推定することが可能となる。

【0150】

したがって、検査対象の正確な濃度を求めることが可能となる。

【0151】

尚、本発明は、上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。

【符号の説明】

【0152】

１〜４ 蛍光検査システム
１０ シリコン集積回路
１１ シリコン回路基板
１２ フォトダイオード
１３ 光子検知部
１３ａ 第１光子検知部
１３ｂ 第２光子検知部
１５ 配線埋設層
２１ 透明板（蓋）
２２ マイクロ流体路
２３ 励起用光源
２４ 制御部
３０ 保持層
３１ マイクロウェル（貫通孔）
４０ 保持層
４１ マイクロウェル（貫通孔）
４２ 透明板（蓋）
４２ａ 蓋部
４２ｂ 隔壁部
４２ｃ 窪み（凹部）
４３ マイクロチャンバー（隔離室）
５１ マイクロチャンバー（隔離室）
５２ ヒーター
５３ 温度センサ
６０ 保持層
６１ マイクロウェル（貫通孔）
６２ 遮光用メタル（遮光用の金属層）
Ｌ１ 励起光

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】