特許 6781549 Ｅｎｄｏ１８０産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6781549

(24)【登録日】2020年10月20日

(45)【発行日】2020年11月4日

(54)【発明の名称】Ｅｎｄｏ１８０産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/37 20060101AFI20201026BHJP

   A61K 8/368 20060101ALI20201026BHJP

   A61K 8/97 20170101ALI20201026BHJP

   A61K 31/192 20060101ALI20201026BHJP

   A61K 31/222 20060101ALI20201026BHJP

   A61K 36/53 20060101ALI20201026BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20201026BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201026BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20201026BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/37

   A61K8/368

   A61K8/97

   A61K31/192

   A61K31/222

   A61K36/53

   A61P17/00

   A61P43/00 111

   A61Q19/00

【請求項の数】2

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2016-9772(P2016-9772)

(22)【出願日】2016年1月21日

(65)【公開番号】特開2017-128538(P2017-128538A)

(43)【公開日】2017年7月27日

【審査請求日】2018年4月5日

【審判番号】不服2019-4707(P2019-4707/J1)

【審判請求日】2019年4月8日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】591082421

【氏名又は名称】丸善製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100108833

【弁理士】

【氏名又は名称】早川 裕司

(74)【代理人】

【識別番号】100162156

【弁理士】

【氏名又は名称】村雨 圭介

(74)【代理人】

【識別番号】100201606

【弁理士】

【氏名又は名称】田岡 洋

(72)【発明者】

【氏名】岩橋 弘恭

【合議体】

【審判長】 岡崎 美穂

【審判官】 齋藤 恵

【審判官】 佐々木 秀次

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−２９１９２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−１６２６１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２１２７７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２１２７７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２３９５４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−３３０２２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２５６２７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１００２３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−３１９１８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１８９７０３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１３／１８９６９４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Ｓｔｅｆａｎｉｅ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， Ｅｎｄｏ１８０， ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏａｇｅｄ ｓｋｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３年，Ｖｏｌ．７０，ｐ．４２−４８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC A61K8/00-8/99,31/00-33/44,36/00-9068

A61Q1/00-90/00

A23L5/40-49,31/00-33/29

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｊａｐｉｏ−ＧＰＧ／ＦＸ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ロスマリン酸を有効成分とすることを特徴とする、線維芽細胞におけるＥｎｄｏ１８０の産生を促進するために用いるＥｎｄｏ１８０産生促進剤。

【請求項2】

メリッサ抽出物を有効成分とすることを特徴とする、線維芽細胞におけるＥｎｄｏ１８０の産生を促進するために用いるＥｎｄｏ１８０産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｅｎｄｏ１８０産生促進剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

紫外線の長期曝露によって引き起こされる光老化では、真皮コラーゲン線維構造の量的、質的変化が確認され、シワ形成への関与が知られている。コラーゲン線維構造は繰り返し起こるコラーゲン線維の合成と分解の代謝バランスによって恒常性が維持されている。この分解過程には、マトリックスメタロプロテアーゼによるコラーゲンの断片化と、断片化されたコラーゲンの線維芽細胞への取り込み、分解が含まれている。このうちコラーゲン断片の細胞内への取り込みには膜タンパク質であるコラーゲンレセプター「Ｅｎｄｏ１８０」の関与が知られている（非特許文献１）。

【0003】

Ｅｎｄｏ１８０はマンノース受容体Ｃ２（ＭＲＣ２）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）およびＣＤ２８０としても知られる受容体で、コラーゲンなどの結合したリガンドをエンドソームにおける分解へと誘導する、リサイクルされるエンドサイトーシス受容体である。

【0004】

Ｅｎｄｏ１８０は、マクロファージマンノース受容体ファミリーであるマンノース受容体、ホスホリパーゼＡ２、およびＤＥＣ−２０５／ＭＲ６と相同性を共有する。Ｅｎｄｏ１８０は、原形質膜から、後期エンドソーム／リソソーム区画までではなく、リサイクリングエンドソームまでが標的とされるという点で、マンノース受容体のファミリーの中でも特殊であり、細胞遊走、および細胞内分解のためのコラーゲンの取り込みを促進することによって、細胞運動性および細胞外マトリックスの再構築において機能を果たす。

【0005】

また、ｕＰＡＲＡＰとして、ウロキナーゼ型プラスミン活性化因子（ｕＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）と三重複合体を形成し、プラスミノーゲンからのプラスミンの生成に関与する。

【0006】

Ｅｎｄｏ１８０は、細胞表面上のクラスリンで覆われたピット、およびエンドソームにおいて局在化する。線維芽細胞、内皮細胞、およびマクロファージにおいて主に発現される。組織としては肺、血管、骨および皮膚において、主に発現される（特許文献１参照）。

【0007】

一方、皮膚の真皮もコラーゲンに富む組織であるが、真皮中のコラーゲン線維のリモデリングにおけるＥｎｄｏ１８０の関与に関する報告は少ない。これまでに、光老化皮膚では線維芽細胞のＥｎｄｏ１８０発現低下と、それに伴う真皮マトリックスへの断片化コラーゲンを蓄積することが知られている（非特許文献２）。また、断片化コラーゲンによって線維芽細胞に酸化ストレスが誘導されることが知られている（非特許文献３）。さらに、紫外線によるＥｎｄｏ１８０発現低下メカニズムにケラチノサイトが産生するＩＬ−１αが関与していることも知られている（非特許文献４）。このことから紫外線の長期曝露によって引き起こされる光老化皮膚の形成にＥｎｄｏ１８０の関与が考えられる。そのメカニズムとして線維芽細胞のＥｎｄｏ１８０発現低下によって断片化コラーゲンの取り込みが抑えられることで、正常なコラーゲン線維構造の再生が障害され、また細胞周囲への断片化コラーゲンの蓄積によって線維芽細胞の機能障害を誘導することが考えられるため、Ｅｎｄｏ１８０発現低下はシワの形成に寄与する可能性が考えられる。

【0008】

従って、皮膚におけるＥｎｄｏ１８０発現を促進する物質はシワ形成を予防または改善することができると考えられる。

【0009】

そのため、Ｅｎｄｏ１８０発現の促進を高めるべく、例えばＥｎｄｏ１８０発現を促進することにより、光老化皮膚における線維芽細胞のＥｎｄｏ１８０発現を促進し、正常なコラーゲン線維構造の再生を促し、シワの形成を抑えることが考えられる。Ｅｎｄｏ１８０の発現を促進する成分として、カフェイン、トコフェロールや（−）カテキン（特許文献２参照）などが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特表２０１２−５２１２１７号公報

【特許文献2】独国特許出願公開第１０２０１２２１０３８４号明細書

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Georgia M. et al., Journal of Cell Science, 122, 4042-48 (2009)

【非特許文献2】Stefanie T. et al., Journal of Dermatological Science, 70, 42-48 (2013)

【非特許文献3】GJ. Fisher et al., The American Journal of Pathology, 174, 101-114 (2009)

【非特許文献4】第40回日本香粧品学会発表要旨 p.16

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、天然物由来の化合物の中からＥｎｄｏ１８０産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするＥｎｄｏ１８０産生促進剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記課題を解決するために、本発明のＥｎｄｏ１８０産生促進剤は、ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を配合することを特徴とする。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有させることにより、作用効果に優れたＥｎｄｏ１８０産生促進剤を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進剤は、ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。

【0016】

ロスマリン酸は、下記構造式（１）で表わされる化学構造を有し、ロスマリン酸を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。このようなロスマリン酸を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。ロスマリン酸を含有する植物としては、例えば、メリッサ（Melissa officinalis L.）等が挙げられる。

【0017】

【化1】

【0018】

カフェ酸は、下記構造式（２）で表わされる化学構造を有し、カフェ酸を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。このようなカフェ酸を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。カフェ酸を含有する植物としては、例えば、メリッサ（Melissa officinalis L.）等が挙げられる。

【0019】

【化2】

【0020】

メリッサ（Melissa officinalis L.）は、ヨーロッパ全土、中央アジア、北アメリカ等に分布するシソ科の多年生草本であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得るメリッサの構成部位としては、例えば、葉部、茎部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部及び／又は茎部である。

【0021】

前記、抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。なお、前記ロスマリン酸およびカフェ酸もしくはメリッサからの抽出物には、ロスマリン酸およびカフェ酸もしくはメリッサからの抽出物、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。

【0022】

前記抽出原料であるメリッサの葉部及び／又は茎部は、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。前記メリッサは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。なお、脱脂等の前処理を行うことにより、メリッサの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。

【0023】

前記抽出に用いる溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。

【0024】

前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

【0025】

前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部添加することが好ましい。

【0026】

本発明において、抽出原料であるメリッサから、Ｅｎｄｏ１８０産生促進剤を有する物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。

【0027】

具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのメリッサの地上部を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、濾過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明のＥｎｄｏ１８０産生促進剤として用いることができる。

【0028】

得られるメリッサの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。

【0029】

なお、得られるメリッサの抽出液は、Ｅｎｄｏ１８０産生促進剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記メリッサの抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、美容用飲食品に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製としては、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。

【0030】

以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からロスマリン酸及びカフェ酸を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。

【0031】

以上のようにして得られるロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサの抽出物は、Ｅｎｄｏ１８０産生促進作用を有しており、これらの作用に基づいて、本発明のＥｎｄｏ１８０産生促進剤として使用することができる。

【0032】

なお、本実施形態においては、ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を上記有効成分として用いてもよいし、これらを混合して上記有効成分として用いてもよい。ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、ロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上が有するＥｎｄｏ１８０産生促進作用の程度等により適宜調整すればよい。

【0033】

本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物のみからなるものでもよいし、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物を製剤化したものでもよい。

【0034】

本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。Ｅｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、他の組成物（例えば、皮膚外用剤、美容用飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。

【0035】

本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤を製剤化した場合、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。

【0036】

なお、本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、必要に応じて、Ｅｎｄｏ１８０産生促進作用を有する他の天然抽出物等を、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物とともに配合して有効成分として用いることができる。

【0037】

本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤のヒトに対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。

【0038】

また、本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。

【0039】

また、本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、優れたＥｎｄｏ１８０産生促進作用を有するため、例えば、皮膚外用剤又は飲食品に配合するのに好適である。この場合に、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物をそのまま配合してもよいし、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物又はこれらの混合物から製剤化したＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤を配合してもよい。

【0040】

ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。

【0041】

飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品等を幅広く含むものである。

【0042】

なお、本実施形態のＥｎｄｏ１８０産生促進作用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。

【実施例】

【0043】

以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例においては、被験試料として、表１に示す製品（試料Ｎｏ．１〜３）を使用した。

【0044】

〔表１〕
試料Ｎｏ． 製品名 製造者名／販売者名
１ ロスマリン酸 和光純薬工業株式会社
２ カフェ酸 和光純薬工業株式会社
３ メリッサ抽出液ＢＧ−Ｊ凍結乾燥品 丸善製薬株式会社

【0045】

〔試験例１〕
−皮膚線維芽細胞におけるＥｎｄｏ１８０産生促進作用試験−
ヒト正常皮膚線維芽細胞 （ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０^５ ｃｅｌｌｓ/ｍＬの濃度に０．２５％ ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで希釈した後、６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌ当たり２ｍＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２ｍＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。

【0046】

調製した試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗Ｅｎｄｏ１８０抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。Ｅｎｄｏ１８０のタンパク質産生量は、被験試料添加および無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク中のＥｎｄｏ１８０由来のバンドのＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バンド強度）を、ＧＡＰＤＨ由来のバンドのＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙで割ることで、細胞あたりの補正値を算出した。Ｅｎｄｏ１８０産生促進率の計算方法は以下のとおりである。

【0047】

Ｅｎｄｏ１８０産生促進率（％）＝ Ａ／Ｂ×１００
Ａ ：被験試料添加時の細胞あたりのＥｎｄｏ１８０産生量
Ｂ ：被験試料無添加時の細胞あたりのＥｎｄｏ１８０産生量

【0048】

〔表２〕ＥＮＤＯ１８０産生促進率（％）
試料濃度（μｇ／ｍＬ）
１ １０
試料Ｎｏ．１ １１９．４％ １１４．３％
試料Ｎｏ．２ １２９．９％ １７４．６％

試料濃度（μｇ／ｍＬ）
５ ５０
試料Ｎｏ．３ １０５．４％ １２７．０％

【産業上の利用可能性】

【0049】

本発明のロスマリン酸、カフェ酸及びメリッサ抽出物から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するＥｎｄｏ１８０産生促進剤は、シワ形成の予防または改善に大きく貢献できる。