特許 6792347 ｐＨ応答性を有する脂質、およびリポソーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6792347

(24)【登録日】2020年11月10日

(45)【発行日】2020年11月25日

(54)【発明の名称】ｐＨ応答性を有する脂質、およびリポソーム

(51)【国際特許分類】

   C07J 9/00 20060101AFI20201116BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20201116BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201116BHJP

   A61K 8/63 20060101ALI20201116BHJP

   A61K 8/14 20060101ALI20201116BHJP

【ＦＩ】

   C07J9/00CSP

   A61K9/127

   A61K45/00

   A61K8/63

   A61K8/14

【請求項の数】6

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-88834(P2016-88834)

(22)【出願日】2016年4月27日

(65)【公開番号】特開2017-197463(P2017-197463A)

(43)【公開日】2017年11月2日

【審査請求日】2019年4月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(73)【特許権者】

【識別番号】000231497

【氏名又は名称】日本精化株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(74)【代理人】

【識別番号】100194803

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 理弘

(74)【代理人】

【識別番号】100202430

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 千香子

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 奈穂子

(72)【発明者】

【氏名】粂井 貴行

(72)【発明者】

【氏名】河野 健司

(72)【発明者】

【氏名】弓場 英司

(72)【発明者】

【氏名】山川 智史

(72)【発明者】

【氏名】清水 透

(72)【発明者】

【氏名】大橋 幸浩

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０６４６９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／１１８６１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 仏国特許出願公開第０２９０７４５５（ＦＲ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０４４３６２０１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３８１６２０７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２００８−０００３１７７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１０−００２４０５０（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Molecules，２０１４年，１９，１３１７７−１３１８７

【文献】 Tetrahedron Lett.，２００７年，４８，８５６６−８５６９

【文献】 インド国特許出願第２２７４／ＭＵＭ／２０１０号

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｊ ９／００

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ８／１４

Ａ６１Ｋ ８／６３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（１）で表されるフィトステロールエステルおよびその塩。

【化1】

（式中、Ｒ^１は、フィトステロールからそれに結合する水酸基を除いて得られるフィトステロール残基であって、β−シトステロール、スチィグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロールのいずれかを示す。
Ｒ^２は、シクロヘキシレン基、またはメチルプロピレン基を示す。
ｎは、１〜３の整数を示す。）

【請求項2】

請求項１に記載のフィトステロールエステルが、脂質二重膜に担持されていることを特徴とするリポソーム。

【請求項3】

前記脂質二重膜を構成するリン脂質と前記フィトステロールエステルとの重量比が、５０：５０以上９９：１以下であることを特徴とする請求項２に記載のリポソーム。

【請求項4】

内部に薬効成分を包含することを特徴とする請求項２又は３に記載のリポソーム。

【請求項5】

請求項１に記載のフィトステロールエステルを含む皮膚外用剤。

【請求項6】

請求項２〜４のいずれかに記載のリポソームを含む皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐＨ応答性を有するフィトステロールエステル、およびこのフィトステロールエステルを含むリポソームに関する。

【背景技術】

【0002】

リポソームとはリン脂質からなる脂質二重膜の単層、または複数層からなるカプセル構造のことをいう。リン脂質の分子は松葉のような形をしていて、リン酸部分が親水性、脂肪酸エステル部分が疎水性という２つの性質を併せ持っているので、水に放たれると、疎水性の部分が内側に集まり、親水性の部分が外側に向くことで、球形のリポソームを形成する。リポソームは、水溶性の薬効成分をその親水性の部分に、油溶性の薬効成分をその疎水性の部分に閉じこめることができる。リポソームの脂質二重膜中には水相が閉じこめられており、この水相に薬剤を含ませ、目的病巣部位で薬剤を放出させる、ドラッグ・デリバリー・システムへの応用が主に医学の分野で注目されている。また、化粧品分野において、皮膚に塗布した時の環境の変化に応じて、有効成分を放出し、効果的に皮膚内に浸透させることができると期待されている。一般的に、環境応答性をコントロールする技術開発において、光、ＵＶ、湿度、圧力等が制御因子として知られているが、定量性に乏しいことに加え、これらの因子は安全性の面で化粧品への応用が困難であった。

【0003】

特許文献１では、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとがリポソーム膜に担持され、４０〜４５度程度に加熱すると内包物を放出する温度感受性リポソームが提案されている。特許文献２では、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種と、を含む、酸性ｐＨ環境下で内包物を保持し、塩基性ｐＨ環境下で内包物を放出するｐＨ応答性リポソームが提案されている。特許文献３では、ポリアクリル酸系共重合体を含む、特定の温度、ｐＨで親水性から疎水性へと相転移して、内包物を放出するリポソームが提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００６−３０６７９４号公報

【特許文献2】特開２０１０−２０９０１２号公報

【特許文献3】特開２０１５−２０９４９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、特定のｐＨで親水性−疎水性変化を起こすフィトステロールエステル、および、このフィトステロールエステルを含むことで、特定のｐＨで内包物を放出することのできるリポソームを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を解決するための手段は以下のとおりである。
１．下記一般式（１）で表されるフィトステロールエステルおよびその塩。

【化1】

（式中、Ｒ^１は、フィトステロールからそれに結合する水酸基を除いて得られるフィトステロール残基を示す。
Ｒ^２は、炭素数２以上６以下の直鎖、分岐、または環状の炭化水素基を示す。ただし、エーテル結合を含んでいてもよい。
ｎは、１〜３の整数を示す。）
２．前記一般式（１）において、Ｒ^２が、シクロヘキシレン基、メチルプロピレン基、またはエチレン基であることを特徴とする１．に記載のフィトステロールエステル。
３．１．又は２．に記載のフィトステロールエステルが、脂質二重膜に担持されていることを特徴とするリポソーム。
４．前記脂質二重膜を構成するリン脂質と前記フィトステロールエステルとの重量比が、５０：５０以上９９：１以下であることを特徴とする３．に記載のリポソーム。
５．内部に薬効成分を包含することを特徴とする３．又は４．に記載のリポソーム。
６．１．又は２．に記載のフィトステロールエステルを含む皮膚外用剤。
７．３．〜５．のいずれかに記載のリポソームを含む皮膚外用剤。

【発明の効果】

【0007】

本発明のフィトステロールエステルを脂質二重膜に担持させたリポソームは、特定のｐＨでリポソーム膜表面が親水性から疎水性へと相転移して変化することにより、リポソームの脂質二重膜が破壊されて内包物を放出させることができる。それゆえ、環境応答性因子として利用することができる。リポソームを構成するリン脂質の相転移温度の制御により、温度応答性を付与することもできる。本発明のリポソームは、特定のｐＨで、また、条件によっては、特定の温度、ｐＨで内包物を放出できるため、化粧料、皮膚外用剤、薬剤、生化学用試薬等に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】試験例４〜７で作成したリポソームのｐＨに対する放出率のグラフ。

【図2】試験例４及び７で作成したリポソームの温度に対する放出率のグラフ。

【図3】試験例１のリポソームで処置したＢ１６−Ｆ１０細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明のフィトステロールエステルは、下記一般式（１）またはその塩で表される。

【化1】

（式中、Ｒ^１は、フィトステロールからそれに結合する水酸基を除いて得られるフィトステロール残基を示す。
Ｒ^２は、炭素数２以上６以下の直鎖、分岐、または環状の炭化水素基を示す。ただし、エーテル結合を含んでいてもよい。
ｎは、１〜３の整数を示す。）

【0010】

式（１）中、Ｒ^１は、フィトステロール残基を表す。
フィトステロールとは、植物に含まれるステロールの総称であり、主な成分としてはβ−シトステロール、スチィグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等が知られている。本発明に使用されるフィトステロールとしては、これらに限定されず、植物から得られるステロールであれば特に制限することなく用いることができる。また、複数のフィトステロールの混合物でもよい。

【0011】

式（１）中、Ｒ^２は、炭素数２以上６以下の直鎖、分岐、または環状の炭化水素基を表す。ただし、エーテル結合を含んでいてもよい。
具体的には、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、エチレンオキシエチレン基、メチルメチレン基、ジメチルメチレン基、メチルプロピレン基、イソブチレン基、ｓ−ブチレン基、イソペンチレン基、ネオペンチレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基等が挙げられる。これらの中で、シクロヘキシレン基、メチルプロピレン基、エチレン基が好ましく、シクロヘキシレン基がより好ましい。

【0012】

式中、ｎは１〜３の整数を示し、好ましくは１である。
本発明のフィトステロールエステルの分子量は、４００以上６００以下がのぞましい。
本発明のフィトステロールエステルとしては、シクロヘキサンジカルボン酸フィトステリル、メチルグルタル酸フィトステリル、コハク酸フィトステリルが好ましい。

【0013】

本発明のフィトステロールエステルは、フィトステロールとポリカルボン酸無水物を、有機溶媒下で加熱しエステル化した後、水洗を行い、有機層を濃縮し、再結晶することにより得ることができる。
また、反応は溶媒非存在下でも行うことができ、酸性物質もしくはアルカリ性物質からなる反応触媒存在下でも行うことができる。
さらに、水洗工程では、必要に応じて、中和のために酸性物質もしくはアルカリ性物質を添加してもよい。
なお、本発明のフィトステロールエステルの製法は、この限りではない。

【0014】

本発明に使用されるポリカルボン酸無水物としては、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物、ピメリン酸無水物、スベリン酸無水物、ジグリコール酸無水物、ジメチルコハク酸無水物、メチルグルタル酸無水物、ジメチルグルタル酸無水物、シクロプロパンジカルボン酸無水物、シクロブタンジカルボン酸無水物、シクロペンタンジカルボン酸無水物、シクロヘキサンジカルボン酸無水物等が挙げられる。これらの中で、コハク酸無水物、メチルグルタル酸無水物、シクロヘキサンジカルボン酸無水物が好ましく、シクロヘキサンジカルボン酸無水物がより好ましい。

【0015】

本発明のフィトステロールエステルは、上記一般式（１）で表される化合物の塩であってもよい。塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム、アミン、塩基性アミノ酸等の有機塩基との塩が挙げられる。

【0016】

本発明のフィトステロールエステルは、特定のｐＨで、親水性から疎水性へと変化する。本発明のフィトステロールエステルを脂質二重膜に担持したリポソームは、特定のｐＨで、リポソーム膜に担持されたフィトステロールエステルが親水性から疎水性へと相転移することで、リポソームの脂質二重膜が破壊されて内包物を放出させることができ、環境応答性因子として応用可能である。

【0017】

「リポソーム」
本発明のフィトステロールエステルとリン脂質とから、リポソームを形成することができる。これは、本発明のフィトステロールエステルが、リポソームの脂質二重膜中の親油性部分に入り込むことができるためである。
ここで、本発明のリポソームとは、本発明のフィトステロールエステルがリポソームの脂質二重膜に担持されているものを意味する。本発明のフィトステロールエステルがリポソームに担持されているか否かは、ゲルろ過法、超遠心法、透析法等によりリポソームと本発明のフィトステロールエステルとを分離することができるか否かで判別することができる。

【0018】

本発明のリポソームは、リポソームの脂質二重膜を構成するリン脂質と本発明のフィトステロールエステルの重量比が５０：５０以上９９：１以下であることが好ましく、６０：４０以上８０：２０以下がより好ましい。リン脂質とフィトステロールエステルの重量比が９９：１よりフィトステロールエステルの比率が小さいと疎水性が弱いため、フィトステロールエステルをリポソームに含有させたときに脂質二重膜を壊す力が十分でない。リン脂質とフィトステロールエステルの重量比が５０：５０よりフィトステロールエステルの比率が大きいと親水性が高くなり、本発明のリポソームが凝集するのに必要なｐＨが低くなりすぎる。

【0019】

本発明のリポソームにおいて、リポソーム膜表面が親水性から疎水性に変化すると、脂質二重膜が破壊されてリポソームの内包物が放出される。そのため、本発明のリポソームは、皮膚外用剤、化粧料、食品、医薬品、生化学用試薬等への応用が可能である。

【0020】

リポソームの脂質二重膜が破壊される原理は以下のとおりである。
リポソームの水分散液において、リポソーム膜表面が親水性を維持できる条件下では、本発明のフィトステロールエステルはリポソームに担持された状態で水中に安定して存在する。この水分散液のｐＨを変化させて本発明のフィトステロールエステルが疎水性となると、水中でリポソームは不安定化し、凝集することにより、脂質二重膜が破壊される。なお、本発明のリポソームにおいて、フィトステロールエステルはリポソームに担持されているため、親水性−疎水性の変化によるリポソームの表面電荷の変化は、リポソームの脂質二重膜の表面近傍で起こる。そのため、本発明のリポソームの親水性−疎水性の変化は、リポソームのゼータ電位により定量することができる、

【0021】

本発明のリポソームを構成するリン脂質は、リポソームの膜脂質として通常用いられる両親媒性のリン脂質を用いることができる。このようなリン脂質としては、例えばホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリンなどのリン脂質が挙げられる。これらのリン脂質の構成脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられる。これらは単独でまたは２種以上組み合わせて使用できる。特に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが好ましい。

【0022】

ここで、リン脂質の性状は、アシル基を構成する脂肪酸により異なる。ホスファチジルコリンの場合、卵黄ホスファチジルコリンや大豆ホスファチジルコリンなどの不飽和脂肪酸を多く含むホスファチジルコリンはペースト状である。多価不飽和脂肪酸残基を有する非水添リン脂質は、空気に触れさせたり、光を当てたりすると、褐色を帯び、においが変化することがある。これは不飽和脂肪酸が空気中の酸素により酸化されるためである。リン脂質の酸化による変性を防ぐ目的で、リン脂質の精製段階で水素を添加し、不飽和脂肪酸残基を飽和脂肪酸残基へ変化させたものが水添リン脂質であり、水添リン脂質は、固形状である。

【0023】

本発明のリポソームを形成するリン脂質は、非水添リン脂質でもよく、水添リン脂質でもよく、これらを併用してもよい。水添リン脂質は、脂肪酸が二重結合を有さず柔軟であるため、非水添リン脂質より密に充填することでき、緻密な脂質二重膜を形成することができる。非水添リン脂質と水添リン脂質とは、その割合を特に制限することなく併用することができるが、通常、非水添リン脂質と水添リン脂質とのモル比が９９：１以上１：９９以下である。ここで、天然物由来であるリン脂質は、種々の化合物の混合物であるため、モル比は、主たる化合物の分子量を使用して算出する。

【0024】

さらに、本発明のリポソームにおいて、リン脂質の相転移温度（Ｔｃ）は、温度応答性にも影響を与える。使用するリン脂質は、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−８０８０（ＤＳＰＣ；Ｔｃ５５℃）、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−６０６０（ＤＰＰＣ；Ｔｃ４１℃）、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−４０６０（ＭＰＰＣ；Ｔｃ３５℃）、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−６０４０（ＰＭＰＣ；Ｔｃ２８℃）、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−４０４０（ＤＭＰＣ：Ｔｃ２３℃）、ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−８１８１（ＤＯＰＣ；Ｔｃ−２２℃）などを用いることができる。体温付近で、応答性を発揮させるためには、特にＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−４０４０（ＤＭＰＣ）が好ましい。

【0025】

本発明のリポソームには、ステロールを有していてもよい。ステロールは、脂質二重膜中に入り込み、脂質二重膜をゲルでも液晶でもない中間状態にする作用を有していることが知られている（参考文献：「リポソーム」南江堂）。ステロールは、非水添リン脂質からなる脂質二重膜に対しては、膜透過性や膜流動性を低下させ、水添リン脂質からなる脂質二重膜に対しては、その相転移を消失させ、膜流動性を高める作用を有する。

【0026】

本発明に用いるステロールとしては動物ステロール、植物ステロール（フィトステロール）、菌類ステロール等が挙げられる。動物ステロールとしては例えば、コレステロール、コレスタノール、７−デヒドロコレステロールが挙げられる。また、植物ステロール（フィトステロール）としてはシトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロール等が挙げられる。また、植物ステロールの水素添加物であるフィトスタノールが挙げられる。菌類ステロールとしては例えばエルゴステロールが挙げられる。
本発明に用いるステロールとして、市販品を用いることができる。例えば、タマ生化学株式会社製 フィトステロールＳ（フィトステロール）、日本精化株式会社製 コレステロールＪＳＣＩ（コレステロール）、コグニスジャパン株式会社製 ＧＥＮＥＲＯＬ １２２Ｎ（フィトステロール）、日本水産株式会社製 マリンコレステロール（コレステロール）等が挙げられる。

【0027】

水添リン脂質、フィトステロールのいずれか、または両方を配合することで脂質二重膜をより安定にすることができる。すなわち、これらを配合した脂質二重膜は、内包物の意図せぬ漏出が抑えられ、環境応答性をより鋭敏にすることができる。

【0028】

本発明のリポソームは、公知のリポソームの製造方法により製造することができる。公知のリポソームの製造方法としては、エクストルーダー法、超音波法、フレンチプレス法高圧乳化法などが挙げられる。高圧乳化機としてはプライミクス株式会社製 Ｔ．Ｋフィルミックス（薄膜旋回型高速ホモミキサー）、マイクロフルイディックス社製 マイクロフルイダイザー（超高圧ホモジナイザー）、吉田機械興業株式会社製 ナノヴェイタ（ナノマイザー）等を用いることができる。

【0029】

一例として、エクストルーダー法により本発明のリポソームを製造する方法について説明する。リポソームの脂質二重膜を構成するリン脂質とフィトステロールエステルとをクロロホルムなどの適当な有機溶媒に溶解させ、その溶液を容器内に入れる。次いで、エバポレーターを用いて有機溶媒を除去し、容器内壁面にリン脂質とフィトステロールエステルとからなる混合薄膜を形成する。
この混合薄膜は、さらに３〜１２時間程度真空乾燥して、有機溶媒を完全に除去することが好ましい。次いで、この容器内に緩衝液などの適当な溶液を投入し、超音波処理またはボルテックスミキサーなどを用いて強く撹拌して、混合薄膜を容器内壁面から剥離することによりリポソームを形成することができる。この緩衝液等の溶液に、薬効成分を含ませることで、リポソーム内に薬効成分を包含することができる。

【0030】

リポソームの粒径は、得られた分散液をエクストルーダーに通し、そのフィルター孔径を適宜設定することにより調節することができる。本発明のリポソームの粒径は特に制限されないが、通常、０．０５μｍ以上１００μｍ以下である。リポソームの粒径は、使用目的に応じて適宜調整すればよい。
本発明のリポソームは、上記の粒径の範囲内であれば、一層の脂質二重膜からなる単層リポソーム、または複数の脂質二重膜からなる多重層リポソームのいずれであってもよい。親油性の薬効成分は、脂質二重膜の膜中に包含されるため、親油性の薬効成分を多く包含させるには、多重層リポソームとすることが好ましい。

【0031】

上記のようにして得られたリポソーム分散液から、リポソームの脂質二重膜に担持されなかった本発明のフィトステロールエステルや、リポソーム内に包含されなかった薬効成分等は、ゲルろ過法、超遠心法、透析法などにより除去することができる。除去したい物質が電荷を有する場合には、イオン交換クロマトグラフィーを用いることもできる。

【0032】

上記のような方法により製造されるリポソームにおいて、本発明のフィトステロールエステルは、脂質二重膜中に担持され、親水基のカルボキシル基がリポソーム膜の外側表面又は内側表面に露出していると考えられる。

【0033】

リポソーム内に含ませる薬効成分としては、本発明のリポソームの製造を阻害しないものであれば特に限定されず、抗癌剤、プラスミド、タンパク質、酵素、保湿剤、抗炎症剤、ビタミン類、抗酸化剤、紫外線吸収剤、血行促進剤、創傷治癒剤、抗菌性物質、皮膚賦活剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、美白剤等を用いることができる。これら薬効成分としては、親水性、親油性のいずれでもよく、どちらも包含することができる。
親水性の薬効成分はリポソームの内部に、親油性の薬効成分はリポソームの脂質二重膜に包含される。

【0034】

本発明のリポソームは、特定の条件下で内包物を放出することができるため、いわゆるドラッグ・デリバリー・システムに用いることができ、皮膚外用剤、化粧料、食品、医薬品、生化学用試薬等に用いることができる。また、本発明のフィトステロールエステルはエモリエント剤としてそのまま、皮膚外用剤、化粧料、食品、医薬品、生化学用試薬等に用いることもできる。

【0035】

本発明の化合物は以下の方法で合成することができるが、合成方法はこの限りではない。
＜試験例１＞
「本発明のフィトステロールエステルの合成１」
・シクロヘキサン１，２−ジカルボン酸フィトステリルの合成
撹拌機、温度計、ガス導入管、冷却管を備えた、５００ｍｌの反応容器にシクロヘキサン１，２−ジカルボン酸無水物３０．０ｇ（０．１９ｍｏｌ）、フィトステロール（タマ生化学株式会社製、商品名：フィトステロールＳ）６６．３ｇ（０．１６ｍｏｌ）、トルエン２００ｇを入れ、窒素気流下、８時間還流反応させた。反応終了後、メチルエチルケトン１４．８ｇ、精製水６０．０ｇを加え、６０℃にて一時間撹拌した後、水層が中性になるまで水洗した。有機層を減圧下に濃縮し、へプタンを加えて再結晶し、シクロヘキサン１，２−ジカルボン酸フィトステリル５４．３ｇを白色結晶として得た（収率５９．５％）。

【0036】

＜試験例２＞
「本発明のフィトステロールエステルの合成２」
・３−メチルグルタル酸フィトステリルの合成
撹拌機、温度計、ガス導入管、冷却管を備えた、５００ｍｌの反応容器にメチルグルタル酸無水物２５．０ｇ（０．２０ｍｏｌ）、フィトステロール７３．６ｇ（０．１８ｍｏｌ）、トルエン２２０ｇを入れ、窒素気流下、８時間還流反応させた。反応終了後、メチルエチルケトン１６．０ｇ、精製水６５．０ｇを加え、６０℃にて一時間撹拌した後、水層が中性になるまで水洗した。有機層を減圧下に濃縮し、へプタンを加えて再結晶し、３−メチルグルタル酸フィトステリル６５．４ｇを白色結晶として得た（収率６２．５％）。

【0037】

＜試験例３＞
「本発明のフィトステロールエステルの合成３」
・コハク酸フィトステリルの合成
撹拌機、温度計、ガス導入管、冷却管を備えた、５００ｍｌの反応容器にコハク酸無水物２０．０ｇ（０．２０ｍｏｌ）、フィトステロール７３．６ｇ（０．１８ｍｏｌ）、トルエン２２０ｇを入れ、窒素気流下、８時間還流反応させた。反応終了後、メチルエチルケトン１５．７ｇ、精製水６５．０ｇを加え、６０℃にて一時間撹拌した後、水層が中性になるまで水洗した。有機層を減圧下に濃縮し、へプタンを加えて再結晶し、コハク酸フィトステリル６５．４ｇを白色結晶として得た（収率７１．４％）。

【0038】

＜試験例４＞
「本発明のリポソームの作成１」
ジミリストイルホスファチジルコリン（日油株式会社製、商品名：ＣＯＡＴ ＳＯＭＥ ＭＣ−４０４０、以下、ＤＭＰＣという。）１５．４５ｍｇと、試験例１で得たフィトステロールエステル８．６ｍｇを、クロロホルム、メタノールを２：１の体積比で混合してなる溶液３ｍＬに溶解させた。この溶液３ｍＬをなす型フラスコに採り、ロータリーエバポレーターによりクロロホルム・メタノール混合溶液を除去し、フラスコ内壁面にＤＭＰＣと試験例１のフィトステロールエステルからなる薄膜を形成した。

【0039】

蛍光物質であるカルセイン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）溶液（６３ｍＭ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ加え、バス型超音波照射装置により超音波を照射して、フラスコ内壁面から混合薄膜を剥離させ、蛍光液に混合薄膜を分散した。ＮａＯＨ及びＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調整した。この分散液を５０℃以上の条件下にて、エクストルーダーに孔径１００ｎｍの膜を挟み、リポソーム分散液を２５回通すことで、リポソームの粒径を１００ｎｍにそろえた。

【0040】

その後、Ｓｈｅｆａｄｅｘ Ｇ−５０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）をゲル、リン酸緩衝水溶液を移動相としたゲルろ過法で精製し、リポソームを得た。この精製により外水相から蛍光物質であるカルセイン、および遊離しているフィトステロールエステルを取り除くことができる。リン脂質と試験例１のフィトステロールエステルの重量比は６５：３５であり、モル比は６０：４０である。

【0041】

なお、上記した混合薄膜中のリン脂質量の定量は、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて、コリンオキシターゼ・ＤＡＯＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３，５−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ）法により行った。具体的には、リポソーム分散液、ブランク溶液、及び、リン脂質Ｃテストワコーに付属の標準溶液をそれぞれ発色溶液と混合し３７℃で５分間インキュベートし、各溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度を紫外・可視分光光度計（日本分光株式会社製、装置名：Ｖ−５６０）を用いて測定し、得られた吸光度からリポソーム分散液の濃度を決定した。
＜試験例５＞
「本発明のリポソームの作成２」
試験例１のフィトステロールエステルを試験例２のフィトステロールエステルに替えて、試験例２のフィトステロールエステルの使用量を８．２ｍｇとして、試験例４と同様にリポソームを調製した。
リン脂質と試験例２のフィトステロールエステルの重量比は６６：３４であり、モル比は６０：４０である。
＜試験例６＞
「本発明のリポソームの作成３」
試験例１のフィトステロールエステルを試験例３のフィトステロールエステルに替えて、試験例３のフィトステロールエステルの使用量を８．０ｍｇとして、試験例４と同様にリポソームを調製した。
リン脂質と試験例３のフィトステロールエステルの重量比は６７：３３であり、モル比は６０：４０である。

【0042】

＜試験例７＞
「リポソームの作成４」
試験例１のフィトステロールエステルをフィトステロール（商品名：フィトステロールＳ）に替えてフィトステロールの使用量を７．０ｍｇとして、試験例４と同様にリポソームを調製した。
リン脂質とフィトステロールの重量比は７１：２９であり、モル比は６０：４０である。

【0043】

「リポソームのゼータ電位測定」
リポソームの表面電荷の変化を確認するため、ゼータ電位をレーザードップラー法により求めた。リポソーム溶液を０．１ｍＭリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．４）３．０ｍＬに加え、所定のセルに溶液を移して測定を行った。測定にはゼータ電位粒径測定システム（大塚電子株式会社製、装置名：ＥＬＳＺ−１０００）を用いた。リポソーム濃度は２０μＭとなるように調整した。測定は２５℃でおこなった。

【0044】

試験例４〜７の、各温度においてｐＨを変化させた時のζ電位を表１に示す。

【表1】

【0045】

「リポソームの温度、ｐＨ応答性評価」
試験例４〜７のリポソームの温度、ｐＨに対する応答性を評価した。

【0046】

リポソームの脂質二重膜が破壊されると、リポソーム内に含まれていたカルセインが外水相に放出される。放出されたカルセインを、下記手法により４９０ｎｍの光で励起し、発せられる蛍光を５２０ｎｍで測定することにより、リポソームの温度、ｐＨ応答性の評価を行った。
なお、リポソームの脂質二重膜中では蛍光物質であるカルセインの濃度が高く濃度消光される。そのため、本発明の測定方法で観測された蛍光は、全てリポソームから放出された外水相中のカルセインに由来するとみなすことができる。

【0047】

・ｐＨ応答性評価
試験管に各ｐＨに調製したリン酸緩衝水溶液を加えた。試験管内のリン脂質濃度が０．０２ｍＭとなるように試験例４〜７のリポソーム溶液を添加した後、３５℃で３０分間インキュベートした（最終体積４ｍＬ）。その後、１％ＮａＯＨ水溶液を加えｐＨ７．４となるようにした。その後、カルセインの放出量を調べた。最後に１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を８μＬ加えてリポソームを破壊した。その後、下記温度応答性と同様にしてリポソームからの放出率を算出した。

【0048】

・温度応答性評価
試験管にｐＨ７．４に調製したリン酸緩衝水溶液を加えた。試験管内のリン脂質濃度が０．０２ｍＭとなるように試験例４及び７のリポソーム溶液を添加した（最終体積４ｍＬ）。測定は２５〜７０℃の範囲とし、常に昇温した。１０分間インキュベーションしたのち、１％ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＨ７．４となるようにした。その後、カルセインの放出量を調べた（カルセインは弱酸性条件で消光するため）。最後に１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を８０μＬ加えてリポソームを破壊した。各温度におけるｐＨが７．４のときのリポソームをバッファーに添加直後の蛍光強度を０％とし（Ｆ_{０，７．４}）、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたときの蛍光強度を１００％の放出量とみなして（Ｆ_{１００，７．４}）リポソームからの内包物の放出率を以下の計算式により算出した。

【0049】

【数1】

またｐＨ＝ｘのときの放出率Ｆｔは、Ｆｔ＝（測定値）×Ｆ_{１００，７．４}／Ｆ_{１００，ｘ}として、ｐＨ７．４に補正した値から算出した。蛍光強度の測定は分光蛍光光度計（日本分光株式会社製、装置名：ＦＰ−６２００、ＦＰ−８５００、ＦＰ−８５００ＤＳ、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｊａｐａｎ社製））および温度コントローラ（日本分光株式会社製、装置名：ＥＴＣ−２７２Ｔ）を用いて行った。

【0050】

試験例４〜７の、各温度においてｐＨを変化させた時の放出率のグラフを図１に示す。また、試験例４及び７の、各ｐＨにおいて温度を変化させた時の放出率のグラフを図２に示す。
図１に示すように、本発明のリポソームは、ｐＨ応答性に優れていた。それに対し、フィトステロールエステルを有さない試験例７は、ｐＨが変化してもリポソームは崩壊せず、内容物の放出がほとんど起こらなかった。また、図２に示すように、試験例４で作成した本発明のリポソームは、ｐＨ５．０の条件下で２５℃から３０℃の間で応答性を示し、人の体温近傍の温度で応答性を有することが確認できた。

【0051】

＜試験例８＞
「細胞内での放出性試験」
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）１５．４５ｍｇと、試験例１〜３のフィトステロールエステルのいずれか、又はフィトステロールを８．６ｍｇとり、さらに蛍光物質であるＲｈ−ＰＥを全リン脂質量に対し、０．２モル％になるように加え、クロロホルム、メタノールを２：１の体積比で混合してなる溶液３ｍＬに溶解させた。この溶液３ｍＬをなす型フラスコに採り、ロータリーエバポレーターによりクロロホルム・メタノール混合溶液を除去し、フラスコ内壁面にＤＭＰＣと試験例１〜３のフィトステロールのいずれか、又はフィトステロールからなる薄膜を形成した。

【0052】

蛍光物質であるカルセイン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）溶液（６３ｍＭ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ加え、バス型超音波照射装置により超音波を照射して、フラスコ内壁面から混合薄膜を剥離させ、蛍光液に混合薄膜を分散した。ＮａＯＨ及びＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調整した。この分散液を５０℃以上条件下にて、エクストルーダーに孔径１００ｎｍの膜を挟み、リポソーム分散液を２５回通すことで、リポソームの粒径を１００ｎｍにそろえた。

【0053】

マウスメラノーマ細胞であるＢ１６−Ｆ１０細胞を、松浪ガラスボトムディッシュ１穴当たり２×１０^５個になるように撒き、ＤＭＥＭメディウムを培養液として、ＣＯ_２インキュベーター内で、ＣＯ_２濃度５％、３７℃で一晩培養した。

【0054】

ＤＭＥＭメディウムの組成は以下のとおり。
ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）培地（フェノールレッドあり）（ＤＭＥＭ、和光純薬工業株式会社製）、牛胎児血清（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ， Ｉｎｃ社製）１０％。

【0055】

その後、リン酸緩衝水溶液で２回、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝水溶液（以下、ＰＢＳ（−）という。）で１回洗浄した後、ＤＭＥＭメディウム１．５ｍＬ（牛胎児血清フリー）を加えた。
脂質濃度０．５０ｍＭとなるようにリポソーム複合体の分散液を、全量が０．５ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）を、それぞれ加えた後、３７℃で４時間インキュベーションすることで細胞にリポソームを取り込ませた。リン酸緩衝水溶液で３回洗浄してＢ１６−Ｆ１０細胞内に取り込まれていないリポソームを除去した。ＤＭＥＭ（フェノールレッドフリー、牛胎児血清フリー）を２ｍＬ加え、顕微鏡観察に用いた。

【0056】

「共焦点レーザー顕微鏡による細胞内動態の観察」
ＤＭＥＭ（フェノールレッドフリー）を２ｍＬ加えて共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、装置名：ＬＳＭ ５ ＥＸＣＩＴＥＲ）により、Ｂ１６−Ｆ１０細胞にリポソーム分散液を加えてから３時間後の細胞内動態を観察した。なお、Ｒｈ−ＰＥの蛍光は赤色で観察され、脂質二重膜では強く蛍光するが、水相ではその蛍光は弱い。カルセインは、緑色蛍光で観察され、１０ｍＭを超える濃度で自己消光するため、リポソーム内では蛍光を発さず、外水相に放出されて初めて蛍光を発する。

【0057】

試験例１〜３のフィトステロールエステルを含むリポソームで処理した細胞は、Ｒｈ−ＰＥの赤色蛍光を示し、蛍光の強さは同程度であった。また、試験例１〜３のフィトステロールエステルを含むリポソームで処理した細胞は、いずれもカルセインの緑色蛍光を示したが、特に試験例１で得たフィトステロールエステルを含むリポソームで処理した細胞は非常に強い緑色蛍光を示した。

【0058】

図３に、試験例１のリポソームで処置したＢ１６−Ｆ１０細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像を示す。図３において、左上は細胞に取り込まれたあとのリポソーム中のＲｈ−ＰＥの蛍光（赤色）を、左下はカルセインの蛍光（緑色）を、右上は細胞の全体の微分干渉像（明視野画像）を、右下はＲｈ−ＰＥの蛍光、カルセインの蛍光、微分干渉像を重ね合わせた画像を示す。なお、それぞれの画像は、同一箇所の画像である。
図３の右下の画像には、黄色の輝点が見られ、Ｒｈ−ＰＥによる赤色蛍光とＣａｌｃｅｉｎによる緑色蛍光が同一の箇所で起こったことが確かめられた。

【0059】

リポソームは、エンドサイトーシスにより細胞に取りこまれ、エンドソームに移行する。リポソームは、３７℃で高いｐＨ応答性をもつために、エンドソーム内の弱酸性ｐＨに応答して、脂質二重膜が破壊され、カルセインがリポソーム外に放出されて外水相で希釈され、カルセインの蛍光が強く発せられた。なお、本発明のフィトステロールエステルは、細胞親和性の高いステロール構造を持っており、このフィトステロールエステルを表面近傍に有するリポソームは安定性が高まり、分解酵素による分解は抑えられているため、細胞内のリソソームによるリポソームの分解はほとんど起きていないと推測される。

【図1】

【図2】

【図3】