特許 6793547 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6793547

(24)【登録日】2020年11月12日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20201119BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201119BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20201119BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20201119BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20201119BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20201119BHJP

   A01H 1/00 20060101ALN20201119BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 110

   C12N5/10ZNA

   C12N9/16 Z

   C07K14/47

   C07K19/00

   A61K35/76

   A61P43/00 105

   A61K48/00

   A61K31/7105

   !A01H1/00 A

【請求項の数】45

【全頁数】791

(21)【出願番号】特願2016-539047(P2016-539047)

(86)(22)【出願日】2014年12月12日

(65)【公表番号】特表2017-532001(P2017-532001A)

(43)【公表日】2017年11月2日

(86)【国際出願番号】US2014070175

(87)【国際公開番号】WO2015089486

(87)【国際公開日】20150618

【審査請求日】2017年12月5日

(31)【優先権主張番号】61/939,256

(32)【優先日】2014年2月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/980,012

(32)【優先日】2014年4月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/915,251

(32)【優先日】2013年12月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/939,242

(32)【優先日】2014年2月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/055,484

(32)【優先日】2014年9月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/930,214

(32)【優先日】2014年1月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/915,267

(32)【優先日】2013年12月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/087,537

(32)【優先日】2014年12月4日

(33)【優先権主張国】US

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業（個人型研究（さきがけ））、研究領域「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」、研究題目「立体構造にもとづく次世代ゲノム編集ツールの創出」、平成２５年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）、研究領域「炎症の慢性化機構の解明と制御に向けた基盤技術の創出」、研究題目「慢性炎症による疾患発症機構の構造基盤」、および、平成２６年度、文部科学省、科学技術試験研究委託事

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515236259

【氏名又は名称】ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】507324290

【氏名又は名称】マサチューセッツ・インスティトュート・オブ・テクノロジー

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】コナーマン シルヴァーナ

(72)【発明者】

【氏名】トレビーノ アレクサンドロ

(72)【発明者】

【氏名】ブリガム マーク

(72)【発明者】

【氏名】ラン フェイ

(72)【発明者】

【氏名】シュー パトリック

(72)【発明者】

【氏名】リン チーユー

(72)【発明者】

【氏名】濡木 理

(72)【発明者】

【氏名】西増 弘志

(72)【発明者】

【氏名】石谷 隆一郎

(72)【発明者】

【氏名】チャン フェン

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 RNA Biology, 2013.04.05(online), Vol.10, No.5, pp.726-737

【文献】 Science, 2012, Vol.337, pp.816-821 and Supplementary Materials

【文献】 Cell, 2013.05.09, Vol.153, pp.910-918

【文献】 Nat. Biotechnol., 2013.09, 31(9), pp.833-838 and Supplementary Information

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含む化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡのテトラループおよび／またはステムループ２は、アダプタータンパク質に結合することが可能なアプタマー配列の挿入物により改変されている組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の組成物であって、少なくとも１つの核局在化配列を含むＣａｓ９タンパク質をさらに含み、前記Ｃａｓ９タンパク質は化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である、組成物。

【請求項3】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記少なくとも１つの突然変異を有さない対応するＣａｓ９タンパク質の５％以下のヌクレアーゼ活性を有する、
請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記アダプタータンパク質をさらに含み、前記アダプタータンパク質は機能ドメインと結合している、請求項２もしくは３に記載の組成物。

【請求項5】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記少なくとも１つの突然変異を有さない対応するＣａｓ９タンパク質と比較して少なくとも９７％、または１００％縮小したヌクレアーゼ活性を有する、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、もしくはＤ９８６から選択される位置において少なくとも２つの突然変異を含む、請求項２、３、４または５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６Ａから選択される少なくとも２つの突然変異を含む、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｈ８４０Ａ突然変異、またはＤ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ突然変異、またはＤ１０Ａ突然変異およびＮ８６３Ａ突然変異を含む、請求項２、３、４または５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０Ａ突然変異を含む、請求項２、３、４または５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、機能ドメインと結合している、請求項４に記載の組成物。

【請求項11】

前記アダプタータンパク質と結合している前記機能ドメインが、異種機能ドメインである、請求項４に記載の組成物。

【請求項12】

前記Ｃａｓ９タンパク質と結合している機能ドメインが、異種機能ドメインである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

前記アダプタータンパク質が、リンカーを介して前記機能ドメインと結合している、請求項４に記載の組成物。

【請求項14】

前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡの前記少なくとも１つのループが、前記アプタマー配列の挿入物により改変されていない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記アダプタータンパク質と結合している前記機能ドメインが、転写活性化ドメインである、請求項４に記載の組成物。

【請求項16】

前記Ｃａｓ９タンパク質と結合している前記機能ドメインが、転写活性化ドメインである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項17】

前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９である、請求項１５に記載の組成物。

【請求項18】

前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

前記アダプタータンパク質と結合している前記機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、請求項４に記載の組成物。

【請求項20】

前記Ｃａｓ９タンパク質と結合している前記機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項21】

前記転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢドメインである、請求項１９または２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記転写リプレッサードメインが、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメインまたはＳＩＤ４Ｘドメインである、請求項１９または２０に記載の組成物。

【請求項23】

前記アダプタータンパク質と結合している前記機能ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、ＤＮＡインテグレーション活性または核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する、請求項４に記載の組成物。

【請求項24】

前記Ｃａｓ９タンパク質と結合している前記機能ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、ＤＮＡインテグレーション活性、核酸結合活性、または分子スイッチ活性または化学誘導性もしくは光誘導性を含む１つ以上の活性を有する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項25】

前記ＤＮＡ開裂活性は、ヌクレアーゼに起因する、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

前記ヌクレアーゼが、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記機能ドメインが、リンカーを介して前記Ｃａｓ９タンパク質に結合している、請求項１０に記載の組成物。

【請求項28】

前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡの前記テトラループおよびステムループ２の両方が、前記アプタマー配列の挿入物により改変されている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡが、同一のアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列により改変されている、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡが、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列により改変されている、請求項２８に記載の組成物。

【請求項31】

前記アダプタータンパク質が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、およびＰＲＲ１から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

前記細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項35】

化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡをコードする核酸分子であって、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡは、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡのテトラループおよび／またはステムループ２は、アダプタータンパク質に結合可能なアプタマー配列の挿入物により改変されている、核酸分子。

【請求項36】

真核細胞中で作動可能な調節エレメントと操作可能に結合された、請求項３５に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項37】

少なくとも１つの核局在化配列を含むＣａｓ９タンパク質をさらにコードし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である、請求項３６に記載のベクター。

【請求項38】

前記組成物が、それぞれ異なる標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも２つの異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

前記少なくとも２つの異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系ガイドＲＮＡがそれぞれアダプタータンパク質に結合可能である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記標的配列が、非コードまたは調節配列である、請求項１〜３４または３８〜３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

前記調節配列が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー配列である、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

真核細胞における標的配列の改変のための医薬品の調製における、請求項１〜３４および３８〜４１のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項43】

請求項１〜３４および３８〜４１のいずれか一項に記載の組成物を含む真核宿主細胞。

【請求項44】

請求項４３に記載の真核宿主細胞を含む非ヒト生物。

【請求項45】

請求項１〜３４および３８〜４１のいずれか一項に記載の組成物およびキットの使用指示書を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；２０１４年１月２２日に出願された同第６１／９３０，２１４号明細書；２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５５，４８４号明細書；２０１４年１１月４日に出願された同第６２／０８７，５３７号明細書；２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，２６７号明細書；および２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２５６号明細書からの優先権を主張する。

【0002】

上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。

【0003】

本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物に関する。特に、本発明は、最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素系を包含する。

【0004】

連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより助成されたＮＩＨパイオニアアワードＤＰ１ＭＨ１００７０６のもと政府支援を受けて作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。

【0005】

本発明は、ＪＳＴ（科学技術振興機構）により２０１２年に助成された「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」の分野におけるＰＲＥＳＴＯ（戦略的創造研究推進事業、さきがけ）のもと政府支援を受けて作製された。ＪＳＴは、本発明において一定の権利を有する。

【0006】

本発明は、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｐｏｒｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＥＸＴ）により２０１４年に助成された“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｅｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”の分野のもと政府支援を受けて作製された。ＭＥＸＴは、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0007】

ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタム化タンパク質の生成を要求しないが、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。

【0009】

一態様において、本発明は、天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している組成物を提供する。２つ以上の機能ドメインが存在する場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、例えば、２つの同一または２つの異なるアクチベーターまたはリプレッサーであり得る。一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体組成物を提供する。一態様において、本発明は、本明細書に記載の天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ酵素が少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し；および／または少なくとも１つ以上の核局在化配列を有する組成物を提供する。

【0010】

一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体であって、１つ以上の機能ドメインに会合している１つ以上のアダプタータンパク質が存在し、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループ中に挿入された区別されるＲＮＡ配列に結合している複合体を提供する。

【0011】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、少なくとも１つのｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している組成物を提供する。

【0012】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して少なくとも９７％、または１００および縮小したヌクレアーゼ活性を有する任意の本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、２つ以上の突然変異を含み、ＳｐＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、もしくはＤ９８６またはＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０の２つ以上が突然変異しており、またはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＨ８４０が突然変異している、任意の上記組成物を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６Ａ、またはＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａを含む２つ以上の突然変異、またはＨ８４０Ａを含む少なくとも１つの突然変異を含む、本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質または任意の対応するオルソログによるＨ８４０Ａ、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ、またはＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａを含む、任意の本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳａＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＮ５８０Ａ；またはＳｐＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０Ａ、およびＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａを含む、任意の本明細書に記載の組成物を提供する。

【0013】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、１つ以上の機能ドメインと会合している、任意の本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合している１つ以上の機能ドメインが、異種機能ドメインである、任意の本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合している１つ以上の機能ドメインが、異種機能ドメインである、任意の本明細書に記載の組成物を提供する。

【0014】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質が、機能ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質は、場合により、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間のリンカーを含み、リンカーは、場合により、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含む、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0015】

一態様において、本発明は、ｓｇＲＮＡの前記少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されておらず、場合により、未改変ｓｇＲＮＡループの１つは、テトラループまたはステムループ２のいずれか１つである、本明細書に記載の組成物、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物を提供する。

【0016】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合している１つ以上の機能ドメインが、転写活性化ドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0017】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合している１つ以上の機能ドメインが、転写活性化ドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0018】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合している１つ以上の機能ドメインが、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９を含む転写活性化ドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。アダプタータンパク質と会合しているものに関する活性化（またはアクチベーター）ドメインへの本明細書における他の参照としては、任意の公知の転写活性化ドメイン、具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９が挙げられる。

【0019】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合している１つ以上の機能ドメインが、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡおよびＳＥＴ７／９を含む転写活性化ドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合しているものに関する活性化（またはアクチベーター）ドメインへの本明細書における他の参照としては、任意の公知の転写活性化ドメイン、具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９が挙げられる。

【0020】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合している１つ以上の機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0021】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合している１つ以上の機能ドメインが、転写リプレッサードメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0022】

一態様において、本発明は、転写リプレッサードメインが、ＫＲＡＢドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0023】

一態様において、本発明は、転写リプレッサードメインが、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメインまたはＳＩＤ４Ｘドメインである、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0024】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質と会合している１つ以上の機能ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、ＤＮＡインテグレーション活性または核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0025】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合している１つ以上の機能ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、ＤＮＡインテグレーション活性、核酸結合活性、または分子スイッチ活性または化学誘導性または光誘導性を含む１つ以上の活性を有する、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0026】

ヒストン修飾ドメインも、一部の実施形態において好ましい。例示的なヒストン修飾ドメインは以下に記載される。トランスポーゼース、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、および／またはインテグラーゼドメインも、本発明の機能ドメインとして好ましい。一部の実施形態において、ＤＮＡインテグレーション活性としては、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメインおよび／またはトランスポーゼースドメインが挙げられる。

【0027】

一態様において、本発明は、ＤＮＡ開裂活性が、ヌクレアーゼに起因する、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0028】

一態様において、本発明は、ヌクレアーゼが、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを含む、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0029】

一態様において、本発明は、１つ以上の機能ドメインがＣＲＩＳＰＲ酵素に付着しており、その結果、ｓｇＲＮＡおよび標的への結合時、機能ドメインが機能ドメインのその属性機能での機能を可能とする空間配向になる、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0030】

一態様において、本発明は、１つ以上の機能ドメインが、リンカー、場合により、ＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＣＲＩＳＰＲ酵素に付着している、本明細書に記載の組成物を提供する。一態様において、本発明は、ｓｇＲＮＡが改変されており、その結果、ｓｇＲＮＡがアダプタータンパク質に結合し、ＣＲＩＳＰＲ酵素および標的にさらに結合した後、機能ドメインが機能ドメインのその属性機能での機能を可能とする空間配向になる、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0031】

一態様において、本発明は、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループが、テトラループおよび／またはループ２である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0032】

一態様において、本発明は、ｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２が、区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されている、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0033】

一態様において、本発明は、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物が、アプタマー配列である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0034】

一態様において、本発明は、アプタマー配列が、同一のアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0035】

一態様において、本発明は、アプタマー配列が、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0036】

一態様において、本発明は、アダプタータンパク質が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0037】

一態様において、本発明は、細胞が、真核細胞、場合により、哺乳動物細胞である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0038】

一態様において、本発明は、細胞が、ヒト細胞またはマウス細胞である、本明細書に記載の組成物を提供する。

【0039】

一態様において、本発明は、例えば、細胞系を含み、場合により、ヒト細胞系またはマウス細胞系である、本明細書に記載の哺乳動物細胞を提供する。

【0040】

一態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載の組成物により形質転換され、またはた前記形質転換体の子孫であるトランスジェニック哺乳動物モデル、場合により、マウスを提供する。

【0041】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の組成物の１つ以上の宿主への投与、またはその宿主中の発現を含む、ゲノム遺伝子座イベントを導入する方法を提供する。

【0042】

一態様において、本発明は、ゲノム遺伝子座イベントが、遺伝子活性化、遺伝子阻害、または遺伝子座中の開裂、またはＤＮＡの挿入に影響を及ぼすことを含む、本明細書に記載の方法を提供する。

【0043】

一態様において、本発明は、組成物またはそれをコードする核酸分子の送達を含み、前記核酸分子が、調節配列に作動可能に結合しており、インビボで発現される、本明細書に記載の方法を提供する。インビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、またはＡＡＶを介するものであり得る。

【0044】

一態様において、本発明は、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸分子を含むベクターであって、プロモーターに作動可能に結合しているガイド配列（ｓｇＲＮＡ）を含む真核細胞中で作動可能な調節エレメントを含み、ｓｇＲＮＡは、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されているベクターを提供する。

【0045】

一態様において、本発明は、プロモーターに作動可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子を含む真核細胞中で作動可能な調節エレメントを含むベクターであって、酵素は、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の機能ドメインと会合しているベクターを提供する。

【0046】

一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体または組成物をコードする核酸分子を提供する。

【0047】

一態様において、本発明は、機能獲得（ＧＯＦ）または機能損失（ＬＯＦ）をスクリーニングする方法であって、Ｃａｓ９を含有し、または発現する本明細書に記載の細胞系またはモデルの細胞を含み、請求項１に記載の組成物を細胞系またはモデルの細胞中に導入すること（ｓｇＲＮＡは、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかを含む）、導入されたｓｇＲＮＡがアクチベーターを含むそれらの細胞に関して、または導入されたｓｇＲＮＡがリプレッサーを含むそれらの細胞に関してＧＯＦまたはＬＯＦをそれぞれモニタリングすることを含む方法を提供する。

【0048】

一態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性および場合により、少なくとも１つ以上の核局在化配列を有し；ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含み；ＣＲＩＳＰＲ酵素は、同一であっても異なっていてもよく、好ましくは、異なる機能ドメインである２つ以上の機能ドメインと会合しており；またはｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、２つ以上の機能ドメインと会合しており；またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の機能ドメインと会合しており、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している複合体が提供される。

【0049】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、１つ以上の機能ドメインを含む、本明細書に記載の組成物を提供する。このような組成物において、２つ以上のｓｇＲＮＡが存在し得、ｓｇＲＮＡは、異なる配列を標的化し、それにより、組成物を用いる場合、多重化が存在する。組成物は、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変された２つ以上のｓｇＲＮＡを含み得る。組成物は、１つ以上の機能ドメインと会合している１つ以上のアダプタータンパク質が存在し、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループ中に挿入された区別されるＲＮＡ配列に結合しているものを含み得る。

【0050】

一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変更または改変する方法を提供する。前記方法は、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し、発現する細胞中に、Ｃａｓタンパク質およびＤＮＡ分子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入することを含み得、それによりガイドＲＮＡは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、Ｃａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を開裂し、それにより遺伝子産物の発現を変更し；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に存在しない。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されているＣａｓタンパク質をさらに包含する。好ましい実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物の発現を減少させる。

【0051】

一態様において、本明細書に記載の組成物において、標的配列は、非コードまたは調節（例として、プロモーター、特に、近位プロモーター）またはエンハンサーまたはサイレンサー配列であり得る。

【0052】

一態様において、本発明は、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、Ｃａｓタンパク質および細胞中で遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡを含み、それによりガイドＲＮＡは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、Ｃａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を開裂し、それにより遺伝子産物の発現を変更し；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に存在しない系を提供する。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明の一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質であり、好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。本発明は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されているＣａｓ９タンパク質をさらに包含する。好ましい実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物の発現を減少させる。

【0053】

別の態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系であって、前記ベクターは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡに作動可能に結合している第１の調節エレメントおよびＣａｓタンパク質に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む系を提供する。成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上に局在し得る。ガイドＲＮＡは、細胞中で遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、Ｃａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を開裂し、それにより遺伝子産物の発現を変更し；Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に存在しない。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明の一実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質であり、好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。本発明は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されているＣａｓタンパク質をさらに包含する。好ましい実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物の発現を減少させる。

【0054】

一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み；成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にある。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でｔｒａｃｒ配列を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。最適アラインメントの決定は、当業者の技能の範囲内である。例えば、公開および市販のアラインメントアルゴリズムおよびプログラム、例えば、限定されるものではないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ｍａｔｌａｂにおけるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、ＢｉｏｐｙｔｈｏｎおよびＳｅｑＭａｎが存在する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論により拘束されるものではないが、核局在化配列は、真核生物中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要でないが、そのような配列を含めることにより、特に核中の核酸分子のターゲティングに関して系の活性が向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一般に、および本明細書全体で、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由末端を含み、自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野において公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、付加ＤＮＡセグメントを例えば標準分子クローニング技術により挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、それにおいてウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する。ウイルスベクターとしては、宿主細胞中への形質移入のためにウイルスにより担持されるポリヌクレオチドも挙げられる。あるベクターは、それが導入された宿主細胞中で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それが作動的に結合している遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。

【0055】

組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得、そのことは、組換え発現ベクターが、発現に使用すべき宿主細胞に基づき選択することができ、発現させるべき核酸配列に作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターのうち、「作動可能に結合している」は、目的ヌクレオチド配列が調節エレメントに、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系またはベクターが宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞中で）を可能とするように結合していることを意味するものとする。

【0056】

用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよびある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的組織、例えば、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特異的臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球）中で発現を指向し得る。調節エレメントは、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的または発生段階依存的様式の発現も指向し得、それは、組織または細胞タイプ特異的であってもなくてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」により、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者により認識される。ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされる転写物、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体、それらの融合タンパク質など）を産生することができる。

【0057】

有利なベクターとしては、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられ、そのようなベクターのタイプは、特定のタイプの細胞のターゲティングのために選択することもできる。

【0058】

一態様において、本発明は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む真核宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）および（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノム中に安定的にインテグレートされている。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、真核宿主細胞は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば、哺乳動物であり得る。また、生物は、節足動物、例えば、昆虫であり得る。生物は、植物でもあり得る。さらに、生物は、真菌であり得る。

【0059】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態において、キットは、系の同一または異なるベクター上にある成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。

【0060】

一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターを対象中の真核細胞中に送達する。一部の実施形態において、前記改変を、細胞培養物中の前記真核細胞中で行う。一部の実施形態において、方法は、前記改変前に前記真核細胞を対象から単離することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む。

【0061】

一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。

【0062】

一態様において、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする）および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。

【0063】

一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナリングイベントをモジュレートする生物活性剤を開発する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）試験化合物を、記載の実施形態のいずれか１つのモデル細胞と接触させること；および（ｂ）前記疾患遺伝子中の前記突然変異に関連する細胞シグナリングイベントの低減または増大を示すリードアウトの変化を検出し、それにより、前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナリングイベントをモジュレートする前記生物活性剤を開発することを含む。

【0064】

一態様において、本発明は、ｔｒａｃｒメイト配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中に存在する対応する標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞中に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は、原癌遺伝子または癌遺伝子である。

【0065】

一態様において、本発明は、１つ以上の細胞中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を導入することにより１つ以上の細胞を選択する方法であって、１つ以上のベクターを細胞中に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、および編集テンプレートの１つ以上の発現をドライブし；編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素開裂を停止させる１つ以上の突然変異を含む）；編集テンプレートと、選択すべき細胞中の標的ポリヌクレオチドとを相同組換えさせること；ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導する）、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の細胞の選択を可能とすることを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。本発明の別の好ましい実施形態において、選択すべき細胞は、真核細胞であり得る。本発明の態様により、選択マーカーもカウンターセレクション系を含み得る２ステッププロセスも要求しない規定の細胞の選択が可能となる。

【0066】

別の態様において、本発明は、上記のいずれかもしくは全ておよび／または実施例８の結晶構造表（ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９結晶構造）もしくは実施例１２にさらに記載のものの座標により定義される構造を有する結晶に対応し、またはそれから得られるＸ線回折パターンを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））系を包含する。

【0067】

さらなる態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系またはその機能部分内でフィットし、またはそれに結合する潜在化合物を同定または設計するコンピュータ支援法またはその逆（所望の化合物に結合する潜在ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系またはその機能部分を同定または設計するコンピュータ支援法）または潜在ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を同定または設計するコンピュータ支援法（例えば、操作することができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の予測区域に関して、例えば、結晶構造データに基づき、またはＣａｓ９オルソログのデータに基づき、または機能群、例えば、アクチベーターもしくはリプレッサーをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に付着させることができる場所に関して、またはＣａｓ９トランケーションに関して、またはニッカーゼの設計に関して）を含み、前記方法は、
コンピュータシステム、例えば、プロセッサ、データ保存システム、入力デバイス、および出力デバイスを含むプログラミングされたコンピュータを使用し、
（ａ）プログラミングされたコンピュータ中に前記入力デバイスを介して、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系結合ドメインまたは代替的にもしくはさらにＣａｓ９オルソログ間のバリアンスに基づき変動するドメインにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造からの、またはそれに関する原子のサブセットの三次元座標を含むデータまたはＣａｓ９に関するもの、またはニッカーゼに関するもの、または機能群に関するものを、場合によりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系複合体からの構造情報と入力し、それによりデータセットを生成するステップ；
（ｂ）前記プロセッサを使用して、前記データセットを、前記コンピュータデータ保存システム中に保存された構造のコンピュータデータベース、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に結合もしくは推定上結合し、またはそれへの結合が所望される化合物の構造、またはＣａｓ９オルソログに関するもの（例えば、Ｃａｓ９として、またはＣａｓ９オルソログ間で変動するドメインもしくは領域に関する）またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造に関するもの、またはニッカーゼに関するもの、または機能群に関するものと比較するステップ；
（ｃ）前記データベースから、コンピュータ法を使用して、構造、例えば、所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構造、あるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構造に結合し得る所望の構造、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の他の部分からの、および／もしくはＣａｓ９オルソログからのデータに基づき操作することができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の部分、トランケートＣａｓ９、新規ニッカーゼもしくは特定の機能群、または機能群もしくは機能群−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を付着させるための位置を選択するステップ；
（ｄ）コンピュータ法を使用して、選択構造のモデルを構築するステップ；ならびに
（ｅ）前記出力デバイスに、選択構造を出力するステップ；
および場合により、選択構造の１つ以上を合成するステップ；
およびさらに場合により、前記合成選択構造を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系として、またはその中で試験するステップを含み；
または前記方法は、以下を含む：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の少なくとも２つの原子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の本明細書の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標または少なくともＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造のサブドメインの座標（「選択座標」）を提供すること、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の他の部分からの、および／またはＣａｓ９オルソログ、または機能群の構造からのデータに基づき操作することができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の結合分子またはその部分の結合分子を含む候補の構造を提供し、候補の構造を選択座標にフィットし、それにより所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構造、あるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構造に結合し得る所望の構造、操作することができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の部分、トランケートＣａｓ９、新規ニッカーゼ、もしくは特定の機能群、または機能群もしくは機能群−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を付着させるための位置を含む産物データをその出力と得ること；および場合により、前記産物データから化合物を合成することおよびさらに場合により、前記合成化合物をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系として、またはその中で試験することを含む。

【0068】

試験は、前記合成選択構造から得られたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を、例えば、結合または所望の機能の実行について分析することを含み得る。

【0069】

上記方法における出力は、データ伝送、例えば、遠隔通信、電話、ビデオカンファレンス、マスコミュニケーション、例えば、プレゼンテーション、例えば、コンピュータプレゼンテーション（例えば、ＰＯＷＥＲＰＯＩＮＴ）、インターネット、ｅメール、文書コミュニケーション、例えば、コンピュータプログラム（例えば、ＷＯＲＤ）文書などを介する情報の伝送を含み得る。したがって、本発明は、本明細書の結晶構造表および／または図による原子座標データ（前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義する）、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９についての構造因子データ（前記構造因子データは、本明細書の結晶構造表および／または図の原子座標データから誘導可能である）を含有するコンピュータ読み取り可能媒体も包含する。コンピュータ読み取り可能媒体は、上記方法の任意のデータも含有し得る。本発明は、本明細書の結晶構造表および／または図による原子座標データ（前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義する）、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９についての構造因子データ（前記構造因子データは、本明細書の結晶構造表および／または図の原子座標データから誘導可能である）のいずれかを含有する、上記方法のとおり合理的設計を生成または実施するための方法、コンピュータシステムをさらに包含する。本発明は、ユーザにコンピュータシステムまたは媒体またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９もしくはその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９についての構造因子データ（前記構造は、本明細書の結晶構造表および／または図に記載されており、前記構造因子データは、本明細書の結晶構造表および／または図の原子座標データから誘導可能である）、または本明細書のコンピュータ媒体もしくは本明細書のデータ伝送を提供することを含む、作業を行う方法をさらに包含する。

【0070】

「結合部位」または「活性部位」は、結合に関与する化合物、例えば、核酸分子に結合し得る結合空洞または領域中の部位（例えば、アミノ酸残基の原子、官能基または複数のそのような原子および／または基）を含み、または本質的にそれからなる。

【0071】

「フィッティング」は、自動的、または半自動的手段により、候補分子の１つ以上の原子と、本発明の構造の少なくとも１つの原子との間の相互作用を決定し、そのような相互作用が安定的である程度を計算することを意味する。相互作用としては、電荷、立体的考察などにより生じる引力および斥力が挙げられる。コンピュータに基づきフィッティングする種々の方法をさらに記載する。

【0072】

「二乗平均平方根（またはｒｍｓ）偏差」は、平均からの偏差の平方の算術平均の平方根を意味する。

【0073】

「コンピュータシステム」は、原子座標データを分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ保存手段を意味する。本発明のコンピュータベース系の最小ハードウェア手段は、典型的には、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ保存手段を含む。望ましくは、構造データを可視化するためにディスプレイまたはモニタが提供される。データ保存手段は、ＲＡＭまたは本発明のコンピュータ読み取り可能媒体にアクセスするための手段であり得る。このような系の例は、Ｕｎｉｘ、ＷｉｎｄｏｗｓまたはＡｐｐｌｅオペレーティングシステムを実行するコンピュータおよびタブレットデバイスである。

【0074】

「コンピュータ読み取り可能媒体」は、例えば、媒体が上記コンピュータシステムにおける使用に好適であるようにコンピュータにより直接または間接的に読み取り、アクセスすることができる任意の１つまたは複数の媒体を意味する。このような媒体としては、限定されるものではないが、磁気保存媒体、例えば、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体および磁気テープ；光学保存媒体、例えば、光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ；電気的保存媒体、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ；サムドライブデバイス；クラウド保存デバイスおよびそれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気／光学保存媒体が挙げられる。

【0075】

本発明の特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の成分の結晶構造の立体構造変動は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系機能に重要であり得るヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）構造領域に対するタンパク質構造領域のフレキシビリティーまたは移動についての重要でクリティカルな情報を提供する。本出願においてＣＲＩＳＰＲ酵素としてのＣａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）について提供される構造情報を使用してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をさらにエンジニアリングおよび最適化することができ、これを外挿して他のＣＲＩＳＰＲ酵素系、例えば、他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素系における構造−機能関係も調査することができる。

【0076】

本発明は、特に、本発明の改変ガイドとの組合せの最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素系を包含し、さらにＣＲＩＳＰＲ酵素は機能ドメインとも会合している。特に、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、目的機能を示す機能ドメインをリクルートし、または付属させ、または挿入し、または付着させることができるＤＮＡ結合タンパク質にそれを変換する１つ以上の突然変異を含む。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、定されるものではないが、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６Ａ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置ナンバリングに基づく）が挙げられる１つ以上の突然変異を含み、および／または１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１もしくはＨＮＨドメイン中に存在し、もしくは本明細書に記載の他の突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を有し、ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列は、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、酵素は機能ドメインをさらに含む。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０における突然変異が好ましい。特に、ＳａＣａｓ９中の突然変異に代えて、ＳｐＣａｓ９中のＨ８４０に対応する突然変異が好ましい。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９において、Ｄ１０およびＮ５８０における突然変異が好ましい。一部の実施形態において、Ｎ５８０突然変異は、ＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａであり得る。理論により拘束されるものではないが、これは、タンパク質機能について、結合挙動を変化させ得るＨ８４０Ａ等価物よりも予測可能な突然変異であると考えられる。

【0077】

本明細書に提供される構造情報は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系全体の機能性を最適化するためのｓｇＲＮＡ構造のエンジニアリングまたは変更を許容する標的ＤＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）とのｓｇＲＮＡ（またはキメラＲＮＡ）相互作用の調査を可能とする。例えば、ＲＮＡに結合し得るアダプタータンパク質の挿入により、Ｃａｓ９タンパク質と衝突させずにｓｇＲＮＡのループを伸長させることができる。これらのアダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質または融合物をさらにリクルートし得る。

【0078】

一部の好ましい実施形態において、機能ドメインは、転写活性化ドメイン、好ましくは、ＶＰ６４である。一部の実施形態において、機能ドメインは、転写抑制ドメイン、好ましくは、ＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインは、ＳＩＤ、またはＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであり、その結果、エピジェネティック修飾酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、それはＰ６５活性化ドメインであり得る。

【0079】

本発明の態様は、天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み得るＣＲＩＳＰＲ酵素とを含み得、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２つ以上の突然変異を含み、その結果、酵素は野生型酵素と比較して変更または縮小したヌクレアーゼ活性を有し、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ分子の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、１つ以上の異種機能ドメインをさらにリクルートする組成物を包含する。本発明の一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、またはＤ９８６からなる群から選択される残基中の２つ以上の突然変異を含む。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６Ａを含む群から選択される２つ以上の突然変異を含む。上記のとおり、ＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０、特にＮ５８０Ａが、特にＳａＣａｓ９中で使用される。別の実施形態において、機能ドメインは、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４である。別の実施形態において、機能ドメインは、転写リプレッサードメイン、例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＳＩＤドメインまたはＳＩＤ４Ｘドメインである。本発明の実施形態において、１つ以上の異種機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性からなる群から選択される１つ以上の活性を有する。本発明のさらなる実施形態において、細胞は、真核細胞または哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらなる実施形態において、アダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１からなる群から選択される。別の実施形態において、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、テトラループおよび／またはループ２である。本発明の一態様は、細胞中に本明細書に記載の組成物のいずれかを導入することにより細胞中の遺伝子発現を変化させるように目的ゲノム遺伝子座を改変する方法を包含する。

【0080】

本発明の一態様は、上記エレメントが単一組成物中に含まれ、または個々の組成物中に含まれることである。これらの組成物は、有利には、ゲノムレベルに対して機能的効果を誘発するために宿主に適用することができる。

【0081】

一般に、ｓｇＲＮＡは、特異的結合部位（例えば、アプタマー）を、結合させるべき１つ以上の機能ドメイン（例えば、融合タンパク質を介して）を含むアダプタータンパク質に提供するように改変される。改変ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ複合体（すなわち、ｓｇＲＮＡおよび標的へのＣＲＩＳＰＲ酵素の結合）を形成したら、アダプタータンパク質が結合し、アダプタータンパク質上の機能ドメインが有効であるべき帰属機能に有利な空間配向で位置決めされるように改変される。例えば、機能ドメインが転写アクチベーター（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）である場合、転写アクチベーターは、それが標的の転写に影響を及ぼすことを可能とする空間配向で配置される。同様に、転写リプレッサーは、有利には、標的の転写に影響を及ぼすように位置決めされ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）は、有利には、標的を開裂し、または部分的に開裂するように位置決めされる。

【0082】

当業者は、アダプター＋機能ドメインの結合を可能とするが、アダプター＋機能ドメインの適切な位置決めを可能としない（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因）ｓｇＲＮＡの改変が、意図されない改変であることを理解する。１つ以上の改変ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載のとおりテトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３において、好ましくは、テトラループまたはステムループ２のいずれかにおいて、最も好ましくは、テトラループおよびステムループ２の両方において改変することができる。

【0083】

本明細書に説明されるとおり、機能ドメインは、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、核酸結合活性、および分子スイッチ（例えば、光誘導性）からなる群からの１つ以上のドメインであり得る。一部の場合、さらに少なくとも１つのＮＬＳを提供することが有利である。一部の場合、ＮＬＳをＮ末端において位置決めすることが有利である。２つ以上の機能ドメインを含める場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。

【0084】

ｓｇＲＮＡは、同一または異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えば、アプタマー）を含むように設計することができる。ｓｇＲＮＡは、転写開始部位（すなわち、ＴＳＳ）の−１０００〜＋１核酸上流、好ましくは、−２００核酸上流のプロモーター領域に結合するように設計することができる。この位置決めは、遺伝子活性化（例えば、転写アクチベーター）または遺伝子阻害（例えば、転写リプレッサー）に影響を及ぼす機能ドメインを改善する。改変ｓｇＲＮＡは、組成物中に含まれる１つ以上の標的遺伝子座に標的化される１つ以上の改変ｓｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ、少なくとも２つのｓｇＲＮＡ、少なくとも５つのｓｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｓｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｓｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｓｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｓｇＲＮＡ）であり得る。

【0085】

さらに、縮小したヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性が不活化される場合に最も有効である（例えば、野生型酵素と比較して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％のヌクレアーゼ不活化；または言い換えると、有利には、非突然変異もしくは野生型Ｃａｓ９酵素もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素の約０％のヌクレアーゼ活性、または非突然変異もしくは野生型Ｃａｓ９酵素もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素の約３％もしくは約５％もしくは約１０％以下のヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素）。これは、突然変異をＳｐＣａｓ９およびそのオルソログのＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメイン中に導入することにより可能である。例えば、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、またはＤ９８６からなる群から選択される残基中の突然変異を利用し、より好ましくは、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡまたはＤ９８６Ａからなる群から選択される突然変異の１つ以上を導入する。好ましい突然変異のペアは、ＳｐＣａｓ９およびそのオルソログのＤ１０ＡとＨ８４０Ａ、より好ましくは、Ｄ１０ＡとＮ８６３Ａである。一部の実施形態において、ＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａを本明細書に記載のとおり使用することができる。

【0086】

不活化ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の機能ドメイン、例えば、改変ｓｇＲＮＡアダプタータンパク質について本明細書に記載のもの、例として、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、核酸結合活性、および分子スイッチ（例えば、光誘導性）からなる群からの１つ以上のドメインに会合していてよい（例えば、融合タンパク質を介して）。好ましいドメインは、Ｆｏｋ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１である。Ｆｏｋ１が提供されるイベントにおいて、複数のＦｏｋ１機能ドメインを提供して機能ダイマーを可能とすることおよびＴｓａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２０１４）に具体的に記載のとおり機能的使用（Ｆｏｋ１）に適切な間隔を提供するようにｓｇＲＮＡを設計することが有利である。アダプタータンパク質は、このような機能ドメインを付着させるために公知のリンカーを利用し得る。一部の場合、さらに少なくとも１つのＮＬＳを提供することが有利である。一部の場合、ＮＬＳをＮ末端において位置決めすることが有利である。２つ以上の機能ドメインを含める場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。

【0087】

一般に、不活化ＣＲＩＳＰＲ酵素上の１つ以上の機能ドメインの位置決めは、帰属機能効果により標的に影響を及ぼすための機能ドメインについての正確な空間配向を可能とするものである。例えば、機能ドメインが転写アクチベーター（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）である場合、転写アクチベーターは、それが標的の転写に影響することを可能とする空間配向で配置される。同様に、転写リプレッサーは、有利には、標的の転写に影響を及ぼすように位置決めされ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）は、有利には、標的を開裂し、または部分的に開裂するように位置決めされる。これとしては、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ／Ｃ末端以外の位置を挙げることができる。

【0088】

結晶構造実験に起因して、本出願人らは、ＳｐＣａｓ９タンパク質のＲｅｃ１ドメイン、Ｒｅｃ２ドメイン、ＨＮＨドメイン、またはＰＩドメインまたはそれらのドメインに対応する任意のオルソログ中の機能ドメインの位置決めが有利であることを同定した。ＳｐＣａｓ９タンパク質のＲｅｃ１ドメインまたはＲｅｃ２ドメインまたはそれらのドメインに対応する任意のオルソログへの機能ドメインの位置決めが、一部の例において好ましいことがある。ＳｐＣａｓ９タンパク質の５５３位におけるＲｅｃ１ドメイン、５７５位におけるＲｅｃ１ドメイン、１７５〜３０６の任意の位置におけるＲｅｃ２ドメインもしくはその置換、７１５〜９０１の任意の位置におけるＨＮＨドメインもしくはその置換、または１１５３位におけるＰＩドメインもしくはそれらのドメインに対応する任意のオルソログへの機能ドメインの位置決めが、一部の場合に好ましいことがある。Ｆｏｋ１機能ドメインは、Ｎ末端において付着させることができる。２つ以上の機能ドメインを含める場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。

【0089】

アダプタータンパク質は、改変ｓｇＲＮＡ中に導入されるアプタマーまたは認識部位に結合し、ｓｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ複合体中に取り込まれたら、標的に帰属機能により影響する１つ以上の機能ドメインの適切な位置決めを可能とする任意数のタンパク質であり得る。本出願において詳細に説明するとおり、このようなものは、コートタンパク質、好ましくは、バクテリオファージコートタンパク質であり得る。このようなアダプタータンパク質と会合している機能ドメイン（例えば、融合タンパク質の形態で）としては、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、ＤＮＡ開裂活性、核酸結合活性、および分子スイッチ（例えば、光誘導性）からなる群からの１つ以上のドメインを挙げることができる。好ましいドメインは、Ｆｏｋ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１である。機能ドメインが転写アクチベーターまたは転写リプレッサーであるイベントにおいて、さらに少なくともＮＬＳを提供し、好ましくはＮ末端において提供することが有利である。２つ以上の機能ドメインを含める場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。アダプタータンパク質は、このような機能ドメインを付着させるために公知のリンカーを利用し得る。

【0090】

したがって、改変ｓｇＲＮＡ、不活化ＣＲＩＳＰＲ酵素（機能ドメインを有し、または有さない）、および１つ以上の機能ドメインを有する結合タンパク質は、それぞれ個々に、組成物中に含め、個々にまたは集合的に宿主に投与することができる。あるいは、それらの成分は、宿主に投与するための単一組成物中で提供することができる。宿主への投与は、宿主への送達のための当業者に公知のまたは本明細書に記載のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を介して実施することができる。本明細書に説明のとおり、異なる選択マーカーの使用（例えば、レンチウイルスｓｇＲＮＡ選択のため）およびｓｇＲＮＡの濃度（例えば、複数のｓｇＲＮＡを使用するか否かに依存する）は、効果改善の誘発に有利であり得る。

【0091】

この概念に基づき、いくつかのバリエーションがゲノム遺伝子座イベント、例として、ＤＮＡ開裂、遺伝子活性化、または遺伝子不活化を誘発するために適切である。提供される組成物を使用して、当業者は、同一または異なる機能ドメインにより単一または複数の遺伝子座を有利におよび特異的に標的化して１つ以上のゲノム遺伝子座イベントを誘発することができる。組成物は、細胞中のライブラリーにおいてスクリーニングの、およびインビボ機能モデリングの広範な方法において適用することができる（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化および機能の同定；機能獲得モデリング；機能損失モデリング；最適化およびスクリーニング目的のための細胞系およびトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）。

【0092】

本発明は、条件的または誘導性ＣＲＩＳＰＲトランスジェニック細胞／動物を樹立および利用するための本発明の組成物の使用を包含する（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４、または本明細書に引用されるＰＣＴ特許出願公開、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）参照、これらは本発明にも本出願にも先行しないと考えられる）。例えば、標的細胞は、条件的にもしくは誘導的に（例えば、Ｃｒｅ依存性構築物の形態で）ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）および／または条件的もしくは誘導的にアダプタータンパク質を含み、標的細胞中に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞中でＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）発現および／またはアダプター発現の条件を誘導し、または生じさせるものを発現する。本発明の教示および組成物を、ＣＲＩＳＰＲ複合体を作出する公知の方法と適用することにより、機能ドメインにより影響される誘導性ゲノムイベントも本発明の一態様である。このもう１つの例は、ＣＲＩＳＰＲノックイン／条件的トランスジェニック動物（例えば、Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを含む、例えば、マウス）の作出および本明細書に記載の１つ以上の改変ｓｇＲＮＡ（例えば、遺伝子活性化目的のために目的標的遺伝子のＴＳＳに対して−２００ヌクレオチド）（例えば、コートタンパク質、例えば、ＭＳ２により認識される１つ以上のアプタマーにより改変されたｓｇＲＮＡ）、本明細書に記載の１つ以上のアダプタータンパク質（１つ以上のＶＰ６４に結合しているＭＳ２結合タンパク質）および条件的動物の誘導手段（例えば、Ｃａｓ９発現を誘導性にするためのＣｒｅリコンビナーゼ）を提供する１つ以上の組成物の後続の送達である。あるいは、アダプタータンパク質は、条件的または誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素による条件的または誘導性エレメントとして提供し、有利には、多数の用途のための特異的ｓｇＲＮＡの最小の設計および投与のみを要求するスクリーニング目的に有効なモデルを提供することができる。

【0093】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログであり、Ｃａｓは、ヘリカルドメイン２トランケーションを含む。

【0094】

一態様において、本発明は、潜在的な構造安定化および／またはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ特異性保持の支援のためにヘリカルドメイン２を置き換えるため、ヘリカルドメイン２トランケーションが、３、６、９、または１２個のリピートの群のフレキシブルグリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）またはリジッドアルファ−ヘリカルリンカー（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）の１つ以上のセットにより置換されている、本明細書に記載の組成物、方法または使用を提供する。

【0095】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９である、本明細書に記載の組成物、方法または使用を提供する。

【0096】

一態様において、本発明は、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素であって、ＨＤ２ドメインがトランケートされた酵素を提供する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９であり得る。

【0097】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素であって、トランケーションは、ＨＤ２ドメインの置換であり、例えば、トランケーションは、リンカー、例えば、フレキシブルリンカー；例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーによるＨＤ２ドメインの置換である酵素を提供する。

【0098】

一態様において、本発明は、キメラ３成分ＣＲＩＳＰＲ酵素であって、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素からのＮ’およびＣ’末端成分、ならびに第２のＣＲＩＳＰＲ酵素からの内部成分を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素のオルソログであり；例えば、第１および第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、それぞれＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９またはＳｔＣａｓ９、例えば、Ｓｔ３Ｃａｓ９を含む酵素を提供する。一部の態様において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素は、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素からの内部成分により置き換えられている第１のＣＲＩＳＰＲ酵素からの内部成分を含み得、前記内部成分は、同一または異なる。本発明の一態様において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳａＣＲＩＳＰＲ酵素またはＳｔＣＲＩＳＰＲ酵素またはＳｔ３ＣＲＩＳＰＲ酵素である。本発明は、本明細書に記載のとおりＣＲＩＳＰＲ酵素がキメラまたはトランケートである、本明細書に記載の組成物、方法、系、または使用を想定する。

【0099】

したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に公知の生成物、作製方法、または使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（欧州特許条約第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない任意の生成物、方法、または生成物の作製または生成物の使用方法を、本発明の範囲に包含しないものとし、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に記載の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法の放棄を本明細書に開示することがさらに留意される。

【0100】

本開示および特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記述されない構成要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響する構成要素を排除することが留意される。本明細書では、誓約と解釈されるべきものは存在しない。

【0101】

これらのおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、またはそれから明らかであり、それにより包含される。

【0102】

本発明の新規特徴を、特に添付の特許請求の範囲を用いて記載する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより得られる。

【図面の簡単な説明】

【0103】

【図1】ＣＲＩＳＰＲ系の模式的モデルを示す。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）を、２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、およびＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（赤色三角）を媒介する。

【図2A-F】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図3A-D】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図4A-G】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5】プロトスペーサー配列の表を提供し、ヒトおよびマウスゲノム中の遺伝子座に対して例示的化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系に基づき設計されたプロトスペーサー標的と対応するＰＡＭについての改変効率結果をまとめる。細胞をＣａｓ９およびプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはキメラＲＮＡのいずれかにより形質移入し、形質移入から７２時間後に分析した。インデルパーセントは、示された細胞系からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果に基づき算出した（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差は、標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）であり、Ｎ．Ｄ．は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して検出可能でないことを示し、Ｎ．Ｔ．は、本試験において試験しなかったことを示す）。

【図6A-C】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。

【図7】二本鎖切断により誘導された微小挿入および欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの模式図を示す。

【図8A-B】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的バイシストロニック発現ベクターを示す。

【図9A-C】ヒトゲノム中の隣接する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図９Ａ）と、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図９Ｂ）との間の距離のヒストグラム；ならびに染色体（Ｃｈｒ）単位のそれぞれのＰＡＭについての距離（図９Ｃ）を示す。

【図10A-C】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図11A-C】哺乳動物細胞中のゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作を示す。

【図12A-B】哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングのノザンブロット分析の結果を示す。

【図13】ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座中のプロトスペーサーの例示的選択を示す。

【図14】ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の例示的プロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的を示す。

【図15】Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシーケンシング、およびノザンブロットアッセイに使用されたプライマーおよびプローブについての配列の表を提供する。

【図16A-C】キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。

【図17A-B】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を示す。

【図18】ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用するヒトゲノム中のいくつかの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位の例示的可視化を示す。

【図19A-D】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。

【図20A-F】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図21A-D】相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【図22A-B】ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。

【図23A-M】Ｃａｓ９タンパク質のトポロジーを示す図を提供する。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ複合体結晶構造のリボン表示および種々の図（Ａ〜Ｉ）、結晶構造からのキメラＲＮＡアークテクチャー（Ｊ〜Ｋ）、結晶構造からの相互作用の模式図（Ｌ）ならびに結晶構造からのトポロジー模式図（Ｍ）が提供される。

【図24A-C】結晶構造から、ＳｐＣａｓ９の触媒ドメイン、新たなニッカーゼのための突然変異誘発の部位を示す模式図（Ａ）、二重ニック形成の試験のためのｓｇＲＮＡの局在を示す模式図（Ｂ）、ならびにニッカーゼ活性を保持する１つのＨＮＨ突然変異体Ｎ８５４Ａ、およびニッカーゼ活性を示す１つのＨＮＨ突然変異体（Ｎ８６３Ａ）、およびニッカーゼ活性を示す２つのＲｕｖＣＩＩＩ突然変異体（Ｈ９８３Ａ、Ｄ９８６Ａ）を示すＳｕｒｖｅｙｏｒゲル試験結果の結果（Ｃ）を示す。

【図25A-B】開裂活性を保持する結晶構造からのＳｐＣａｓ９トランケーション突然変異体のＳｕｒｖｅｙｏｒゲル試験結果（Ａ）ならびに図２５Ａのゲルのレーンのアミノ酸トランケーションおよびフレキシブル（ＧＧＧＳ）またはリジッド（Ａ（ＥＡＡＡＫ））リンカー置換を示す表（Ｂ）を示す。

【図26A-B】規定の塩基または塩基への群の活性への寄与を調査するために突然変異されたものを含む結晶構造からのＳｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡを示す。

【図27A-C】必須機能ドメインのマッピングのための突然変異体（Ａ）、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９からの領域を含有するキメラ（Ｂ）、およびＳｐＣａｓ９の化学誘導性ダイマー化の設計（Ｃ）を含む本明細書の結晶構造に基づくキメラ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））Ｃａｓ９のトランケーションおよび作出を示す。

【図28】Ｃａｓ９結晶（０．２ｍｍ）の写真を示す。

【図29】Ｃａｓ９を表面表現で示す構造図を示す；赤色、ｓｇＲＮＡ；シアン、ｓｇＲＮＡのガイド領域；金色、標的ＤＮＡ。

【図30A-D】全体構造を示す。（Ａ）化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のドメイン組織化、およびｓｇＲＮＡ：標的ＤＮＡ複合体の模式図。（Ｂ）Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のリボン表示。不規則なリンカーを赤色点線として示す。（Ｃ）Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の表面表現。ＲｕｖＣ（Ｄ１０Ａ）およびＨＮＨ（Ｈ８４０Ａ）ドメインの活性部位を破線黄色円により示す。（Ｄ）Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の静電表面電位。明確性のためにＨＮＨドメインは省略する。分子グラフ画像は、ＣｕｅＭｏｌ（ｃｕｅｍｏｌ．ｏｒｇのウェブサイト参照）を使用して作成した。図３７および３８も参照。

【図31A-E】ＲＥＣローブおよびＰＩドメインを示す。（Ａ）ＲＥＣローブの構造。ＲＥＣ２ドメインおよびブリッジヘリックスをそれぞれ暗灰色および緑色に着色する。ＲＥＣ１ドメインを灰色に着色し、リピート相互作用およびアンチリピート相互作用領域をそれぞれ淡青色および桃色に着色する。結合ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡを半透明リボン表示として示す。（Ｂ）ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメイン中のＳｐＣａｓ９トランケーションの位置を示す模式図。右側のバーは、トランケーション突然変異体により生成されたインデル突然変異を示し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、Ｎ．Ｄ．は、検出不能を示す）により計測した。（Ｃ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のトランケーション突然変異体の発現を示すウエスタンブロット。（Ｄ）ＰＩドメインの構造。結合ｓｇＲＮＡを半透明リボン表示として示す。（Ｅ）野生型ＳｐＣａｓ９およびＳｔ３Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９、ならびにＳｐＣａｓ９ＰＩドメイントランケーション構築物の示す模式図。Ｃａｓ９は、ＮＧＧ（左側の棒グラフ）またはＮＧＧＮＧ（右側の棒グラフ）ＰＡＭ（ｎ＝３、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、Ｎ．Ｄ．は、検出不能を示す）のいずれかの上流の標的部位におけるインデル生成についてアッセイする。図３９〜４１も参照。

【図32A-F】ＮＵＣローブを示す。ヘリックスを筒状物として示し、ベータシートを矢印として示す。（Ａ）ＲｕｖＣドメインの構造。ＲＮアーゼＨ折り畳みコアのコア構造をシアンでハイライト表示する。活性部位残基をスティックモデルとして示す。（Ｂ）ホリデイジャンクションとの複合体におけるＴ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣダイマーの構造（ＰＤＢ ＩＤ ４ＬＤ０）。２つのプロモーターをそれぞれシアンおよび灰色に着色する。（Ｃ）配列（上段）は、逆鎖のＤＮＡ上のＣａｓ９ニック形成標的を説明する。標的１および２は、それらの間で４ｂｐの距離だけ離隔する。ヒートマップ（下段）は、二本鎖（ｓｇＲＮＡ１または２のいずれかを用いる）または一本鎖分解（両方のｓｇＲＮＡを一緒にのみ用いる）を誘導するそれぞれの触媒突然変異体の能力を示す。灰色枠：アッセイせず。（Ｄ）Ｃａｓ９ニッカーゼによるインデル形成は、ｓｇＲＮＡペア間の離隔距離に依存する（右パネル）。離隔距離は、所与のｓｇＲＮＡペアのガイド配列のＰＡＭ−遠位（５’）終端間の塩基対の数として定義する（ｎ＝３、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、Ｎ．Ｄ．は、検出不能を示す）。（Ｅ）ＨＮＨドメインの構造。ββα−金属折り畳みのコア構造をマゼンタでハイライト表示する。活性部位残基をスティックモデルとして示す。（Ｆ）ホリデイジャンクションとの複合体におけるＴ４ＥｎｄｏＶＩＩダイマーの構造（ＰＤＢ ＩＤ ２ＱＮＣ）。２つのプロモーターをそれぞれ桃色および灰色に着色し、ββα−金属折り畳みコアをマゼンタでハイライト表示する。結合Ｍｇ^２＋イオンをオレンジ球状物として示す。

【図33A-D】ｓｇＲＮＡおよびその標的ＤＮＡを示す。（Ａ）ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ複合体の模式図。ｃｒＲＮＡ配列のガイドおよびリピート領域をそれぞれ空色および青色に着色する。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を赤色に着色し、リンカー領域を青紫色に着色する。標的ＤＮＡおよびテトラループをそれぞれ黄色および黒色に着色する。ｔｒａｃｒＲＮＡの３’テールのナンバリングを赤色背景上で示す。ワトソン−クリックおよび非ワトソン−クリック塩基対をそれぞれ黒色および灰色線により示す。不規則なヌクレオチドを点線により枠で囲む。（Ｂ）ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ複合体の構造。（Ｃ）リピート：アンチリピート二本鎖および三方向ジャンクションの構造。キー相互作用を灰色点線として示す。（Ｄ）インデル誘導能に対するｓｇＲＮＡ突然変異の効果。＋８３ｓｇＲＮＡ足場からの塩基変化をそれぞれの位置において示し、点線は未変更塩基を示す（ｎ＝３、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定に基づき、Ｎ．Ｄ．は、検出不能を示す）。図４２も参照。

【図34A-K】ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡの認識を示す。（Ａ）Ｃａｓ９によるｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ認識の模式図。主鎖を介してｓｇＲＮＡ：ＤＮＡと相互作用する残基を括弧で示す。（ＢおよびＣ〜Ｋ）ガイド（Ｂ）、ガイド：ＤＮＡ二本鎖（Ｄ）、リピート（Ｅ）、アンチリピート（Ｆ）、三方向ジャンクション（Ｇ）、ステムループ１（Ｈ）、リンカー（Ｉ）、ステムループ２（Ｊ）およびステムループ３（Ｋ）の認識。水素結合および塩架橋を点線として示す。（Ｃ）インデル誘導能に対するＣａｓ９（上段）およびｓｇＲＮＡ（下段）突然変異の効果（ｎ＝３、エラーバーは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示し、ｐ値は、対応のないスチューデントｔ検定に基づき、Ｎ．Ｄ．は、検出不能を示す）。

【図35A-D】複合体の構造フレキシビリティーを示す。（Ａ）Ｍｏｌ ＡおよびＭｏｌ Ｂの構造比較。Ｍｏｌ Ａ（左側）において、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメイン間の不規則リンカーを破線により示す。Ｍｏｌ Ｂ（右側）において、不規則ＨＮＨドメインを点線円により示す。ＲｕｖＣドメイン中のフレキシブル連結セグメント（α４０およびα４１）を橙色でハイライト表示する。（Ｂ）Ｍｏｌ ＡおよびＭｏｌ Ｂ中のＣａｓ９タンパク質の重ね合わせ。２つの複合体をそれらのＲｕｖＣドメインのコアβ−シートに基づき重ね合わせる。明確性のため、ＨＮＨドメインおよび結合ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡを省略する。（Ｃ）Ｍｏｌ ＡおよびＭｏｌ Ｂ中の結合ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡの重ね合わせ。（Ｂ）における２つの複合体の重ね合わせ後、Ｃａｓ９タンパク質を省略してｓｇＲＮＡ：ＤＮＡを示す。（Ｄ）Ｃａｓ９の分子表面。明確性のため、ＨＮＨドメインおよび結合ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を省略する。ａ２−α３ループとβ１７−β１８ループとの間の相互作用を除き、ＲＥＣおよびＮＵＣローブ間の直接接触は存在しないことに留意されたい。

【図36】Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ開裂のモデルを示す。

【図37】電子密度マップを示す。三方向ジャンクション周囲の２ｍＦ_Ｏ−ＤＦ_Ｃ電子密度マップを灰色メッシュとして示す（２．５σにおいて起伏）。

【図38A-C】ジシステイン突然変異体（Ｃ８０Ｌ／Ｃ５７４Ｅ）がＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中で機能的であることを示す。（Ａ）Ｃａｓ９中のシステイン突然変異（Ｃ８０ＬおよびＣ５７４Ｅ）の位置を説明する模式図。（Ｂ）Ｃａｓ９のＣ８０Ｌ／Ｃ５７４Ｅ突然変異体の機能を試験するために使用された標的部位の配列。（Ｃ）野生型またはＣ８０Ｌ／Ｃ５７４Ｅ突然変異体のいずれかにより生成されたインデルを示すＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ（ｎ＝３）。

【図39】Ｃａｓ９の二次構造エレメントの図面を説明する模式図を示す。

【図40A-B】ファミリーＩＩ−ＡおよびＩＩ−ＣにおけるＣａｓ９オルソログの配列アラインメントを示す。触媒残基を赤色三角で示す。ブリッジヘリックス上のクリティカルなアルギニン残基を緑色三角で示す。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の二次構造を配列の上部に示す。この図は、ＴＣｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）およびＥＳＰｒｉｐｔ（Ｇｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を使用して作成した。Ｓｐ、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；Ｓｍ、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）；Ｓｔ３、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ−３；Ｓｔ１、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ−１；Ｃｊ、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；Ｍｍ；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）。

【図41】ファミリーＩＩ−Ａ、ＩＩ−ＢおよびＩＩ−ＣにおけるＣａｓ９オルソログの配列アラインメントを示す。ファミリーＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣからの３５個のＣａｓ９オルソログをアラインし（ＢＬＯＳＵＭ６２）、クラスター化する（Ｊｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒモデル近隣結合法、外集団として化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いる）。上段のバーは、アミノ酸による保存を示す。それぞれの線において、黒色バーは少なくとも７５％のコンセンサスを有する残基を示し、灰色バーは非保存残基を示す。

【図42】ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖と基準Ａ型ＲＮＡ二本鎖との比較を示す。ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖をＡ型ＲＮＡ二本鎖上でそれらのリン原子に基づき重ね合わせる。Ａ型ＲＮＡ二本鎖を暗灰色に着色する。明確性のため、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド５１〜９７を省略する。

【図43】既に研究されたｄＣａｓ９アクチベーター設計のＤＮＡ構築物設計を示す。活性化ドメインを触媒的に不活性なｄＣａｓのＣ末端にリンカーを介して融合させる。ＮＬＳは、Ｃａｓ９とＶＰ６４との間に取り込む。

【図44】ｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２の終端におけるＭＳ２ループの挿入物の説明を示す。ＭＳ２−ＶＰ６４融合タンパク質をそれら２つのループにリクルートする。ｄＣａｓ９と一緒になると、これは標的遺伝子座の標的ＤＮＡへのＶＰ６４活性化ドメインのリクルートメントをもたらす。挿入されたＭＳ２ＲＮＡステムループを暗緑色に着色する。

【図45】Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞中のＮｅｕｒｏｇ２発現の上方調節のグラフ表示を示す。テトラループもしくはループ２のいずれか、その両方に挿入されたＭｓ２ループを含み、またはそれを含まない４つの異なるガイドＲＮＡを、ｄＣａｓ９およびＭＳ２−ｖｐ６４、ｄＣａｓ９−ｖｐ６４およびＭＳ２−ｖｐ６４またはｄＣａｓ９−ｖｐ６４単独との組合せで試験した。ＴＬ：ＭＳ２、ｓｇＲＮＡテトラループ中へのＭＳ２ループ挿入；Ｌ２：ＭＳ２、ｓｇＲＮＡのループ２中へのＭＳ２ループ挿入。色は、どのタンパク質コード構築物を、対応するガイドと同時形質移入したかを示す。

【図46】Ｃａｓ９−ＭＳ２アクチベーターによるヒトＡＳＣＬ１上方調節を示す。

【図47】Ｃａｓ９−ＭＳ２アクチベーターによるヒトＭＹＯＤ１上方調節を示す。

【図48】オルソゴナルＰＰ７／ＭＳ２遺伝子標的化の説明を示す。模式図において、異なる遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡは、それらの遺伝子座をそれぞれ活性化および抑制するＭＳ２−ＶＰ６４またはＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘをリクルートするように区別されるＲＮＡループにより改変する。

【図49】Ｃａｓ９中の転写ドメイン置換および挿入の位置を示す。ＨＮＨドメインを桃色に着色する。曲線矢印は、立体構造変化に起因するＤＮＡ（黄色）ＲＮＡ（青色）二本鎖に対するＨＮＨドメインの移動を示す。赤色円中のＡは、転写エフェクタードメインの挿入に使用された第１のループ（ＡＡ Ｇ５３３）および標的ＤＮＡに対するその位置を示す。転写エフェクタードメインの挿入のための第３のループ（Ｋ１１５３）を赤色円上でＣにより示す。

【図50】ＡＳＣＬ１活性化に対するｓｇＲＮＡ改変の効果を示す。３’ＭＳ２および改変ＭＳ２ １．０ｓｇＲＮＡアーキテクチャーをそれらのＡＳＣＬ１活性化能について試験した。

【図51】ｓｇＲＮＡ改変ＭＹＯＤ１活性化の効果を示す。３’ＭＳ２および改変ＭＳ２ １．０ｓｇＲＮＡアーキテクチャーをそれらのＡＳＣＬ１活性化能について試験した。

【図52】ＡＳＣＬ１活性化に対するｄＣａｓ９ＮＬＳおよびＮ８６３Ａ改変の効果を示す。

【図53】ＭＹＯＤ１活性化に対するｄＣａｓ９ＮＬＳおよびＮ８６３Ａ改変の効果を示す。

【図54】個々または組合せの活性化ドメインに融合しているＭＳ２との組合せにおける異なるＮＬＳおよび点突然変異ｄＣａｓ−ＶＰ６４アークテクチャーの比較を示す。ＳＶ４０：ＳＶ４０ＮＬＳ；ａ−ｉｍｐ：ａ−インポーチンＮＬＳ；ＤＶ：ｄＣａｓ−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＶＰ６４；Ｍｍ：ＭＳ２−ＡＳＣＬ１ＴＡＤ；ＭＰ：ＭＳ２−ｐ６５；ＭＰＨ：ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１；ＭＰｍ：ＭＳ２−ｐ６５−ＡＳＣＬ１ＴＡＤ。全てのｄＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ（特に記載のない場合）を含有する。

【図55】個々または組合せの活性化ドメインに融合しているＭＳ２との組合せにおける異なるＮＬＳおよび点突然変異ｄＣａｓ−ＶＰ６４アークテクチャーの比較を示す。ＳＶ４０：ＳＶ４０ＮＬＳ；ａ−ｉｍｐ：ａ−インポーチンＮＬＳ；ＤＶ：ｄＣａｓ−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＶＰ６４；Ｍｍ：ＭＳ２−ＭｙｏｄＴＡＤ；ＭＰ：ＭＳ２−ｐ６５；ＭＰＨ：ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１；ＭＰｍ：ＭＳ２−ｐ６５−ＭｙｏｄＴＡＤ。全てのｄＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ（特に記載のない場合）を含有する。

【図56】ＡＳＣＬ１活性化のためのＭＳ２二重アクチベーター融合タンパク質を示す。追加のＨＳＦ１活性化ドメイン融合物を有し、または有さないＭＳ２−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５の比較。最大の相対的改善は、それ自体の活性化ドメインを有さないｄＣａｓ９について生じた。この改善は、マルチモーダル転写モジュレーションにおける系の将来的使用に特に重要であり、転写モジュレーションは、ｄＣａｓ９ではなく、ｓｇＲＮＡおよびそのアプタマー化タンパク質によってのみ生じ、区別されるガイド配列が区別される機能を標的化することが可能となる。

【図57】ＭＹＯＤ１活性化のためのＭＳ２二重アクチベーター融合タンパク質を示す。

【図58】モジュレートすることが困難な１２個の遺伝子について単一ｓｇＲＮＡガイド配列により活性された発現レベル倍率を示す。ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１／ＳＶ４０−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４系により示された全ての活性化。ガイド局在をそれぞれの標的のＴＳＳに対してプロットする。

【図59】上記列記の困難な標的についての対照試料中のその遺伝子についてのｑＰＣＲからのデルタＣｔ値に対する最良のガイド配列の発現倍率のプロットを示す。

【図60】１０個の遺伝子の多重化活性化を示す。

【図61】標的遺伝子の多重化活性化を示す。

【図62】既に決定された最適な単一ガイドを同時に使用する２、４、６、８または１０個の遺伝子の組合せの標的化を示す。全ての実験は、ＮＬＳ−ｄＣＡＳ（Ｄ１０、Ｈ８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４をＭＳ２−ＮＬＳ−Ｐ６５−ＨＳＦ１との組合せで使用する。

【図63】標的遺伝子の多重化活性化群を示す。

【図64A-F】ＲＮＡガイド転写活性化複合体の構造ガイド設計および最適化を示す。ａ、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ三元複合体の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：４ＯＯ８）は、標的ＤＮＡからのＮおよびＣ末端融合部位の閉塞を明らかにする。ｓｇＲＮＡテトラループおよびステムループ２は、この立体構造でＣａｓ９アミノ酸残基に大部分接触せず、既存のＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ相互作用を変更せずに改変することができる。ｂ、３成分転写活性化系（ＳＡＭ）：ｓｇＲＮＡ２．０、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１転写トランスアクチベーター、およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の図。ｓｇＲＮＡに対するＭＳ２ステムループ付加を赤色でハイライト表示する。ｃ、ＭＳ２−ＶＰ６４トランスアクチベーターの最適なリクルートメントのためのｓｇＲＮＡ足場の設計および最適化。ｄ、ｓｇＲＮＡ内のＭＳ２ステムループ配置は、転写活性化効率に顕著に影響する。ｅ、異なる活性化ドメインの組合せは、相乗的に作用して転写活性化のレベルをさらに向上させる。ｆ、ＭＳ２−ｐ６５へのＨＳＦ１トランス活性化ドメインの付加は、転写活性化の効率をさらに増加させる。全ての値は、平均＋−ＳＥＭであり、ｎ＝３である。^＊は、スチューデントｔ検定に基づくｐ＜０．０５を示す。

【図65A-D】ＳＡＭ媒介遺伝子活性化の特性決定および効率的なｓｇＲＮＡについての選択規則を示す。ａ、ｓｇＲＮＡの局在に対してプロットされた１２個の異なる遺伝子の活性化倍率。距離は、＋１におけるＴＳＳに対するｂｐで計測する。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４を有するｓｇＲＮＡ１．０（灰色）、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１を有するｓｇＲＮＡ２．０（青色）。矢印は、不十分な転写活性化を有するｓｇＲＮＡ標的部位を示す。全ての値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。ｂ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４および標的遺伝子のための単一ｓｇＲＮＡ１．０；ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、単一ｓｇＲＮＡ１．０と同一の標的部位のための単一ｓｇＲＮＡ２．０、およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１；ならびにｄＣａｓ９−ＶＰ６４および同一遺伝子を標的化する８つのｓｇＲＮＡの混合物を使用して達成された活性化効率の比較。ｃ、標的遺伝子転写活性化の、そのベースライン発現レベルの関数としての効率。より高い基礎レベルの転写を有する遺伝子は、より低い上方調節倍率を示す。それぞれの標的遺伝子について、ベースライン発現レベルは、ＧＦＰ形質移入対照細胞におけるｑＰＣＲを使用して計測し、ＧＡＰＤＨに対するレベルとして表現する（ｘ軸上でＧＡＰＤＨと比較して低い発現倍率）。ｄ、遺伝子活性化効率と、ＴＳＳへの距離として表現される近位プロモーター領域中のｓｇＲＮＡ標的化位置との相関。同一標的遺伝子についてのそれぞれのｓｇＲＮＡの活性化効率は、最大活性化ｓｇＲＮＡに対して正規化する。ＴＳＳへの近位性は、標的上方調節と正に相関する。青色線は中央値を示し、枠は２５および７５パーセンタイルを示す。

【図66A-B】ＳＡＭが特性決定および未特性決定ｌｉｎｃＲＮＡ転写物を活性化させることを示す。ａ、ＴＳＳに対するｓｇＲＮＡ２．０の局在に対してプロットされた６つのｌｉｎｃＲＮＡの活性化倍率。全ての値は、平均＋−ＳＥＭであり、ｎ＝３である。ｂ、ｓｇＲＮＡｌｉｎｃＲＮＡ活性化効率と、ＴＳＳへのｓｇＲＮＡ標的距離との相関。同一の標的ｌｉｎｃＲＮＡについてのそれぞれのｓｇＲＮＡの活性化効率は、最大活性化ｓｇＲＮＡに対して正規化する。コード遺伝子とは対照的に、有意な相関は観察されない。青色線は、中央値を示し、枠は２５および７５パーセンタイルを示す。

【図67A-E】多重化ｓｇＲＮＡ２．０発現を使用する内因性遺伝子の同時活性化を示す。ａ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１を有する単一ｓｇＲＮＡ２．０による個々の遺伝子の活性化。ｂ、異なる遺伝子をそれぞれ標的化する１０個のｓｇＲＮＡ２．０の混合物を使用する１０個の遺伝子の同時活性化。ｃ、個々のｓｇＲＮＡ２．０の活性化の相対的効率は、標的遺伝子および異なる遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡ２．０の数に応じて変動する。ｄ、遺伝子活性化効率に対するｓｇＲＮＡ希釈の効果。結果は、標的遺伝子に対する単一未希釈ｓｇＲＮＡ２．０の活性化倍率に対する活性化の割合としてプロットする。ｅ、単一１０倍希釈ｓｇＲＮＡ２．０の活性化効率と、１０個の異なる遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡ２．０の混合物内で送達された同一のｓｇＲＮＡ２．０の活性化効率との間の相関プロット。ｓｇＲＮＡ希釈間の性能は、多重化における性能を有意に予測し、多重化挙動のガイド自律成分を示唆する。全ての値は、平均＋−ＳＥＭであり、ｎ＝３である。

【図68A-E】ＳＡＭを使用する哺乳動物細胞におけるゲノムスケールレンチウイルススクリーンを示す。ａ、ｓｇＲＮＡ２．０、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１を発現させるための３つのレンチウイルスベクターの設計。それぞれのベクターは、３つ全てのベクターを発現する細胞の同時選択を可能とする区別される選択マーカーを含有する。ｂ、ＳＡＭ成分のレンチウイルス送達は、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１により安定的にインテグレートされた２９３ＦＴ細胞系を最初に生成し、続いてそれらの細胞を単一遺伝子標的化レンチウイルスｓｇＲＮＡ２．０によりＭＯＩ＜０．２において形質導入することにより試験した。転写活性化効率は、ｓｇＲＮＡ２．０レンチウイルス形質導入およびＺｅｏｃｉｎまたはピューロマイシンによる選択の４日後に計測する。全ての値は、平均＋−ＳＥＭであり、ｎ＝３である。ｃ、ＳＡＭを使用する転写活性化スクリーニングのフローチャート。ｄ、Ａ３７５細胞中の形質導入の３および２１日後のｓｇＲＮＡ２．０の累積頻度。２１日間曲線のシフトは、ｓｇＲＮＡ２．０のサブセットの枯渇を表す。全てのガイドの０．１％未満は、３日目に検出されない（１０個未満のリードにより検出）。ｅ、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｐ＜０．０１ Ｂ−Ｈ ＦＤＲ補正後）に基づく有意な枯渇を示す遺伝子カテゴリー。左側のカテゴリーは、１０００個の最も枯渇したガイドに基づき、右側のカテゴリーは、３つ全てのガイド／遺伝子の平均に基づく最大枯渇を有する１０００個の遺伝子に基づく。

【図69A-F】ゲノムスケール遺伝子活性化スクリーニングが、ＢＲＡＦ阻害剤耐性のメディエーターを同定することを示す。ａ、ＰＬＸ−４７２０による処理を用い、または用いないレンチウイルス形質導入後の異なる時点におけるｓｇＲＮＡ２．０頻度の分布を示す枠プロット。ビヒクルは、ＤＭＳＯである。２つの感染レプリケートを示す。ｂ、ＰＬＸ−４７２０処理後の特異的ｓｇＲＮＡ２．０のエンリッチメントを示すスカッタープロット。ｃ、両方の感染レプリケートの平均に基づくＲＩＧＥＲ Ｐ値分析（ＫＳ法）を使用する上位の候補遺伝子の同定。遺伝子は、染色体内の位置により組織化される。ｄ、ＢＲＡＦ阻害剤耐性をもたらす遺伝子摂動についての、ＳＡＭおよびＧｅＣＫＯスクリーンからの上位１００ヒットについてのＲＩＧＥＲ Ｐ値。ｅ、ＲＩＧＥＲを使用して同定されたピューロマイシンおよびＺｅｏｃｉｎスクリーンからの上位１０個の共有候補を示す。両方のスクリーンについて、全てのエンリッチｓｇＲＮＡ２．０の上位５％に存在するそれぞれの遺伝子を標的化するユニークｓｇＲＮＡ２．０のパーセントをプロットする。ｆ．ｚスコアのヒートマップ、それぞれの列は異なるＢＲＡＦ^Ｖ６００黒色腫短期培養物を表し、行はＢＲＡＦ阻害剤マーカー遺伝子の発現およびシグネチャー（上段パネル）、ＳＡＭ上位スクリーンヒットの発現（中段パネル）およびスクリーンシグネチャースコア（単一試料遺伝子セットエンリッチメント分析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用するシグネチャー生成の方法を参照）（下段パネル）を表す。遺伝子およびシグネチャーの区別される転写状態は、既に定義されたＢＲＡＦ阻害耐性を表す（Ｋｏｎｉｅｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４，８１６−８２７，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−０４２４（２０１４））。列は、ＭＩＴＦ発現によりソートし、最大発現は、ＢＲＡＦ阻害剤感受性を示す。ＳＡＭスクリーンのからの上位ヒットは、耐性状態と有意に関連する（ＭＩＴＦ低発現および高レベルの耐性マーカー）。試料のサブセットは、ＰＬＸ感受性（青色文字／矢印）および耐性（赤色文字／矢印）について既に試験した。ＩＣ：情報係数（詳細については方法を参照）。Ｐ値は、並べ替え検定を使用して生成する（ｎ＝１０，０００）。

【図70A-E】Ｃａｓ９ｓｇＲＮＡの構造ガイドエンジニアリングを示す。ａ、それぞれのステムループとＣａｓ９との間の接触を示すｓｇＲＮＡステムループの模式図。アミノ酸残基の接触を黄色でハイライト表示する。テトラループおよびステムループ２はＣａｓ９とのいかなる接触も有さない一方、ステムループ１および３はＣａｓ９との広い接触を共有する。ｂ、テトラループおよびステムループ２中に挿入されたＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡ２．０。ｃ、Ｃａｓ９中の第２のＮＬＳまたは代替ＨＮＨドメイン不活性化突然変異の付加は、ＭＹＯＤ１についての転写活性化の効率を改善する。ｄ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４アクチベーターは、テトラループおよびステムループ２へのＭＳ２−Ｐ６５のリクルートメントにより改善された性能を示す。テトラループにおけるＡＵフリップの付加または伸長は、ｄＣａｓ９媒介転写活性化の有効性を増加させない。ｅ、テトラループおよびステムループ２は、ＭＳ２ステムループによる置換に適する。ｓｇＲＮＡ２．０足場からの塩基変化をそれぞれの位置において示し、点線は未変更塩基を示し、点線下方の塩基は挿入物を示す。欠失は、それぞれの位置における点線の不存在により示す。全ての図は、ｎ＝３および平均±ＳＥＭである。

【図71A-C】ＳＡＭが、低レベルの非特異的活性化で１２個の遺伝子のパネルの効率的な活性化を媒介することを示す。ａ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４をＭＳ２−Ｐ６５、ＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１、またはＭＳ２−Ｐ６５−ＭＹＯＤ１との組合せで用いる１２個の遺伝子の活性化レベルの比較。ＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１は、１２個の遺伝子のうち９つについて、ＭＳ２−Ｐ６５単独よりも有意に高い活性化を媒介した。それぞれの遺伝子について８つの試験されたもののうちの最良のガイド（図２ａ参照）を使用し、この実験において使用する。それぞれのタイプのＭＳ２融合物についての活性化レベルを、ＭＳ２−Ｐ６５を使用して達成された活性化に対する割合として提示する。ｂ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１アクチベーター成分による非特異的バックグラウンド活性化を、１２個全ての遺伝子について決定した。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１を非標的化（スクランブル）ガイドと同時形質移入した。ＧＦＰにより形質移入された細胞を使用してそれぞれの遺伝子についてのベースライン発現レベルを計測した。スクランブルガイドによるＩＬ１Ｒ２の活性化のみが、ＧＦＰ試料と有意に異なる。スチューデントｔ検定によるｐ＜０．０５。ｃ、ａにおいて示されるオンターゲット活性化の％として示される両方のスクランブルガイドについての平均活性化。スクランブルガイドによる活性化は、１２個全ての遺伝子について１％未満のオンターゲット活性化を計測する。エラーバーは、ＳＥＭを示す。ｎ＝３。

【図72】ＳＡＭによる特性決定または未特性決定ｌｉｎｃＲＮＡの活性化を示す。ＳＡＭを使用して６つのｌｉｎｃＲＮＡを標的化した。それぞれのｌｉｎｃＲＮＡについて、４つの異なるＭＳ２アクチベーター（ＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１、ＭＳ２−Ｐ６５−ＭｙｏＤ１、ＭＳ２−Ｐ６５、およびＭＳ２−ＶＰ６４）をｄＣａｓ９−ＶＰ６４との組合せで用いて近位プロモーター領域（ＴＳＳから＋１から−８００ｂｐ）を標的化するように８つのｓｇＲＮＡを設計した。２つの異なるドメインとの組合せのＭＳ２アクチベーター（ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１またはＭＳ２−ｐ６５−ＭｙｏＤ１）は、それぞれのｌｉｎｃＲＮＡについて最大活性化を一貫して提供し、ＭＳ２−ｐ６５に対するＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１またはＭＳ２−ｐ６５−ＭｙｏＤ１についてｐ＜０．０１であった。

【図73】ＳＡＭを使用する多重化活性化を示す。２、４、６、または８つのｓｇＲＮＡｓの同時組合せによる１０個の遺伝子のパネルの活性化。上方調節の平均倍率をｌｏｇ_１０スケールで示す。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを示し、ｎ＝３である。

【図74A-B】ＳＡＭ成分の投与量の関数としての１２個の遺伝子のパネルの活性化を示す。ａ、転写上方調節の有効性に対するＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４希釈、それぞれの成分の元の投与量の１：１、１：４、１：１０、および１：５０の効果。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量は一定に保持する。ｂ、それぞれの成分についての元の投与量の１：４、１：１０、および１：５０における３つ全てのＳＡＭ成分（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１、およびｓｇＲＮＡ２．０）の希釈の効果。上方調節の倍率は、ベースラインとしてのＧＦＰ形質移入細胞を使用して計算する。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍを示し、ｎ＝３である。

【図75A-B】癌生存および増幅経路の成分がゲノムワイドＳＡＭスクリーンにおいて枯渇することを示す。３つの全てのガイド／遺伝子の平均枯渇に基づく上位３００個の枯渇遺伝子に対するＩＰＡ分析は、２つのネットワークをもたらし、スコア＞３０であった。枯渇遺伝子を赤色で示す。ａ、ネットワークスコア＝３９、ネットワーク中の２６個の枯渇遺伝子。ｂ、ネットワークスコア＝３７、ネットワーク中の２５個の枯渇遺伝子。両方のネットワークの全ての層上の成分は枯渇を示す。

【図76A-D】ピューロマイシン耐性ＳＡＭ ｓｇＲＮＡ２．０ライブラリーを使用するゲノムワイドレンチウイルススクリーンを示す。ａ、ピューロマイシン耐性ｓｇＲＮＡ２．０レンチウイルスによるＡ３７５細胞の形質導入の３および２１日後のｓｇＲＮＡ２．０の累積頻度。２１日間曲線のシフトは、ｓｇＲＮＡ２．０のサブセットの枯渇を表す。ｂ、ＤＭＳＯビヒクルまたはＰＬＸ−４７２０による処理後のピューロマイシンライブラリーによるレンチウイルス形質導入後の異なる時点におけるｓｇＲＮＡ２．０頻度の分布を示す枠プロット。２つの感染レプリケートを示す。ｃ、両方の感染レプリケートの平均に基づくＲＩＧＥＲ Ｐ値分析（ＫＳ法）を使用する上位の候補遺伝子の同定。遺伝子は、染色体内の位置により組織化される。ｄ、ＺｅｏおよびＰｕｒｏスクリーンからの上位２０ヒット間の重複。同一ファミリーに属する遺伝子を同一色により示す。ベン図の交差において示されるとおり、それぞれのスクリーンの上位ヒット間に５０％の重複が存在する。

【図77】Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ発現および追加の黒色腫細胞系からの薬理学的データを使用する上位スクリーンヒットの検証を示す。ｚスコアのヒートマップ、それぞれの列は異なるＢＲＡＦ^Ｖ６００黒色腫細胞系を表し、行は異なる薬物に対する感受性（上段パネル）、ＳＡＭ上位スクリーンヒットの発現（中段パネル）、およびＳＡＭスクリーンシグネチャースコア（下段パネル、シグネチャー生成の方法を参照）を表す。薬物感受性は、８−アクティビティーエリア（８−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｒｅａ）（ＡＡ）（Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４８３，６０３−６０７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３（２０１２））として計測する。黒色腫細胞系をＰＬＸ薬物感受性によりソートし、より低い値（青色）は、増加した感受性に対応する。関連ＭＡＰＫ阻害剤に対する感受性も示される。ＭＡＰＫ阻害剤に対する耐性を実証するわずかな細胞系が存在し、それらの細胞系において、ＳＡＭ上位ヒットの多くは高度に発現される。これらの上位ヒットに含まれるシグネチャーも、耐性細胞系内で高度にスコアリングされる。関連は、ＰＬＸ−４７２０感受性（インデックス）と特徴のそれぞれとの間の情報係数（ＩＣ）を使用して計測し、ｐ値は並べ替え検定を使用して決定する。ＲＡＦ阻害剤：ＰＬＸ４７２０およびＲＡＦ２６５；ＭＥＫ阻害剤：ＡＺＤ６２４４およびＰＤ−０３２５９０１。

【図78】Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓからの原発性および転移性黒色腫患者試料における上位スクリーンヒットの検証を示す。ｚスコアのヒートマップ、それぞれの列は異なるＢＲＡＦ^Ｖ６００患者黒色腫（原発性または転移性）を表し、行はＢＲＡＦ阻害感受性についての遺伝子／シグネチャーマーカーの発現（上段パネル）、ＳＡＭ上位スクリーンヒットの発現（中段パネル）およびスクリーンシグネチャースコア（シグネチャー生成の方法を参照）（下段パネル）を表す。これらのＴＣＧＡ黒色腫試料についての薬理学的データが利用可能でないため、最初にＴＣＧＡ遺伝子発現データを遺伝子マーカーおよびシグネチャーのパネルに基づきＢＲＡＦ阻害剤感受性／耐性について既に定義された転写状態上にマッピングする（Ｋｏｎｉｅｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４，８１６−８２７，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−０４２４（２０１４））。上位ＳＡＭスクリーンの個々のヒットの発現は増加し、腫瘍と有意に関連し、耐性状態を示す（低いＭＩＴＦ発現および耐性マーカー／シグネチャーの高い発現と定義）。ＳＡＭスクリーンからの上位遺伝子に含まれるシグネチャーも、耐性腫瘍と有意に関連する。黒色腫試料のパネルをＭＩＴＦ発現の減少によりソートし、より高い値（赤色）はＢＲＡＦ阻害に対してより感受性である試料に対応する。関連は、ＭＩＴＦ発現（インデックス）と特徴のそれぞれとの間の情報係数（ＩＣ）を使用して計測し、ｐ値は並べ替え検定を使用して決定する。

【図79A-D】ｓｇＲＮＡ配列含有率と、有意に枯渇した遺伝子の枯渇のレベルとの間の相関を示す。ｓｇＲＮＡヌクレオチド含有率と２１日後の枯渇のヒートマップ。ｓｇＲＮＡ−ｚｅｏ（ａ、ｂ）またはｓｇＲＮＡ−ｐｕｒｏ（ｃ、ｄ）スクリーンにおける（ＲＩＧＥＲ分析から）有意に枯渇した遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡ配列中のＧ含有率（ａ、ｃ）またはＴ含有率（ｂ、ｄ）を有する傾向について分析した。ｓｇＲＮＡ枯渇は、Ｇ含有率と正に相関し、Ｔ含有率と負に相関する。分析された他の塩基（ＡおよびＣ）は、有意（ｐ＜０．０００７）であるが、弱い（ｒ＜０．２）負の相関を有した。

【図80A-EE】実施例２０の例示的補足配列を示す。

【図81A-E】実施例２０において使用された例示的標的ガイド配列を示す。

【図82A-I】実施例２０におけるＡ３７５についての上位３００個の枯渇遺伝子を示す。それぞれの遺伝子についての平均枯渇を、その遺伝子についての全てのｓｇＲＮＡにわたり平均化された２１日目と３日目のｌｏｇ２比として挙げる。

【図83A-C】実施例２０におけるＰＬＸ（２１日目における２つのレプリケートの平均）をＤＭＳＯ対照（２１日目における２つのレプリケートの平均）を比較するｓｇＲＮＡ−Ｚｅｏ ＰＬＸスクリーンについてのＲＩＧＥＲアルゴリズムの出力からの上位１００個の遺伝子を示す。コルモゴロフ−スミルノフ法を使用して遺伝子をスコアリングした。

【図84A-C】実施例２０におけるＰＬＸ（２１日目における２つのレプリケートの平均）をＤＭＳＯ対照（２１日目における２つのレプリケートの平均）を比較するｓｇＲＮＡ−Ｐｕｒｏ ＰＬＸスクリーンについてのＲＩＧＥＲアルゴリズムの出力からの上位１００個の遺伝子を示す。コルモゴロフ−スミルノフ法を使用して遺伝子をスコアリングした。

【図85】それぞれの遺伝子についての相対ＲＮＡ発現レベルを定量するために使用されたＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲプローブＩＤを示す（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

【図86】結晶構造に基づくＳｐ、ＳａおよびＳｔ３Ｃａｓ９間のキメラの試験を示す。Ａ）ＳｐＣａｓ９のドメイン組織化およびアミノ酸（ＡＡ）位置。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９の新たに同定された構造成分である。Ｂ）キメラ境界のＡＡ位置が示されたＮｕｃローブの部分または完全スワップのキメラマップ。Ｃ）左側のそれぞれの対応するキメラを用いて達成されたインデル％。標識は、使用されたｓｇＲＮＡを示す。ＴＧＳ＝標的化配列（ｓｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー部分）、ＢＢ＝ｓｇＲＮＡ骨格。

【0104】

本明細書の図は、説明の目的のためのものにすぎず、必ずしも縮尺通りに描かれていない。

【発明を実施するための形態】

【0105】

特に、本出願人らは、ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃが、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６およびヌクレオチド＋５３から＋５６を置き換えることを見出した。得られる構造は、テトラループおよびステムループ２配列がＭＳ２結合ループにより置き換えられたｓｇＲＮＡ足場である。理論により拘束されるものではないが、テトラループおよびステムループ２は、Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造から得られる情報に基づき置換のために選択した。具体的には、テトラループおよびステムループ２は、Ｃａｓ９タンパク質から突出することが見出され、その結果、ＭＳ２結合ループの付加がいかなるＣａｓ９残基も干渉しないことを示唆する。さらに、ＤＮＡへのテトラループおよびステムループ２部位の近位性は、それらの局在への局在化が、ＤＮＡと任意のリクルートされるタンパク質、例えば、転写アクチベーターとの間の高程度の相互作用をもたらすことを示唆した。

【0106】

一部の実施形態において、ガイドは、標準ｓｇＲＮＡ骨格の＋１３から＋１６に対応するヌクレオチドおよび／または＋５３から＋５６に対応するヌクレオチドが区別されるＲＮＡにより置き換えられるように改変される。

【0107】

一部の実施形態において、アダプタータンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質である。ＲＮＡ結合タンパク質は、アプタマーであり得る対応する区別されるＲＮＡ配列を認識する。例えば、ＭＳ２ＲＮＡ結合タンパク質は、ＭＳ２アプタマーを認識し、それに特異的に結合する（またはその逆）。

【0108】

一部の実施形態において、ガイドおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素のための抑制ドメインは、以下のとおり作用することが実施例１５に示されるものであり得る：
・転写活性を抑制するＳＩＤ４Ｘドメイン；
・転写活性を抑制するＫＲＡＢドメイン；
・抑制ヒストンメチル化を増加させるＮＵＥドメイン；および
・抑制ヒストン修飾をもたらすヒストンデアセチラーゼをリクルートするＮｃｏＲドメイン。

【0109】

リプレッサードメインについての例示的な配列は、実施例１５に見出すことができる。

【0110】

実施例１５は、オルソゴナルアプローチも示す、特に図４８参照。第１のアプタマー／ＲＮＡ結合タンパク質ペアを有する１つのガイドは、アクチベーターに結合または融合させることができる一方、第２のアプタマー／ＲＮＡ結合タンパク質ペアを有する第２のガイドは、リプレッサーに結合または融合させることができる。ガイドは、異なる標的（遺伝子座）のためのものであるため、このことは、１つの遺伝子が活性化され、１つの遺伝子が抑制されることを可能とする。例えば、以下の模式は、そのようなアプローチを示す：
ガイド１−ＭＳ２アプタマー−−−−−−−ＭＳ２ＲＮＡ結合タンパク質−−−−−−−ＶＰ６４アクチベーター；および
ガイド２−ＰＰ７アプタマー−−−−−−−ＰＰ７ＲＮＡ結合タンパク質−−−−−−−ＳＩＤ４ｘリプレッサー。

【0111】

図４８は、オルソゴナルＰＰ７／ＭＳ２遺伝子標的化の説明である。この実施例において、異なる遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡは、それらの標的遺伝子座をそれぞれ活性化および抑制するＭＳ２−ＶＰ６４またはＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘをリクルートするように区別されるＲＮＡループにより改変される。ＰＰ７は、バクテリオファージシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＭＳ２と同様に、それは特異的ＲＮＡ配列および二次構造に結合する。ＰＰ７ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のものとは区別される。結果的に、ＰＰ７およびＭＳ２を多重化して異なるゲノム遺伝子座における区別される効果を同時に媒介することができる。例えば、遺伝子座Ａを標的化するｓｇＲＮＡをＭＳ２ループにより改変し、ＭＳ２−ＶＰ６４アクチベーターをリクルートすることができる一方、遺伝子座Ｂを標的化する別のｓｇＲＮＡをＰＰ７ループにより改変し、ＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメインをリクルートすることができる。したがって、同一の細胞において、ｄＣａｓ９はオルソゴナル遺伝子座特異的改変を媒介し得る。この原理は、他のオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｑ−ベータを取り込むように拡張することができる。

【0112】

２つの異なるアプタマー（区別されるＲＮＡ）の使用は、異なるガイドを用いてアクチベーター−アダプタータンパク質融合物およびリプレッサー−アダプタータンパク質融合物の使用を可能としてある遺伝子の発現を活性化させる一方、別の遺伝子を抑制する。これらは、それらの異なるガイドとともに、多重化アプローチにおいて一緒にまたは実質的に一緒に投与することができる。多数、例えば、１０または２０または３０個などのこのような改変ガイドを同時に全て使用することができる一方、送達すべきＣａｓ９の１つのみ（または少なくとも最小数）を比較的少数のＣａｓ９として多数の改変ガイドと使用することができる。アダプタータンパク質は、１つ以上のアクチベーターまたは１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは、結合または融合）させることができる。例えば、アダプタータンパク質は、第１のアクチベーターおよび第２のアクチベーターと会合させることができる。第１および第２のアクチベーターは同一であり得るが、それらは好ましくは異なるアクチベーターである。例えば、一方はＶＰ６４であり得る一方、他方はｐ６５であり得るが、それらは例にすぎず、他の転写アクチベーターが想定される。３つ以上またはさらには４つ以上のアクチベーター（またはリプレッサー）を使用することができるが、パッケージサイズは数を制限し得、それは５つよりも多数の異なる機能ドメインである。リンカーは、好ましくは、２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と会合しているアダプタータンパク質への直接融合物に対して使用される。好適なリンカーとしては、ＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることできる。

【0113】

酵素ガイド複合体を全体として２つ以上の機能ドメインと会合させることができることも想定される。例えば、酵素と会合している２つ以上の機能ドメインが存在し得、またはガイドと会合している２つ以上の機能ドメインが存在し得（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）、または酵素と会合している１つ以上の機能ドメインおよびガイドと会合している１つ以上の機能ドメインが存在し得る（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）。

【0114】

アダプタータンパク質とアクチベーターまたはリプレッサーとの間の融合物は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳを使用することができる。これらは、３つの（（ＧＧＧＧＳ）_３）または６、９またはさらには１２個以上のリピートにおいて使用して要求されるとおり好適な長さを提供することができる。リンカーは、ＲＮＡ結合タンパク質と機能ドメイン（アクチベーターまたはリプレッサー）との間、またはＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ９）と機能ドメイン（アクチベーターまたはリプレッサー）との間に使用することができる。リンカーを使用して適切な量の「機械的フレキシビリティー」をエンジニアリングする。

【0115】

一部の実施形態において、ＮＬＳの使用が想定される。本出願人らは、ＳＶ４０からのＮＬＳがそれに関して、特にレンチウイルス送達法を使用する場合に有用であることを見出した。

【0116】

一部の実施形態においてＰＰ７バリアントを使用することができる。例えば、本出願人らは、ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４、およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、ＳＧに突然変異しているアミノ酸６８〜６９を有し、野生型タンパク質からアミノ酸７０〜７５が欠失している）が十分に機能することを見出した。したがって、一部の実施形態において、アダプタータンパク質がＲＮＡ結合タンパク質であり、ＲＮＡ結合タンパク質がＰＰ７である場合、ＰＰ７は上記バリアント、すなわち、ＳＧに突然変異しているアミノ酸６８〜６９を有し、および／または野生型タンパク質からアミノ酸７０〜７５が欠失しているバリアントであり得る。

【0117】

同様に、ＭＳ２バリアント、例えば、Ｎ５５突然変異体、特にＮ５５Ｋ突然変異体を使用することもできる。これは、ＭＳバクテリオファージコートタンパク質のＮ５５Ｋ突然変異体（Ｌｉｍ，Ｆ．，Ｍ．Ｓｐｉｎｇｏｌａ，ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｐｅａｂｏｄｙ．“Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９．１２（１９９４）：９００６−９０１０において、野生型ＭＳ２よりも高い結合親和性を有することが示されている）であり、実施例１４において機能することが示された。

【0118】

本出願人らは、実施例１３において、テトラループおよびループ２中の両方の挿入が有効であることを示した。この特定の実施例において、最も効率的な組合せは、ｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２の両方の中のアプタマー（この場合、ＭＳ２ループ、しかし、本出願人らは、のちに、他のアプタマーも使用することができることを示す）の挿入物を使用する。本出願人らは、これをｄＣａｓ９−ｖｐ６４およびＭＳ２−ｖｐ６４構築物との組合せで使用することができる、換言すれば、ＣＲＩＳＰＲ酵素も改変することも示す。この新たなアクチベーター設計（図４４において説明され、図４５においてＴＬ＋Ｌ２：Ｍｓ２ガイドについて赤色バーとして示される）は、従来の設計（図４３に説明され、図４５において一般ガイドについて緑色バーとして示される）と比較してかなり高い標的遺伝子上方調節を媒介することが見出された。

【0119】

他のアクチベーターを使用することができることも想定される。例えば、実施例１４は、改善されたＣａｓ９アクチベーターアーキテクチャーが、ＭＳ２−ＶＰ６４およびｄＣａｓ９−Ｐ６５またはＭＳ２−Ｐ６５およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４のいずれかとの組合せでテトラループおよびループ２中のＭＳ２ループ挿入物を有するｓｇＲＮＡからなることを示した。換言すると、２つの異なるアクチベーターを使用することができ、一方はＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ９）と会合しており、一方はアプタマーを介してガイドと会合している。本出願人らは、Ｃａｓ９へのＶＰ６４の標準Ｃ末端融合物と比較して増加したこの設計の有効性を示した。本出願人らは、２つの異なる活性化ドメインの組合せが標的遺伝子活性化を改善し得る仮定をさらに裏付けた（例えば、異なるエピジェネティックモジュレーター、一般的な転写因子およびコアクチベーターをリクルートすることによる相乗作用を介して）。本出願人らは、Ｃｈｅｎ，Ｂａｏｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｃｅｌｌ １５５．７（２０１３）：１４７９−１４９１におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９イメージングのために最適化された代替ガイドアーキテクチャーが、標準アーキテクチャーと比べていかなる改善も示さないことも決定した。

【0120】

無論、それらの例におけるアクチベーターをリプレッサーにより置き換えることができることが想定される。

【0121】

本出願人らは、本発明の改変ガイドのステムループ２およびテトラループ内の区別されるＲＮＡ配列（好ましくは、アプタマー）の配置も調査した。実施例１４は、ＧＣトラクトの使用をさらに調査する。これらは、一部の実施形態において好ましい。ＧＣトラクトは、ＧＣもしくはＧＧＧＧＣもしくはＣＣＣＣＧもしくはＣＧＣＣもしくはそれらの相補鎖または２ヌクレオチドから最大、例えば、１０、１５もしくは２０ヌクレオチドのＣおよびＧの混合物であり得る。特定の例において、ＭＳ２結合ループ配列：ｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、上記の標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６を置き換えた。ここで、興味深いことに、配列ＣＧＣＣは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋４９から＋５２を置き換えた。配列ＧＧＣＧも、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋５７から＋６０を置き換えた。テトラループＭＳ２結合ループ挿入物は、本明細書に記載のものと同一の原理を用いて設計した。本質的には、ＣＧＣＣおよびＧＧＣＧ配列は、ステムループ２のステム部分を置き換える。元のＡＣＴＴ−ＡＡＧＴステムと比較して増加したＣＧＣＣ−ＧＧＣＧステムの塩基対形成強度は、ステムループ２構造に追加の安定性を提供し、それによりｓｇＲＮＡ性能または寿命を増加させることが仮定された。

【0122】

したがって、一部の実施形態において１つ以上のＧＣトラクトは、ステムループ２のステム部分を置き換え得る。一部の実施形態において、１つ以上のＧＣトラクトは、テトラループのステム部分を置き換え得る。

【0123】

ステムループ２またはテトラループが区別されるＲＮＡ配列により改変されている（例として、置き換えられている）と言及する場合、これは、好ましくは、酵素−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を越えて突出することが見出されたガイドの３または４ヌクレオチドの改変（または置換）を包含する。好適なナンバリングは、ガイドの二次構造自体に基づき、すなわち、ステムループ２およびテトラループに対応するループを探索することにより（またはそれらをエンジニアリングすることにより）明らかであるが、例示的な番号は、＋１３〜１６周囲および／または＋４９〜５２のいずれかの側（どちらかの側の１または２つのヌクレオチドの余地が考えられ、例えば、＋４８〜５２、または＋４９から５３など）である。

【0124】

特に好ましい配置は、アプタマーとそれに続くＧＧＧＳリンカー、好ましくは、（ＧＧＧＳ）_３を、ＮＬＳ、好ましくは、ＳＮ４０からのＮＬＳと一緒に有することである。

【0125】

本出願人らは、実施例１６において、ｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡに結合しているＭＳ２−ＣＩＢ１リクルートメント成分、およびＣＲＹ２−ＶＰ６４転写アクチベータードメインにより特性決定されたｄＣａｓ９ベース光誘導性ＭＳ２エフェクターを生成した。青色光による活性化時、ＣＲＹ２−ＶＰ６４はＭＳ２−ＣＩＢ１と会合し、標的遺伝子座への転写機構のリクルートメントが可能となる。

【0126】

したがって、一部の実施形態において、アダプタータンパク質は第１の誘導性エレメントに融合（またはそうでなければそれと会合）させることができる一方、機能ドメインは第２の相補的誘導性エレメントに融合（またはそうでなければそれと会合）させることができる。相補性は、ヘテロダイマー結合パートナーにより提供することができる。第１および第２の相補的誘導性エレメントの好ましい例は、ＣＩＢ１およびＣＲＹ２系である。ＣＩＢ１ドメインは、光感受性クロプトクロム２（ＣＲＹ２）のヘテロダイマー結合パートナーである。

【0127】

実施例１７において、本出願人らは、ｄＣａｓ９Ｒｅｃ２ドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え；ｄＣａｓ９ＨＮＨドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え；ｄＣａｓ９内のフレキシブルリンカーの部位において転写エフェクタードメインを挿入し（アミノ酸５５３、５７５、または１１５３）；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異ではなくＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａ突然変異の組合せにより触媒的に不活性なｄＣａｓ９を作出した。これらのいずれかは、ある区別される実施形態において好ましい。

【0128】

一部の実施形態において、Ｒｅｃ２は、改変することができ、好ましくは、ｄＣａｓ９のアミノ酸１７５〜３０６が以下のインサートの１つにより置き換えられ、サブドメインをＮからＣ末端から列記する：
− ＶＰ６４活性化ドメイン
− ３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＶＰ６４活性化ドメイン、３×ＧＧＧＧＳリンカー
− ｐ６５活性化ドメイン
− ３×ＧＧＧＧＳリンカー、ｐ６５活性化ドメイン、３×ＧＧＧＧＳリンカー

【0129】

一部の実施形態において、ＨＮＨを改変することができる。例えば、本出願人らは、ＡＡ７７５〜９０１（ＨＮＨドメインの）を置き換えた。これは、アクチベーター、例えば、ｖｐ６４もしくはＰ６５またはリプレッサーのいずれかによるものであり得る。アクチベーターまたはリプレッサーは、挿入される転写エフェクタードメインの両側で（ＧＧＧＧＳ）３または（ＧＧＧＧＳ）６リンカーによりフランキングすることができる。

【0130】

ｄＣａｓ９の３つのループ中への転写ドメインの挿入も想定される。転写エフェクタードメインによる既存のドメイン（例えば、ＨＮＨ、Ｒｅｃ２）の置換の他、一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質中の異なる位置において転写エフェクタードメインを挿入することは有用であり得る。本出願人らは、３つの好ましい位置：Ｇ５３３、Ｆ５７５およびＫ１１５３を同定した。Ｃａｓ９タンパク質中のＧ５３３およびＫ１１５３の局在を、対応する図４９に示す。本出願人らは、それら３つの局在において、挿入される転写エフェクタードメインの両側上で（ＧＧＧＧＳ）１または（ＧＧＧＧＳ）３によりフランキングされたｖｐ６４またはＰ６５のいずれかを挿入する。したがって、一部の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９によるＧ５３３、Ｆ５７５およびＫ１１５３に対応する位置のいずれか１つ以上における１つ以上の機能ドメインの挿入により改変することができる。

【0131】

一部の実施形態において、新規ｄＣａｓ９突然変異が提供される。実施例１８において示されるとおり、触媒的に不活性なｄＣａｓ９を、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異ではなく、Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａ突然変異の組合せにより生成することができる。このナンバリングは、ＳｐＣａｓ９を指すため、オルソログ中の対応する位置が想定される。本出願人らは、ＳａＣａｓ９中の好ましい代替物としてＮ５８０Ａも、特にＤ１０との組合せで提供する。

【0132】

実施例１９において示されるとおり、ＳｐＣａｓ９によるＮ８６３、特に、Ｎ８６３Ａも、不機能Ｃａｓ９中において有用であり、一部の実施形態において好ましい。

【0133】

この実施例は、異なるアクチベータードメインの組合せが改善された効果を有することも示した。例えば、ｐ６５−ＨＳＦ１融合物を有する構築物は、ｐ６５単独を有する構築物よりも強力なアクチベーターであることが見出された（図５６および５７）。したがって、２つ以上のアクチベーターの融合物が一部の実施形態において好ましい。２つ以上のリプレッサーの融合物も一部の実施形態において好ましい。アクチベーターまたはリプレッサーは、当分野において公知のものおよび特に本明細書において参照されるものの任意の組合せであり得る。

【0134】

特に、オルソゴナル系、１つのアクチベーターおよび１つのリプレッサーの組合せアプローチのこの実施例における使用が留意された。異なるガイドおよび異なるＲＮＡ／アダプタータンパク質ペアは、ある遺伝子座における活性化および別の遺伝子座における抑制を可能とした。

【0135】

本出願人らは、多数の困難とされる遺伝子標的のそれぞれについて有意な活性化を観察した。さらに、本出願人らは、ガイド配列の成功率が、典型的には、標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に近接するにつれて増加することを観察した。本発明の好ましい実施形態において、特定の標的について、ＴＳＳの２００ｂｐ以内が、ガイドＲＮＡを選択するための有利な幅であると考えられる。この情報もｓｇＲＮＡガイド配列の選択に有用であり得る。

【0136】

多重化活性化も実施例１９に示した。単一ガイドを用いるロバストな活性化を提供する本出願人らの系の能力の１つの重要な考えられる利点は、遺伝子のパネルを容易に同時に（それらの遺伝子についての複数のガイドへの同時送達により）活性化させるキャパシティーであり、それはそれぞれの遺伝子単独の活性化に多数のガイドが要求される場合に解決困難である。複数の遺伝子を同時に活性化させる本出願人らの系（ＭＳ２−ＮＬＳ−Ｐ６５−ＨＳＦ１との組合せにおけるＮＬＳ−ｄＣＡＳ（Ｄ１０、Ｈ８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４）の能力を試験するため、本出願人らは、２、４、６、８または１０個の遺伝子を一度に標的化するガイドを同時形質移入した。複数の遺伝子の活性化は高度に良好であり、１０個の組合せについても、それぞれの遺伝子は有意に活性化された（図６０〜６３参照）。したがって、一部の実施形態において、アダプタータンパク質は、有利には、融合または結合アクチベーター（さらに上記）、またはリプレッサーに結合または融合させることができる。次いで、これを複数のガイドにより異なる標的に送達することができる。したがって、これは、１つ以上の遺伝子の活性化または抑制を調査すべきスクリーニング法において特に有用である。

【0137】

実施例２０は、特に興味深い。これは、Ｃａｓ９−ガイド−標的ＤＮＡ複合体の「外側」に露出したガイド中の２つの４ｎｔストレッチの同定にフォーカスする。一方の４ｎｔストレッチはテトラループ中に収まり、他方の４ｎｔストレッチはステムループ２中に収まる。これらの４ｎｔストレッチは、アプタマー配列により置き換えることができる。１つ以上のアプタマーはポリヌクレオチドであり、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、ＲＮＡが好ましい。アプタマーは、特異的ＲＮＡ配列を認識する対応ＲＮＡ結合タンパク質を有する。

【0138】

したがって、ここで使用されるＭＳ２系は、ガイド中に挿入されたＲＮＡ配列（上記局在の一方または両方における）および対応するＭＳ２（ＲＮＡ結合）タンパク質を含む。次いで、ＲＮＡ結合タンパク質を機能ドメイン、例えば、アクチベーターまたはリプレッサーに融合させることができる。機能ドメインに直接融合させる代わりに、ＲＮＡ結合タンパク質をさらなるエレメント、例えば、次いで機能ドメインに結合し、それを認識し得る抗体または機能ドメインに融合している分子に融合させることができる（上記ヘテロ二本鎖ＣＩＢ１−Ｃｒｙ２系と同様）。これは、より大きい時間的または空間的制御を可能とし得る。

【0139】

要するに、特異的ＲＮＡ配列を露出ガイドループ中に挿入し、対応するＲＮＡ結合タンパク質を使用することができる（それが機能ドメインに融合しているか、次いで機能ドメインを認識し、またはそれに特異的に結合するさらなるエレメントに融合しているかを問わない）。機能ドメインは、トランス作用アクチベーターまたはリプレッサーであり得る。

【0140】

これは、Ｇ．Ｏ．Ｆ（機能獲得）および／またはＬ．Ｏ．Ｆ．（機能損失）を評価するスクリーニング法において使用することができる。

【0141】

ステムループ２およびテトラループの同定を上記したが、当業者は図４４、４８、６４（特にａおよびｂ）および７０をガイダンスのために参照することも望み得る。図７０は、ステムループ２およびテトラループに対応するヌクレオチドナンバリングを示す。例えば、一部の実施形態において、テトラループは、試験されるガイドのヌクレオチドＧ２９からＡ４１であり、またはそれを含み、５’−ＧＣＵＡＧＡＡＵＡＧＣＡ−３’（２９〜４１位）を含む。ガイドヌクレオチド、例えば、Ｃ４０は、好ましくは、Ｃａｓ９アミノ酸Ａｒｇ３４０と相互作用し得る。一部の実施形態において、ステムループ２は、使用されるガイドのヌクレオチドＡ６８からＧ８１（５’−ＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧ−３’）であり、またはそれを含み得る。酵素アミノ酸Ｈｉｓ１３４９およびＳｅｒ１３５１は、一部の実施形態において、ガイドヌクレオチド、例えば、Ａ６８と相互作用し得る。一部の実施形態において、Ｌｙｓ３３およびＴｙｒ１３５６は、ヌクレオチドＧ８１と相互作用し得る。

【0142】

一部の実施形態において、ＭＳインサートをフランキングする相補的ＧＧＣＣインサート（ＧＣトラクト）を使用することが好ましい（５’−ＧＧＣＣ−３’は、３’終端における同一配列に相補的である（および逆の配向で、すなわち、３’ＣＣＧＧ−５’、図７０に示される）。

【0143】

単一ＭＳ２付加（すなわち、テトラループまたはステムループ２の一方または他方への）は、標準ガイドと比較して機能獲得（遺伝子上方調節）に関する改善を示すが、二重付加（両方のループ上のＭＳ２）は、いっそうより強力な上方調節を示す。したがって、ガイドを用いる２つ以上の機能ドメインの使用が好ましい。

【0144】

本明細書に記載のとおり、Ｃａｓ９に結合している１つのアクチベーター、例えば、ＶＰ６４およびこの実施例においてＭＳ２を介してガイドに結合している別個の類似のアクチベーター、同様にＶＰ６４を有することは、機能獲得（遺伝子上方調節）に関する最大の改善を示す。他のアクチベーターまたはリプレッサーを、挙げられるアクチベーターとここで交換することができる。

【0145】

本出願人らは、この実施例において、ＭＳ２がガイドの３’末端において付着している従来技術のＭＳガイドＲＮＡ配置と比較して機能獲得（遺伝子上方調節）に関する改善も示す。この技術アプローチは、両方内部であり、決して３’末端ではなく、またはそれに追加のループ（ステムループ３）が少なくとも続く（３’方向に）本発明のループと異なるものである。

【0146】

ｌｉｎｃＲＮＡ（双方向プロモーターから産生される非コードＲＮＡ−他方向は、目的遺伝子に対応するＲＮＡである）をガイドを介して標的化し、および／または調査することもできる。

【0147】

この実施例は、レンチウイルスベース送達が有用であることも示す。全体的に、系は、向上した転写活性化を示した。したがって、これはゲノムワイド転写活性化または過剰発現スクリーニング法において有用である。例えば、本発明は、上方調節がある表現型結果を惹起する遺伝子を同定するために使用することができ、この実施例において、それは癌細胞中のＢＲＡＦキナーゼ阻害剤に対する耐性であった。

【0148】

本出願人らは、理論により拘束されるものではないが、ガイド方向が活性化活性に有意に影響を及ぼさず、代わりに活性化効力に影響を及ぼす一次因子はｓｇＲＮＡ部位が−２００から＋１ｂｐ近位プロモーター領域内に局在することであると考えている。したがって、この領域はガイドについての好ましい標的である。

【0149】

アダプタータンパク質（およびしたがって、その対応する区別されるＲＮＡ（好ましくは、アプタマー）は、好ましくは、バクテリオファージコートタンパク質内から選択される。好ましい例としては、本明細書の他箇所で既に列記されたものが挙げられる。

【0150】

実施例２１は、誘導性構造設計活性化メディエータートランスジェニックモデル（この場合、マウス）を樹立することができることを示す。抑制モデルも同様に生成することができる。好ましくは、ＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質のコード領域上流でＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを用いてエンジニアリングされたマウスを樹立する。第２のマウスは、ＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質のコード領域上流およびＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質のコード領域上流でＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを用いてエンジニアリングすることができる。

【0151】

実施例２２は、未知機能の標的化ｌｉｎｃＲＮＡを調査して異常な表現型を決定する。これは、遺伝子の調節領域を標的化するガイドの使用を介するヒト細胞系（Ｃｒｅ誘導性を使用）およびマウスにおける機能獲得および機能損失の調査を含み、ガイドは、アクチベーターまたはリプレッサーを含む。

【0152】

ｌｉｎｃＲＮＡを調査する場合、ガイドは、プロモーター領域を標的化するように設計することができる。理想的には、これは、標的、この場合、未知機能のｌｉｎｃＲＮＡのＴＴＳの上流１０００ヌクレオチド内であるべきである。次いで、動物、例えば、マウスを異常な表現型についてスクリーニングすることができる。

【0153】

ｓｇＲＮＡがアクチベーターを有する細胞は機能獲得についてモニタリングすることができる一方、ｓｇＲＮＡがリプレッサーを有する細胞は機能損失についてモニタリングすることができる。この様式において、哺乳動物、例として、マウスおよびヒト細胞をスクリーニングすることができる。

【0154】

一態様において、本発明の方法において使用されるベクター系は、１つ以上のレンチウイルスベクターを含む。好ましい実施形態において、１つ以上のレンチウイルスベクターは、コドン最適化核局在化シグナル（ＮＬＳ）、コドン最適化Ｐ２Ａバイシストロニックリンカー配列および最適に配置されたＵ６ドライブガイドＲＮＡカセットを含み得る。別の態様において、ベクター系は、２つのレンチウイルスベクターを含み、一方のレンチウイルスベクターはＣａｓ９酵素を含み、他方のレンチウイルスベクターは、本発明のライブラリーから選択されるガイドＲＮＡを含む。本発明の一実施形態において、それぞれのベクターは、異なる選択マーカー、例えば、異なる抗生物質耐性マーカーを有する。本発明は、本発明のライブラリーを含むキットも包含する。ある態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むベクターを含む単一容器を含む。他の態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むプラスミドを含む単一容器を含む。本発明は、本発明のライブラリーからのユニークＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイド配列の選択を含むパネルを含むキットであって、選択は、特定の生理学的状態を示すキットも包含する。好ましい実施形態において、標的化は約１００個以上の配列、約１０００個以上の配列または約２０，０００個以上の配列または全ゲノムである。他の実施形態において、標的配列のパネルは、関連または所望の経路、例えば、免疫経路または細胞分裂にフォーカスされる。

【0155】

したがって、実施例２１および２２は、非ヒト動物または細胞の作出を実現可能に提供することができることを示す。これは、好ましくは、本明細書に記載のとおり触媒活性を改変する１つ以上の突然変異を有するＣａｓ９を構成的または条件的に発現するように変更され、または前記変更された動物もしくは細胞の子孫である。モデルは、適切なガイドを用い、ならびに異なるアダプターおよび標的遺伝子機能の上方および／または下方調節を示すように多重化するための本明細書に記載のアクチベーターまたはリプレッサーを用いるスクリーニングに使用することができる。したがって、対応する細胞系およびトランスジェニック哺乳動物モデルが提供される。モデルおよび細胞系に関するさらなるガイダンスが本明細書に提供される。

【0156】

ガイドの露出または外部部分（ガイド−Ｃａｓ９−ＤＮＡ複合体が形成される場合）は、好ましくは、４ヌクレオチドストレッチである。一部の実施形態において、ストレッチは、テトラループ中に存在し得る。一部の実施形態において、ストレッチは、ステムループ２中に存在し得る。一部の実施形態において、テトラループおよびステムループ２の両方の中のストレッチが想定される。

【0157】

このストレッチは、改変し、変更し、または完全に置き換えることができる。一般に、露出ストレッチのヌクレオチドの数を４つ未満に低減させることは立体的理由から好ましくない。それというのも、これはガイドの残部の二次構造に影響を及ぼし、したがってＣａｓ９−ガイド−ＤＮＡ複合体の形成またはストレッチの露出に影響を及ぼし得るためである。

【0158】

これは、ストレッチ中の元の４ヌクレオチドの４つ全てが保持され、付加（またはさらなるヌクレオチド）が１と２との間、２と３との間、または３と４との間で行われるように改変または変更することができる。付加を直接５’から１に、または３’から直接４に行うことができることも想定される。ステムは、フレキシブルであり得るが、全体的に大部分が自己相補的であることが好ましい。

【0159】

Ｕｎａｆｏｌｄは、ガイドのＲＮＡ二次構造予測を支援し、したがってガイドＲＮＡのどの変化が本明細書に記載のフレームワーク内で許容可能であり得るかを当業者が決定することを支援するために使用することができるソフトウェアツールである。

【0160】

理想的には、ループ特徴部を保持すべきであるが、ガイドに付加される区別されるＲＮＡのタンパク質結合セクションがこれを決定する。酵素の端部に隣接する非ループ終端は、理想的には、それらが存在する必要があるという意味で保持すべきであるが、元のガイドの一次配列は、例えば、１つ以上のＧＣトラクトの挿入物により変化させることができる。理想的には、これは、伸長させることができる付加される区別されるＲＮＡの非ループ（非タンパク質結合終端）において行うべきである。区別されるＲＮＡの非タンパク質結合領域の二次構造は、好ましくは、挙げられるステムを形成すべきである。

【0161】

露出セクション（区別されるＲＮＡの非タンパク質結合セクション、すなわち、酵素複合体の端部と、区別されるＲＮＡ／アプタマーのタンパク質結合ドメインとの間のもの）中のバルジまたはループを回避することが好ましい。むしろ、露出セクションの二次構造としてステムを保持することが好ましい。

【0162】

ステムは、ほぼ同一の長さの相補的セクションの使用を介してＲＮＡ中で形成し、ミスマッチを最小化することができる。ステムの最大長（または５’から３’および３’から５’鎖の両方でステムを形成するヌクレオチドの数）は、立体効果を低減させ、考えられる追加のヌクレオチドの二次または三次構造の形成を低減させるために、好ましくは、１００ヌクレオチドであり、または合計で１００ヌクレオチド（すなわち、約５０ヌクレオチドの２セクション）である。しかしながら、５０〜６０ヌクレオチドがより好ましい最大値であり得るが、パッケージサイズの縮小を保持する一般的必要がある場合、１０から２０または３０が最も好ましい一方、８、１０または１２が最も好ましい。

【0163】

好ましい最小長は、タンパク質結合ループのいずれかの側の４ヌクレオチドである。

【0164】

標的遺伝子座中の遺伝子発現を上方調節する方法であって、標的に指向される本発明の改変ガイドの投与を含み、アダプタータンパク質は、アクチベーターと会合している方法も提供される。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインにより改変することもできる。

【0165】

標的遺伝子座中の遺伝子発現を下方調節する方法であって、標的に指向される本発明の改変ガイドの投与を含み、アダプタータンパク質は、リプレッサーと会合している方法も提供される。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインにより改変することもできる。

【0166】

このような方法は、治療が必要とされる対象、例えば、遺伝子上方調節または遺伝子下方調節を要求する対象を治療する方法において適宜使用することができる。例えば、本明細書に記載のオルソゴナルアプローチに従うことにより、ある遺伝子を上方調節し、別の遺伝子を下方調節する多重方法を使用することもできる。

【0167】

このような治療方法において使用される本発明の組成物および系も提供される。このような治療のための医薬品の製造における本発明の組成物および系の使用も提供される。

【0168】

一般的なガイドに関するが、具体的には、本発明の改変ｓｇＲＮＡおよびそれと形成される複合体に関するガイドに関して、ガイドが以下の特徴の１つ以上を有することが好ましい。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、１つ以上のヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上であり、より好ましくは、４０ヌクレオチド長以上、またはより好ましくは、５０ヌクレオチド長以上である。一部の実施形態において、ガイド配列は、１０から３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、１つ以上のヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上、より好ましくは、４０ヌクレオチド長以上、またはより好ましくは、５０ヌクレオチド長以上であり、ガイド配列は、１０から３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型Ｃａｓ９酵素である。

【0169】

内因性転写抑制は、クロマチン修飾酵素、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）およびデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）により媒介されることが多い。抑制ヒストンエフェクタードメインが公知であり、例示的な列記が以下に提供される。例示的な表において、効率的なウイルスパッケージング（例えば、ＡＡＶを介する）を容易にするために小さいサイズのタンパク質および機能トランケーションが好ましかった。しかしながら、一般に、ドメインとしては、ＨＤＡＣ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害剤、ならびにＨＤＡＣおよびＨＭＴリクルートタンパク質を挙げることができる。機能ドメインは、一部の実施形態において、ＨＤＡＣエフェクタードメイン、ＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメイン、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤エフェクタードメインであり得、またはそれらを含み得る。

【0170】

【表1】

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【0171】

したがって、本発明のリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害剤、ならびにＨＤＡＣおよびＨＭＴリクルートタンパク質から選択することができる。

【0172】

ＨＤＡＣドメインは、上記表のもののいずれか：すなわちＨＤＡＣ８、ＲＰＤ３、ＭｅｓｏＬｏ４、ＨＤＡＣ１１、ＨＤＴ１、ＳＩＲＴ３、ＨＳＴ２、ＣｏｂＢ、ＨＳＴ２、ＳＩＲＴ５、Ｓｉｒ２Ａ、またはＳＩＲＴ６であり得る。

【0173】

一部の実施形態において、機能ドメインは、ＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメインであり得る。好ましい例としては、以下の表のもの、すなわち、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ２ｂ、Ｓｉｎ３ａ、ＮｃｏＲ、ＳＡＬＬ１、ＲＣＯＲ１が挙げられる。ＮｃｏＲが本実施例において例示され、好ましいが、このクラスの他のものも有用であることが想定される。

【0174】

【表2】

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【0175】

一部の実施形態において、機能ドメインは、メチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメインであり得る。好ましい例としては、以下の表のもの、すなわち、ＮＵＥ、ｖＳＥＴ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ｄｉｍ−５、ＫＹＰ、ＳＵＶＲ４、ＳＥＴ４、ＳＥＴ１、ＳＥＴＤ８、およびＴｇＳＥＴ８が挙げられる。ＮＵＥが本実施例において例示され、好ましいが、このクラスの他のものも有用であることが想定される。

【0176】

【表3】

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【0177】

一部の実施形態において、機能ドメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメインであり得る。好ましい例としては、以下の表のもの、すなわち、Ｈｐ１ａ、ＰＨＦ１９、およびＮＩＰＰ１が挙げられる。

【0178】

【表4】

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【0179】

一部の実施形態において、機能ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤エフェクタードメインであり得る。好ましい例としては、以下の表に列記されるＳＥＴ／ＴＡＦ−１βが挙げられる。

【0180】

【表5】

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【0181】

プロモーターまたはプロモーター近位エレメントの他、内因性（調節）制御エレメント（例えば、エンハンサーおよびサイレンサー）を標的化することも好ましい。したがって、本発明は、プロモーターの標的化の他、内因性制御エレメント（例として、エンハンサーおよびサイレンサー）を標的化するために使用することもできる。これらの制御エレメントは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流および下流に、ＴＳＳからの２００ｂｐから出発して１００ｋｂ離れて局在し得る。公知の制御エレメントの標的化は、目的遺伝子を活性化または抑制するために使用することができる。一部の場合、単一制御エレメントは、複数の標的遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。したがって、単一制御エレメントの標的化は、複数の遺伝子の転写を同時に制御するために使用することができる。

【0182】

他方、推定制御エレメントの標的化（例えば、推定制御エレメントの領域ならびにそのエレメント周囲の２００ｂｐから最大１００ｋｂをタイリングすることにより）は、そのようなエレメントを確認するための（目的遺伝子の転写を計測することにより）、または新規制御エレメントを検出するための（例えば、目的遺伝子のＴＳＳの１００ｋｂ上流および下流をタイリングすることにより）手段として使用することができる。さらに、推定制御エレメントの標的化は、疾患の遺伝的原因の理解に関して有用であり得る。疾患表現型と関連する多くの突然変異および共通のＳＮＰバリアントは、コード領域の外側に局在する。本明細書に記載の活性化または抑制系のいずれかによるこのような領域の標的化に続き、ａ）推定標的のセット（例えば、制御エレメントに近接して局在する遺伝子のセット）またはｂ）例えば、ＲＮＡｓｅｑまたはマイクロアレイによる全トランスクリプトームリードアウトのいずれかの転写のリードアウトを得ることができる。これは、疾患表現型に関与する可能性が高い候補遺伝子の同定を可能とする。このような候補遺伝子は新規薬物標的として有用であり得る。

【0183】

用語「と会合している」は、本明細書において、いかに１つの分子が別の分子と「会合する」かに関して使用され、例えば、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間、またはＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間で使用される。このようなタンパク質−タンパク質相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識するような認識に関して把握することができる。あるいは、あるタンパク質は、別のタンパク質にこの２つの融合物を介して会合させることができ、例えば、あるサブユニットが別のサブユニットに融合している。融合は、典型的には、一方のアミノ酸配列の他方のアミノ酸配列への付加により生じ、例えば、それぞれのタンパク質またはサブユニットをコードするヌクレオチド配列の一緒のスプライシングを介する。あるいは、これは、本質的には、２つの分子間の結合、または直接結合、例えば、融合タンパク質として把握することができる。任意のイベントにおいて、融合タンパク質は、２つの目的サブユニット間（すなわち、酵素と機能ドメインとの間またはアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含み得る。したがって、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはアダプタータンパク質は、機能ドメインと、それに結合することにより会合している。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはアダプタータンパク質は、機能ドメインと、その２つが場合により中間リンカーを介して一緒に融合しているために会合している。

【0184】

タンパク質配列に結合するＲＮＡ配列、特にアプタマーが公知であるが、それらが例えば、アダプタータンパク質に結合する手法は、ＲＮＡ配列がタンパク質上の対応するＲＮＡ結合ドメインまたは部分を認識し、それと複合体を形成することである。これは、抗体がエピトープを認識する様式と類似する状況である。したがって、一部の実施形態において、区別されるＲＮＡ配列は、アダプタータンパク質上の相補的ＲＮＡ結合ドメインまたは部分を認識し、それに結合する。一部の実施形態において、区別されるＲＮＡ配列はアプタマーである。アプタマーの機能化は、その対応するタンパク質と会合することが周知である。

【0185】

区別されるＲＮＡ配列は、それが挿入されるガイドと起源および／または配列が異なる配列である。挿入は、挿入部位における元のガイドヌクレオチドの１つ以上の置換（欠失）を含み得る。あるいは、元のガイドヌクレオチドは、挿入ヌクレオチドが既に隣接する（一次構造に関して）元のヌクレオチドを離隔するように、その間の挿入部位により保持することができる。したがって、区別されるＲＮＡ配列は、それが、置き換わっているヌクレオチドと異なる一次構造（ヌクレオチド配列）を有する意味で異なり得る。いずれにしても、置換の場合または欠失なしで単に挿入の場合、得られる改変ガイドの全体的な一次配列は変化する。したがって、一実施形態において、区別されるＲＮＡ配列は、得られる改変ガイド中で異なる配列（一次構造）をもたらすものである。

【0186】

一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、特に明記のない限り、エクスビボで行うことができる。

【0187】

本出願人らは、実施例９および実施例２４の両方において、ＳｐＣａｓ９のヘリカルドメイン２（ＨＤ２）を欠失させることができることを見出した。一部の活性が損失し得る一方、これは、約５０％のみであり得；このトランケーションは有利であり得る。比較的小さいが、ＳｐＣａｓ９についてのアミノ酸の総数の穏やかな低減が見られる。これは、Ｃａｓ９のパッケージングまたは送達のための単一ベクター中へのＣａｓ９およびガイドのコードにのみ役立ち得る。一部の状況において、機能的であるがそれほど活性でないＣａｓ９、または比較的活性なＣａｓ９が有利であり；例えば、オフターゲット効果が懸念される場合、または機能ドメインがＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９複合体（例えば、Ｃａｓ９タンパク質を有する）と会合している場合である。トランケートされたＣａｓ９の部分に代え、本出願人らは、実施例９においてリンカーを付加した。

【0188】

本出願人らは、実施例２４において、ＳｐＣａｓ９のＨＤ２および周囲領域にフォーカスするキメラ３成分酵素を作出することができることも見出した。今日まで、研究はＮ’またはＣ’末端ドメインがＳｐからスワップアウトされ、ＳｔＣａｓ９からの対応ドメインにより置換されているキメラの作出をフォーカスしてきており、例えば、［Ｎ’末端ＳｐＣａｓ９−Ｃ’末端ＳｔＣａｓ９］キメラが提供された。これらの２成分キメラは有用であるが、本出願人らは、目下、キメラ３成分酵素が可能であり、機能的であることを見出した。

【0189】

したがって、一態様において、本発明は、ＨＤ２ドメインがトランケートされたＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素、好ましくは、Ｃａｓ９を提供する。一部の実施形態において、トランケーションは、ＨＤ２ドメインの置換である（すなわち、全体として）。一部の実施形態において、トランケーションは、ＨＤ２ドメインまたはそのトランケート部分の、リンカー、好ましくは、ＧｌｙＳｅｒもしくは他のフレキシブルリンカー、またはリジッドリンカー、例えば、アルファ−ヘリカルリンカー（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）による置換である。ＨＤ２ドメイン（この例において、ＳｐＣａｓ９から）の好適な例は、実施例９に提供し、前記ＨＤ２ドメインを欠くトランケート配列の例もガイダンスのために提供される。

【0190】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する属のＣａｓ９オルソログであり、Ｃａｓは、ヘリカルドメイン２トランケーションを含む。

【0191】

一部の実施形態において、ヘリカルドメイン２を置き換えるため、ヘリカルドメイン２トランケーションは、１、３、６、９、または１２個のリピートの群のフレキシブルグリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）またはリジッドアルファ−ヘリカルリンカー（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）の１つ以上のセットにより置換されている。これは、潜在的な構造安定化および／またはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ特異性の保持の支援を提供し得る。

【0192】

したがって、別の態様において、本発明は、キメラ３成分ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素、好ましくは、Ｃａｓ９を提供する。キメラ３成分酵素は、好ましくは、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素、例えば、ＳｐＣａｓ９からのＮ’およびＣ’末端成分、ならびに異なる酵素、すなわち、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素からの内部成分を含む。第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素は、典型的には、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のオルソログである。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素は、本明細書に記載のオルソログのいずれかであり得る。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素は、Ｓａである。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素は、Ｓｔ酵素である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素は、Ｓｔ３酵素である。

【0193】

第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、機能野生型第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素（任意の翻訳後プロセシングを含む）のＮ’またはＣ末端終端からの２または３アミノ酸における、またはそれ以内のいかなるアミノ酸も含まない。機能野生型第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＮ’またはＣ’末端終端からの最短距離は、理想的には、一部の実施形態において、５から１０アミノ酸である。

【0194】

第１のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素または第２のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素の成分は、一部の実施形態において、少なくとも１つのドメインを含み得、または２つ以上のドメイン間の境界に跨り得る。この例は、実施例２４および図８６Ｂに見出すことができ、ＳｐＣａｓ９（第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素である）にスワップインおよびそれからスワップアウトされた成分は、図８６Ａにおいて同定される種々のドメインの境界に跨る。一部の実施形態において、１つ以上の完全ドメインが好ましい。一部の実施形態において、１つ以上の部分ドメインが好ましい。一部の実施形態において、Ｒｅｃローブは完全にまたは部分的にスワップアウトされており、その結果、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素からの内部成分は完全または部分Ｒｅｃローブを含む。したがって、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素からのＮ’およびＣ’末端成分は、Ｒｅｃローブを欠く。

【0195】

一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、ＨＤ２ドメインである。

【0196】

一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素中の１つ以上の対応成分を置き換える。一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＨＤ２ドメインは、完全にトランケートまたは置換されている。トランケーションは、少なくとも２０％だけ、より好ましくは、少なくとも３０％だけ、より好ましくは、少なくとも４０％だけ、より好ましくは、少なくとも５０％だけ、より好ましくは、少なくとも６０％だけ、より好ましくは、少なくとも７０％だけ、より好ましくは、少なくとも７０％だけ、より好ましくは、少なくとも８０％だけ、より好ましくは、少なくとも９０％だけ、より好ましくは、少なくとも９５％だけ、より好ましくは、少なくとも９８％だけ、より好ましくは、少なくとも９９％だけであり得る。上記のとおり、ＨＤ２ドメイン（この場合、ＳｐＣａｓ９からのもの）の好適な例は、実施例９に提供され、前記ＨＤ２ドメインを欠くトランケート配列の例もガイダンスのために提供される。一部の実施形態において、成分は、ドメインの唯一の部分であり得、例えば、好ましいＮ’末端成分は、Ｓｐ中のＲｕｖＣＩドメインの唯一の部分であるＳｐのアミノ酸１〜１０である。

【0197】

一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素からの内部成分は、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素からの内部成分により置き換えられている。２つの前記内部成分は、同一（すなわち、例えば、配列アラインメントにより比較可能なオルソログ間で互いに対応する）または異なるものであり得る。

【0198】

一部の実施形態において、キメラ３成分酵素は、ＳｐＣａｓ９からのＮ’およびＣ’末端成分、ならびにＳａまたはＳｔ３からの内部ドメインを含む。これは、Ｓｐ−Ｓｔ３−ＳｐまたはＳｐ−Ｓａ−Ｓｐキメラ３成分酵素（Ｎ’からＣ’方向）を提供する。

【0199】

一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＮ’末端成分は、Ｓｐ１〜１０（ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１〜１０）である。一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＮ’末端成分は、Ｓｐ１〜１８９である。一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＮ’末端成分は、ＳＰ１〜２９９である。

【0200】

一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＣ’末端成分は、ＳＰ７２９〜１４０４である。一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＣ’末端成分は、Ｓｐ１９０〜１４０４である。一部の実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＣ’末端成分は、Ｓｐ３２８〜１４０４である。

【0201】

一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓｔ３ ８７〜７１２である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓｔ３ １７４〜７１２である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓｔ３ ８７〜１７３である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓｔ３ １７４〜３１１である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓｔ３ ３１２〜７１２である。したがって、一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分についての好適な下限点は、Ｓｔ３ ８７、または１７４、または３１２である。さらに、一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分についての好適な上限点は、Ｓｔ３ ７１２、または１７２／１７３、または３１１である。これらの組合せのいずれかが好ましいが、上限および下限点が互いに隣接し、または少なくとも１０アミノ酸以内にある場合を除く。

【0202】

一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓａ１２５〜２００である。一部の実施形態において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素の内部成分は、Ｓａ１２５〜２００であり、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＮ’末端成分は、Ｓｐ１〜１８９であり、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素のＣ’末端成分は、Ｓｐ３２８〜１４０４である。

【0203】

これらの境界の一部のバリエーション（アミノ酸が野生型のまさに最初のまたはまさに最後のものである場合を除く）が想定され、末端からの距離に関して上記の要求が留意される。これらの境界の好適な範囲は、１、２、３、４、５、８、１０ １５または２０アミノ酸の領域内である。

【0204】

キメラ３成分ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ酵素が機能的であり、野生型酵素（本明細書に記載のとおり改変されていない酵素）の活性の好ましくは、少なくとも少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％またはより好ましくは、１００％以上を有することが認識される。

【0205】

一部の実施形態において、ハイブリッドガイドがキメラ３成分ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ９酵素との使用に好ましい。ハイブリッドガイドは、骨格および標的化配列を含む。骨格は、ｔｒａｃｒＲＮＡ足場（ｔｒａｃｒメイトおよびｔｒａｃｒ配列）を含み、標的化配列は、ＤＮＡ標的化のための約２０ｎｔのガイド（スペーサー）配列を含む。骨格は、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素と同一の種からの内因性ガイドからのものに対応し得、または骨格は、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素と同一の種からの内因性ガイドからのものに対応し得る。標的化配列は、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素と同一の種からの内因性ガイドからのものに対応し得、または標的化配列は、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはＣａｓ酵素と同一の種からの内因性ガイドからのものに対応し得る。

【0206】

ｗｔＳｐＣａｓ９を参照してトランケーションおよびキメラ３成分ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣａｓ９酵素についての例示的な配置を図２７ＡおよびＢに示し、但し、図２７Ｂの最後のキメラは２成分キメラである。図２７Ａ中の第３の配置に示されるトランケーションは、好ましい。それというのも、これはＨＤＳ領域がリンカーにより置き換えられたＨＤ２トランケーションであるためである。好適なリンカーは、本明細書に記載のＧｌｙＳｅｒリンカーまたはアルファ−ヘリカルリンカーである（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）。

【0207】

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素は、好ましくは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列が１つ以上のヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上、４０ヌクレオチド長以上、または５０ヌクレオチド長以上であり；ガイド配列が１０から３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素がＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいことがある。

【0208】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その成分、およびそのような成分の送達、例として、方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、ならびにその作製および使用、例として量および配合物に関するもの（本発明の実施に有用な全て）に関する一般的情報に関して、以下のものが参照される：米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書および同第８，８９５，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、同第２０１４−０２８７９３８Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、同第２０１４−０２７３２３４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、同第２０１４−０２７３２３２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、同第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、同第２０１４−０２５６０４６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、同第２０１４−０２４８７０２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、同第２０１４−０２４２７００Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、同第２０１４−０２４２６９９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、同第２０１４−０２４２６６４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、同第２０１４−０２３４９７２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、同第２０１４−０２２７７８７Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、同第２０１４−０１８９８９６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、同第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、同第２０１４−０１８６９１９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、同第２０１４−０１８６８４３Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、同第２０１４−０１７９７７０Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）および同第２０１４−０１７９００６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、同第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（ＥＰ１３８１８５７０．７号明細書）、ＥＰ２７６４１０３号明細書（ＥＰ１３８２４２３２．６号明細書）、およびＥＰ２７８４１６２号明細書（ＥＰ１４１７０３８３．５）；ならびにＰＣＴ特許出願公開の国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、国際公開第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、および国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。さらに、それぞれ２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書および同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。さらに、２０１３年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書および同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日に出願された同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日に出願された同第６１／９６０，７７７号明細書および２０１３年１０月２８日に出願された同第６１／９６１，９８０号明細書が参照される。いっそうさらに以下のものが参照される：それぞれ２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書および同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；ならびに２０１４年１０月２８日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、およびそれぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書および同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日および２０１３年２月２５日に出願された同第６１／７５７，９７２号明細書および同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日に出願された同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、および同第６１／８３５，９３１号明細書；両方とも２０１４年６月１１日に出願された同第６２／０１０，８８８号明細書および同第６２／０１０，８７９号明細書；それぞれ２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，３２９号明細書および同第６２／０１０，４４１号明細書；それぞれ２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２２８号明細書および同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日に出願された同第６２／０３８，３５８号明細書；それぞれ２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書および同第６２／０５５，４８７号明細書；ならびに２０１４年１０月２７日に出願された同第６２／０６９，２４３号明細書。２０１４年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、および同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；ならびに２０１４年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書も参照される。ＰＣＴ出願、とりわけ、２０１４年６月１０日に出願された米国指定出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。それぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書および同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第ＵＳＳＮ６１／９８０，０１２号明細書が参照される。ＰＣＴ出願、とりわけ、２０１４年６月１０日に出願された米国指定出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。それぞれ２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書および同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。これらの特許、特許出願公開、および出願のそれぞれ、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献は、その文献においてまたは本明細書に参照により組み込まれるその中の任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許出願公開および出願および出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるのと同程度で参照により本明細書に組み込まれる。

【0209】

さらに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般的情報に関して、以下のものが挙げられる（さらに参照により本明細書に組み込まれる）：
− Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
− ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
− Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
− Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３；
− Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
− ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
− Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
− Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
− Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
− Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９、
− ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４、
− Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ ５，２０１４）（Ｈｓｕ ２０１４）、
− Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１、
− Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６、および
− Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれ、以下に簡単に記載される）。

【0210】

Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．は、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９およびさらには化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方に基づき真核細胞中で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを短鎖ＲＮＡにより指向させてヒトおよびマウス細胞中のＤＮＡの正確な開裂を誘導することができることを実証した。著者らの研究は、ニック形成酵素中に変換されたＣａｓ９を使用して最小の変異原活性で真核細胞中の相同組換え修復を容易にすることができることをさらに示した。さらに、著者らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイ中にコードして哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能とすることができることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性および広い適用性を実証した。細胞中の配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラミングするためにＲＮＡを使用するこの能力は、新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義した。著者らの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳動物細胞中に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム開裂も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの態様は、その効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができることが想定され得る。

【0211】

Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノム中の正確な突然変異を導入するために、二重ＲＮＡと複合体化しているクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）会合Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用した。このアプローチは、非突然変異細胞を殺滅するための標的化されたゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９指向開裂に依存し、選択マーカーまたは対抗選択系の必要性を回避する。この研究は、編集テンプレート上で担持される単一および多ヌクレオチド変化を作製するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変化させることによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性のリプログラミングを報告した。この研究は、２つｃｒＲＮＡの同時使用が、多重突然変異誘発を可能とすることを示した。さらに、このアプローチをリコンビニアリングとの組合せで使用した場合、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中で、記載のアプローチを使用して回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中では、回収された６５％が突然変異を含有した。

【0212】

Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．は、ＤＮＡ結合ドメインベースＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素およびさらには転写アクチベーター様エフェクターの光学および化学モジュレーションを可能とする多用途およびロバストな技術についての当分野における必要性に対処した。

【0213】

微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的のあるミスマッチを許容し、それにより不所望なオフターゲット突然変異誘発を促進し得る２０ｎｔガイド配列により特異的ゲノム遺伝子座に標的化される。これに対処するため、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を、ペア形成ガイドＲＮＡと組み合わせて標的化二本鎖分解を導入するアプローチを記載した。ゲノム中の個々のニックが高いフィデリティーで修復されるため、適切に離隔するガイドＲＮＡを介する同時ニック形成が二本鎖分解に要求され、標的開裂のために特異的に認識される塩基の数を伸長させる。著者らは、ペア形成ニック形成の使用がオフターゲット活性を細胞系中で５０から１，５００倍だけ低減させてマウス接合子中の遺伝子ノックアウトをオンターゲット開裂効率の犠牲なしで容易にし得ることを実証した。この多用途方針は、高い特異性を要求する広範なゲノム編集用途を可能とする。

【0214】

Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．は、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特性決定して標的部位の選択を提供し、オフターゲット効果を回避した。この研究は、２９３Ｔおよび２９３ＦＴ細胞中で＞７００個のガイドＲＮＡバリアントおよび＞１００個の予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９がミスマッチの数、位置および分布に感受性である配列依存的に異なる位置におけるガイドＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のミスマッチを許容することを報告した。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介開裂は、ＤＮＡメチル化により影響されないこと、ならびにＳｐＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの投与量をタイトレートしてオフターゲット改変を最小化することをさらに示した。さらに、哺乳動物ゲノムエンジニアリング適用を容易にするため、著者らは、標的配列の選択および検証ならびにオフターゲット分析をガイドするためのウェブベースソフトウェアツールの提供を報告した。

【0215】

Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．は、哺乳動物中の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を介するＣａｓ９媒介ゲノム編集、ならびに下流機能研究のための改変細胞系の生成のためのツールのセットを記載した。オフターゲット開裂を最小化するため、著者らは、ペア形成ガイドＲＮＡとＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用する二重ニック形成方針をさらに記載した。著者らにより提供されるプロトコルは、標的部位の選択、開裂効率の評価およびオフターゲット活性の分析のためのガイドラインを実験的に導いた。この研究は、標的設計から開始し、遺伝子改変を１〜２週間内ほど早く達成することができ、改変クローン細胞系を２〜３週間以内に誘導することができることを示した。

【0216】

Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．は、ゲノムワイドスケールで遺伝子機能を調査する新たな手法を記載した。著者らの研究は、ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーの送達が１８，０８０個の遺伝子を標的化することを示し、６４，７５１個のユニークガイド配列がヒト細胞中の陰性および陽性選択スクリーニングの両方を可能とした。第１に、著者らは、癌および多能性幹細胞における細胞生存に不可欠な遺伝子を同定するためのＧｅＣＫＯライブラリーの使用を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、損失が、突然変異タンパク質キナーゼＢＲＡＦを阻害する治療剤ベムラフェニブの耐性に関与する遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高ランク候補が既に検証された遺伝子ＮＦ１およびＭＥＤ１２ならびに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、およびＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同一遺伝子を標的化する非依存性ガイドＲＮＡ間の高レベルの一致性および高い割合のヒット確認を観察し、したがって、Ｃａｓ９を用いるゲノムスケールスクリーニングの有望性を実証した。

【0217】

Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．は、２．５Å分解能におけるｓｇＲＮＡおよびその標的ＤＮＡとの複合体における化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。構造は、界面における正荷電溝中にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を収容する標的認識およびヌクレアーゼローブから構成されるバイローブ型アーキテクチャーを明らかにした。認識ローブがｓｇＲＮＡおよびＤＮＡの結合に不可欠である一方、ヌクレアーゼローブは、標的ＤＮＡの相補および非相補鎖の開裂のために適切に位置決めされたＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインをそれぞれ含有する。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用を担うカルボキシル末端ドメインも含有する。この高分解能構造および付随機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機序を明らかにし、したがって、新たな多用途ゲノム編集技術の合理的設計のための経路を開いた。

【0218】

Ｗｕ ｅｔ ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）中の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりロードされた化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、４つの試験ｓｇＲＮＡのそれぞれがｄＣａｓ９を、ｓｇＲＮＡ中の５−ヌクレオチドシード領域およびＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）により高頻度で特性決定された数十から数千のゲノム部位に標的化することを示した。クロマチン接近不可能性は、マッチングシード配列を有する他の部位へのｄＣａｓ９結合を減少させ；したがって、オフターゲット部位の７０％は、遺伝子と関連する。著者らは、触媒的に不活性なＣａｓ９により形質移入されたｍＥＤＣ中の２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的化シーケンシングがバックグラウンドを超える１つのみの突然変異部位を同定することを示した。著者らは、シードマッチが結合をトリガーするが、標的ＤＮＡとの広いペア形成が開裂に要求されるＣａｓ９結合および開裂についての２状態モデルを提案した。

【0219】

Ｈｓｕ ２０１４は、一般に細胞の遺伝子スクリーニングを含むヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を考察する総説であり、それは２０１４年６月５日より前に出願された本明細書の系列の出願の情報、データおよび知見に存在する。Ｈｓｕ ２０１４の一般的教示は、規定のモデル、本明細書の動物を含まない。

【0220】

本発明または本出願に対する従来技術であると考えられないが、本発明の実施において考慮することができるＴｓａｉ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９−７７（２０１４）も挙げられる。

【0221】

一般に、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）中で使用されるものであり、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系のコンテクストにおいて「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡプロセシング部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系のコンテクストにおいて「スペーサー」とも称される）、または本明細書において使用される用語「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするためのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））または他の配列およびＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を集合的に指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系のコンテクストにおいてプロトスペーサーとも称される）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成のコンテクストにおいて、「標的配列」は、ガイド配列が、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する相補性を有するように設計される配列を指す。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在する。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを探索することによりインシリコで同定することができる：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座をフランキングするゲノム配列の２Ｋｂウインドウ中で見出される；２．２０から５０ｂｐからのスパン；および３．２０から５０ｂｐだけ間隔が空いている。一部の実施形態において、これらの基準の２つを使用することができ、例えば、１および２、２および３、または１および３つを使用することができる。一部の実施形態において、３つ全ての基準を使用することができる。

【0222】

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合、ポリマーの集合前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。

【0223】

本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」も、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することができる。例示的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、図１に例示される。

【0224】

本明細書において使用される用語「野生型」は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から区別される天然状態で生じるままの生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。

【0225】

本明細書において使用される用語「バリアント」は、天然状態で生じるものから逸脱するパターンを有する品質の提示を意味すると解釈すべきである。

【0226】

用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた」は、互換的に使用され、人工の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然状態で天然に会合し、または天然状態で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

【0227】

「相補性」は、古典的ワトソン−クリックまたは他の非古典的タイプのいずれかによる別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が第２の核酸配列中の同一数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

【0228】

本明細書において使用されるハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と優位にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長ければ、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。

【0229】

「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの開裂におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補鎖」と称される。

【0230】

本明細書において使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称することができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0231】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、改変、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む。

【0232】

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために互換的に使用される。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。インビボで得られ、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。

【0233】

用語「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能薬剤」または「治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」は、互換的に使用され、対象への投与時にいくつかの利益効果を付与する分子または化合物を指す。利益効果としては、診断測定の使用可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病態の軽減またはその発症の予防；および一般には疾患、症状、障害または病的状態の中和が挙げられる。

【0234】

本明細書において使用される「治療」もしくは「治療する」または「緩和する」または「改善する」は、互換的に使用される。これらの用語は、利益または所望の結果、例として、限定されるものではないが、治療利益および／または予防利益を得るためのアプローチを指す。治療利益は、治療中の１つ以上の疾患、病態、または症状の任意の治療関連改善またはそれらに対する効果を意味する。予防利益については、疾患も、病態も、症状もこれまで顕在化し得なかった場合であっても、組成物を特定の疾患、病態、もしくは症状の発症リスクのある対象に、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象に投与することができる。

【0235】

用語「有効量」または「治療有効量」は、利益または所望の結果を生じさせるために十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与様式などの１つ以上に応じて変動し得、それらは当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも当てはまる。規定の用量は、選択される特定の薬剤、遵守すべき投与レジメン、他の化合物との組合せで投与するか否か、投与のタイミング、イメージングすべき組織、およびそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて変動し得る。

【0236】

本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの慣用の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。

【0237】

本発明のいくつかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターをインビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳させることができる。

【0238】

ベクターは、原核生物中に導入し、その中で増殖させることができる。一部の実施形態において、原核生物を使用して真核細胞中に導入すべきベクターのコピーを増幅し、または真核細胞中に導入すべきベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）。一部の実施形態において、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の資源を提供する。原核生物中のタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；および（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の支援を果たし得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とすることが多い。このような酵素、およびそのコグネート認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。例示的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。

【0239】

好適な誘導的非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。

【0240】

一部の実施形態において、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。

【0241】

一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中のタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。

【0242】

一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現をドライブし得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクター制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示の他のものおよび当技術分野において公知のものに由来する。原核および真核細胞の両方のために他の好適な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照。

【0243】

一部の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中の核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生制御プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。

【0244】

一部の実施形態において、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするようにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物中で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］参照）、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポーフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）である。

【0245】

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全相補性は必ずしも要求されず、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性が存在することを条件とする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在している。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラスト内に存在し得る。標的配列を含むターゲティングされる遺伝子座中への組換えに使用することができる配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドを編集テンプレートと称することができる。本発明の一態様において、組換えは、相同組換えである。

【0246】

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成しているガイド配列を含む）は、標的配列中または付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多い塩基対内）の一方または両方の鎖の開裂をもたらす。理論により拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）を含み得、またはそれからなっていてよく、例えば、ガイド配列に作動可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するためにｔｒａｃｒメイト配列に対する十分な相補性を有する。標的配列と同様に、完全相補性は必要とされず、但し、機能的であるために十分な相補性が存在することを条件とすることが考えられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターを宿主細胞中に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に結合させることができる。あるいは、同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一ベクター中で合わせることができ、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターは第１のベクター中に含まれない。単一ベクター中で合わせるＣＲＩＳＰＲ系エレメントは、任意の好適な配向で配置することができ、例えば、あるエレメントを第２のエレメントに対して５’側（の上流）にまたは３’側（の下流）に局在化することができる。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同一または逆鎖上で局在化し、同一または逆向きで配向させることができる。一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、ならびに１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれているガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合により、ガイド配列に作動可能に結合している）、およびｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全部が単一のイントロン中に存在する）の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同一のプロモーターに作動可能に結合しており、それから発現される。ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター構築物が、図２２に示される。

【0247】

一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超える挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に局在している。一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列の上流、および場合によりｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している調節エレメントの下流の挿入部位を含み、その結果、挿入部位中へのガイド配列の挿入後および発現時にガイド配列が真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位におけるガイド配列の挿入を可能とするために２つのｔｒａｃｒメイト配列間に局在している。このような配置において、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはそれらの組合せを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性をターゲティングすることができる。例えば、単一ベクターは、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、場合により細胞に送達することができる。

【0248】

一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中にアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のもと見出すことができる。一部の実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ開裂活性を有し、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのＣａｓ９であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多い塩基対内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素に対して突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠く。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変える突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。本発明の態様において、ニッカーゼは、相同組換えを介するゲノム編集に使用することができる。例えば、図２１は、相同組換えを介するゲノム編集を示す。図２１（ａ）は、ＲｕｖＣＩ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図を示す。（ｂ）修復テンプレートとしてのセンスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドを使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【0249】

一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれターゲティングする２つのガイド配列との組合せで使用することができる。この組合せにより、両方の鎖をニック形成し、それを使用してＮＨＥＪを誘導することが可能となる。本出願人らは、突然変異原性ＮＨＥＪの誘導における２つのニッカーゼ標的（すなわち、同一局在であるがＤＮＡの異なる鎖にターゲティングされるｓｇＲＮＡ）の効力を実証した（データ示さず）。単一ニッカーゼ（単一ｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９−Ｄ１０Ａ）は、ＮＨＥＪを誘導し、インデルを創成し得ないが、本出願人らは、二重ニッカーゼ（同一局在における異なる鎖にターゲティングされるＣａｓ９−Ｄ１０Ａおよび２つのｓｇＲＮＡ）がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中でそれを行い得ることを示した。効率は、ｈＥＳＣ中でヌクレアーゼ（すなわち、Ｄ１０突然変異を有さない通常のＣａｓ９）の約５０％である。

【0250】

さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を産生することができる。一部の実施形態において、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性がその非突然変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれよりも小さい数未満である場合、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くとみなす。他の突然変異は有用であり得；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の種からのものである場合、対応するアミノ酸の突然変異は、類似効果を達成するように作製することができる。

【0251】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類のものまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い数を超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度または最も高頻度のコドンにより置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより目的宿主細胞中の発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、このことは、次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

【0252】

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。

【0253】

ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。

【0254】

一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出をベースとする。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されている。別の例示的フォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにより開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えばＡ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。さらなるアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号６１／８３６，０８０（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ａ）に見出すことができる。

【0255】

一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の最適なアラインメントの例示的説明を図１０Ｂおよび１１Ｂに提供する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替配列であり得るようにより長いまたは短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態において、転写物または転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。一部の実施形態において、単一転写物は、転写終結配列をさらに含み；好ましくは、これはポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドである。このようなヘアピン構造の例示的説明を、図１１Ｂの下方位置に提供し、最後の「Ｎ」およびループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：

【化1】

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一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物とは別個の転写物である（例えば、図１１Ｂの上段部において説明される）。

【0256】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他の約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。

【0257】

本発明の一態様において、レポーター遺伝子、例として、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を細胞中に導入して遺伝子産物の発現の変更または改変を計測するためのマーカーとして機能する遺伝子産物をコードすることができる。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子は、ベクターを介して細胞中に導入することができる。本発明の好ましい実施形態において、遺伝子産物は、ルシフェラーゼである。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子産物の発現を減少させる。

【0258】

一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、および／またはそれから転写された１つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された生物（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（および場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。

【0259】

核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオンおよび中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。

【0260】

脂質：核酸複合体、例として、ターゲティングされるリポソーム、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第４，９４６，７８７号明細書参照）。

【0261】

核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらを使用してインビトロで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。慣用のウイルスベース系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中のインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法について考えられ、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において観察されている。

【0262】

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用長鎖末端リピートを含む。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれを使用して治療遺伝子を標的細胞中にインテグレートして恒久的なトランス遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書参照）。一過的発現が好ましい用途においては、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示し得、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価および発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。

【0263】

典型的には、パッケージング細胞を使用して宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することにより生成する。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび後続の宿主中へのインテグレーションに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよびインテグレーションに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。

【0264】

一部の実施形態において、宿主細胞を、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入する。一部の実施形態において、細胞を、それが対象中で天然に生じるままで形質移入する。一部の実施形態において、形質移入される細胞を対象から採取する。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞系に由来する。組織培養のための広範な細胞系は、当技術分野において公知である。細胞系の例としては、限定されるものではないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞系は、当業者に公知の種々の資源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより形質移入された細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の成分により一過的に形質移入され（例えば、１つ以上のベクターの一過的形質移入、またはＲＮＡによる形質移入により）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。

【0265】

一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギである。ある実施形態において、生物または対象は、植物である。ある実施形態において、生物または対象または植物は、藻類である。トランスジェニック植物および動物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞形質移入の方法から出発する。トランスジェニック動物も、トランスジェニック植物、特に作物および藻類と同様に提供される。トランスジェニック動物または植物は、疾患モデルの提供以外の用途において有用であり得る。これらとしては、例えば、野生型において通常見られるものよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現を介する食物または飼料生産を挙げることができる。これに関して、トランスジェニック動物、特に、豆類および塊茎、ならびに動物、特に哺乳動物、例えば、家畜（ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタ）が好ましいが、家禽類および食用昆虫も好ましい。

【0266】

トランスジェニック藻類または他の植物、例えば、アブラナは、例えば、植物油またはバイオ燃料、例えば、アルコール（特にメタノールおよびエタノール）の産生において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業において使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングすることができる。

【0267】

一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞集団をサンプリングし、１つ以上の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階においてエクスビボで行うことができる。１つ以上の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）中に再導入することさえできる。

【0268】

一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより、標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0269】

一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0270】

作物ゲノミクスの近年の進歩とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的でコスト効率の良い遺伝子編集および操作を実施する技能により、産生の改善および形質の向上のためにそのようなゲノムを形質転換するための単一および多重化遺伝子操作の迅速な選択および比較が可能となる。これに関して、米国特許および刊行物：米国特許第６，６０３，０６１号明細書−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆおよび米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓが参照され、これらのそれぞれの全ての内容および開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容および開示も参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して微細藻類をエンジニアリングする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を植物系において用いることができることは、参照により全体として組み込まれるマニュスクリプト“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ”，ｂｙ Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｕｇ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］にも提供されており、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を使用して植物ゲノムの特異的部位において二本鎖分解を作出して双子葉および単子葉植物における標的化ゲノム改変を達成することができることが実証されている。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、特に明らかでない限り、変更すべき箇所は変更して、植物細胞にも当てはまり得る。

【0271】

植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）はトマト萎凋病を引き起こすが、攻撃するのはトマトのみであり、Ｆ．オキシスポラム・ｆ・ジアンチ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ） プクシニア・グラミニス・ｆ・エスピー・トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は既存のおよび誘導される防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物より高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異および組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しない。また、水平抵抗性、例えば、典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、および垂直抵抗性、例えば、典型的には数個の遺伝子によって制御される、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルでは、植物と病原体とは共に進化し、一方の遺伝的変化が他方の変化と均衡する。従って、育種家は自然変異性を用いて、収穫量、品質、均一性、耐寒性、抵抗性に関して最も有用な遺伝子をかけ合わせる。抵抗性遺伝子の供給源には、天然または外来品種、在来品種、野生植物の近縁種、および誘発突然変異（例えば突然変異誘発物質による植物材料の処理）が含まれる。本発明を用いることで、突然変異を誘発する新規の手段が植物育種家に提供される。従って、当業者は、抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、かつ所望の特性または形質を有する品種において本発明を用いることにより、これまでの突然変異誘発物質より高い精度で抵抗性遺伝子の産生を誘発し、ひいては植物育種プログラムを加速させおよび改善することができる。

【0272】

一態様において、本発明は、上記方法および組成物に開示のエレメントのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。エレメントは、個々にまたは組合せで提供することができ、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブ中で提供することができる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語の、例えば、２つ以上の言語の指示書を含む。

【0273】

一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ以上を利用するプロセスにおいて使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中で提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応または貯蔵緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、任意の緩衝液、例として、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せであり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、約７から約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に結合させるためのベクター中への挿入のためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。

【0274】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｔ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0275】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核中に残留するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。標的は、制御エレメントまたは調節エレメントまたはプロモーターまたはエンハンサーまたはサイレンサーであり得る。プロモーターは、一部の実施形態において、ＴＴＳから＋２００ｂｐまたはさらには＋１０００ｂｐの領域中に存在し得る。一部の実施形態において、調節領域は、エンハンサーであり得る。エンハンサーは、典型的には、ＴＴＳから＋１０００ｂｐ超に存在し得る。より特定すると、真核タンパク質コード遺伝子の発現は、一般に、複数のシス作用性転写制御領域を介して調節される。一部の制御エレメントは、開始部位に近接して局在する一方（プロモーター近位エレメント）、他のエレメントは、より遠位で存在する（エンハンサーおよびサイレンサー）。プロモーターは、転写開始の部位を決定し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を指向する。３つのタイプのプロモーター配列が、真核ＤＮＡ中で同定されている。ＴＡＴＡボックスは、最も一般的であり、急速に転写される遺伝子中で高頻度で見られる。イニシエータープロモーターは、一部の遺伝子中に低頻度で見出され、ＣｐＧアイランドは、転写される遺伝子の特徴である。プロモーター近位エレメントは、開始部位の約２００塩基対以内で生じる。いくつかのそのようなエレメントは、最大約２０塩基対を含有し、特定の遺伝子の調節に役立ち得る。エンハンサーは、通常、約１００〜２００塩基対長であり、複数の８から２０ｂｐ制御エレメントを含有する。これらは、プロモーターから２００塩基対から数十キロベース上流または下流、イントロン内、または遺伝子の最終エクソンから下流に局在し得る。プロモーター近位エレメントおよびエンハンサーは、特異的分化細胞タイプ中でのみ機能する細胞タイプ特異的であり得る。しかしながら、これらの領域のいずれかも標的配列であり得、標的が制御エレメントまたは調節エレメントまたはプロモーターまたはエンハンサーまたはサイレンサーであり得る概念により包含される。

【0276】

理論により拘束されるものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合するはずであることが考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの条件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の実施例セクションに挙げ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素について使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。

【0277】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１およびＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを挙げることができる。

【0278】

標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナリング生化学経路に関連する配列、例えば、シグナリング生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織または細胞と比較して患部組織に由来する細胞中で異常なレベルにおいてまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じさせている任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得；これは、異常に低いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得、発現の変化は、疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接担い、または疾患の病因を担う遺伝子と連鎖不平衡をなす突然変異または遺伝子変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、既知または未知のものであり得、正常または異常レベルにおけるものであり得る。

【0279】

疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。

【0280】

疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表ＡおよびＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。シグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。

【0281】

これらの遺伝子および経路中の突然変異は、不適切なタンパク質の産生または機能に影響する不適切な量のタンパク質をもたらし得る。遺伝子、疾患およびタンパク質のさらなる例は、米国仮特許出願から参照により本明細書に組み込まれる。このような遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。

【0282】

【表6】

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【0283】

【表7】

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【0284】

【表8】

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【0285】

【表9】

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【0286】

【表10】

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【0287】

【表11】

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【0288】

【表12】

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【0289】

【表13】

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【0290】

【表14】

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【0291】

【表15】

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【0292】

【表16】

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【0293】

【表17】

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【0294】

【表18】

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【0295】

【表19】

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【0296】

【表20】

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【0297】

【表21】

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【0298】

【表22】

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【0299】

本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅ならびにＤＮＡリピート不安定性および神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関連する方法および組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。規定の態様のタンデムリピート配列が２０を超えるヒト疾患を担うことが見出されている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの異常を補正することができる。

【0300】

本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２ＡおよびＥＭＰ２Ｂ遺伝子の異常の補正のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期において癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、および最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりターゲティングすることもでき、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓにより編集，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。

【0301】

本発明のさらに別の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉにより編集，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されているいくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の異常を補正することができる。

【0302】

本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所のウェブサイト（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにおけるウェブサイト）上にトピックサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する異常の補正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーが挙げられる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている。

【0303】

一部の実施形態において、病態は、新形成である。病態が新形成であり得る一部の実施形態において、ターゲティングすべき遺伝子は、表Ａに列記のもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は、加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、脆弱性Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は、薬物嗜好であり得る。一部の実施形態において、病態は、自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は、炎症であり得る。一部の実施形態において、病態は、パーキンソン病であり得る。

【0304】

パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、およびＮＵＲＲ１が挙げられる。

【0305】

嗜好関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。

【0306】

炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。

【0307】

心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。

【0308】

アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。

【0309】

自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。

【0310】

黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。

【0311】

統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せを挙げることができる。

【0312】

腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。

【0313】

セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１）を挙げることができる。

【0314】

筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。

【0315】

プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。

【0316】

プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。

【0317】

免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。

【0318】

トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。

【0319】

神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。

【0320】

神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、またはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。

【0321】

本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例は、以下のものから選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩおよびＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症および（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。

【0322】

明らかなとおり、本発明の系を使用して任意の目的ポリヌクレオチド配列をターゲティングすることができることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療することができる病態または疾患の一部の例を上記表に含め、それらの病態に現在関連する遺伝子の例もその表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。

【0323】

本発明の態様は、エンジニアリングおよび最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達も包含する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のプラスミドもしくはウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の配合、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の配合、用量）および同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の配合、用量）の配合および用量、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶおよびアデノウイルスが関わる臨床試験およびそうした臨床試験に関する文献の配合および用量を使用して、Ｃａｓ９および１つ以上のガイドＲＮＡを送達することができる。例えば、ＡＡＶについては、投与経路、配合および用量を米国特許第８，４５４，９７２号明細書にあるとおりとし、およびＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりとすることができる。アデノウイルスについては、投与経路、配合および用量を米国特許第８，４０４，６５８号明細書にあるとおりとし、およびアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりとすることができる。プラスミド送達については、投与経路、配合および用量を米国特許第５，８４６，９４６号明細書にあるとおりとし、およびプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりとすることができる。用量は、平均７０ｋｇの個体に基づくかまたはそれに対して推定してもよく、異なる体重および種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者または対象の年齢、性別、全般的な健康、他の状態ならびに対処すべき特定の状態または症状を含めた通常の要因に依存して、医学または獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）の裁量の範囲内にある。

【0324】

ウイルスベクターは目的の組織に注入され得る。細胞型に特異的なゲノム改変については、Ｃａｓ９の発現を細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用してもよく、およびニューロン特異的発現はシナプシンＩプロモーターを使用してもよい。

【0325】

トランスジェニック動物および植物
トランスジェニック動物もまた提供される。好ましい例としては、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質それ自体という意味においてＣａｓ９を含む動物が挙げられる。マウス、ラットおよびウサギが好ましい。本明細書で例示されるとおり構築物でトランスジェニックマウスを作成するには、純粋な線状ＤＮＡを偽妊娠雌、例えばＣＢ５６雌由来の接合体の前核に注入し得る。次にファウンダーが同定され、遺伝子型が決定され、ＣＢ５７マウスと戻し交配され得る。次に構築物がクローニングされ、場合により、例えばサンガーシーケンシングによって検証され得る。例えばモデルにおいて１つ以上の遺伝子がノックアウトされる場合、ノックアウトが想定される。しかしながらノックインもまた（単独でまたは組み合わせで）想定される。例示的なノックインＣａｓ９マウスを作成しており、これを例示するが、Ｃａｓ９ノックインが好ましい。Ｃａｓ９ノックインマウスを作成するには、本明細書に記載されるとおり（図２５Ａ〜図２５Ｂおよび図２６）、同じ構成的および条件的構築物の標的をＲｏｓａ２６遺伝子座に仕向け得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書および同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改良し得る。別の実施形態において、Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改良し得る。

【0326】

条件的Ｃａｓ９マウスの有用性：本出願人らは、２９３細胞において、Ｃｒｅとの同時発現によりＣａｓ９条件的発現構築物を活性化し得ることを示している。本出願人らはまた、Ｃｒｅが発現するとき正しくターゲティングされるＲ１ ｍＥＳＣが活性Ｃａｓ９を有し得ることも示す。Ｃａｓ９の後にはＰ２Ａペプチド開裂配列と、次にＥＧＦＰが続くため、本出願人らはＥＧＦＰを観察することにより発現の成功を特定する。本出願人らは、ｍＥＳＣにおけるＣａｓ９活性化を示している。この同じ概念が、条件的Ｃａｓ９マウスを極めて有用にするものである。本出願人らはそれらの条件的Ｃａｓ９マウスを、Ｃｒｅを遍在的に発現するマウス（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ系統）と交配させることができ、あらゆる細胞でＣａｓ９を発現するマウスが得られ得る。胎仔または成体マウスにおいてゲノム編集を誘導するために必要なことはキメラＲＮＡの送達のみであるはずである。興味深いことに、条件的Ｃａｓ９マウスを組織特異的プロモーターの制御下でＣｒｅを発現するマウスと交配させる場合、同様にＣｒｅを発現する組織にのみＣａｓ９が存在するはずである。この手法を用いて正確な組織に限ったゲノムの編集を、同組織にキメラＲＮＡを送達することにより行い得る。

【0327】

上述のとおり、トランスジェニック動物はまた、トランスジェニック植物、特に作物および藻類と同様に提供される。トランスジェニック植物は、疾患モデルを提供すること以外の適用で有用であり得る。そうした適用には、例えば通常野生型で見られるレベルより高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現による食糧または飼料生産が含まれ得る。この点で、トランスジェニック植物、特に豆類および塊茎、および動物、特に家畜（乳牛、ヒツジ、ヤギおよびブタ）などの哺乳動物、また家禽および食用昆虫も好ましい。

【0328】

トランスジェニック藻類または他の植物、例えばセイヨウアブラナが、例えば植物油またはバイオ燃料、例えばアルコール（特にメタノールおよびエタノール）の生産において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業で使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。

【0329】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
インビボ送達の点では、ＡＡＶはいくつかの理由で他のウイルスベクターと比べて有利である：
毒性が低い（これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心が不要であるという精製方法に起因し得る）
宿主ゲノムにインテグレートされないため挿入突然変異生成を引き起こす可能性が低い。

【0330】

ＡＡＶは４．５または４．７５Ｋｂのパッケージング限界を有する。これは、Ｃａｓ９ならびにプロモーターおよび転写ターミネーターを全て同じウイルスベクターに詰め込まなければならないことを意味する。４．５または４．７５Ｋｂより大きい構築物はウイルス産生の著しい低下を引き起こし得る。ＳｐＣａｓ９は非常に大きく、遺伝子それ自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶにパッケージングすることが難しい。従って本発明の実施形態は、より短いＣａｓ９のホモログを利用することを含む。例えば：

【0331】

【表23】

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【0332】

従ってこれらの種は、概して好ましいＣａｓ９種である。本出願人らは、送達およびインビボマウス脳Ｃａｓ９発現データを示している。

【0333】

インビボでゲノム改変を媒介するためＣａｓ９コード核酸分子、例えばＤＮＡをウイルスベクターにパッケージングする２つの方法が好ましい：
ＮＨＥＪ媒介性遺伝子ノックアウトを達成するため：
単一ウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含むベクター：
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界に至るまで）
二重ウイルスベクター：
Ｃａｓ９の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界に至るまで）

【0334】

相同性組換え修復を媒介するため。上記に記載する単一および二重ウイルスベクター手法に加え、さらなるベクターを使用して相同性組換え修復テンプレートが送達される。

【0335】

Ｃａｓ９コード核酸分子の発現をドライブするために使用されるプロモーターとしては、以下を挙げることができる：
ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして働き得る：これは、追加的なプロモーターエレメント（これはベクター中でスペースを取り得る）の必要性をなくすのに有利である。空いた追加のスペースは、追加的なエレメント（ｇＲＮＡ等）の発現のドライブに使用することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ９の過剰発現に起因する毒性を低下させるためにも使用することができる。

【0336】

遍在的な発現には、以下のプロモーターを使用することができる：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖等

【0337】

脳での発現には、以下のプロモーターを使用することができる：全てのニューロンに対するシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対するＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴ等

【0338】

肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。

【0339】

肺での発現には、ＳＰ−Ｂを使用することができる。

【0340】

内皮細胞にはＩＣＡＭを使用することができる。

【0341】

造血細胞にはＩＦＮβまたはＣＤ４５を使用することができる。

【0342】

骨芽細胞にはＯＧ−２を使用することができる。

【0343】

ガイドＲＮＡのドライブに使用されるプロモーターとしては、以下を挙げることができる：
Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＵ６またはＨ１
Ｐｏｌ ＩＩプロモーターおよびイントロンカセットを使用することによるｇＲＮＡの発現

【0344】

ＡＡＶに関して、ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせであってよい。標的とする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳または神経細胞を標的にするためＡＡＶ血清型１、２、５またはハイブリッドまたはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ；および心臓組織を標的にするためＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。上記のプロモーターおよびベクターは個々に好ましい。

【0345】

ＲＮＡ送達もまた有用なインビボ送達方法である。リポソームまたはナノ粒子を使用してＣａｓ９およびｇＲＮＡ（および、例えばＨＲ修復テンプレート）を細胞に送達することが可能である。従ってＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９の送達および／または本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソームまたはナノ粒子を介してもよい。例えば、インビボ送達のためＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソーム形質移入試薬、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミンおよび他の市販の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に有効に送達することができる。

【0346】

ＮＨＥＪまたはＨＲ効率を増強させることもまた、送達の助けとなる。ＮＨＥＪ効率は、Ｔｒｅｘ２などの末端プロセシング酵素を同時発現させて増強することが好ましい（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）。ＨＲ効率は、Ｋｕ７０およびＫｕ８６などのＮＨＥＪ機構を一過性に阻害して増加させることが好ましい。ＨＲ効率はまた、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡなどの原核生物または真核生物相同組換え酵素を同時発現させて増加させることもできる。

【0347】

種々の送達手段が本明細書に記載され、本節でさらに考察される。

【0348】

ウイルス性送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９および／または本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のウイルスベクター型、またはそれらの組み合わせを使用して送達することができる。Ｃａｓ９および１つ以上のガイドＲＮＡは１つ以上のウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、例えば筋肉内注射によって目的の組織に送達されるが、他の場合にはウイルス性送達は静脈内、経皮的、鼻腔内、経口、粘膜、または他の送達方法による。かかる送達は単回用量によっても、あるいは複数回用量によってもよい。当業者は、本明細書における送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、または組織、治療対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方法、求められる形質転換／改変のタイプ等の種々の要因に応じて大幅に異なり得ることを理解する。

【0349】

かかる投薬量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油等）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、抗原性を増強するアジュバント、免疫賦活性化合物または分子、および／または当該技術分野において公知の他の化合物をさらに含有し得る。本明細書におけるアジュバントは、抗原が吸着するミネラル（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；または抗原溶液が油中に乳化される油中水型エマルション（ＭＦ−５９、フロイントの不完全アジュバント）（時に死滅マイコバクテリアを含む（フロイントの完全アジュバント））を含有して抗原性をさらに増強し得る（抗原の分解を阻害しおよび／またはマクロファージの流入を生じさせる）。アジュバントにはまた、免疫賦活性分子、例えばサイトカイン、副刺激分子、および例えば、免疫賦活性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチドも含まれる。かかる投薬量配合は当業者により容易に確かめられる。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩をさらに含有し得る。加えて、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、香味料、着色料、マイクロスフェア、ポリマー、懸濁剤等もまた本明細書において存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬品成分、例えば保存剤、保湿剤、懸濁剤、界面活性剤、抗酸化剤、固化防止剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定剤等もまた、特に剤形が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分としては、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の詳細な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

【0350】

本明細書のある実施形態では、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０^５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態では、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０^６粒子（例えば、約１×１０^６〜１×１０^１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０^７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０^８粒子（例えば、約１×１０^８〜１×１０^１１粒子または約１×１０^８〜１×１０^１２粒子）、および最も好ましくは少なくとも約１×１０^０粒子（例えば、約１＊×１０^９〜１×１０^１０粒子または約１×１０^９〜１×１０^１２粒子）、またはさらには少なくとも約１×１０^１０粒子（例えば、約１×１０^１０〜１×１０^１２粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０^１４粒子以下、好ましくは約１×１０^１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０^１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０^１１粒子以下、および最も好ましくは約１×１０^１０粒子以下（例えば、約１×１０^９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０^６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０^６ｐｕ、約４×１０^６ｐｕ、約１×１０^７ｐｕ、約２×１０^７ｐｕ、約４×１０^７ｐｕ、約１×１０^８ｐｕ、約２×１０^８ｐｕ、約４×１０^８ｐｕ、約１×１０^９ｐｕ、約２×１０^９ｐｕ、約４×１０^９ｐｕ、約１×１０^１０ｐｕ、約２×１０^１０ｐｕ、約４×１０^１０ｐｕ、約１×１０^１１ｐｕ、約２×１０^１１ｐｕ、約４×１０^１１ｐｕ、約１×１０^１２ｐｕ、約２×１０^１２ｐｕ、または約４×１０^１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）のアデノウイルスベクター、およびその第２９欄第３６〜５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態では、アデノウイルスは複数回用量で送達される。

【0351】

本明細書のある実施形態では、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０^１０〜約１×１０^１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する生理食塩水約２０〜約５０ｍｌの範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と、それに対する任意の副作用との均衡をとるように調整され得る。本明細書のある実施形態では、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０^５〜１×１０^５０ゲノムのＡＡＶ、約１×１０^８〜１×１０^２０ゲノムのＡＡＶ、約１×１０^１０〜約１×１０^１６ゲノム、または約１×１０^１１〜約１×１０^１６ゲノムのＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０^１３ゲノムのＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、または約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成する常法の試験を介して容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書、第２７欄第４５〜６０行を参照のこと。

【0352】

本明細書のある実施形態では、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、約０．１〜約２ｍｇ、または約１μｇ〜約１０μｇであり得る。

【0353】

本明細書の用量は平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学または獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、または当業の科学者の裁量の範囲内にある。

【0354】

レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞および分裂終了細胞の両方において感染してその遺伝子を発現する能力を有する複合レトロウイルスである。最も一般的に知られるレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的にする。

【0355】

レンチウイルスは以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルス移入プラスミド骨格を含む）のクローニング後、１０％ウシ胎仔血清含有および抗生物質不含のＤＭＥＭ中に形質移入前日に５０％コンフルエンスとなるようＴ−７５フラスコにおいて低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを播種した。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後に形質移入を行った。細胞に１０μｇのレンチウイルス移入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）、および以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇ偽型）、および７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）を形質移入した。カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬリポフェクタミン２０００および１００ｕｌ Ｐｌｕｓ試薬）を含有する４ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ中で形質移入を行った。６時間後、１０％ウシ胎仔血清を含有する抗生物質不含ＤＭＥＭに培地を交換した。

【0356】

レンチウイルスは以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を取り除き、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターでろ過した。次にそれを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次にそれをアリコートに分け、直ちに−８０℃で凍結した。

【0357】

別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小の非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼の遺伝子治療について企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５、Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅにおいて２００５年１１月２１日にオンラインで発表（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照のこと）。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、滲出型の加齢性黄斑変性症の治療に対する網膜下注入によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｉｎ）およびアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターもまた企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（２０１２年９月）を参照のこと）、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系用に改良され得る。

【0358】

別の実施形態において、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖにより共有される共通のエクソンを標的にするｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを有する自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照）を本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。最低でも患者体重キログラム当たり２．５×１０^６個のＣＤ３４＋細胞を採取し、２×１０^６細胞／ｍｌの密度で２ｍＭ Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中において１６〜２０時間予備的に刺激することができる。予備刺激した細胞は、フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ^２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、タカラバイオ株式会社）でコーティングした７５ｃｍ^２組織培養フラスコにおいてレンチウイルスを感染多重度５で１６〜２４時間形質導入し得る。

【0359】

レンチウイルスベクターはパーキンソン病の治療などで開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書および米国特許第７３０３９１０号明細書および同第７３５１５８５号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、同第２００９０００７２８４号明細書、同第２０１１０１１７１８９号明細書；同第２００９００１７５４３号明細書；同第２００７００５４９６１号明細書、同第２０１００３１７１０９号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；同第２０１１０２９３５７１号明細書、同第２００４００１３６４８号明細書、同第２００７００２５９７０号明細書、同第２００９０１１１１０６号明細書および米国特許第７２５９０１５号明細書を参照のこと。

【0360】

ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９、および／または本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡの形態でも送達することができる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、βグロビン−ポリＡテール（１２０個以上の一連のアデニン）から以下のエレメント：Ｔ７＿プロモーター−コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを使用して合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡもまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含むカセットからのインビトロ転写を用いて転写させることができる。

【0361】

発現を増強しかつ毒性を低下させるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素および／またはガイドＲＮＡを、プソイドＵまたは５−メチル−Ｃを使用して改変することができる。

【0362】

ｍＲＮＡ送達方法は、現在、肝臓送達に特に有望である。詳細には、ＡＡＶ８について、肝臓への送達に特に好ましい。

【0363】

ナノ粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、ナノ粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達されてもよい。

【0364】

例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（「脂質エンベロープを有するｐＨ応答性ポリマーナノ粒子を使用したインビトロおよびインビボｍＲＮＡ送達（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．電子出版２０１１年４月１日）は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルに包まれている被覆されている生分解性のコア−シェル構造を有するナノ粒子について記載する。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分がエンドソーム破壊を促進するように選択された一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡを送達に好ましい。

【0365】

一実施形態では、自己集合性生体接着ポリマーをベースとするナノ粒子が企図され、これは、いずれも脳への、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達およびペプチドの経鼻送達に適用され得る。他の実施形態、例えば疎水性薬物の経口吸収および経眼送達もまた企図される。分子エンベロープ技術は、保護されかつ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９ およびＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照のこと）。標的組織に応じて、単回または複数回用量で約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。

【0366】

一実施形態において、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室により開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍成長を止めることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。詳細には、Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室は、新規生体材料およびナノ製剤の合成、精製、特徴付け、ならびに配合のための完全に自動化されたコンビナトリアルシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３を参照のこと。

【0367】

米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与に特に有用なリピドイド化合物に関し、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。粒子、リポソーム、またはミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、または固体の形態であってもよく、および薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子であってもよい。アミノアルコール（ｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）リピドイド化合物を他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わせて粒子を形成してもよい。これらの粒子は、次に場合により医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。

【0368】

米国特許出願公開第０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコールリピドイド化合物の調製方法も提供する。アミンの１つ以上の等価物を好適な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させることにより、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、従ってアミノアルコールリピドイド化合物に第一級または第二級アミンが生じる。これらの第一級または第二級アミンはそのまま残るか、または異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応し得る。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰量未満のエポキシド末端化合物と反応することにより、種々の数のテイルを有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物がもたらされ得る。特定のアミンは２つのエポキシド由来化合物テイルで完全に官能化され得る一方、他の分子はエポキシド由来化合物テイルで完全には官能化されない。例えば、ジアミンまたはポリアミンは分子の種々のアミノ部分の１、２、３、または４個のエポキシド由来化合物テイルを含み、第一級、第二級、および第三級アミンをもたらし得る。特定の実施形態では、全てのアミノ基が完全に官能化されるわけではない。特定の実施形態では、同じ種類のエポキシド末端化合物の２つが使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒を伴いまたは伴わずに実施され、および合成は３０〜１００℃の範囲の高温、好ましくは約５０〜９０℃で実施されてもよい。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は場合により精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して特定の数のエポキシド由来化合物テイルを有するアミノアルコールリピドイド化合物を生じさせてもよい。または混合物を精製して特定の立体異性体または位置異性体を生じさせてもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、アルキルハロゲン化物（例えばヨウ化メチル）または他のアルキル化剤を使用してアルキル化されてもよく、および／またはアシル化されてもよい。

【0369】

米国特許出願公開第０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されるアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技術を用いて調製および／またはスクリーニングされ得る。特定の実施形態では、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチドまたは他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞に形質移入するその能力に関してスクリーニングされる。

【0370】

米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されているポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは生命工学的および生物医学的応用において、コーティング（医療器具またはインプラント用の薄膜または多層膜のコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、マイクロパターニング剤、および細胞封入剤として使用され得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡはインビトロおよびインビボの両方でその化学構造に応じた種々のレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの大きい化学的多様性により、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能となった。さらに、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下植え込み後の炎症細胞の動員を低減し、および線維症を低減する。これらのポリマーを使用して細胞封入用の高分子電解質複合カプセルを形成し得る。この発明はまた、抗菌コーティング、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ送達、および幹細胞組織工学などの他の多くの生物学的応用性も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

【0371】

別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。詳細には、脂質ナノ粒子に封入された抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照のこと）を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。静脈内投与される約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注射関連反応のリスクを低減するための与薬が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミンまたはセチリジン、およびラニチジンなどが企図される。５用量について４週間おきにキログラム当たり約０．３ｍｇの複数回用量もまた企図される。

【0372】

ＬＮＰは、肝臓へのｓｉＲＮＡの送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，３６３−４７０頁を参照のこと）、従って肝臓へのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達が企図される。２週間おきの６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与されるＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルが終わるまでに患者が部分奏効を達成して、リンパ節転移が完全に退縮しかつ肝腫瘍が実質的に縮小したことを実証した。この患者では４０用量後に完全奏効が得られ、患者は２６ヶ月間にわたる用量の投与を受けた後にも寛解を保っており、治療を完了させた。ＲＣＣ患者ならびにＶＥＧＦ経路阻害薬による以前の治療後に進行している腎臓、肺、およびリンパ節を含む肝外疾患部位を有する患者の２人は、全ての部位で約８〜１２ヶ月間安定であり、ＰＮＥＴおよび肝転移を有する患者は１８ヶ月間（３６用量）の延長試験を継続し、安定であった。

【0373】

しかしながら、ＬＮＰの電荷を考慮しなければならない。カチオン性脂質は負電荷脂質と組み合わせると非二重層構造を誘導し、それにより細胞内送達が促進されるためである。荷電したＬＮＰは静脈注射後急速に循環から取り除かれるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，１２８６−２２００頁，Ｄｅｃ．２０１１を参照のこと）。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの負電荷ポリマーは低いｐＨ値（例えばｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここではイオン化可能な脂質が正電荷を示す。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、すなわち１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、および１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に注目が集まっている。これらの脂質を含有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、インビボで肝細胞において顕著に異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて順にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い効力が異なることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，１２８６−２２００頁，Ｄｅｃ．２０１１を参照のこと）。特にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有する製剤について、１μｇ／ｍｌレベルの投薬量が企図され得る。

【0374】

Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，１２８６−２２００頁，Ｄｅｃ．２０１１）によるＬＮＰの調製およびＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入を使用しおよび／または適合させることができる。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、およびＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）によって提供されてもよく、または合成されてもよい。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡが、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含有するＬＮＰに封入されてもよい。必要な場合、細胞取込み、細胞内送達、および体内分布を評価するため０．２％ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、カナダ）を含めてもよい。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物を最終脂質濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌとなるようにエタノール中に溶解することにより実施され得る。脂質のこのエタノール溶液を、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じるように５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下しながら添加して多重膜小胞を形成し得る。エクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに通して多重膜小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌで溶解したＲＮＡを、押し出した予成形された大きい単層小胞に滴下しながら添加し、かつ最終ＲＮＡ／脂質重量比が０．０６／１ｗｔ／ｗｔとなるまで常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成され得る。エタノールの除去および製剤緩衝液の中和は、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を使用してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して１６時間透析することにより実施された。ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒度測定器、小胞／強度モード、およびガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によりナノ粒度分布を決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒度は直径約７０ｎｍであり得る。透析前および透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ｓｉＲＮＡを除去することにより、ｓｉＲＮＡ封入効率を決定し得る。封入されたＲＮＡを溶出ナノ粒子から抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。ｓｉＲＮＡと脂質との比は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）のＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅ酵素アッセイを使用して小胞中のコレステロール含量を計測することにより決定された。

【0375】

Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，１２８６−２２００頁，Ｄｅｃ．２０１１による大きいＬＮＰの調製を使用しおよび／または適合させることができる。ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有するエタノール中に、脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。その脂質プレミックスに酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で添加し得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中で自発的なリポソーム形成が生じ得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして粒度を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中種々の時点でアリコートを取り出し、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、英国）によってリポソーム粒度の変化を調べ得る。所望の粒度に達したら、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）を添加し得る。ＰＥＧ−脂質の添加時、リポソームはその粒度であるはず、さらなる成長は有効に抑えられる。次に空のリポソームにＲＮＡを約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のｓｉＲＮＡ対総脂質比で添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、ロードされたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し得る。

【0376】

球状核酸（Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＳＮＡ（商標））構築物および他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、意図する標的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達する手段として企図される。多量のデータにより、核酸で機能化された金ナノ粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が、以下のような複数の成功の鍵に基づき代替的なプラットフォームより優れていることが示されている：

【0377】

高い生体内安定性。その高密度のローディングにより、大部分のカーゴ（ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ）は細胞内部で構築物に結合したまま留まり、核酸安定性および酵素分解に対する抵抗性が付与される。

【0378】

送達性。研究された全ての細胞型について（例えば、ニューロン、腫瘍細胞系等）、この構築物は担体または形質移入剤の必要なしに９９％の形質移入効率を実証している。

【0379】

治療的ターゲティング。構築物のユニークな標的結合親和性および特異性により、一致する標的配列への精巧な特異性が実現される（すなわち、限られたオフターゲット効果）。

【0380】

優れた有効性。この構築物は、先行する従来の形質移入試薬（リポフェクタミン２０００およびシトフェクチン）より性能が著しく優れている。

【0381】

低毒性。この構築物は、明らかな毒性なしに種々の培養細胞、初代細胞、および組織に侵入することができる。

【0382】

顕著な免疫応答がない。全ゲノムマイクロアレイ試験およびサイトカイン特異的タンパク質アッセイによって計測したとき、この構築物が誘発する全般的な遺伝子発現の変化は最小限である。

【0383】

化学的調整可能性。いかなる単一の薬剤または組み合わせによる薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を使用しても、構築物の表面を合うように調整することができる。

【0384】

核酸ベースの治療薬向けのこのプラットフォームは、炎症および感染症、癌、皮膚障害および心血管疾患を含めた多数の病状に適用可能であり得る。

【0385】

引用可能文献としては、以下が挙げられる：Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）およびＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１３０２１４３。

【0386】

ｓｉＲＮＡを含む自己集合性ナノ粒子は、例えば腫瘍血管新生発現インテグリンを標的化する手段としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドが結合したＰＥＧ化されているポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と共に構成され、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現、従って腫瘍血管新生を阻害するｓｉＲＮＡの送達に用いられ得る（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照のこと）。２〜６の範囲にわたるリン酸（核酸）に対する正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）を与えるようにカチオン性ポリマーと核酸との等容積の水溶液を混合することにより、ナノプレックスを調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、約１００ｎｍの平均粒度分布を有するポリプレックスの形成がもたらされ、ひいてはここではナノプレックスと称される。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌの自己集合性ナノ粒子での送達には、約１００〜２００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量が想定される。

【0387】

Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のナノプレックスは、２〜６の範囲にわたるリン酸（核酸）に対する正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）を与えるようにカチオン性ポリマーと核酸との等容積の水溶液を混合することにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、約１００ｎｍの平均粒度分布を有するポリプレックスの形成がもたらされ、ひいてはここではナノプレックスと称される。Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．のＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡは以下のとおり合成された：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）がＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）から注文された。アミン改変ＲＮＡセンス鎖が、炭酸緩衝液（ｐＨ９）中の１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルと共に微量遠心管に加えられた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させ、水中に再懸濁し、非改変アンチセンス鎖とアニールさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡが得られた。液体は全てＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理され、微量金属汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することによりＴｆ標的化および非標的化ｓｉＲＮＡナノ粒子を形成し得る。典型的には、ナノ粒子は水中に３（±）の電荷比および０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で形成された。標的化ナノ粒子の表面上にあるアダマンタン−ＰＥＧ分子の１パーセントがＴｆで改変された（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。ナノ粒子は注入用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中に懸濁された。

【0388】

Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的化ナノ粒子送達系を使用するｓｉＲＮＡ臨床試験を行った（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準治療の治療法に不応性の固形癌患者が２１日サイクルの１、３、８および１０日目に３０分間の静脈内注入によって標的化ナノ粒子の用量の投与を受ける。ナノ粒子は、以下を含有する合成送達系からなる：（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）と会合するようにナノ粒子の外側に提示されるヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および（４）ＲＲＭ２（臨床で使用される配列は旧称ｓｉＲ２Ｂ＋５であった）の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ。ＴＦＲは長い間悪性細胞で上方制御されることが知られており、ＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（臨床バージョンは名称ＣＡＬＡＡ−０１）は、非ヒト霊長類における反復投与試験において良好な忍容性があることが示されている。リポソーム送達によりｓｉＲＮＡを投与されたのは一人の慢性骨髄性白血病患者であるが、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の臨床試験は、標的化送達系でｓｉＲＮＡを全身的に送達して固形癌患者を治療する最初の人体試験である。この標的化送達系がヒト腫瘍に機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供できるかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．は、３つの異なる投与コホートの３人の患者；患者Ａ、ＢおよびＣの生検を調べた（全患者が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４および３０ｍｇ ｍ^−２ ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ−０１用量を受けていた）。本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系にも同様の用量を企図し得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上でＴＦ受容体（ＴＦＲ）と会合するようにナノ粒子の外側に提示されるヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンドおよび／または親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有するナノ粒子によって実現し得る。

【0389】

エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡおよびタンパク質を輸送する内因性ナノ小胞であり、マウスにおいて低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡを脳に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ターゲティングは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチド３に融合したＬａｍｐ２ｂ（エキソソーム膜タンパク質）を発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより実現された。エレクトロポレーションによって精製エキソソームに外来性ｓｉＲＮＡを負荷した。静脈内注入したＲＶＧ標的化エキソソームはＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンをもたらした。ＲＶＧエキソソームに対する前曝露はノックダウンを減弱せず、他の組織における非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介性ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性は、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）およびタンパク質（６２％）ノックダウンによって実証された。

【0390】

免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は同種の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプを有する近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、ＭＨＣ−ＩＩおよびＣＤ８６などのＴ細胞活性化因子を欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は７日間にわたり顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均質であり、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）および電子顕微鏡法によって決定するときサイズ分布のピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１０^６細胞当たり６〜１２μｇのエキソソーム（タンパク質濃度に基づき計測）を得た。

【0391】

次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させたエレクトロポレーションプロトコルを用いて改変エキソソームに外来性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションは十分に特徴付けられていないことに伴い、エレクトロポレーションプロトコルの実験最適化のため非特異的Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡが使用された。エキソソームの超遠心および溶解後、封入されたｓｉＲＮＡの量がアッセイされた。４００Ｖおよび１２５μＦでのエレクトロポレーションがｓｉＲＮＡの最も大きい保持率をもたらし、これが後続の全ての実験に使用された。

【0392】

Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡ１５０μｇを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウス、およびｓｉＲＮＡに静電的に結合する９個のＤ−アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチドであるＲＶＧ−９Ｒと複合体形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを注入したマウスとノックダウン効率を比較した。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ治療マウスおよびｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１および６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）によってもたらされた有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対して６２％、Ｐ＜０．０１）が観察された。さらに、出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム治療動物において、アルツハイマー病理におけるアミロイド斑の主成分である全β−アミロイド１−４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ−アミロイド１−４０の低下より大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＡＣＥ１開裂産物に対する５’−ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これがｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。

【0393】

最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮ−α血清濃度を評価することにより、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソーム処置後、ＩＬ−６分泌を強力に刺激したｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的に、ｓｉＲＮＡ−形質移入試薬治療と同様、全てのサイトカインで有意な変化は示されなかったことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームが僅か２０％のｓｉＲＮＡしか封入しないことを所与とすれば、ＲＶＧ−エキソソームによる送達は、同等のｍＲＮＡノックダウンおよびより高いタンパク質ノックダウンが対応する免疫刺激レベルなしに５分の１のｓｉＲＮＡで達成されたことから、ＲＶＧ−９Ｒ送達と比べて効率が高いものと見られる。この実験は、ＲＶＧ−エキソソーム技術の治療可能性を実証したもので、潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患に対する本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達に適用することができる。約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量が本発明について企図され得る。

【0394】

Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、培養細胞に由来するエキソソームをどのようにインビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡ送達に利用することができるかを開示している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターの形質移入による標的化エキソソームの作成を記載する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、エキソソームを形質移入細胞上清からどのように精製し特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、ｓｉＲＮＡをエキソソームに負荷するための決定的に重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してｓｉＲＮＡをインビトロおよびインビボでマウス脳に効率的に送達するかを概説する。予想される結果の例においては、エキソソーム媒介性ｓｉＲＮＡ送達が機能アッセイにより評価され、イメージングもまた提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。自己由来の樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して本発明に係る送達または投与が実施されてもよい。

【0395】

別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．の血漿エキソソーム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）が企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マスト細胞、上皮細胞および腫瘍細胞を含む多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内側ヘの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは天然では細胞間にＲＮＡを運び、この特性は遺伝子治療において有用であり得る。

【0396】

血漿からのエキソソームの調製は、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去しおよび１６ ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルターでろ過することにより行われる。エキソソームを１２０ ０００ｇで７０分間超遠心することによりペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的形質移入を、ＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）で製造者の指示に従い実施する。１００ｍｌ ＰＢＳにｓｉＲＮＡを２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で添加する。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ形質移入試薬の添加後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰のミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの化学的形質移入もｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームは健常ドナーの末梢血から単離された単球およびリンパ球と共培養され得る。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含有するエキソソームをヒトの単球およびリンパ球に導入し、再びヒトに自家導入し得ることが企図され得る。このように、本発明に係る送達または投与は血漿エキソソームを使用して実施し得る。

【0397】

リポソーム
本発明に係る送達または投与はリポソームで実施することができる。リポソームは、内側の水性区画を取り囲む単層膜または多重膜脂質二重層、および比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層で構成される球形小胞構造である。リポソームは生体適合性で非毒性であり、親水性および親油性の両方の薬物分子を送達し、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、かつそのロードを生体膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送することができるため、薬物送達担体として大きな注目を集めている（例えば、レビューについてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。

【0398】

リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から作製することができる；しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成にはリン脂質が最も一般的に用いられる。リポソームの形成は脂質薄膜を水溶液と混合すると自発的に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出し機器を使用して振盪の形態の力を加えることにより促進することもできる（例えば、レビューについてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。

【0399】

リポソームに、その構造および特性を改良するためいくつかの他の添加剤を添加してもよい。例えば、リポソームの構造の安定化を助けるため、およびリポソーム内部のカーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかを添加してもよい。さらに、リポソームは水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０および１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。

【0400】

従来のリポソーム製剤は、主に、天然リン脂質ならびに１，２−ジステアロイル（ｄｉｓｔｅａｒｏｒｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリンおよびモノシアロガングリオシドなどの脂質で構成される。この製剤はリン脂質のみで出来ているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その一つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとするいくつかの試みが、特に脂質膜の操作において行われている。これらの試みの一つはコレステロールの操作に重点を置いたものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物活性化合物の血漿中への急速な放出が抑えられ、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の安定性が増す（例えば、レビューについてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。

【0401】

特に有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルはｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで見ることができる。これらの粒子は、導入遺伝子を血管内注入後に脳全体に送達することを可能にする。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼファミリーを血管内注入で脳に送達することは、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物を可能にし得るものと仮定する。リポソームでの生体内投与には約１〜５ｇのＤＮＡが企図され得る。

【0402】

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系が安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与されてもよい（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照のこと）。ＳＮＡＬＰ中の標的化された約１、３または５ｍｇ／ｋｇ／日の特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを毎日静脈注射することが企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、約（ａｂｐｉｔ）１または２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与される特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが封入されたＳＮＡＬＰ）もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照のこと）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−！，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照のこと）。

【0403】

別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍に対する分子の送達に有効であるが、血管新生に乏しいＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照のこと）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡおよびＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびｓｉＲＮＡと、２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比および４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを用いて配合することにより調製され得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０〜１００ｎｍのサイズである。

【0404】

さらに別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、およびカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照のこと）。例えばボーラス静脈内注入として、投与用量当たり約２ｍｇ／ｋｇの総ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ投薬量が企図され得る。

【0405】

さらに別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、および１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照のこと）。インビボ試験に使用される製剤は、約９：１の最終的な脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。

【0406】

ＲＮＡｉナノ医薬の安全性プロファイルがＡｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ ａｎｄ Ｇｏｌｌｏｂによりレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照のこと）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４個の異なる脂質−低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、および拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質で構成される。この粒子は直径が約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化の間、イオン化可能な脂質が粒子形成中に脂質をアニオン性ｓｉＲＮＡと縮合させる働きをする。徐々に酸性になるエンドソーム条件下で正に荷電すると、イオン化可能な脂質はまたＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、ｓｉＲＮＡが細胞質中に放出されることが可能となる。ＰＥＧ脂質は粒子を安定化させ、形成中の凝集を抑え、続いて薬物動態特性を向上させる中性の親水性外面を提供する。

【0407】

現在までにＳＮＡＬＰｓｉＲＮＡ製剤を使用した２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓および空腸で発現し、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの集合および分泌に必須である。１７人の対象者が単一用量のＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢ（７用量レベルにわたり用量漸増）を受けた。肝毒性（前臨床試験に基づき潜在的な用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。１人（２人のうち）の対象者は最も高い用量で免疫系刺激と一致するインフルエンザ様症状を起こし、試験を終了させる決断がなされた。

【0408】

Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めており、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用いるもので、突然変異体ＴＴＲおよび野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的にしてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療する。３つのＡＴＴＲ症候群：家族性アミロイド神経障害（ＦＡＰ）および家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−いずれもＴＴＲにおける常染色体優性突然変異により引き起こされる；および野生型ＴＴＲにより引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）が記載されている。ＡＴＴＲ患者においてＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者（２３人が治験薬および８人がプラセボ）に０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ基準）の用量範囲内で投与された。治療は十分な忍容性があり、肝機能検査値の有意な増加はなかった。２３人中３人の患者において≧０．４ｍｇ／ｋｇで注入関連反応が認められた；全患者とも注入速度を下げたことに応答し、全員が試験を続行した。２人の患者において１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で最小限かつ一過性の血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０およびＩＬ−１ｒａの上昇が（前臨床試験およびＮＨＰ試験から予想されたとおり）認められた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の期待される薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。

【0409】

さらに別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を可溶化することにより作製されてもよく、それらがエタノール中にそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で溶解された（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照）。この脂質混合物が、それぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）および６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノールおよび脂質濃度となるように水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に混合しながら添加され、２２℃で２分間平衡させた後、押し出された。水和した脂質が、動的光散乱分析によって決定するとき７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまで、Ｌｉｐｅｘエクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して２２℃で２つの積み重ねた８０ｎｍ孔径フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出された。これは概して１〜３回通過させることが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化されている）が、予め平衡化させた（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら添加された。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な標的ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートすることにより小胞の再構成およびｓｉＲＮＡの封入が可能にされた。次にエタノールが除去され、透析によるかあるいはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションにより外側緩衝液がＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に交換された。制御された段階希釈法プロセスを用いてｓｉＲＮＡがＳＮＡＬＰに封入された。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）およびＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。負荷済みの粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰがＰＢＳに対して透析され、使用前に０．２μｍフィルターでろ過滅菌された。平均粒度は７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用される製剤の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系は使用直前に滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈され、製剤は１０ｍｌ／ｋｇの総容積で外側尾静脈から静脈内投与された。この方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に敷衍することができる。

【0410】

他の脂質
他のカチオン性脂質、例えばアミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）を利用してＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをＳｉＲＮＡと同様に封入し得る（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９−８５３３を参照のこと）。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：それぞれモル比４０／１０／４０／１０、および約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／総脂質比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよび（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒度分布および０．１１〜０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）を確実にするため、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡを添加する前に、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜に通して押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子が使用されてもよく、ここでは４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比がインビボ活性を増強するようにさらに最適化され得る。

【0411】

Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（「マウスにおける化学改変ｍＲＮＡ送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１）、オンライン発行２０１１年１月９日）は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を記載している。脂質エンベロープの使用もまた本発明において好ましい。

【0412】

別の実施形態において、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系と配合して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００およびコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧが挙げられ、自発的小胞形成手法を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓと配合され得る（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照のこと）。成分モル比は約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００／ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比はＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ約１２：１および９：１であり得る。製剤は約８０ｎｍの平均粒子直径を有し、９０％超の捕捉効率であり得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。

【0413】

Ｔｅｋｍｉｒａは、米国および米国外に、ＬＮＰおよびＬＮＰ製剤の種々の態様に関する約９５件のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書および同第７，８３８，６５８号明細書ならびに欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書および同第１６６４３１６号明細書を参照のこと）、それらは全て本発明に使用しおよび／または適合させることができる。

【0414】

ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、タンパク質、タンパク質前駆体、または部分的にもしくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質もしくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤化の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書および同第２０１３０２４５１０７号明細書および同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）にさらに記載されるものなどのＰＬＧＡマイクロスフェアに封入されて送達されてもよい。この製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであってもよい。Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，「エンジニアリングされた核酸の送達および製剤化（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）」、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照のこと。

【0415】

Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド、および核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬のバイオアベイラビリティの課題に対処する。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路としては、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍ならびに眼への送達が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０およびＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照のこと。

【0416】

米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、生理活性分子、例えばポリヌクレオチド分子、ペプチドおよびポリペプチドおよび／または医薬品を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。このデンドリマーは、生理活性分子の送達を、例えば肝臓、脾臓、肺、腎臓または心臓に標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分枝状単量体単位から段階的な方式で調製される合成三次元巨大分子であり、その性質および機能性を容易に制御し、変えることができる。デンドリマーは、構成要素を多官能性コアに繰り返し加えることによるか（ダイバージェント合成手法）、または多官能コアに向かって繰り返し加える（コンバージェント合成手法）ことにより合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高い世代のデンドリマーの形成がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに対して、第一級アミンに対するアクリロニトリルの二重マイケル付加と、続くニトリルの水素化により、２倍の数のアミノ基が付加される。その結果アミノ基の倍加が生じる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは１００％プロトン化可能な窒素および最大６４個の末端アミノ基を含有する（第５世代、ＤＡＢ ６４）。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容可能なアミン基である。遺伝子送達剤としてのデンドリマーの使用は、大部分が、それぞれコンジュゲーション単位としてアミン／アミドの混合物またはＮ−Ｐ（Ｏ_２）Ｓを有するポリアミドアミンおよび亜リン酸含有化合物の使用に主眼が置かれており、遺伝子送達のためのより低世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの使用に関する研究は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬物デリバリーおよび周辺のアミノ酸基によって化学的に改変されるときのゲスト分子のその封入のためのｐＨ感受性制御放出系としても研究されている。ポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞毒性およびＤＮＡとの相互作用ならびにＤＡＢ ６４の形質移入有効性もまた研究されている。

【0417】

米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えばポリプロピレンイミンデンドリマーが、特異的標的化および低毒性など、遺伝物質などの生理活性分子の標的化デリバリーにおける使用に好適な特性を示すという観察に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体もまた生理活性分子の標的化デリバリーに好適な特性を示す。「生理活性ポリマー（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照されたく、これは以下を開示している「カチオン性ポリアミンポリマーおよびデンドリマーポリマーを含む種々のポリマーが抗増殖活性を有する、従って新生物および腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬およびアテローム性動脈硬化症などの、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得ることが示される。こうしたポリマーは単独で活性薬剤として、または他の治療剤、例えば薬物分子または遺伝子治療用核酸の送達媒体として使用され得る。そのような場合、ポリマーそれ自体の固有の抗腫瘍活性は、送達される薬剤の活性を補完し得る」。

【0418】

超荷電タンパク質（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）
超荷電タンパク質は、通常高い正または負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされたまたは天然に存在するタンパク質の一クラスである。極度に負に荷電したタンパク質および極度に正に荷電したタンパク質の両方が、熱的または化学的に引き起こされる凝集に耐える顕著な能力を呈する。極度に正に荷電したタンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。カーゴをこれらのタンパク質、例えばプラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることにより、インビトロおよびインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することが可能となり得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成および特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０−１０１１２）。

【0419】

哺乳類細胞に対するｓｉＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究および治療の双方の適用に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ＧＦＰタンパク質（または他の極度に正に荷電したタンパク質）を適切な無血清培地中でｓｉＲＮＡと混合し、細胞を加える前に複合体を形成させる。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質−ｓｉＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞系に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６）。しかしながら、手順を特定の細胞系に最適化するため、タンパク質およびｓｉＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を実施すべきである。
（１）治療前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５細胞をプレーティングする。
（２）治療当日、精製＋３６ＧＦＰタンパク質を最終濃度が２００ｎＭとなるように無血清培地中に希釈する。最終濃度が５０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ＧＦＰおよびｓｉＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ｓｉＲＮＡ複合体を細胞に添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、ノックダウンのアッセイに応じてさらに４８時間またはそれより長くインキュベートする。
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、または他の適切な方法によって細胞を分析する。

【0420】

Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、＋３６ ＧＦＰが様々な細胞における有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出している。プラスミドＤＮＡはｓｉＲＮＡより大きいカーゴであるため、プラスミドを有効に複合体化するには、比例してさらなる＋３６ ＧＦＰタンパク質が必要となる。有効なプラスミド送達のため、出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ ＧＦＰの変異体を開発している。種々の細胞において以下のプロトコルが有効となっているが、上記のとおりプラスミドＤＮＡおよび超荷電タンパク質の用量を特定の細胞系および送達用途に最適化することが勧められる。
（１）治療前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５をプレーティングする。
（２）治療当日、精製ｐ３６ ＧＦＰタンパク質を最終濃度が２ｍＭとなるように無血清培地中に希釈する。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ ＧＦＰおよびプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質−ＤＮＡ複合体を穏やかに添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、さらに２４〜４８時間インキュベートする。
（７）必要に応じてプラスミド送達を（例えばプラスミドドライブ遺伝子発現により）分析する。

【0421】

例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１−８４３（２０１２）も参照のこと。この超荷電タンパク質の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用しおよび／または適合させることができる。

【0422】

細胞浸透ペプチド
さらに別の実施形態において、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達のために企図される。ＣＰＰは、種々の分子積み荷（ナノサイズ粒子から化学小分子およびＤＮＡの大断片）の細胞取り込みを容易にする短鎖ペプチドである。本明細書において使用される用語「積み荷」は、限定されるものではないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子および放射性材料からなる群を含む。本発明の態様において、積み荷は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の任意の成分または機能ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系全体も含み得る。本発明の態様は、所望の積み荷を対象中に送達する方法であって、（ａ）本発明の細胞浸透ペプチドおよび所望の積み荷を含む複合体を調製すること、ならびに（ｂ）複合体を対象に経口投与、関節内投与、腹腔内投与、鞘内投与、動脈内投与、鼻腔内投与、実質内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、直腸内投与、または局所投与することを含む方法をさらに提供する。積み荷は、化学結合を介し、または共有結合を介し、または非共有結合相互作用を介してペプチドと会合している。

【0423】

ＣＰＰの機能は、積み荷を細胞中に送達することであり、生存哺乳動物細胞のエンドソームに送達される積み荷とのエンドサイトーシスを介して一般に生じるプロセスである。細胞浸透ペプチドは、異なるサイズ、アミノ酸配列、および電荷のものであるが、全てのＣＰＰは、細胞膜をトランスロケートし、細胞質またはオルガネラへの種々の分子積み荷の送達を容易にする能力である１つの区別される特徴を有する。ＣＰＰトランスケーションは、３つの主要な流入機序に分類することができる：膜中の直接浸透、エンドサイトーシス媒介流入、および一過的構造の形成を介するトランスケーション。ＣＰＰは、様々な疾患、例として、癌の治療における薬物送達剤およびウイルス阻害剤、ならびに細胞標識のための造影剤としての医療における多数の用途を見出した。後者の例としては、ＧＦＰのための担体、ＭＲＩ造影剤、または量子ドットとしての作用が挙げられる。ＣＰＰは、研究および医療において使用されるインビトロおよびインビボ送達ベクターとしての大きい潜在性を保持する。ＣＰＰは、典型的には、高い相対存在量の正荷電アミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニンを含有するアミノ酸組成を有し、または交互パターンの極性／荷電アミノ酸および非極性疎水性アミノ酸を含有する配列を有する。これら２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオンまたは両性と称される。第３のクラスのＣＰＰは、非極性残基のみを含有する疎水性ペプチドであり、低い正味荷電を有し、または細胞取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見された初期ＣＰＰの１つは、培養物中の多数の細胞タイプにより周囲の媒体から効率的に取り込まれることが見出されたヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）からのトランス作用転写アクチベーター（Ｔａｔ）であった。これ以降、公知のＣＰＰの数はかなり拡大し、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成アナログが生成された。ＣＰＰとしては、限定されるものではないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８〜６０）、トランスポータン、および（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ_４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。

【0424】

米国特許第８，３７２，９５１号明細書に記載のとおり、高度に細胞浸透効率および低い毒性を示す好酸球カチオンタンパク質（ＥＣＰ）に由来するＣＰＰが提供される。脊椎動物対象中へのＣＰＰのその積み荷との送達の態様も提供される。ＣＰＰおよびその送達のさらなる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；同第８；６１４，１９４号明細書および同第８，０４４，０１９号明細書に記載される。

【0425】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達するためにＣＰＰを用いることができることは、参照により全体として組み込まれるマニュスクリプト“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，ｂｙ Ｓｕｒｅｓｈ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ−Ｂｏｎｓｒａｈ Ｋｗａｋｕ Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ａｐｒ ２．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］にも提供され、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質およびＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる治療がヒト細胞系において内因性遺伝子破壊をもたらすことが実証されている。この論文において、Ｃａｓ９タンパク質は、チオエーテル結合を介してＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、凝縮正荷電ナノ粒子を形成した。改変Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡによるヒト細胞、例として、胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、および胚性癌細胞の同時および連続治療が効率的な遺伝子破壊をもたらし、プラスミド形質移入に対してオフターゲット突然変異を低減させることが示された。

【0426】

植込み型装置
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に植込み型装置もまた企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出させる植込み型医療器具が、いくつかの種類のかかる装置、治療の実施態様および植え込み方法を含め、提供されることを開示する。この装置は、例えばマトリックスなどの、装置本体として使用されるポリマー基材と、薬物と、ある場合にはさらなる足場材料、例えば金属または別のポリマー、ならびに可視性およびイメージングを増強する材料とで構成される。薬物の選択は、薬物を局所的に長時間放出するという利点に基づき、ここで薬物は直接的に腫瘍、炎症、変性などの患部の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して、または対症目的で、または損傷した平滑筋細胞に対して、または予防のため放出される。ある種の薬物は、限定はされないが、ｓｉ ＲＮＡ、ｓｈ ＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ、リボザイムおよびヌクレオシド類似体を含めた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく遺伝子サイレンシング薬である。従って、このシステムは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。一部の実施形態における植え込み方法は、小線源照射療法および針生検を含め、現在開発され、他の治療に使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には同じ治療手技の中で数個の装置が植え込まれる。

【0427】

米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおり、腹腔などの体腔に適用可能なシステム、および／または薬物送達系が繋ぎ止められたりまたは取り付けられたりしない、生体安定性および／または分解性および／または生体吸収性ポリマー基材（例えば場合によりマトリックスであってもよい）を含む任意の他の種類の投与を含めた、薬物送達植込み型または挿入型システムが提供される。用語「挿入」には植え込みも含まれることに留意しなければならない。この薬物送達系は、好ましくは米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。

【0428】

１つまたは複数のポリマーは生体適合性で、１つおよび／または複数の薬剤を組み込み、制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここで例えばマトリックスなどのポリマー基材の総容積は、一部の実施形態では場合により、および好ましくは、薬剤の治療レベルに達することを可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤を負荷するための容積によって必要とされるところに応じて、好ましくは０．１ｍ^３〜１０００ｍｍ^３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは場合により、例えば、サイズが機能性によって決まる装置、例えばおよび限定なしに、膝関節、子宮内または子宮頸部リングなどで取り込まれる場合、さらに大きくてもよい。

【0429】

薬物送達系（組成物の送達用）は、一部の実施形態では、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで主となる放出機構はバルク浸食である；または一部の実施形態では、非分解性の、または分解が遅いポリマーが使用され、ここで主となる放出機構はバルク浸食よりむしろ拡散であって、外側部分が膜として機能し、かつその内側部分が、長期間にわたり（例えば約１週間〜約数ヵ月間）実質的に周囲の影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を備える異なるポリマーの組み合わせもまた場合により用いられ得る。表面における濃度勾配は、好ましくは全薬物放出期間のうちかなりの期間において事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と称される）。用語「一定」とは、拡散速度が好ましくは治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、それでもなお、場合により初期バーストを特徴としおよび／または例えばある程度増減して変動し得ることが意味される。拡散速度は好ましくは長期間にわたりそのように維持され、それは、治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのにある程度一定であると考えられる。

【0430】

薬物送達系は場合により、および好ましくは、ヌクレオチドベースの治療剤を、化学的性質であるか、それとも酵素からの攻撃および対象の体における他の要因に起因するかに関わらず、分解から保護するように設計される。

【0431】

米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの薬物送達系は、例えば場合により、限定はされないが熱的加熱および冷却、レーザービーム、ならびに集束超音波を含む超音波および／またはＲＦ（高周波）方法または装置を含めた、非侵襲性および／または最小侵襲性の作動および／または加速／減速方法によって、その装置の植え込み時および／または植え込み後に動作する検知および／または作動器具を場合により伴う。

【0432】

米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、場合により、細胞の高度な異常増殖、および抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位、例えば腫瘍、活動性および／または慢性炎症および感染症、例えば自己免疫病状、変性した組織、例えば筋肉および神経組織、慢性痛、変性部位、ならびに骨折箇所および組織再生が増強される他の創傷箇所、ならびに損傷した心筋、平滑筋および横紋筋が含まれ得る。局所送達部位にはまた、場合により、妊娠、感染症および加齢の予防を含めた予防的活動を果たすことを可能にする部位も含まれる。

【0433】

組成物の植え込み部位、すなわち標的部位は、好ましくは標的化された局所送達に十分に小さい半径、面積および／または容積を特徴とする。例えば、標的部位は場合により約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。

【0434】

標的部位の位置は、好ましくは治療有効性が最大となるように選択される。例えば、薬物送達系の組成物（場合により上記に記載したとおりの植え込み用装置を伴う）は、場合により、および好ましくは、腫瘍環境、またはその関連する血液供給源の内部もしくはそれに近接して植え込まれる。

【0435】

例えば組成物（場合により装置を伴う）は、場合により膵臓、前立腺、乳房、肝臓の内部もしくはそれに近接して、ニップルを用いて血管系の中などに植え込まれる。

【0436】

標的位置は、場合により以下からなる群から選択される（Ｌｏｄｅｒの植え込みには場合により体内の任意の部位が好適であり得るため、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質および灰白質におけるパーキンソン病またはアルツハイマー病などにおける変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などにおける脊椎；３．ＨＰＶ感染症を予防するための子宮頸部；４．活動性および慢性炎症関節；５．乾癬などにおける真皮；６．鎮痛効果のための交感神経および感覚（ｓｅｎｓｏｒｉｃ）神経部位；７．骨内埋込み；８．急性および慢性感染症部位；９．腟内；１０．内耳−聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．実質組織、例えば、限定はされないが、腎臓、肝臓、脾臓；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．体腔、例えば腹腔（例えば、限定はしないが、卵巣癌）；２４．食道内および２５．直腸内。

【0437】

場合により、システム（例えば組成物を入れた装置）の挿入は標的部位および当該部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注入を伴い、標的部位およびかかる部位の近傍の局所的ｐＨおよび／または温度および／またはＥＣＭにおける薬物の拡散および／または薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的な要因に影響が及ぼされる。

【0438】

場合により、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、レーザービーム、放射線、熱的加熱および冷却、および超音波、例えば集束超音波および／またはＲＦ（高周波）方法または装置、および化学的活性化因子を含めた、非侵襲性および／または最小侵襲性のおよび／または他の作動および／または加速／減速方法によって、挿入前および／または挿入時および／または挿入後に動作する検知および／または作動器具を伴い得る。

【0439】

米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によれば、薬物は好ましくは、以下に記載するとおり、例えば乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、および前立腺における限局した癌の症例のための、遺伝子サイレンシング生物学的ＲＮＡｉ薬物を含む。さらに、ｓｉＲＮＡ以外の多くの薬物がＬｏｄｅｒにおける封入に適用可能であり、かかる薬物を例えばマトリックスなどのＬｏｄｅｒ基材で封入し得る限り、この発明に関連して使用することができる。かかる薬物には、背痛の場合に脊椎の近傍に植え込まれるＬｏｄｅｒ内の真菌感染症用のアムホテリシンＢ；骨髄炎などでの抗生物質；麻酔薬などの鎮痛薬；アルツハイマー病またはパーキンソン病などにおける抗変性薬を含め、現在この発明以外の方法によって送達されている承認済みの薬物が含まれる。かかるシステムは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用しおよび／または適合させることができる。

【0440】

例えば、平滑筋細胞（ステント留置手技中に損傷し、結果として増殖する傾向があるもの）の成長または再成長の防止などの特定の適用について、薬物は、場合により、Ｈ１９サイレンシングを含め、平滑筋細胞をサイレンシングするｓｉＲＮＡであるか、またはタキソール、ラパマイシンおよびラパマイシン類似体からなる群から選択される薬物であってもよい。その場合、Ｌｏｄｅｒは好ましくは、一定の速度で長時間放出する薬物溶出性ステント（ＤＥＳ）か、あるいはステントに関連する、別途植え込まれる専用の装置である。この全てについて、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。

【0441】

特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経および筋肉の変性疾患が発症する。サイレンシングＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉するための治療特性を有し得る。小分子薬物および巨大分子を含めた抗アポトーシス薬、抗炎症薬および抗変性薬の局所送達もまた場合により効果があり得る。その場合、Ｌｏｄｅｒは一定速度での長時間放出用に適用されおよび／または別途植え込まれる専用の装置を介して適用される。この全てについて、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。

【0442】

特定の適用のさらに別の例として、精神障害および認知障害が遺伝子改変因子で治療される。サイレンシングＲＮＡによる遺伝子ノックダウンが治療選択肢である。ヌクレオチドベースの薬剤を中枢神経系部位に局所送達するＬｏｄｅｒが、限定はされないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害および行動性の病気を含めた精神障害および認知障害に対する治療選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳部位に植え込まれると、小分子薬物および巨大分子を含めた薬物も局所送達することができる。この全てについて、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。

【0443】

特定の適用の別の例として、局所部位での自然免疫および／または適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、移植臓器拒絶反応を予防することが可能となる。移植臓器および／または移植部位に植え込まれたＬｏｄｅｒによるサイレンシングＲＮＡおよび免疫調節試薬の局所送達は、ＣＤ８などの免疫細胞を寄せ付けないことによる局所的な免疫抑制が移植臓器に対して活性化された状態にする。この全てについて、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用しおよび／または適合させることができる。

【0444】

特定の適用の別の例として、ＶＥＧＦおよびアンジオゲニンなどを含めた血管成長因子が血管新生に必須である。因子、ペプチド、ペプチドミメティクスの局所送達、またはそれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療モダリティである；Ｌｏｄｅｒによる血管新生を刺激する因子、ペプチド、巨大分子および小分子薬物の局所送達およびそれらのリプレッサーのサイレンシングは、末梢性、全身性および心臓の血管疾患に治療効果がある。

【0445】

挿入、例えば植え込みの方法は、場合によりかかる方法を変更することなしに、あるいは場合により軽微な変更のみを伴い、場合により他の種類の組織移植および／または挿入および／または組織採取に既に用いられているものであってもよい。かかる方法には、場合により、限定はされないが、小線源照射療法、生検、超音波を伴うおよび／または伴わない内視鏡検査、例えばＥＲＣＰ、脳組織への定位的方法、腹腔鏡検査、例えば関節、腹部器官、膀胱壁および体腔への腹腔鏡の植え込みが含まれる。

【0446】

ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡはまた個別に送達されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡより先に送達され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡ投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与され得る。

【0447】

あるいは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは共に投与することができる。有利には、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与の１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）に投与することができる。

【0448】

最も効率的なゲノム改変レベルを達成するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよび／またはガイドＲＮＡのさらなる投与が有用であり得る。

【0449】

毒性およびオフターゲット効果を最小限に抑えるためには、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞または動物モデルで種々の濃度を試験し、ディープシーケンシングを使用して潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度を分析することにより決定し得る。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的化するガイド配列について、ディープシーケンシングを使用して以下の２つのオフターゲット遺伝子座、すなわち１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’および２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における改変レベルを評価することができる。オフターゲット改変レベルを最小限に抑えながら最も高いオンターゲット改変レベルが得られる濃度をインビボ送達に選択するべきである。

【0450】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶化および結晶構造の特性決定
本発明の結晶は、タンパク質結晶化技術、例として、回分、液体架橋、透析、水蒸気拡散および懸滴法により得ることができる。一般に、本発明の結晶は、実質的に純粋なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびそれが結合する核酸分子を、沈殿に必要な濃度をほんの少し下回る濃度の沈殿剤を含有する水性緩衝液中で溶解させることにより成長させる。水を制御蒸発により除去して結晶成長が停止するまで維持される沈殿条件をもたらす。

【0451】

結晶、結晶構造および原子構造座標の使用：本発明の結晶、および特にそれから得られる原子構造座標は、広範に使用される。結晶および構造座標は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に結合する化合物（核酸分子）、および特定の化合物（核酸分子）に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の同定に特に有用である。したがって、本明細書に記載の構造座標は、追加の合成または突然変異ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、結合ドメインの結晶構造の決定における位相モデルとして使用することができる。本明細書の結晶構造表および図におけるような核酸分子と複合体化しているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造の供給は、当業者にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の作用機序への詳細な見識を提供する。この見識は、改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を、例えば、それに機能群、例えば、リプレッサーまたはアクチベーターを付着させることにより設計する手段を提供する。機能群、例えば、リプレッサーまたはアクチベーターをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のＮまたはＣ末端に付着させることができる一方、結晶構造は、Ｎ末端が覆われ、または遮蔽されているように見える一方、Ｃ末端は機能群、例えば、リプレッサーまたはアクチベーターにより利用可能であることを実証する。さらに、結晶構造は、機能群、例えば、アクチベーターまたはリプレッサーの付着に好適なおよそＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））残基５３４〜６７６間にフレキシブルなループが存在することを実証する。付着は、リンカー、例えば、フレキシブルグリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）または（ＧＧＧＳ）_３またはリジッドアルファ−ヘリカルリンカー、例えば、（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）を介するものであり得る。フレキシブルループの他、ヌクレアーゼまたはＨ３領域、Ｈ２領域およびヘリカル領域も存在する。「ヘリックス」または「ヘリカル」は、当分野において公知のヘリックス、例として、限定されるものではないが、アルファ−ヘリックスを意味する。さらに、ヘリックスまたはヘリカルという用語は、Ｎ末端ターンを有するｃ末端ヘリカルエレメントを示すために使用することもできる。

【0452】

核酸分子と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造の供給は、薬物または化合物の発見、同定、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に結合し得る化合物のための設計のための新規アプローチを可能とし、したがって、本発明は、多細胞生物、例えば、藻類、植物、無脊椎動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物；例えば、栽培植物、動物（例えば、生産動物、例えば、ブタ、ウシ、ニワトリ；コンパニオン動物、例えば、ネコ、イヌ、げっ歯類（ウサギ、ネズミ、ハムスター）；実験動物、例えば、マウス、ラット）、およびヒトの病態または疾患の診断、治療、または予防において有用なツールを提供する。したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の合理的設計のコンピュータベース方法を提供する。この合理的設計は、本明細書の結晶構造表および／または図中の一部または全部（例えば、少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には、少なくとも１０個、より有利には、少なくとも５０個、いっそうより有利には、少なくとも１００個の原子の構造）の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を提供すること；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が望まれる所望の核酸分子の構造を提供すること；ならびに本明細書の結晶構造表および／または図中の一部または全部の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を、所望の核酸分子にフィットすること（前記フィットにおいて、所望の核酸分子を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体のために結合する前記所望の核酸分子について本明細書の結晶構造表および／または図の一部または全部の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の推定改変を得ること含む）を含み得る。方法または方法のフィットは、活性部位または結合領域（例えば、少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には、少なくとも１０個、より有利には、少なくとも５０個、いっそうより有利には、少なくとも１００個の原子の構造）に近接する本明細書の結晶構造表および／または図の一部または全部の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の目的原子の座標を使用して活性部位または結合領域の近接性をモデリングすることができる。これらの座標は、次いで所望または候補核酸分子に対して「インシリコ」でスクリーニングされる空間を定義するために使用することができる。したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の合理的設計のコンピュータベース方法を提供する。この方法は、本明細書の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標（「選択座標」）を提供すること；候補または所望の核酸分子の構造を提供すること；および候補の構造を選択座標にフィットすることを含み得る。この様式において、当業者は、機能群および候補または所望核酸分子をフィットすることもできる。例えば、本明細書の結晶構造表および／または図中の一部または全部（例えば、少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には、少なくとも１０個、より有利には、少なくとも５０個、いっそうより有利には、少なくとも１００個の原子の構造）の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を提供すること；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が所望される所望の核酸分子の構造を提供すること；本明細書の結晶構造表および／または図中の一部または全部の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を、所望の核酸分子にフィットすること（前記フィットにおいて、所望の核酸分子を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体のために結合する前記所望の核酸分子について本明細書の結晶構造表および／または図中の一部または全部の座標により定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の推定改変を得ることを含む）；推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体を選択すること、そのような推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体を機能群（例えば、アクチベーター、リプレッサー）にフィットすること（例えば、機能群の位置決め（例えば、フレキシブルループ内の位置）についての局在および／または機能群の位置決めの局在の作出のための推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体の推定改変に関して）。示唆されるとおり、本発明は、活性部位または結合領域に近接する本明細書の結晶構造表および／または図中の座標を使用して実施することができ；したがって、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の目的サブドメインを用い得る。本発明の方法は、ドメインまたはサブドメインの座標を使用して実施することができる。方法は、場合により、候補または所望核酸分子および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を「インシリコ」出力から合成することならびに「ウエット」または実際の候補または所望核酸分子に結合している「ウエット」または実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に結合している「ウエット」または実際の機能群の結合および／または活性を試験することを含み得る。方法は、「インシリコ」出力からＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（機能群を含む）を合成することならびにインビボ「ウエット」または実際の候補または所望核酸分子に結合している「ウエット」または実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に結合している「ウエット」または実際の機能群の結合および／または活性を試験すること、例えば、「インシリコ」出力からの機能群を含む「ウエット」または実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を、所望または候補核酸分子を含有する細胞と接触させることを含み得る。これらの方法は、所望の反応、例えば、症状または病態または疾患の軽減について細胞または細胞を含有する生物を観察することを含み得る。候補核酸分子の構造を提供するステップは、核酸分子データ、例えば、病態または疾患に関するそのようなデータを含有するデータベースをコンピュータによりスクリーニングすることにより化合物を選択することを含み得る。候補核酸分子の結合のための３Ｄ記述子は、本明細書の結晶構造からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体またはそのドメインもしくは領域のアーキテクチャーおよび化学的性質から導かれる幾何および機能制約から導くことができる。事実上、記述子は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を候補または所望核酸分子に結合させるための本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体結晶構造の仮想改変のタイプであり得る。次いで、記述子を使用して核酸分子データベースを調査して記述子への推定上良好な結合を有するデータベースのそれらの核酸分子を確認することができる。次いで、記述子および推定上良好な結合を有する核酸分子を使用して本明細書の「ウエット」ステップを実施することができる。

【0453】

「フィットすること」は、候補の少なくとも１つの原子と、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の少なくとも１つの原子との間の相互作用の自動または半自動手段による決定およびそのような相互作用が安定である程度の計算を意味し得る。相互作用としては、電荷、立体的考察などにより生じる引力、斥力を挙げることができる。「サブドメイン」は、二次構造の少なくとも１つ、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの完全エレメントを意味し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の特定の領域またはドメインとしては、本明細書の結晶構造表および／または図中に同定されたものが挙げられる。

【0454】

いずれのイベントにおいても、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９（（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）複合体の三次元構造の決定は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）に結合する新たなおよび特異的核酸分子の設計、ならびに新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の設計、例えば、種々の核酸分子に結合させるためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の改変による設計、互いに相互作用し得る、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と相互作用し得る（例えば、機能の自己活性化および／または自己終結を提供する誘導系）、核酸分子核酸分子と相互作用し得る種々の機能群のいずれか１つ以上にそれに結合したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の改変による設計（例えば、機能群は、転写リプレッサー、転写アクチベーター、ヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミラーゼ、タンパク質キナーゼ、およびタンパク質ホスファターゼからなる群から選択することができる調節または機能ドメインであり得；一部の態様において、機能ドメインは、エピジェネティックレギュレーターであり；例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、米国特許第８，５０７，２７２号明細書参照、この文献およびその文献に引用される全ての文献および全ての出願引用文献は、参照により本明細書に組み込まれることがここでも挙げられる）、Ｃａｓ９の改変による設計、新規ニッカーゼによる設計）のための基礎を提供する。実際、本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）結晶構造は、多数の使用を有する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）結晶構造の三次元構造を知ることから、コンピュータモデリングプログラムを使用してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の考えられるまたは裏付けされた部位、例えば、結合部位または他の構造もしくは機能特徴部と相互作用することが予測される様々な分子を設計または同定することができる。潜在的に結合する化合物（「バインダー」）は、ドッキングプログラムを使用するコンピュータモデリングの使用を介して試験することができる。ドッキングプログラム；例えば、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．３，ｎｏ．４（１９９８），１６０−１７８、およびＤｕｎｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ２（１９９７），２７−４２参照）が公知である。この手順は、潜在的なバインダーのコンピュータフィッティングを含み得、潜在的バインダーの形状および化学構造がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）にいかに十分に結合するかを確認する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の活性部位または結合部位のコンピュータ支援手動試験を実施することができる。プログラム、例えば、ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１９８５，２８，８４９−５７）（種々の官能基を有する分子間の推定相互作用部位を決定するプログラム）を使用して活性部位または結合部位を分析して結合化合物の部分構造を予測することもできる。コンピュータプログラムを用いて２つの結合パートナー、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）および候補核酸分子または核酸分子および候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の引力、斥力または立体障害を推定することができ；本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）はそのような方法を可能とする。一般に、フィットがタイトになればなるほど、立体障害が少なくなり、引力が大きければ大きいほど、潜在的なバインダーが強力になる。それというのも、これらの特性はよりタイトな結合定数と一致するためである。さらに、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の設計において特異性が大きければ大きいほど、それがオフターゲット分子と相互作用しない可能性も高くなる。さらに、「ウエット」法が本発明により可能とされる。例えば、一態様において、本発明は、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）に結合している候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のバインダー（例えば、標的核酸分子）の構造を決定する方法であって、（ａ）本発明による候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の第１の結晶または候補候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の第２の結晶を提供すること、（ｂ）第１の結晶または第２の結晶を、複合体が形成し得る条件下で前記バインダーと接触させること；ならびに（ｃ）前記候補（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）複合体の構造を決定することを含む方法を提供する。第２の結晶は、本明細書に記載の本質的に同一の座標を有し得るが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であるそのような系と、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であるそのような系のＣａｓ９からのもの）、「例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９」は、Ｃａｓ９がＣａｓ９であり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはそのオルソログのものまたはそれに由来し得ることを示す）のマイナーな変更に起因して、結晶は異なる空間群で形成し得る。

【0455】

本発明は、「インシリコ」法に代えて、またはその他に、他の「ウエット」法、例として、結合活性を有する化合物を選択するための、バインダー（例えば、標的核酸分子）および候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、または候補バインダー（例えば、標的核酸分子）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、または候補バインダー（例えば、標的核酸分子）および候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）（１つ以上の機能群を有し、または有さない上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）の高スループットスクリーニングをさらに含む。結合活性を示すバインダーおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系のそれらのペアを選択し、Ｘ線分析のために例えば、共結晶化により、または浸漬により本明細書の構造を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶とさらに結晶化させることができる。得られるＸ線構造は、種々の目的について、例えば、重複面積について本明細書の結晶構造表のものおよび図中の情報と比較することができる。好ましいフィッティング特性、例えば、バインダーおよび本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造データのペアに基づき予測される強力な引力を有するものを決定することによりバインダーおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の考えられるペアを設計し、同定し、または選択したら、次いでそれらの考えられるペアを「ウエット」法により活性についてスクリーニングすることができる。結果的に、一態様において、本発明は、考えられるペアを得、または合成すること；ならびにバインダー（例えば、標的核酸分子）および候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、または候補バインダー（例えば、標的核酸分子）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、または候補バインダー（例えば、標的核酸分子）および候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）（１つ以上の機能群を有し、または有さない上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）を接触させて結合能を決定することを含み得る。後者のステップにおいて、接触は、有利には、機能を決定するための条件下で行う。このようなアッセイの実施に代えて、またはその他に、本発明は、前記接触から複合体を得、または合成し、例えば、Ｘ線回折またはＮＭＲまたは他の手段により複合体を分析して結合または相互作用能を決定することを含み得る。次いで、結合についての詳細な構造情報を得、この情報に照らして、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系またはその成分の構造または機能性に対して調整を行うことができる。これらのステップは、反復し、必要に応じて再反復することができる。あるいはまたはさらに、上記方法からのまたはその方法における潜在的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、核酸分子とともにインビボであり得、例として、限定されるものではないが、例として、生物（例として、非ヒト動物およびヒト）に投与して機能、例として、所望のアウトカム（例えば、症状の軽減、治療）がそれから得られるかどうかを確認または裏付ける。

【0456】

本発明は、本明細書の結晶構造表の構造座標および／または図中の情報を使用することにより未知構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体の三次元構造を決定する方法をさらに含む。例えば、Ｘ線結晶分析まＮＭＲ分光データを未知結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体に提供する場合、本明細書の結晶構造表および図に定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を使用してそのデータを解釈して未知の系または複合体についての有力な構造をＸ線結晶分析の場合において位相モデリングのような技術により提供することができる。したがって、本発明の方法は、未知結晶構造を有するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体の表示を、本明細書の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ（９）系および複合体の類似表示とアラインして相同または類似領域（例えば、相同または類似配列）をマッチさせること；対応する領域（例えば、配列）の本明細書の結晶構造表および／または図中に定義される構造に基づき未知結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体のマッチした相同または類似領域（例えば、配列）の構造をモデリングすること；ならびに前記マッチした相同領域の構造を実質的に保存する未知結晶構造についての立体構造（例えば、低エネルギー立体構造が形成されるように好ましい相互作用が形成されるべきことを考慮する）を決定することを含み得る。「相同領域」は、例えば、アミノ酸に関して、同一または類似の、例えば、脂肪族、芳香族、極性、負荷電、または正荷電の側鎖化学基を有する２つの配列中のアミノ酸残基を説明する。核酸分子に関する相同領域は、少なくとも８５％または８６％または８７％または８８％または８９％または９０％または９１％または９２％または９３％または９４％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％の相同性または同一性を含み得る。同一および類似領域は、当業者によりそれぞれ「インバリアント」および「保存」と記載されることがある。有利には、第１および第３のステップは、コンピュータモデリングにより実施される。相同性モデリングは、当業者に周知の技術である（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、およびＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖｏｌ １７２（１９８８），５１３参照）。本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の保存領域および未知結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系のそのコンピュータ表示は、未知結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系の結晶構造の予測および決定を支援する。

【0457】

さらにまた、インシリコでＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造を用いる本発明の態様は、本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造を使用することにより推測される新たなＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造に同等に適用することができる。この様式において、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造のライブラリーを得ることができる。したがって、合理的なＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ設計が本発明により提供される。例えば、本明細書に記載の方法によりＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体の立体構造または結晶構造を決定したら、そのような立体構造は、結晶構造が依然として未知である他のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体の立体構造または結晶構造を決定する本明細書のコンピュータベース法において使用することができる。これらの結晶構造の全てからのデータは、データベース中に存在し得、本明細書の方法は、本明細書の結晶構造またはその一部をライブラリー中の１つ以上の結晶構造に対して含む本明細書の比較を有することにより、よりロバストであり得る。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系もしくは複合体の構造を生成し、および／またはその合理的設計を実施することが意図されるシステム、例えば、コンピュータシステムをさらに提供する。システムは、本明細書の結晶構造表および／または図による原子座標データを含有し、または例えば、モデリングによりそれから誘導することができ、前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系もしくは複合体またはそれらの少なくとも１つのドメインもしくはサブドメインの三次元構造、またはそれらについての構造因子データを定義し、前記構造因子データは、本明細書の結晶構造表および／または図の原子座標データから誘導可能である。本発明はまた、本明細書の結晶構造表および／または図による、または相同性モデリングによりそれから誘導される原子座標データ（前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系もしくは複合体またはそれらの少なくとも１つのドメインもしくはサブドメインの三次元構造を定義する）またはそれらについての構造因子データ（前記構造因子データは、本明細書の結晶構造表および／または図の原子座標データから誘導可能である）を有するコンピュータ読み取り可能媒体を含む。「コンピュータ読み取り可能媒体」は、コンピュータにより直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体を指し、それとしては、限定されるものではないが、磁気保存媒体；光学保存媒体；電気的保存媒体；クラウド保存およびそれらのカテゴリーのハイブリッドが挙げられる。このようなコンピュータ読み取り可能媒体を提供することにより、原子座標データは、モデリングまたは他の「インシリコ」法のために定型的にアクセスすることができる。本発明は、例えば、インターネットまたはグローバル通信／コンピュータネットワークを介して登録に基づきそのようなコンピュータ読み取り可能媒体へのアクセスに提供することにより作業を行う方法をさらに包含し；またはコンピュータシステムは、登録に基づきユーザに利用可能であり得る。「コンピュータシステム」は、本発明の原子座標データを分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ保存手段を指す。本発明のコンピュータベースシステムの最小ハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含み得る。望ましくは、ディスプレイまたはモニタが構造データを可視化するために提供される。本発明は、本明細書に記載の任意の方法もしくはそのステップにおいて得られる情報または本明細書に記載の任意の情報を、例えば、遠隔通信、電話、マスコニュニケーション、マスメディア、プレゼンテーション、インターネット、ｅメールなどを介して伝送する方法をさらに包含する。本発明の結晶構造を分析してＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系または複合体のフーリエ電子密度マップを生成することができ；有利には、三次元構造は、本明細書の結晶構造表および／または図による原子座標データにより定義される。フーリエ電子密度マップは、Ｘ線回折パターンに基づき計算することができる。次いで、これらのマップを使用して結合または他の相互作用の態様を決定することができる。電子密度マップは、公知のプログラム、例えば、ＣＣＰ４コンピュータパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｏ．４．Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ，Ｄ５０，１９９４，７６０−７６３）からのものを使用して計算することができる。マップ可視化およびモデル構築のため、プログラム、例えば、「ＱＵＡＮＴＡ」（１９９４，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ａ４７（１９９１），１１０−１１９）を使用することができる。

【0458】

本明細書の結晶構造表（実施例８参照）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））についての原子座標データを与え、ユニークな番号によるそれぞれの原子；それぞれのアミノ酸残基の化学元素およびその位置（電子密度マップおよび抗体配列比較により決定）、元素が局在するアミノ酸残基、鎖識別子、残基の数、それぞれの原子の原子位置（オングストローム）を結晶軸に関して定義する座標（例えば、Ｘ、Ｙ、Ｚ）、それぞれの位置の原子の占有率、原子のその原子中心周囲の移動を説明する等方性変位パラメータ「Ｂ」（オングストローム^２）、および原子番号を列記する。実施例１２、本明細書の本文および図も参照。

【0459】

本発明の特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の成分の結晶構造の立体構造バリエーションは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系機能に重要であり得るヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）構造領域に対するタンパク質構造領域のフレキシビリティーまたは移動についての重要でクリティカルな情報を提供する。本出願においてＣＲＩＳＰＲ酵素としてＣａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）について提供される構造情報を使用してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をさらにエンジニアリングおよび最適化することができ、これを外挿して他のＣＲＩＳＰＲ酵素系における構造−機能関係も調査することができる。本発明の一態様は、２．４Å分解能におけるｓｇＲＮＡおよびその標的ＤＮＡとの複合体における化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造に関する。構造は、界面における正荷電溝中にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を収容する標的認識およびヌクレアーゼローブから構成されるバイローブ型アーキテクチャーを明らかにした。認識ローブは、ｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ結合に不可欠であり、ヌクレアーゼローブは、それぞれ標的ＤＮＡの相補および非相補鎖の開裂のために適切に位置決めされたＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含有する。本明細書に提供されるこの高分解能構造および機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機序を解明し、最適化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系およびその成分を生成するための大量の情報を提供する。

【0460】

本発明の特定の実施形態において、結晶構造は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機序の理解に向かうクリティカルなステップを提供する。本明細書の構造および機能分析は、Ｃａｓ９ベースゲノムモジュレート技術の合理的エンジニアリングに有用な足場を提供し、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ配列のＣａｓ９媒介認識またはｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖間のミスマッチ許容に関するガイダンスを提供し得る。本発明の態様はまた、トランケーション突然変異体に関し、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９トランケーション突然変異体は、インビボおよび治療用途のためのサイズ制約ウイルスベクター中へのＣａｓ９のパッケージングを容易にし得る。同様に、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの将来的なエンジニアリングは、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能とし、標的部位認識フィデリティーを改善し、Ｃａｓ９ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を増加させ得る。

【0461】

本発明は、最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素系を包含する。特に、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、目的機能を示す機能ドメインをリクルートし、または付属させ、または挿入し、または付着させることができるＤＮＡ結合タンパク質にそれを変換する１つ以上の突然変異を含む。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異、例として、限定されるものではないが、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６Ａ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸位置ナンバリングに基づく）を含み、および／または１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１もしくはＨＮＨドメイン中に存在し、または本明細書に記載の他の突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメイン中の１つ以上の突然変異を有し、ｔｒａｃｒメイト配列は、転写された場合、ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズし、ガイド配列は、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、酵素は、機能ドメインをさらに含む。

【0462】

本明細書に提供される構造情報は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系全体の機能性を最適化するためのｓｇＲＮＡ構造のエンジニアリングまたは変更を可能とする標的ＤＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）とのｓｇＲＮＡ（またはキメラＲＮＡ）相互作用の調査を可能とする。例えば、区別されるＲＮＡループまたは区別される配列に結合し得るアダプタータンパク質をリクルートし得る区別されるＲＮＡループまたは区別される配列の挿入によりＣａｓ９タンパク質と衝突させずにｓｇＲＮＡのループを伸長することができる。アダプタータンパク質としては、限定されるものではないが、多様なバクテリオファージコートタンパク質内に存在するオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組合せを挙げることができる。このようなコートタンパク質のリストとしては、限定されるものではないが、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓおよびＰＲＲ１が挙げられる。これらのアダプタータンパク質またはオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質または融合物をさらにリクルートし得る。一部の実施形態において、機能ドメインは、トランスポーゼースドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、レゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写調節タンパク質（または転写複合体リクルート）ドメイン、細胞取り込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター；ヒストン修飾酵素の阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼおよびヒストンテールプロテアーゼからなる群から選択することができる。一部の好ましい実施形態において、機能ドメインは、転写活性化ドメイン、好ましくは、ＶＰ６４である。一部の実施形態において、機能ドメインは、転写抑制ドメイン、好ましくは、ＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインは、ＳＩＤ、またはＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであり、その結果、エピジェネティック修飾酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、それはＰ６５活性化ドメインであり得る。

【0463】

本発明は、目下、以下の非限定的な実施例によりさらに記載される。

【実施例】

【0464】

以下の実施例を、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために挙げ、それらは本発明をいかなる様式にも限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、目下好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更および他の使用は、当業者が行う。

【0465】

実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎ１のクラスター、ならびに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（ダイレクトリピート）を含有する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に指向する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。

【0466】

細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ_２インキュベーションで維持した。マウスｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞系（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭにより、３７℃、５％のＣＯ_２で維持した。

【0467】

ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、形質移入１日前に１ウェル当たり２００，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を形質移入した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計８００ｎｇのプラスミドを使用した。

【0468】

ゲノム改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシーケンシング分析
ＨＥＫ２９３ＦＴまたはＮ２Ａ細胞を、上記プラスミドＤＮＡにより形質移入した。形質移入後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。抽出されたゲノムＤＮＡを直ちに処理または−２０℃において貯蔵した。

【0469】

それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位周囲のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×ＴａｑポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、開裂したＤＮＡの率の尺度としての相対バンド強度に基づくものであった。図８は、このＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの模式的説明を提供する。

【0470】

相同組換えの検出のための制限断片長多型アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴおよびＮ２Ａ細胞を、プラスミドＤＮＡにより形質移入し、３７℃において７２時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムＤＮＡを抽出した。相同組換え（ＨＲ）テンプレートのホモロジーアーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。精製産物をＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化し、６％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。

【0471】

ＲＮＡ二次構造予測および分析
ＲＮＡ二次構造予測は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。

【0472】

ＲＮＡ精製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおり維持および形質移入した。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。トータル細胞ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルＲＮＡをＮａｏｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、同一濃度に正規化した。

【0473】

哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノザンブロット分析
ＲＮＡを等容量の２×ローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱し、氷上で１分間冷蔵し、次いで８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に、少なくとも３０分間のゲルのプレラン後にロードした。試料を４０Ｗ限界において１．５時間電気泳動した。その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ｍＡにおいてセミドライ転写装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）中で室温において１．５時間転写した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒのＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上のオートクロスリンクボタンを使用してＲＮＡをメンブレンに架橋させた。メンブレンをＵＬＴＲＡｈｙｂ−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で回転させながら４２℃において３０分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはＩＤＴに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。メンブレンを予備加温（４２℃）された２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより１分間１回洗浄し、次いで４２℃において３０分間２回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において１時間または一晩曝露させ、次いでｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。

【0474】

細菌ＣＲＩＳＰＲ系構築および評価
ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびリーダーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座エレメントを、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）のためのフランキングホモロジーアームを用いてＰＣＲ増幅した。２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位を２つのダイレクトリピート間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した（図８）。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＣＹＣ１８４中にｔｅｔプロモーターの下流でクローニングした。Ｃｓｎ２の最後の５０ｂｐは除き、他の内因性ＣＲＩＳＰＲ系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢｓａＩ消化ベクターｐＤＣ０００（ＮＥＢ）中にクローニングし、次いでＴ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によりライゲートしてｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを生成した。ＰＡＭ配列（本明細書において「ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列」とも称される）を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミドを、同等のオーバーハングを担持するハイブリダイズされたオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９中にライゲートすることにより創成した。全ての構築物のためのクローニングは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０９（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で実施した。ＰＡＭを有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド

【0475】

哺乳動物細胞中の発現のために選択した（図６Ａに説明される発現構築物、図６Ｂに示されるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果により決定された機能性を有する）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーターおよびノザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノザンブロットにより確認した。図６Ｃは、長鎖または短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにＳｐＣａｓ９およびＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析の結果を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物の形質移入は、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノザンブロット上で検出される。

【0476】

正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現をドライブした（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つのダイレクトリピート（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」にも包含される；図２Ｃ）によりフランキングされている単一スペーサーからなるプレｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。

【0477】

哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびプレｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の開裂を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ成分の組合せにより形質移入した。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な開裂活性を検出した（図７）（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入は、プロトスペーサーの最大５．０％の開裂を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入も、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮアーゼ、例えば、関連ＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆した。残り３つの成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム開裂活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのサンガーシーケンシングにより開裂活性を確認し；４３個のシーケンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図３〜６、１０、および１１参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。開裂効率を最適化するため、本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが開裂効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の開裂を媒介し得ることを見出した（図６Ｂ）。

【0478】

図１２は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノザンブロット分析を提供する。図１２Ａは、２つのダイレクトリピートによりフランキングされている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサー（図６参照）およびダイレクトリピート配列を、図１２Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノザンブロットプローブを生成する領域を示す。図１２Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮアーゼＩＩＩの存在に依存的でなかった。形質移入２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの開裂を促進することができることを実証する。

【0479】

図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１およびこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ開裂の提案される機序を示す模式図を説明する。ダイレクトリピート−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に指向する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩならびに正確な転写開始および終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６によりドライブされるｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、プレｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介少数挿入および欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＥＭＸ１標的スペーサーを担持するプレｃｒＲＮＡアレイを用いてまたは用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、ならびにＳｐＣａｓ９開裂部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入および欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシーケンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、またはミスマッチの塩基は挿入または突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。

【0480】

３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させた。同時送達効率を増加させるため、形質移入細胞中のキメラＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９の同時発現をドライブするバイシストロニック発現ベクターを創成した。並行して、バイシストロニックベクターを使用してプレｃｒＲＮＡ（ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ）をＳｐＣａｓ９とともに発現させてｃｒＲＮＡへのプロセシングを誘導し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別個に発現させた（図１１Ｂの上図および下図を比較）。図８は、ｈＳｐＣａｓ９を有するプレｃｒＲＮＡアレイ（図８Ａ）またはキメラｃｒＲＮＡ（図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の下流およびＥＦ１αプロモーターの上流の短い線により表わされる）のためのバイシストロニック発現ベクターの模式的説明を提供し、種々のエレメントの局在およびガイド配列挿入の場所を示す。図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の局在周囲の拡大された配列は、部分ＤＲ配列（ＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）および部分ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ）も示す。ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。オリゴヌクレオチドについての配列設計を図８の模式的説明の下方に示し、適切なライゲーションアダプターを示す。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを表す。キメラＲＮＡ媒介開裂の効率を、上記の同一のＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびアンプリコンのサンガーシーケンシングの両方を使用して、本出願人らは、キメラＲＮＡ設計がヒトＥＭＸ１遺伝子座の開裂を約４．７％の改変比率で促進することを確認した（図３）。

【0481】

真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の一般化可能性を、ヒトＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ、ならびにマウスＴｈ遺伝子座中の複数部位をターゲティングするキメラＲＮＡを設計することによりヒトおよびマウス細胞の両方において追加のゲノム遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。図１３は、いくつかの追加のターゲティングされるヒトＰＶＡＬＢ（図１３Ａ）およびマウスＴｈ（図１３Ｂ）遺伝子座中のプロトスペーサーの選択を説明する。遺伝子座およびそれぞれの最後のエクソン内の３つのプロトスペーサーの局在の模式図を提供する。下線付き配列は、３０ｂｐのプロトスペーサー配列およびＰＡＭ配列に対応する３’末端における３ｂｐを含む。センスおよびアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方および下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％および０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した（図５）。開裂はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるプレｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で開裂された（図６および１３）。

【0482】

図１１は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図１１Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図１１Ｂは、プレｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのダイレクトリピート領域間のハイブリダイゼーションを示すプレｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）および２０ｂｐのガイド配列、ならびにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分ダイレクトリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒメイトおよびｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介開裂の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図１１Ｃに説明する。プロセシングされたプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）またはキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。

【0483】

ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギーおよびボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用してゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。したがって、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。

【0484】

ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計を図２２に示し、それはガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、およびＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターを説明する。図２２ｂに示されるベクターは、Ｈ１プロモーターに結合しているｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含む。

【0485】

細菌アッセイでは、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図３Ｃ）。これらの結果は、哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響を与えるさらなる因子が存在し得ることを示唆している。

【0486】

ＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー開裂に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図３Ａ）。図３Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の開裂効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム開裂を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図３Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム開裂を媒介し得る。図３Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図３Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。

【0487】

エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高フィデリティ遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪおよびＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図４Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓａｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニック形成されたゲノムＤＮＡが高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図４Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシーケンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９またはｈＳｐＣａｓ９ｎ、およびプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲテンプレートにより同時形質移入することによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図４Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在およびプライマーアニーリング配列（矢印）とともに提供する。ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲテンプレートのインテグレーションを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図４Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する開裂産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人らは、ゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図４Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐおよびＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。

【0488】

アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な開裂が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計および開裂の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域のターゲティングされる欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図４Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。

【0489】

実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系改変および代替例
配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ^２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとでターゲティング能を制限する（図９、ヒト染色体配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を評価）。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図１０は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのサーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の適応を説明する。図１０Ａは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１の模式的説明を提供する。図１０Ｂは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化ｈＳｔＣａｓ９を、構成的ＥＦ１αプロモーターを使用して発現させる。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの成熟バージョンを、Ｕ６プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡからの配列を説明する。ｃｒＲＮＡ配列中の小文字「ａ」により示される単一塩基を使用してＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写ターミネーターとして機能するポリＵ配列を除去する。図１０Ｃは、ヒトＥＭＸ１遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図１０Ｄは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する標的遺伝子座中のｈＳｔＣａｓ９媒介開裂の結果を示す。ＲＮＡガイドスペーサー１および２は、それぞれ１４％および６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計分析も図５に提供する。図１４は、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の追加のプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的の模式図を提供する。２つのプロトスペーサー配列を強調し、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフを満たすそれらの対応するＰＡＭ配列を対応する強調配列に対して３’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。

【0490】

実施例３：試料標的配列選択アルゴリズム
規定のＣＲＩＳＰＲ酵素についての所望のガイド配列長およびＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づきインプットＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧＮＧ−３’を探索することにより同定することができる。Ｎ_ｘ中の値「ｘ」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、２０である。

【0491】

ＤＮＡ標的部位のゲノム中の複数の発生は、非特異的ゲノム編集をもたらし得るため、全ての潜在的な部位を同定した後、プログラムは配列が関連参照ゲノム中で出現する回数に基づき配列をフィルタリング除去する。配列特異性が「シード」配列、例えば、ＰＡＭ配列自体を含め、ＰＡＭ配列から５’側の１１〜１２ｂｐにより決定されるそれらのＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップはシード配列に基づき得る。したがって、追加のゲノム遺伝子座における編集を回避するため、結果を関連ゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数に基づきフィルタリングする。使用者に、シード配列の長さを選択させることができる。使用者に、フィルタ通過の目的のためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を規定させることもできる。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルトレーションレベルは、シード配列の長さおよびゲノム中の配列の発生数の両方を変えることにより変更する。プログラムは、さらにまたは代替的に、同定された標的配列の逆相補鎖を提供することにより、報告された標的配列に相補的なガイド配列の配列を提供し得る。

【0492】

配列選択を最適化する方法およびアルゴリズムのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／０６４，７９８号明細書（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１２／０８４）に見出すことができる。

【0493】

実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込むｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記載する。図１６ａは、キメラＲＮＡおよびＣａｓ９のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターによりドライブされ、キメラＲＮＡはＵ６プロモーターによりドライブされる。キメラガイドＲＮＡは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイドおよびｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡと、それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を、それぞれ図１６ｂおよび１６ｃに説明する。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す。ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し、ｃｒＲＮＡは、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図１７ａおよび１７ｂにヒストグラムにより示し、それぞれ図１６ｂおよび１６ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」は、インデルが検出されなかったことを示す）。プロトスペーサーＩＤおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、ＰＡＭ配列、および鎖局在を表Ｄに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラＲＮＡの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。

【0494】

【表24】

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【0495】

ガイド配列を最適化するためのさらなる詳細は、米国仮特許出願第６１／８３６，１２７号明細書（代理人整理番号４４７９０．０８．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｇ）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

【0496】

最初に、ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つの部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路によるその後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれることを示し、ｎについては４８、５４、６７、および８５の値が使用される。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は、３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒介し、特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１６ｂおよび１７ａ）。ハイブリッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列およびｔｒａｃｒ配列）を検出可能な開裂を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も、ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１６ｃおよび１７ｂ）。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について、ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される二次構造は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。

【0497】

実施例５：Ｃａｓ９多様性
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびＤＮＡ開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列およびサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。

【0498】

本出願人らは、公知のＣａｓ９との配列相同性および公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ ＫｏｏｎｉｎおよびＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図１９および２０Ａ〜Ｆ）。

【0499】

Ｃａｓ９およびニッカーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質に転換するＣａｓ９酵素の突然変異および変化した機能を有するそれの使用のさらなる詳細は、米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書および同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２および４７９０．０７．２０２２およびＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４ＥおよびＢＩ−２０１３／００４Ｆ）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

【0500】

実施例６：Ｃａｓ９オルソログ
本出願人らは、関連性のあるＰＡＭ配列および対応するキメラガイドＲＮＡを同定するためＣａｓ９オルソログを分析した。拡張したＰＡＭセットを有することにより、全ゲノムにわたるより幅広いターゲティングが提供され、またユニークな標的部位の数が大幅に増加し、かつゲノムにおいて高い特異性レベルで新規Ｃａｓ９を同定できる可能性がもたらされる。

【0501】

Ｃａｓ９オルソログの特異性は、各Ｃａｓ９がガイドＲＮＡとそのＤＮＡ標的との間のミスマッチを許容する能力を試験することにより評価し得る。例えば、ガイドＲＮＡにおける突然変異が開裂効率に及ぼす効果を試験することにより、ＳｐＣａｓ９の特異性が特徴付けられている。ガイド配列と標的ＤＮＡとの間の単一または複数のミスマッチを含むガイドＲＮＡのライブラリが作製された。これらの知見に基づき、以下の指針に基づきＳｐＣａｓ９の標的部位を選択することができる：

【0502】

特定の遺伝子の編集に対するＳｐＣａｓ９の特異性を最大化するため、目的の遺伝子座内の標的部位は、潜在的な「オフターゲット」ゲノム配列が以下の４つの制約条件に従うように選択しなければならない：まず第一に、それらの配列の後に５’−ＮＧＧまたはＮＡＧ配列のいずれかを有するＰＡＭが続いてはならない。第二に、標的配列とのそれらの配列の大域的な配列類似性が最小化されなければならない。第三に、最大数のミスマッチがＰＡＭ−オフターゲット部位の近位領域内になければならない。最後に、最大数のミスマッチが連続しているかまたは離れていても４塩基未満でなければならない。

【0503】

同様の方法を用いて他のＣａｓ９オルソログの特異性を評価し、標的種のゲノム内にある特定の標的部位を選択するための基準を確立することができる。既述のとおり、このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生解析から、３群の大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）および２群の小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）を含む５つのＣａｓ９ファミリーが明らかとなった（図１９および図２０Ａ〜図２０Ｆを参照）。Ｃａｓオルソログに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書および同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２および４７９０．０７．２０２２およびＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４ＥおよびＢＩ−２０１３／００４Ｆ）を参照することができる。

【0504】

実施例７：植物遺伝子を標的化および操作するためにＣａｓ９を使用する植物（微細藻類）のエンジニアリング
Ｃａｓ９を送達する方法
方法１：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９を発現するベクターを使用してＣａｓ９およびガイドＲＮＡを送達する。

【0505】

方法２：本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ−Ｒｂｃ Ｓ２またはベータ２−チューブリンの制御下でＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを発現するベクターを使用してＣａｓ９およびＴ７ポリメラーゼを送達する。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをドライブするＴ７プロモーターを含有するベクターを使用して送達する。

【0506】

方法３：本出願人らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびインビトロで転写されたガイドＲＮＡを藻類細胞に送達する。ＲＮＡは、インビトロで転写させることができる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９についてのコード領域およびＣａｓ９ｍＲＮＡの安定化を確保するためのＣｏｐ１からの３’ＵＴＲからなる。

【0507】

相同組換えのため、本出願人らは、追加の相同組換え修復テンプレートを提供する。

【0508】

ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＣａｓ９の発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列。

【化2】

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【化3】

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【化4】

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【0509】

ベータ−２チューブリンプロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼの発現をドライブするカセットと、それに続くＣｏｐ１の３’ＵＴＲについての配列：

【化5】

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【化6】

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【0510】

Ｔ７プロモーターによりドライブされるガイドＲＮＡの配列（Ｔ７プロモーター、Ｎは、ターゲティング配列を表す）：
ｇａａａｔＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃｔｔｔｔｔｔｔ

【0511】

遺伝子送達：
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒからのコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）株ＣＣ−１２４およびＣＣ−１２５を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。

【0512】

また、本出願人らは、Ｃａｓ９を構成的に発現するコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の系統を生成する。このことは、ｐＣｈｌａｍｙ１（ＰｖｕＩを使用して線形化）を使用し、ハイグロマイシン耐性コロニーを選択することにより行うことができる。Ｃａｓ９を含有するｐＣｈｌａｍｙ１についての配列を以下に示す。遺伝子ノックアウトを達成するためのこの手法において、ガイドＲＮＡのためのＲＮＡを送達することが必要なだけである。相同組換えのため、本出願人らは、ガイドＲＮＡおよび線形化相同組換えテンプレートを送達する。

【0513】

ｐＣｈｌａｍｙ１−Ｃａｓ９：

【化7】

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【化8】

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【化9】

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【化10】

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【化11】

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【化12】

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【0514】

全ての改変コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）細胞について、本出願人らは、ＰＣＲ、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、およびＤＮＡシーケンシングを使用して良好な改変を確認した。

【0515】

実施例８：結晶構造
図２３Ａ〜Ｍは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ複合体結晶構造（Ａ〜Ｉ）、結晶構造からのキメラＲＮＡアーキテクチャー（Ｊ〜Ｋ）、結晶構造からの相互作用模式図（Ｌ）および結晶構造からのトポロジー模式図（Ｍ）の種々の図を提供する。

【0516】

図２３Ｊ〜Ｋは、ＳｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡ構造研究に関し、図２６Ａ〜Ｂは、ｓｇＲＮＡ突然変異にも関する。ＳｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡは、活性への規定の塩基または塩基群の寄与を調査するために突然変異させた。これらは、ステム１（ＤＲとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成領域）、バルジ（ＤＲとｔｒａｃｒＲＮＡとの間のペア形成しない塩基）、ループ１（ＤＲとｔｒａｃｒとの間の人工ＧＡＡＡコネクター）、リンカー１（ステム１とステム２との間）、ステム２（ｔｒａｃｒＲＮＡテールにより形成される第１のヘアピン）、ループ２（ステム２間のループ）、ステム３（ｔｒａｃｒＲＮＡテールにより形成される第２の、または最後のヘアピン）、およびループ３（ステム３間のループ）に分類されるｓｇＲＮＡのダイレクトリピート（ＤＲ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域中の突然変異を含む。突然変異は、予測二次構造および図２３Ａ〜Ｍ、特に図２３Ｊに説明される二次構造に基づき選択した。さらに、ＭＢＰに融合している機能ドメインをリクルートするための相互作用／結合のためにループ領域中にＭＳ２ループを取り込むように３つのｓｒＲＮＡ足場を設計した。ｓｇＲＮＡをＵ６：：ＰＣＲアンプリコンとして合成し、野生型ＳｐＣａｓ９との同時形質移入において試験した。

【0517】

４００ｎｇのＣａｓ９プラスミド、１００ｎｇのｓｇＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００により２００，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中に；ＤＮＡをＳＵＲＶＥＹＯＲ分析のために形質移入の３日後に回収した。

【0518】

したがって、本発明は包含し、本発明は、以下の結晶構造表（ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９結晶構造）の座標により定義される構造を有する結晶を有するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））系を包含する。

【0519】

【表25】

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【0877】

【表383】

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【0878】

【表384】

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【0894】

【表400】

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【0895】

【表401】

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【0896】

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【0897】

【表403】

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【0898】

【表404】

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【0899】

【表405】

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【0900】

【表406】

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【0901】

【表407】

[この文献は図面を表示できません]

【0902】

実施例９：結晶構造からの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）ＳｐＣａｓ９トランケーション
図２５Ａ〜Ｂは、全長ＳｐＣａｓ９からのＳｐＣａｓ９トランケーションに関する。これらの図は、開裂活性を保持する結晶構造からのＳｐＣａｓ９トランケーション突然変異体のＳｕｒｖｅｙｏｒゲル試験結果（Ａ）ならびにアミノ酸トランケーションおよび図２５Ａのゲルのレーンのフレキシブル（ＧＧＧＳ）またはリジッド（Ａ（ＥＡＡＡＫ））リンカー置換を示す表（Ｂ）を示す。

【0903】

この実施例において、ＳｐＣａｓ９配列は、１．オルソログ（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３、および（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））、例として、保存または可変の領域についてより小さいＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））と比較すること、および２．標的ＤＮＡ：ｓｇＲＮＡ二本鎖の接触に潜在的にクリティカルでないと結晶分析により同定された境界により分析した。ＳｐＣａｓ９のある領域（ヘリカルドメイン２）は、多くのより小さいＣａｓ９オルソログ中に存在せず、機能に重要でないと予測された。トランケーションの２つの類似セットを作製し、一方はより小さいＣａｓ９との配列アラインメントにより、一方は結晶予測により作製した。さらに、３、６、９、または１２個のリピートの群のフレキシブルグリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）またはリジッドアルファ−ヘリカルリンカー（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）のいくつかのセットも使用して潜在的な構造安定化および／またはＳｐＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ特異性の保持の支援のためにヘリカルドメイン２を置き換えた。ヘリカル領域２トランケーションおよびリンカー置換の全ては、ＳｐＣａｓ９活性を保持した。ＳｐＣａｓ９は、ヘリカル１、２、および３ドメイン、ならびにＣ’末端推定ＰＡＭ認識ドメイン中で体系的にトランケートした。トランケーション突然変異体は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に以下のとおり形質移入した：４００ｎｇのトランケーションＣａｓ９プラスミドおよび１００ｎｇのｓｇＲＮＡを２００，０００個の細胞中にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００により同時形質移入した。細胞からのＤＮＡをＳＵＲＶＥＹＯＲ分析のために回収した。

【0904】

下記：全長ＳｐＣａｓ９ＤＮＡ配列およびサブドメインの配列：それに続くヘリカルドメイン２トランケーションおよびバリアント。
＞全長ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ

【化13】

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【化14】

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【化15】

[この文献は図面を表示できません]

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

＞Ｎ’末端ＮＬＳ
ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣ
＞ＲｕｖＣＩドメイン

【化17】

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＞ブリッジヘリックス
ＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣ
＞ヘリカルドメイン１

【化18】

[この文献は図面を表示できません]

＞ヘリカルドメイン２（非必須）

【化19】

[この文献は図面を表示できません]

＞ヘリカルドメイン３

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

＞フレキシブルリンカー
ＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴ
＞ＲｕｖＣ ＩＩ
ＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧ
＞ＨＮＨ
ＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＴＡＴＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣ
＞ＲｕｖＣＩＩＩ
ＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧ
＞Ｃ末端（ＰＡＭ認識ドメイン）

【化21】

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Ｃ’−ＮＬＳ
ＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧ
６．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２（１７４−３１１）ヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

【化24】

[この文献は図面を表示できません]

７．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−（ＧＧＧＧＳ）３ヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

８．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−（ＧＧＧＧＳ）６ヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

９．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−（ＧＧＧＧＳ）９ヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

１０．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−（ＧＧＧＧＳ）１２ヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

１１．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３Ａヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化38】

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【化39】

[この文献は図面を表示できません]

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

１２．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３Ａヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

【化42】

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【化43】

[この文献は図面を表示できません]

１３．Ｓｐ＿Δ＿ｈｅｌ２−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３Ａヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化44】

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【化45】

[この文献は図面を表示できません]

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

１４．Ｓｐ＿ｄｅｌ＿ｈｅｌ２−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３１２Ａヘリカルドメイン２欠失（オルソログアラインメントから）

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

３０．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）（Ｈｉｒｏｓｈｉ予測）

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

【化53】

[この文献は図面を表示できません]

３１．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１０９８−終端）

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

【化56】

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３２．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−（ＧＧＧＧＳ）３

【化57】

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【化58】

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【化59】

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３３．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−（ＧＧＧＧＳ）６

【化60】

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【化61】

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【化62】

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３４．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−（ＧＧＧＧＳ）９

【化63】

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【化64】

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【化65】

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３５．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−（ＧＧＧＧＳ）１２

【化66】

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【化67】

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【化68】

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３６．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３Ａ

【化69】

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【化70】

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【化71】

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【化72】

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３７．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３Ａ

【化73】

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【化74】

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【化75】

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３８．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）３Ａ

【化76】

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【化77】

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【化78】

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３９．Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）−Ａ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３ＬＥ（ＥＡＡＡＫ）３１２Ａ

【化79】

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【化80】

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【化81】

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【化82】

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【0905】

実施例１０：新たなニッカーゼ
図２４Ａ〜Ｃは新たなＳｐＣａｓ９ニッカーゼに関し、以下を提供する。Ａ．ＳｐＣａｓ９の触媒ドメイン、および推定新ニッカーゼについての突然変異誘発の部位を示す模式図。ＲｕｖＣドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを橙色で示し、ＨＮＨドメインをＲｕｖＣＩＩとＲｕｖＣＩＩＩとの間で白色で示す。ドメインサイズは縮尺通りに描かれていない。Ｂ．二重ニック形成の試験に使用されるｓｇＲＮＡの局在を示す模式図：ｓｇＲＮＡを単独で（Ａ１またはＣ１単独）ＳｐＣａｓ９ニッカーゼと形質移入する場合、インデルは生じないはずである。ＲｕｖＣＩＩＩ突然変異ニッカーゼとの組合せで使用されるＡ１＋Ｃ１の組合せは、５’−オーバーハングをもたらす一方、Ｄ１＋Ａ１およびＣ７＋Ａ１は３’−オーバーハングをもたらす。逆に、ＨＮＨ突然変異ニッカーゼと使用されるそれらの３つの組合せは、それぞれ３’−、５’−、および５’−オーバーハングをもたらす。Ｃ．ヌクレアーゼ活性を保持する１つのＨＮＨ突然変異体（Ｎ８５４Ａ）、およびニッカーゼ活性を示す１つのＨＮＨ突然変異体（Ｎ８６３Ａ）、ならびにニッカーゼ活性を示す２つのＲｕｖＣＩＩＩ突然変異体（Ｈ９８３Ａ、Ｄ９８６Ａ）を示すＳｕｒｖｅｙｏｒ試験。

【0906】

この実施例において、５つの潜在的なニック形成突然変異部位を、Ｃａｓ９オルソログ間の配列相同性に基づき選択した。３つの追加の部位を本明細書の結晶分析データに基づき選択した。ニッカーゼ突然変異体Ｃａｓ９のこれらのセットのサブセットを再クローニングして最適化ＳｐＣａｓ９のものと同一であるＮ’およびＣ’−ＮＬＳ配列の両方を取り込んだ。配列を以下に示す。

【0907】

ニッカーゼ突然変異体を再クローニングして指定突然変異をｐＡＡＶベクター中にＣｂｈプロモーター下に取り込み、配列を検証した。

【0908】

全ての潜在的ニッカーゼについてのヌクレアーゼおよび二重ニック形成活性は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中で以下のとおり試験した：約２００，０００個の細胞中へのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００による４００ｎｇのニッカーゼおよび１００ｎｇのＵ６ドライブｓｇＲＮＡ（１つのガイドについて１００ｎｇ、またはｓｇＲＮＡのペアについてぞれぞれ５０ｎｇ）の同時形質移入。形質移入された細胞からのＤＮＡをＳＵＲＶＥＹＯＲ分析のために回収した。ニッカーゼは、単一ｓｇＲＮＡと同時形質移入した場合にインデル突然変異をもたらさないが、適切に離隔するｓｇＲＮＡのペアと同時形質移入した場合、それをもたらす。元のＤ１０Ａ ＳｐＣａｓ９ニッカーゼからのデータに基づき、ＲｕｖＣドメイン突然変異体のために選択されたｓｇＲＮＡのペア（Ａ１／Ｃ１）は、０ｂｐの離隔および最大開裂のための５’−オーバーハングを有する。

【0909】

【表408】

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【0910】

【表409】

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【0911】

＞ＮＬＳ−Ｓ１５Ａ−ＮＬＳ

【化83】

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【化84】

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【化85】

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＞ＮＬＳ−Ｅ７６２Ａ−ＮＬＳ

【化86】

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【化87】

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【化88】

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【化89】

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＞ＮＬＳ−Ｈ９８２Ａ−ＮＬＳ

【化90】

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【化91】

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【化92】

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＞ＮＬＳ−Ｈ９８３Ａ−ＮＬＳ

【化93】

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【化94】

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【化95】

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【化96】

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＞ＮＬＳ−Ｄ９８６Ａ−ＮＬＳ

【化97】

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【化98】

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【化99】

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【0912】

実施例１１：本明細書の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９結晶構造に基づくキメラＣａｓ９のトランケートおよび作出
図２７Ａ〜Ｃは、本明細書の結晶構造に基づくキメラＣａｓ９のトランケートおよび作出に関する。これらの図は、以下を説明する模式図を提供する。Ａ．タンパク質のトランケーションのためのＣａｓ９の不可欠な機能ドメインを確定するために設計されるＳｐＣａｓ９突然変異体。Ｂ．サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）からのＣａｓ９、または他のＣａｓ９オルソログからの配列（桃色の領域）を含有するキメラＣａｓ９。Ｃ．ＳｐＣａｓ９の化学誘導性ダイマー化を作出するための設計。化学誘導性ＳｐＣａｓ９は機能する。

【0913】

キメラＣａｓ９のためのＤＮＡ配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによりヒト発現のために最適化し、デノボ合成する。キメラＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９オルソログからの個々の機能ドメインをクローニングおよびライゲートすることにより（すなわち、所望のＣａｓ９オルソログからの個々の機能ドメインをＰＣＲ増幅させ、次いでＧｉｂｓｏｎまたはＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングのいずれかによりそれらの片を一緒にアセンブルすることにより）、構築することができる。さらに、化学誘導性Ｃａｓ９のセットを２成分系として構築し、Ｃａｓ９タンパク質の一部分がＦＫＢＰに融合しており、残りがＦＲＢに融合している（例えば、ＦＫＢＰ−Ｃａｓ９（アミノ酸１〜１０９８）、ＦＲＢ−Ｃａｓ（１０９９〜１３６８））。化学誘導の不存在下、２つの誘導性Ｃａｓ９成分の同時形質移入は、触媒活性を有さないが、成分の機能アセンブリはラパマイシン［５ｎＭから１０μＭ］を使用して誘導することができる。

【0914】

実施例１２：ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡとの複合体におけるＣａｓ９の結晶構造
Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）により特異的ゲノム遺伝子座に標的化することができる微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＲＮＡガイドヌクレアーゼである。本出願人らは、２．４Å分解能におけるｓｇＲＮＡおよびその標的ＤＮＡとの複合体における化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告する。構造は、界面における正荷電溝中にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を収容する標的認識およびヌクレアーゼローブから構成されるバイローブ型アーキテクチャーを明らかにした。認識ローブがｓｇＲＮＡおよびＤＮＡの結合に不可欠である一方、ヌクレアーゼローブは、標的ＤＮＡの相補および非相補鎖の開裂のために適切にそれぞれ位置決めされたＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインをそれぞれ含有する。この高分解能構造および付随機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機序を解明し、新たな多用途ゲノム編集技術の合理的設計のための経路を開く。

【0915】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）−Ｃａｓ系は、侵入ファージおよび他の可動遺伝子エレメントに対する防御のための天然存在の微生物適応免疫系である（Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，２０１０；Ｔｅｒｎｓ ａｎｄ Ｔｅｒｎｓ，２０１１）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）は、広範な微生物種にわたり機能的に同定されており（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，２００８）、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびその対応するＣＲＩＳＰＲアレイのクラスターを含有する。これらの特徴的なＣＲＩＳＰＲアレイは、外来遺伝子材料の短鎖セグメント（プロトスペーサー）に由来する非反復配列の短鎖ストレッチ（スペーサー）により間隔が空いている反復配列（ダイレクトリピート、リピートと称される）からなる。ＣＲＩＳＰＲアレイは転写され、短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、それはＣａｓタンパク質を標的核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡに、ワトソン−クリック塩基対形成を介して指向して核酸破壊を容易にする。

【0916】

ＩおよびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡとの複合体におけるＣａｓタンパク質のアンサンブルを利用して標的核酸の認識および後続の分解を媒介する（Ｓｐｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。対照的に、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、標的ＤＮＡ（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の認識および開裂を、２つの非コードＲＮＡ、ｃｒＲＮＡおよびトランス作用ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）とともにＣａｓ９（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）と呼ばれる単一酵素を介して達成する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしてｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を形成し、次いでそれをＣａｓ９上にロードして適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を担持するコグネートＤＮＡ配列の開裂を指向する（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0917】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、真核細胞中のゲノム編集を容易にするために採用され得る最初のものであった（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９タンパク質は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡおよび最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）の合成融合物とともに、哺乳動物中で５’−ＮＧＧ ＰＡＭ配列に先行する実質的に任意の配列の開裂を指示するようにプログラミングすることができた（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。この前例のないフレキシビリティーは、広範囲の用途、例として、遺伝子改変細胞および動物モデルの迅速な生成（Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ならびにゲノムスケール遺伝子スクリーニング（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｈａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を可能とした。

【0918】

しかしながら、Ｃａｓ９技術の開発の順調な進歩にかかわらず、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体がその標的ＤＮＡをいかに認識および開裂するかという機序が解明されるべきままである。今日まで、ドメインレベルにおける生化学分析は、真核細胞中の相同組換え修復を容易にし（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）、さらに適切にペア形成したｓｇＲＮＡを所与として改善された特異度でＤＮＡを開裂する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）天然Ｃａｓ９をＤＮＡニック形成酵素（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）に変換するための部位特異的エンジニアリングを可能とした。さらに、触媒的に不活性なＣａｓ９は、エフェクタードメインを標的化し、内因性転写をモジュレートするためのＲＮＡガイドＤＮＡ結合プラットフォームとして機能し得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらのＣａｓ９エンジニアリングの進歩は、このフレキシブルＲＮＡガイドゲノム位置決め系の潜在性を完全に実現するにあたり考えられるもののまさに最初のステップを表す。したがって、Ｃａｓ９に関する正確な構造情報は、この洗練されたＲＮＡガイド微生物適応免疫系がいかに機能するかの理解を向上させるだけでなく、Ｃａｓ９標的化特異性のさらなる改善、インビトロおよびインビボ送達の単純化、ならびに新規機能および特徴の最適化のためのＣａｓ９のエンジニアリングも提供する。

【0919】

この実施例において、本出願人らは、２．４Å分解能におけるｓｇＲＮＡおよびその標的ＤＮＡとの複合体における化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告する。この高分解能構造は、機能分析とともに、ガイドＲＮＡ、標的ＤＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質をインテグレートするキー機能相互作用を明らかにし、Ｃａｓ９機能を向上させ、新規用途をエンジニアリングするための経路を開く。

【0920】

Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ三元構造の全体構造：本出願人らは、ＳｅＭｅｔ−標識タンパク質を使用するＳＡＤ（単一波長異常分散）法により、２．４Å分解能における９８ヌクレオチド（ｎｔ）ｓｇＲＮＡおよび２３ｎｔ標的ＤＮＡとの複合体における全長化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（残基１〜１３６８；Ｄ１０Ａ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ５７４Ｅ／Ｈ８４０Ａ）の結晶構造を解明した（図１、３７および表１）。Ｃａｓ９の溶液挙動を改善するため、本出願人らは、あまり保存されていない２つのシステイン残基（Ｃｙｓ８０およびＣｙｓ５７４）を、ロイシンおよびグルタミン酸によりそれぞれ置き換えた。このＣ８０Ｌ／Ｃ５７４Ｅ突然変異体は、ヒト胚性腎臓２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞中のゲノムＤＮＡを効率的に開裂する能力を保持し、それらの突然変異がＣａｓ９ヌクレアーゼ機能に対して効果を有さないことを裏付けた（図３８）。さらに、結晶化の間の標的ＤＮＡの開裂を防止するため、本出願人らは、２つの触媒残基、ＲｕｖＣドメインからのＡｓｐ１０およびＨＮＨドメインからのＨｉｓ８４０を、アラニンにより置き換えた。

【0921】

【表410】

[この文献は図面を表示できません]

【0922】

結晶分析非対称単位は、２つのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ三元複合体（Ｍｏｌ ＡおよびＭｏｌ Ｂ）を含有した。２つの複合体間に立体構造の差異が存在するが、ｓｇＲＮＡおよびＤＮＡは、Ｃａｓ９により類似の様式において認識される。最も注目すべきは、Ｍｏｌ Ａ中のＨＮＨドメインが不規則リンカーによりＲｕｖＣドメインと接続されている一方、Ｍｏｌ Ｂ中のＨＮＨドメインは電子密度マップ中で可視的でなく、このことはＨＮＨドメインのフレキシブルな性質を示す。したがって、本出願人らは、最初に、特に記載のない限り、Ｍｏｌ Ａの構造的特徴を記載し、次いでＣａｓ９の立体構造フレキシビリティーを示唆する２つの複合体間の構造的差異を考察する。

【0923】

結晶構造は、Ｃａｓ９が２つのローブ、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブからなることを明らかにした（図３０Ａ〜Ｃ）。ＲＥＣローブは、３つの領域、ブリッジヘリックス（ＢＨ）と称される長鎖α−ヘリックス（残基６０〜９３）、ＲＥＣ１（残基９４〜１７９および３０８〜７１３）、およびＲＥＣ２（残基１８０〜３０７）ドメインに分類することができる（図３０Ａ〜Ｃ）。ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣ（残基１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８）、ＨＮＨ（残基７７５〜９０８）、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）（残基１０９９〜１３６８）ドメインからなる（図３０Ａ〜Ｃ）。負荷電ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二本鎖は、ＲＥＣおよびＮＵＣローブ間の界面における正荷電溝中に収容される（図３０Ｄ）。ＮＵＣローブにおいて、ＲｕｖＣドメインは、３つの分割ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣＩ〜ＩＩＩ）からアセンブルされ、それがＰＩドメインと調和してｓｇＲＮＡの３’テールと相互作用する正荷電表面を形成する（図３０Ｄ）。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣＩＩ〜ＩＩＩモチーフ間に存在し、タンパク質の残部とのわずかな接触のみを形成する。

【0924】

リピート：アンチリピート二本鎖と相互作用しているＣａｓ９のＲＥＣローブ：ＲＥＣローブは、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含む。ＲＥＣ１は、２６個のα−ヘリックス（α２〜α５およびα１２〜α３３）および２つのβ−シート（β６／β１０およびβ７〜β９）を含む延長されたα−ヘリカル構造を採用した一方、ＲＥＣ２は、６つのヘリックス束構造（α６〜α１１）を採用した（図３１Ａおよび３９）。Ｄａｌｉサーチ（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｍ，２０１０）は、ＲＥＣローブが他の公知のタンパク質と構造的類似性を共有しないことを明らかにし、このことはそれがＣａｓ９特異的機能ドメインであることを示した。

【0925】

ＲＥＣローブは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系（ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣ）内のＣａｓ９の３つのファミリーにわたり少なくとも保存された領域の１つであり、多くのＣａｓ９は、顕著に短いＲＥＣローブを含有する（図４０、４１）。本出願人らは、ＲＥＣローブ中のトランケーションが許容され得ることを仮定した。予測どおり、ＲＥＣ２ドメインが結合ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二本鎖に接触しない観察と一致して、ＲＥＣ２ドメインを欠くＣａｓ９突然変異体（Δ１７５〜３０７）は、野生型Ｃａｓ９活性の約５０％を示し（図３１Ｂ）、このことは、ＲＥＣ２ドメインがＤＮＡ開裂にクリティカルでないことを示した。より低い開裂効率は、部分的には、野生型タンパク質のものに対するＣａｓ９（Δ１７５〜３０７）発現のレベルの低減が原因であり得る（図３１Ｃ）。著しく対照的に、ＲＥＣ１ドメインのｃｒＲＮＡリピート相互作用領域の欠失（Δ９７〜１５０）またはｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート相互作用領域の欠失（Δ３１２〜４０９）は、ＤＮＡ開裂活性を停止させ（図３１Ｂ）、このことは、ＲＥＣ１ドメインによるリピート：アンチリピート二本鎖の認識がＣａｓ９機能にクリティカルであることを示した。

【0926】

ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインは、ＰＡＭ特異性を付与する：ＮＵＣローブは、７つのα−ヘリックス（α４７〜α５３）、三本鎖逆平行β−シート（β１８〜β２０）、五本鎖逆平行β−シート（β２１〜β２３、β２６およびβ２７）、および二本鎖逆平行β−シート（β２４およびβ２５）（図３１Ｄおよび３９）を含む延長された構造を採用するＰＩドメインを含有する。ＲＥＣローブと同様に、ＰＩドメインも、Ｃａｓ９ファミリーにユニークな新規タンパク質折り畳みを表す。

【0927】

本発明の構造中の結合相補鎖ＤＮＡおよびＲｕｖＣドメイン中の活性部位の局在は、ＰＩドメインが標的ＤＮＡの非相補鎖上のＰＡＭ配列を認識するように位置決めされることを示唆する。本出願人らは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９；この研究におけるＣａｓ９）ＰＩドメインの、異なるＰＡＭを認識するオルソロガスＣａｓ９タンパク質のものによる置換が、ＳｐＣａｓ９ＰＡＭ特異性を変更するのに十分か否かを試験した。サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ−３Ｃａｓ９（Ｓｔ３Ｃａｓ９）はＳｐＣａｓ９と約６０％の配列同一性を共有し；さらに、それらのｃｒＲＮＡリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡは交換可能である（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。しかしながら、ＳｐＣａｓ９およびＳｔ３Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡ開裂のために異なるＰＡＭ配列（Ｃａｓ９について５’−ＮＧＧおよびＳｔ３Ｃａｓ９について５’−ＮＧＧＮＧ）を要求する（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0928】

本出願人らは、２つのＰＩドメインをスワップして２つのキメラＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９（Ｓｔ３Ｃａｓ９のＰＩドメインを有するＳｐＣａｓ９）およびＳｔ３−ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９のＰＩドメインを有するＳｔ３Ｃａｓ９）を生成し、５’−ＮＧＧ ＰＡＭ（５’−ＧＧＧＣＴ）または５’−ＮＧＧＮＧ ＰＡＭ（５’−ＧＧＧＣＧを担持する標的ＤＮＡ配列についてのそれらの開裂活性を試験した（図３１Ｅ）。ＳｐＣａｓ９およびＳｔ３−ＳｐＣａｓ９は、５’−ＮＧＧ ＰＡＭを有する標的ＤＮＡを開裂するが、Ｓｔ３Ｃａｓ９は開裂せず（図３１Ｅ）、このことはＳｐＣａｓ９のＰＩドメインが５’−ＮＧＧ ＰＡＭの認識に要求され、Ｓｔ３Ｃａｓ９のＰＡＭ認識を変更するのに十分であることを示す。Ｓｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９のものよりも低いレベルにもかかわらず、５’−ＮＧＧ ＰＡＭを有する標的ＤＮＡについての開裂活性を保持した（図３１Ｅ）。さらに、ＰＩドメインの欠失（Δ１０９９〜１３６８）は、開裂活性を停止させ（図３１Ｅ）、このことはＰＩドメインがＣａｓ９機能にクリティカルであることを示した。これらの結果は、ＰＩドメインがＰＡＭ特異性の主要な決定因子であることを明らかにする。

【0929】

ＲｕｖＣドメインは、非相補鎖ＤＮＡを標的化する：ＲｕｖＣドメインは、α−ヘリックス（α３４、α３５およびα４０〜α４６）および２つの追加の二本鎖逆平行β−シート（β３／β４およびβ１５／β１６）によりフランキングされている六本鎖混合β−シート（β１、β２、β５、β１１、β１４およびβ１７）からなる（図３２Ａおよび３９）。これは、ＲＮアーゼＨ折り畳みにより特徴付けられるレトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバー、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲｕｖＣ（ＰＤＢコード１ＨＪＲ、１３％の同一性、１２３個の等価Ｃα原子について３．４Åの平方根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ））（Ａｒｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣ（ＰＤＢコード４ＬＤ０、１７％の同一性、１２９個の等価Ｃα原子について３．４Åのｒｍｓｄ）（Ａｒｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣ（ＰＤＢコード４ＬＤ０、１７％の同一性、１２９個の等価Ｃα原子について３．４Åのｒｍｓｄ）（Ｇｏｒｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（図３２Ｂ）と構造的類似性を共有する。ＲｕｖＣヌクレアーゼは、４つの触媒残基（例えば、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣ中のＡｓｐ７、Ｇｌｕ７０、Ｈｉｓ１４３およびＡｓｐ１４６）を有し、２金属機序を介してホリデイジャンクションを開裂する（Ａｒｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｇｏｒｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｃａｓ９ＲｕｖＣドメインのＡｓｐ１０（Ａｌａ）、Ｇｌｕ７６２、Ｈｉｓ９８３およびＡｓｐ９８６は、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｕｖＣの触媒残基のものと類似する位置において局在し（図３２Ａ、Ｂ）、Ｄ１０Ａ突然変異が非相補ＤＮＡ鎖の開裂を停止させ、Ｃａｓ９が開裂活性のためにＭｇ２＋イオンを要求する従来の結果と一致する（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。さらに、Ｇｌｕ７６２、Ｈｉｓ９８３またはＡｓｐ９８６のアラニン置換も、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換した（図３２Ｃ、Ｄ）。それぞれのニッカーゼ突然変異体は、並置ｓｇＲＮＡのペア（図３２Ｃ、Ｄ）を使用して標的化された二本鎖分解を容易にし得、これはＤ１０Ａニッカーゼにより既に実証されているとおりである（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。構造観察および突然変異分析のこの組合せは、Ｃａｓ９ＲｕｖＣドメインが他のレトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーヌクレアーゼについて既に観察された２金属機序を介して標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂することを示唆する。

【0930】

Ｃａｓ９ＲｕｖＣドメインとＲｕｖＣヌクレアーゼとの間に、それらの機能的差異を説明するキー構造的非類似性が存在することに留意することが重要である。Ｃａｓ９ＲｕｖＣドメインとは異なり、ＲｕｖＣヌクレアーゼはダイマーを形成し、ホリデイジャンクションを認識する（Ｇｏｒｅｃｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（図３２Ｂ）。保存ＲＮアーゼＨ折り畳みの他、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインは、ガイド：ＤＮＡ二本鎖（α４３とα４４との間の終端キャッピングループ）およびＰＩドメイン／ステムループ３（β３およびβ４により形成されるβ−ヘアピン）との相互作用に関与する追加の構造エレメントを有する（図３２Ａ）。

【0931】

ＨＮＨドメインは、相補鎖ＤＮＡを標的化する：ＨＮＨドメインは、４つのα−ヘリックス（α３６〜α４２）によりフランキングされている二本鎖逆平行β−シート（β１２およびβ１３）を含む（図３２Ｅ）。同様に、これは、ββα−金属折り畳みにより特徴付けられるＨＮＨエンドヌクレアーゼ、例えば、ファージＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅｎｄｏ ＶＩＩ）（Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）（ＰＤＢコード２ＱＮＣ、８％の同一性、６０個の等価Ｃα原子について２．６Åのｒｍｓｄ）（図３２Ｆ）およびビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）ヌクレアーゼ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）（ＰＤＢコード１ＯＵＰ、８％の同一性、７８個の等価Ｃα原子について２．９Åのｒｍｓｄ）と構造的類似性を共有する。ＨＮＨヌクレアーゼは、３つの触媒残基（例えば、Ｅｎｄｏ ＶＩＩ中のＡｓｐ４０、Ｈｉｓ４１、およびＡｓｎ６２）を有し、単一金属機序を介して核酸基質を開裂する（Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ホリデイジャンクションとの複合体におけるＥｎｄｏ ＶＩＩ Ｎ６２Ｄ突然変異体の構造において、Ｍｇ２＋イオンはＡｓｐ４０、Ａｓｐ６２および基質の切断しやすいリン酸基の酸素原子により配位される一方、Ｈｉｓ４１は触媒作用のために水分子を活性化させる一般塩基として作用する（図３２Ｆ）。Ｃａｓ９ＨＮＨドメインのＡｓｐ８３９、Ｈｉｓ８４０、およびＡｓｎ８６３は、それぞれＥｎｄｏＶＩＩのＡｓｐ４０、Ｈｉｓ４１、およびＡｓｎ６２に対応し（図３２Ｅ）、Ｈｉｓ８４０が相補ＤＮＡ鎖の開裂にクリティカルである観察と一致する（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｎ８６３Ａ突然変異体は、ニッカーゼとして機能し（図３２Ｃ、Ｄ）、このことはＡｓｎ８６３が触媒作用に関与することを示す。これらの観察は、Ｃａｓ９ＨＮＨドメインが、他のＨＮＨスーパーファミリーヌクレアーゼについて観察される単一金属機序を介して標的ＤＮＡの相補鎖を開裂し得ることを示唆する。しかしながら、本発明の構造において、Ｃａｓ９のＡｓｎ８６３は、Ｅｎｄｏ ＶＩＩ中のＡｓｎ６２とは異なる位置において局在する一方（Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）、Ｃａｓ９のＡｓｐ８３９およびＨｉｓ８４０（Ａｌａ）は、それぞれＥｎｄｏ ＶＩＩのＡｓｐ４０およびＨｉｓ４１と類似する位置において局在する（図３２Ｅ、Ｆ）。これは、本出願人らの結晶化溶液中の二価イオン、例えば、Ｍｇ２＋の不存在に起因し得、このことはＡｓｎ８６３が活性部位に向き、触媒作用に関与し得ることを示唆する。ＨＮＨドメインは他のＨＮＨエンドヌクレアーゼとββα−金属折り畳みを共有する一方、それらの全体構造は異なり（図３２Ｅ、Ｆ）、それらの基質特異性の差異と一致する。

【0932】

ｓｇＲＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡを認識する：ｓｇＲＮＡは、人工テトラループにより接続されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ由来配列からなる（図３３Ａ）。ｃｒＲＮＡ配列は、ガイド（２０ｎｔ）およびリピート（１２ｎｔ）領域に下位分類することができ、同様にｔｒａｃｒＲＮＡ配列はアンチリピート（１４ｎｔ）および３つのｔｒａｃｒＲＮＡステムループに下位分類することができる（図３３Ａ）。結晶構造は、ｓｇＲＮＡが標的ＤＮＡに結合してガイド：ＤＮＡ二本鎖、リピート：アンチリピート二本鎖およびステムループ１〜３を含むＴ形状アーキテクチャーを形成することを明らかにする（図３３Ａ、Ｂ）。リピート：アンチリピート二本鎖およびステムループ１は、単一ヌクレオチド（Ａ５１）により接続されており、ステムループ１および２は５ｎｔ一本鎖リンカー（ヌクレオチド６３〜６７）により接続されている。

【0933】

ガイド（ヌクレオチド１〜２０）および標的ＤＮＡ（ヌクレオチド３’〜２３’）は、２０個のワトソン−クリック塩基対を介してガイド：ＤＮＡハイブリッド二本鎖を形成し、二本鎖の立体構造は基準のＡ型ＲＮＡ二本鎖から変形する（図３３Ｂおよび４２）。ｃｒＲＮＡリピート（ヌクレオチド２１〜３２）およびｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート（ヌクレオチド３７〜５０）は、９個のワトソン−クリック塩基対（Ｕ２２：Ａ４９〜Ａ２６：Ｕ４５およびＧ２９：Ｃ４０〜Ａ３２：Ｕ３７）を介してリピート：アンチリピート二本鎖を形成する（図３３Ａ、Ｂ）。この領域内で、Ｇ２７、Ａ２８、Ａ４１、Ａ４２、Ｇ４３、およびＵ４４はペア形成せず、Ａ２８およびＵ４４は二本鎖からフリップアウトする（図３３Ｃ）。Ｇ２７およびＡ４１のヌクレオ塩基はＡ２６：Ｕ４５およびＧ２９：Ｃ４０ペアとそれぞれスタッキングし、Ｇ２７の２−アミノ基はＧ４３とＵ４４との間の骨格リン酸基と相互作用し、二本鎖構造を安定化する（図３３Ｃ）。Ｇ２１およびＵ５０は、ガイド：ＤＮＡ／リピート：アンチリピート二本鎖とステムループ１との間の３方向ジャンクションにおいてゆらぎ塩基対を形成し、Ｔ形状アーキテクチャーを安定化する（図３３Ｃ）。

【0934】

ヌクレオチド配列のＲＮＡ折り畳み予測から予測されるとおり、ｔｒａｃｒＲＮＡ３’テール（ヌクレオチド６８〜８１および８２〜９６）は、４および６つのワトソン−クリック塩基対（Ａ６９：Ｕ８０〜Ｕ７２：Ａ７７およびＧ８２：Ｃ９６〜Ｇ８７：Ｃ９１）を介してそれぞれステムループ２および３を形成する（図３３Ａ、Ｂ）。これまで認識されていないが、３つのワトソン−クリック塩基対（Ｇ５３：Ｃ６１、Ｇ５４：Ｃ６０およびＣ５５：Ｇ５８）を介してヌクレオチド５２〜６２もステムループ（ステムループ１）を形成し、Ｕ５９はステムからフリップアウトする（図３３Ａ、Ｂ）。ステムループ１は、Ｇ６２〜Ｇ５３：Ｃ６１スタッキング相互作用およびＧ６２〜Ａ５１／Ａ５２極性相互作用により安定化される（図３３Ｃ）。

【0935】

ガイド：ＤＮＡおよびリピート：アンチリピート二本鎖は、２つのローブの界面における正荷電溝中に収容され、深く埋め込まれる一方、ｓｇＲＮＡの残部は、タンパク質の裏側上の正荷電界面と広く相互作用する（図３０Ｄ）。Ｍｏｌ Ａにおいて、標的ＤＮＡの３’末端塩基（ＰＡＭに相補的な３’−ＡＣＣ）は、電子密度マップにおいて可視的でない。対照的に、Ｍｏｌ Ｂ中の２つの隣接塩基（３’−ＡＣ）は、Ｃａｓ９により認識されないが、それらは結晶充填相互作用に起因して構造的に規則的に並んでおり、電子密度マップにおいて可視的である。これらの観察は、ＰＡＭ（５’−ＴＧＧ）に相補的な３’−ＡＣＣ配列がＣａｓ９により認識されないことを示唆し、Ｃａｓ９触媒ＤＮＡ開裂が非相補鎖上の５’−ＮＧＧ ＰＡＭを要求するが、相補鎖上の３’−ＮＣＣ配列を要求しないことを実証する従来の生化学データと一致する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0936】

従来の研究は、４８ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡテールを有するｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ（＋４８）とも称される）が、インビトロでのＣａｓ９触媒ＤＮＡ開裂のための最小領域であるが（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、伸長ｔｒａｃｒＲＮＡテールを有するｓｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ（＋６７）およびｓｇＲＮＡ（＋８５）がインビボでＣａｓ９開裂活性を大幅に改善することを示した（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。本発明の構造は、ｓｇＲＮＡ（＋４８）、ｓｇＲＮＡ（＋６７）およびｓｇＲＮＡ（＋８５）がそれぞれステムループ１、ステムループ１〜２およびステムループ１〜３を含有することを明らかにした（図３３Ａ、Ｂ）。これらの観察は、ステムループ１が機能Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の形成に不可欠である一方、ステムループ２および３は、安定的複合体形成をさらに支持し、ｓｇＲＮＡ安定性を向上させ、こうしてインビボ活性を改善することを示した。

【0937】

Ｃａｓ９機能に対するそれぞれのｓｇＲＮＡ構造成分の重要性を裏付けるため、本出願人らは、リピート：アンチリピート二本鎖、ステムループ１〜３、およびステムループ１および２間のリンカー中の突然変異を有する多数のｓｇＲＮＡを試験した。本出願人らの結果は、ステムループ２および３ならびにリンカー領域が多数の突然変異を許容し得る一方、リピート：アンチリピート二本鎖およびステムループ１がＣａｓ９機能にクリティカルであることを明らかにした（図３３Ｄ）。さらに、ｓｇＲＮＡ配列は、多数の突然変異を許容し得る（図３３Ｄ、再構築ｓｇＲＮＡ）。これらの結果は、Ｃａｓ９によるリピート：アンチリピート二本鎖の構造依存的認識の機能重要性を強調する。

【0938】

ブリッジヘリックス上の保存アルギニンクラスターは、ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ相互作用においてクリティカルな役割を担う：ｃｒＲＮＡガイド領域は、主としてＲＥＣローブにより認識される（図３４Ａ）。ｃｒＲＮＡガイド領域（ヌクレオチド４〜６および１３〜２０）の骨格リン酸基は、ＲＥＣ１ドメイン（Ａｒｇ１６５、Ｇｌｙ１６６、Ａｒｇ４０３、Ａｓｎ４０７、Ｌｙｓ５１０、Ｔｙｒ５１５およびＡｒｇ６６１）およびブリッジヘリックス（Ａｌａ５９、Ａｒｇ６３、Ａｒｇ６６、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ７１、Ａｒｇ７４およびＡｒｇ７８）と相互作用し（図３４Ｂ）、Ｃ１５、Ｕ１６およびＧ１９の２’−ヒドロキシル基はＲＥＣ１ドメイン中のＴｙｒ４５０、Ａｒｇ４４７／Ｉｌｅ４４８およびＴｈｒ４０４とそれぞれ水素結合する（図３４Ｂ）。これらの観察は、Ｃａｓ９結合ｓｇＲＮＡの８つのＰＡＭ近位ヌクレオチドのワトソン−クリック面が溶媒に露出され、こうして標的相補鎖とのペア形成のための核形成部位として機能することを示唆した。これは、１０〜１２ｂｐのＰＡＭ近位「シード」領域がＣａｓ９触媒ＤＮＡ開裂にクリティカルである従来の報告と一致する（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0939】

突然変異分析は、ブリッジヘリックス上のＲ６６Ａ、Ｒ７０ＡおよびＲ７４Ａ突然変異が、ＤＮＡ開裂活性を顕著に低減させることを実証し（図３４Ｃ）、このことはブリッジヘリックスによるｓｇＲＮＡ「シード」領域の認識の機能的重要性を強調した。Ａｒｇ７８およびＡｒｇ１６５も「シード」領域と相互作用するが、Ｒ７８ＡおよびＲ１６５Ａ突然変異体は、穏やかに減少した活性のみを示した（図３４Ｃ）。これらの結果は、Ａｒｇ６６、Ａｒｇ７０およびＡｒｇ７４が、ｓｇＲＮＡ骨格との分岐塩架橋を形成する一方、Ａｒｇ７８およびＡｒｇ１６５がｓｇＲＮＡ骨格との単一塩架橋を形成することを反映し得る。ブリッジヘリックス上のアルギニン残基のクラスターは、ＩＩ型Ａ〜Ｃ系におけるＣａｓ９タンパク質間で高度に保存され（図４０、４１）、このことはブリッジヘリックスがｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡの認識に関与するＣａｓ９タンパク質の普遍的な構造的特徴であることを示唆する。この観念は、厳密に保存されるアルギニン残基が、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のＡｒｇ７０と同等であり、ＩＩ−Ｂ型系のフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９の機能に不可欠である従来の観察により支持される（Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。さらに、リピート：アンチリピート二本鎖相互作用残基（Ａｒｇ７５およびＬｙｓ１６３）およびステムループ１相互作用残基（Ａｒｇ６９）のアラニン突然変異は、ＤＮＡ開裂活性の減少をもたらし（図３４Ｃ）、このことはＣａｓ９によるリピート：アンチリピート二本鎖およびステムループ１の認識の機能的重要性を裏付けた。

【0940】

ｃｒＲＮＡガイド領域は、Ｕ１６−Ａｒｇ４４７およびＧ１８−Ａｒｇ７１相互作用を除き配列非依存的にＣａｓ９により認識される（図３４Ａ、Ｂ）。この塩基特異的Ｇ１８−Ａｒｇ７１相互作用は、４つのＰＡＭ近位ガイド配列中のグアニンを有するｓｇＲＮＡについて観察されるＣａｓ９の優先性を部分的に説明し得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0941】

ＲＥＣ１およびＲｕｖＣドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ標的化を容易にする：Ｃａｓ９は、２０ｂｐのＤＮＡ標的部位を配列非依存的に認識する（図３４Ａ）。標的ＤＮＡ（ヌクレオチド１’、９’〜１１’、１３’、および２０’）の骨格リン酸基は、ＲＥＣ１（Ａｓｎ４９７、Ｔｒｐ６５９、Ａｒｇ６６１およびＧｌｎ６９５）、ＲｕｖＣ（Ｇｌｎ９２６）、およびＰＩ（Ｇｌｕ１１０８）ドメインと相互作用する。標的ＤＮＡ（ヌクレオチド５’、７’、８’、１１’、１９’、および２０’）のＣ２’原子は、ＲＥＣ１ドメイン（Ｌｅｕ１６９、Ｔｙｒ４５０、Ｍｅｔ４９５、Ｍｅｔ６９４およびＨｉｓ６９８）およびＲｕｖＣドメイン（Ａｌａ７２８）とのファンデルワールス相互作用を形成する（図３４Ｄ）。これらの相互作用は、Ｃａｓ９によるＤＮＡとＲＮＡ標的との区別に寄与する可能性が高い。ガイド：ＤＮＡ二本鎖の末端塩基対（Ｇ１：Ｃ２０’）は、終端キャッピング相互作用を介してＲｕｖＣドメインにより認識され（図３４Ｄ）；ｓｇＲＮＡ Ｇ１および標的ＤＮＡ Ｃ２０’のヌクレオ塩基は、それぞれＴｙｒ１０１３およびＶａｌ１０１５の側鎖と相互作用する一方、ｓｇＲＮＡ Ｇ１の２’−ヒドロキシルおよびリン酸基はそれぞれＶａｌ１００９およびＧｌｎ９２６と相互作用する。これらの終端キャッピング相互作用は、Ｃａｓ９が１７〜２０ｂｐのガイド：ＤＮＡ二本鎖を認識し、伸長ガイド配列が細胞中で分解され、配列特異性に改善に寄与しない従来の観察と一致する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。まとめると、これらの構造的知見は、Ｃａｓ９のＲＮＡガイドＤＮＡ標的化機序を説明する。

【0942】

リピート：アンチリピート二本鎖は、配列依存的にＲＥＣおよびＮＵＣローブにより認識される：リピート：アンチリピート二本鎖は、ＲＥＣおよびＮＵＣローブにより広く認識される（図３４Ａ）。ｃｒＲＮＡリピート（ヌクレオチド２４、２６、および２７）およびアンチリピート（ヌクレオチド４１、４５、４６、および４８〜５０）の骨格リン酸基は、ＲＥＣ１ドメイン（Ａｒｇ１１５、Ｈｉｓ１１６、Ｈｉｓ１６０、Ｌｙｓ１６３、Ａｒｇ３４０、およびＡｒｇ４０３）、ＰＩドメイン（Ｌｙｓ１１１３）、およびブリッジヘリックス（Ｌｙｓ７６）と相互作用する（図３４Ｅ、Ｆ）。ｃｒＲＮＡリピート（ヌクレオチド２２〜２４）およびアンチリピート（ヌクレオチド４３〜４５および４７）の２’−ヒドロキシル基は、ＲＥＣ１ドメイン（Ｌｅｕ１０１、Ｓｅｒ１０４、Ｐｈｅ１０５、Ｉｌｅ１３５、Ｔｙｒ３５９、およびＧｌｎ４０２）およびＰＩドメイン（Ｉｌｅ１１１０およびＴｙｒ１１３１）と水素結合する。

【0943】

ガイド領域の配列非依存的認識とは対照的に、Ｃａｓ９とリピート：アンチリピート二本鎖との間の配列依存的相互作用が存在する。フリップしたＵ４４のヌクレオ塩基は、Ｔｙｒ３２５およびＨｉｓ３２８の側鎖間に挟まれ、そのＮ３原子はＴｙｒ３２５のカルボニル基と水素結合する一方、ペア形成していないＧ４３のそれはＴｙｒ３５９の側鎖とスタッキングし、Ａｓｐ３６４の側鎖と水素結合する（図３４Ａ、Ｆ）。最後に、Ｕ２３／Ａ４９およびＡ４２／Ｇ４３のヌクレオ塩基は、それぞれＡｒｇ１１２２の側鎖およびＰｈｅ３５１の主鎖カルボニル基と水素結合する。

【0944】

本発明の構造において、リピート：アンチリピート二本鎖は、主として、ＩＩ型Ａ〜Ｃ系内のＣａｓ９オルソログ間で配列および長さが異なるＲＥＣローブにより認識され（図４０、４１）、密接に関連するＩＩ型系間でのみＣａｓ９およびｓｇＲＮＡが交換可能である従来の観察と一致する（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。３つのＰＡＭ遠位塩基対（Ｃ３０：Ｇ３９〜Ａ３２：Ｕ３７）はＣａｓ９により認識されず、複合体から突出しており（図３４Ａ）、Ｃａｓ９結合リピート：アンチリピート二本鎖が宿主ＲＮアーゼＩＩＩ酵素によりプロセシングされる提案モデルと一致する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0945】

Ｇ２１：Ｕ５０ゆらぎペア中のＧ２１およびＵ５０のヌクレオ塩基は、それぞれガイド：ＤＮＡ二本鎖中の末端Ｃ２０：Ｇ１’ペアおよびブリッジヘリックス上のＴｙｒ７２の側鎖とスタッキングし、Ｕ５０ Ｏ４原子はＡｒｇ７５の側鎖と水素結合する（図３４Ｅ）。特に、Ａ５１は、ｓｙｎ立体構造を採用し、Ｕ５０と逆の方向に配向される（図３３Ｃおよび３４Ｇ）。Ａ５１のヌクレオ塩基は、ＰＩドメイン中のＰｈｅ１１０５側鎖とリンカー中のＵ６３ヌクレオ塩基との間に挟まれ、そのＮ７およびＮ１原子はそれぞれＰｈｅ１１０５の主鎖アミド基およびステムループ１中のＧ６２ ２’−ヒドロキシル基と水素結合する（図３４Ｇ）。リピート：アンチリピート二本鎖は、ＩＩ型Ａ〜Ｃ系間で配列および長さが異なる一方、Ｇ２１：Ｕ５０塩基対は、Ｃａｓ９間で高度に保存され（Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、このことはこのゆらぎペア形成が３方向ジャンクション形成に関与する普遍的な構造的特徴であることを示唆する。

【0946】

リピート：アンチリピート二本鎖の配列依存的認識を確認するため、本出願人らは、Ｃａｓ９媒介ＤＮＡ開裂に対するリピート：アンチリピート突然変異の効果を評価し、Ｃａｓ９活性を顕著に低減させる複数の突然変異を見出した（図３４Ｃ）。特に、Ａｓｐ３６４との塩基特異的水素結合を形成するＧ４３のアデニンによる置換は、Ｃａｓ９活性を３倍超だけ低減させた。さらに、リピート：アンチリピート二本鎖中のフリップしたＵ４４のアデニンによる置換は、開裂活性の５倍超の降下をもたらした一方、Ｕ４４の別のピリミジン塩基（シトシン）による置換は、開裂活性に有意に影響を及ぼさなかった（図３４Ｃ）。これらの結果は、Ｇ４３およびＵ４４の塩基特異的認識がＣａｓ９によるｓｇＲＮＡ認識において重要な役割を担い得ることを示唆する。

【0947】

ｓｇＲＮＡステムループ１〜３は、Ｃａｓ９と相互作用する：ステムループ１は、主として、ＲＥＣローブによりＰＩドメインと一緒に認識される（図３４Ａ）。ステムループ１（ヌクレオチド５２、５３、および５９〜６１）の骨格リン酸基は、ＲＥＣ１ドメイン（Ｌｅｕ４５５、Ｓｅｒ４６０、Ａｒｇ４６７、Ｔｈｒ４７２、およびＩｌｅ４７３）、ＰＩドメイン（Ｌｙｓ１１２３およびＬｙｓ１１２４）、およびブリッジヘリックス（Ａｒｇ７０およびＡｒｇ７４）と相互作用し、Ｇ５８の２’−ヒドロキシル基はＲＥＣ１ドメイン中のＬｅｕ４５５と水素結合する。Ａ５２は、表面から端部のπ−πスタッキング相互作用を介してＰｈｅ１１０５と相互作用し（図３４Ｇ）、フリップしたＵ５９ヌクレオ塩基はＡｓｎ７７の側鎖と水素結合する（図３４Ｈ）。

【0948】

ステムループ２および３、ならびに一本鎖リンカーは、主として、ＮＵＣローブにより認識され（図３４Ａ）；これは、ＮＵＣおよびＲＥＣローブの両方により認識されるステムループ１およびガイド：ＤＮＡ／リピート：アンチリピート二本鎖とは対照的である。リンカー（ヌクレオチド６３〜６５および６７）の骨格リン酸基は、ＲｕｖＣドメイン（Ｇｌｕ５７、Ｌｙｓ７４２、およびＬｙｓ１０９７）、ＰＩドメイン（Ｔｈｒ１１０２）、ブリッジヘリックス（Ａｒｇ６９）と相互作用し、Ｕ６４およびＡ６５の２’−ヒドロキシル基はそれぞれＧｌｕ５７およびＨｉｓ７２１と水素結合する（図３４Ｉ）。Ｃ６７のヌクレオ塩基は、Ｖａｌ１１００の主鎖アミド基と水素結合する（図３４Ｉ）。

【0949】

ステムループ２は、直接（Ａ６８Ｎ６およびＧ８１Ｏ６原子間）および水媒介（Ａ６８Ｎ１およびＧ８１Ｎ１原子間）水素結合相互作用により形成されるＮＵＣローブと非ワトソン−クリックＡ６８：Ｇ８１ペアとの間の相互作用を介してＣａｓ９により認識される（図３４Ｊ）。Ａ６８およびＧ８１のヌクレオ塩基は、それぞれＳｅｒ１３５１およびＴｙｒ１３５６の側鎖に接触し、Ａ６８：Ｇ８１ペアは水媒介水素結合を介してＴｈｒ１３５８により認識される（図３４Ｊ）。Ａ６８の２’−ヒドロキシル基は、Ｈｉｓ１３４９の側鎖と水素結合し、Ｇ８１の２−アミノ基は、Ｌｙｓ３３の主鎖カルボニル基と水素結合する（図３４Ｊ）。

【0950】

ステムループ３は、ステムループ２よりも広くＮＵＣローブと相互作用する（図３４Ｋ）。Ｃ９１およびＧ９２の骨格リン酸基は、ＲｕｖＣドメイン（Ａｒｇ４０およびＬｙｓ４４）と相互作用する一方（図３４Ｋ）、Ｇ８９およびＵ９０のヌクレオ塩基はそれぞれＧｌｎ１２７２およびＧｌｕ１２２５／Ａｌａ１２２７と水素結合する（図３４Ｋ）。Ａ８８およびＣ９１のヌクレオ塩基は、複数の水素結合相互作用を介してＡｓｎ４６の側鎖により認識される（図３４Ｋ）。

【0951】

Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの構造的フレキシビリティー：ＨＮＨドメインは、ＰＡＭ配列の３ヌクレオチド上流の位置における標的ＤＮＡの相補鎖を開裂するが（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、本発明の構造において、ＨＮＨドメインは結合相補鎖の切断しやすいリン酸基から離れて位置決めされる（図３５Ａ）。Ｍｏｌ Ａ およびＭｏｌ Ｂの構造比較は、ＨＮＨドメインによる相補鎖開裂への機序の見識を提供した。Ｍｏｌ Ａにおいて、ＨＮＨドメインにはＲｕｖＣドメインのα４０ヘリックスが続き、それはα４０〜α４１リンカー（残基９１９〜９２５）によりα４１ヘリックスと接続される（図３５Ａ）。Ｍｏｌ Ａにおいて、残基９１３〜９２５はα４３ヘリックスのＣ末端部分およびα４３〜α４４リンカーを形成する一方、Ｍｏｌ Ｂにおいて、それらの残基は、相補鎖の開裂部位に指向される伸長α−ヘリックスを形成する（図３５Ａ）。これらの観察は、ＨＮＨドメインがＨＮＨおよびＲｕｖＣドメインを接続するセグメントの立体構造変化を介して標的ＤＮＡにアプローチし、それを開裂し得ることを示唆する。

【0952】

さらに、構造比較は、ＲＥＣおよびＮＵＣローブ間の立体構造フレキシビリティーを明らかにした（図３５Ｂ）。Ｍｏｌ Ａと比較して、Ｍｏｌ Ｂは、２つのローブがＲｕｖＣドメイン中のブリッジヘリックスとβ５鎖との間のヒンジループにおいて１５°だけ回転されるよりオープンな立体構造を採用する（図３５Ｂ）。結合ｓｇＲＮＡは、ヒンジループと相互作用する一本鎖リンカーにおいて付随する立体構造変化も受ける（図３５Ｃ）。本出願人らは、リピート：アンチリピート二本鎖およびＲＥＣ１ドメインのα２〜α３ループと相互作用するＰＩドメインのβ１７〜β１８ループの付随する変位も観察した（図３５Ｂ）。特に、α２〜α３およびβ１７〜β１８ループ間の相互作用を除き、本発明の構造において２つのローブ間の直接接触は存在せず（図３５Ｄ）、このことはＣａｓ９がｓｇＲＮＡの不存在下で高度にフレキシブルであることを示唆する。Ｃａｓ９のフレキシブル性は、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ三元複合体のアセンブリにおける役割を担う可能性が高い。

【0953】

ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡとの複合体におけるＣａｓ９の結晶構造は、ｃｒＲＮＡガイド領域および標的ＤＮＡの相補鎖により形成される２０ｂｐのヘテロ二本鎖がＣａｓ９のＲＥＣおよびＮＵＣローブ間の界面における正荷電溝中に収容され、標的の切断しやすいリン酸基は、ＨＮＨドメインによる開裂のために適切に位置決めされることを明らかにする。本発明の構造は非相補ＤＮＡ鎖を含有しないが、結合相補鎖の位置は、非相補鎖の切断しやすいリン酸がＲｕｖＣドメインの活性部位に近接して局在することを示唆し、従来の生化学データと一致する（Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。さらに、本出願人らの構造および機能分析は、ＰＩドメインが非相補鎖のＰＡＭ配列の認識に関与することを示す。

【0954】

これらの観察に基づき、本出願人らは、Ｃａｓ９触媒ＲＮＡガイドＤＮＡ開裂のためのモデルを提案する（図３６）。Ｃａｓ９は、ＰＡＭ近位ガイド領域およびｓｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二本鎖を認識してＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ二元複合体を形成する。二元複合体は、続いて結合ｓｇＲＮＡの２０ｎｔガイド領域に相補的なＤＮＡ配列を認識し、最終的なＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ三元複合体を形成する。三元複合体形成の間、ＰＩドメインは非相補鎖のＰＡＭ配列を認識し、Ｒ−ループ形成を容易にする。三元複合体のアセンブリ時、可動ＨＮＨドメインはガイド：ＤＮＡ二本鎖中の相補鎖にアプローチし、それを開裂する一方、ＲｕｖＣドメインは一本鎖非相補鎖を開裂する。

【0955】

本出願人らの結晶構造は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機序の理解へのクリティカルステップを提供する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９または関連オルソログを用いるさらなる構造および機能研究、例として、非相補鎖を含有するＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ三元複合体の構造決定が、詳細、例えば、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ配列のＣａｓ９媒介認識またはｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖間のミスマッチ許容の説明に重要であり得る。しかしながら、本発明の構造および機能分析は、Ｃａｓ９ベースゲノムモジュレート技術の合理的エンジニアリングに有用な足場を既に提供する。本出願人らは、例えば、インビボおよび治療用途のためのサイズ制約ウイルスベクター中へのＣａｓ９のパッケージングを容易にする化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９トランケーション突然変異体を報告した（図３１Ｂ）。同様に、ＰＩドメインの将来的なエンジニアリングは、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能とし、標的部位認識フィデリティーを改善し、Ｃａｓ９ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を増加させる。

【0956】

実験手順
タンパク質調製：全長化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（残基１〜１３６８）をコードする遺伝子を、改変ｐＣｏｌｄ−ＧＳＴベクター（ＴａＫａＲａ）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位間にクローニングした。タンパク質を２０℃において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。溶出させたタンパク質を４℃においてＴＥＶプロテアーゼと一晩インキュベートしてＧＳＴタグを除去し、Ｎｉ−ＮＴＡ，Ｍｏｎｏ Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上でのクロマトグラフィーによりさらに精製した。天然タンパク質について同様のプロトコルを使用してＳｅＭｅｔ標識タンパク質を調製した。ｓｇＲＮＡは、ＰＣＲ増幅テンプレートを使用してＴ７ポリメラーゼによりインビトロ転写させ、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。標的ＤＮＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。精製したＣａｓ９タンパク質をｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ（モル比１：１．５：２）と混合し、次いで１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して複合体を精製した。

【0957】

結晶分析：精製したＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を懸滴蒸気拡散法により２０℃において結晶化させた。結晶は、１μｌの複合体溶液（Ａ_{２６０ｎｍ}＝１５）および１μｌの保存溶液（１２％のＰＥＧ３，３５０、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭの酢酸アンモニウム、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＮＤＳＢ−２５６）を混合することにより得た。ＳｅＭｅｔ標識タンパク質を天然タンパク質についてのものと同様の条件下で結晶化させた。Ｘ線回折データを、ＳＰｒｉｎｇ−８（兵庫、日本）においてビームラインＢＬ３２ＸＵおよびＢＬ４１ＸＵで１００Ｋにおいて収集した。２５％のエチレングリコールが補給された保存溶液中で、結晶を凍結保護した。Ｘ線回折データは、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０）を使用して処理した。構造は、ＳｅＭｅｔ標識結晶からの２．８Å分解能データを使用するＳＡＤ法により決定した。ＳＨＥＬＸＤ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２００８）およびａｕｔｏＳＨＡＲＰ（ｄｅｌａＦｏｒｔｅｌｌｅ ａｎｄ Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，１９９７）を使用して潜在的な４４個のＳｅ原子の４０個を局在させた。ａｕｔｏＳＨＡＲＰを使用して初期位相を計算し、ＤＭを使用する２倍ＮＣＳ平均化（Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）によりさらに改善させた。このモデルは、ＰＨＥＮＩＸ ＡｕｔｏＳｏｌ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）を使用して自動的に構築し、次いでＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を使用して手動モデルを構築しＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）を使用してリファインした。天然２．４Å分解能データを使用して得られたモデルをさらにリファインした。

【0958】

細胞培養および形質移入：ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはマウスＮｅｕｒｏ２ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）細胞系を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ_２インキュベーションで維持した。細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、形質移入２４時間前に１２０，０００個の細胞／ウェルの密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して７０〜８０％のコンフルエンシーにおいて細胞を形質移入した。合計４００ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび１００ｎｇのＵ６：：ｓｇＲＮＡのＰＣＲ産物を形質移入した。

【0959】

ゲノム改変のためのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ：２９３ＦＴ細胞を、上記ＤＮＡにより形質移入した。細胞を３７℃において形質移入後、７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化された細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間、６８℃において１５分間、および９８℃において１０分間インキュベートした。

【0960】

それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼおよびＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づくものであった。インデル割合は、式１００×（１−（１−（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））^１／２）（式中、ａは、未消化ＰＣＲ産物のインテグレート強度であり、ｂおよびｃは、それぞれの開裂産物のインテグレート強度である）により決定した。

【0961】

ウエスタンブロット：ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を形質移入し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）が補給された１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で溶解させた。溶解物をＢｏｌｔ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードし、ニトロセルロース膜に転写した。膜は、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０および５％のブロッキング剤（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中でブロッキングした。膜をウサギ抗ＦＬＡＧ（１：５０００、Ａｂｃａｍ）、ＨＲＰコンジュゲート抗ＧＡＰＤＨ（１：５，０００ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ（１：１０００）によりプロービングした。ブロットをＧｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）上で可視化した。

【0962】

配列情報：
イタリック：３×ＦＬＡＧ配列
下線：ＮＬＳ配列
野生型ＳｐＣａｓ９

【化100】

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【化101】

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Ｓｐ＿ｄｅｌ（９７−１５０）

【化102】

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【化103】

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Ｓｐ＿ｄｅｌ（１７５−３０７）

【化104】

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【化105】

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Ｓｐ＿ｄｅｌ（３１２−４０９）

【化106】

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【化107】

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Ｓｐ＿ｄｅｌ（１０９８−終端）

【化108】

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【化109】

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Ｓｔ３Ｃａｓ９

【化110】

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【化111】

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ＳｐＣａｓ９（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５７４Ａ）

【化112】

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【化113】

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Ｓｐ＿Ｓｔ３ Ｃａｓ９キメラ（Ｓｔ３を太字）

【化114】

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【化115】

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Ｓｔ３＿Ｓｐ Ｃａｓ９キメラ（Ｓｔ３を太字）

【化116】

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【化117】

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ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ
突然変異残基（ＧＣＣに変化）を以下の順に太字で示す：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｎ８６３、Ｈ９８３、Ｄ９８６

【化118】

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ＳｐＣａｓ９点突然変異体
突然変異残基（ＧＣＣに変化）を以下の順に太字で示す：Ｒ６３Ａ、Ｒ６６Ａ、Ｒ６９Ａ、Ｒ７０Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｒ７５Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｋ１６３Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｋ５１０Ａ

【化119】

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ｓｇＲＮＡ配列：
ガイド配列を下線

【化120】

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【0963】

【表411】

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【0964】

実施例１３：ｓｇＲＮＡのループ中へのＭＳ２ループの挿入物によりｓｇＲＮＡアーキテクチャーを改変することによりＮｅｕｒｏｇ２遺伝子を標的化する最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の生成
結晶構造情報（２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書、２０１４年１月２２日に出願された同第６１／９３０，２１４号明細書、２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書に記載）は、ｓｇＲＮＡアーキテクチャーを改変するための構造情報を提供する。本出願人らは、ｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２の両方の伸長のための潜在的な空間が存在することを決定した（Ｃａｓ９タンパク質との衝突なし）。本出願人らは、それらの位置におけるＭＳ２ループの挿入物が、それらの２つの局在へのＭＳ２結合タンパク質のリクルートメントを可能とし、それにより任意のエフェクター融合物（例えば、転写アクチベータードメインｖｐ６４、ｐ６５、転写リプレッサードメインＳＩＤ４Ｘ、ＫＲＡＢ、または任意のエピジェネティックエフェクタードメイン）の遺伝子座特異的リクルートメントを媒介することを示した。実施例は、興味深い。Ｃａｓ９−ガイド−標的ＤＮＡ複合体の「外側」に露出されるガイド中の２つの４ｎｔストレッチの同定に対するフォーカスが存在する（それら４ｎｔステム末端とＣａｓ９アミノ酸との間の接触は、結晶中で同定されなかった）。一方の４ｎｔストレッチはテトラループ中に収まり、他方の４ｎｔストレッチはステムループ２中に収まる。これら４ｎｔのストレッチの一方または両方は、アプタマー配列により置き換えることができる。一方または両方は、完全にもしくは部分的に置き換えることができ、またはその一方または両方は、完全に保持することができ、非コードループをその４ｎｔの後に付加することができる。アプタマーは、ポリヌクレオチドであり、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、ＲＮＡが好ましい。アプタマーは、特異的ＲＮＡ配列を認識する対応するＲＮＡ結合タンパク質を有する。ｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２へのこれらのエフェクタードメインのリクルートメントは、標的化されるＤＮＡに対してより好ましい位置決めを潜在的にもたらした（Ｃａｓ９タンパク質へのエフェクタードメインのＣ末端融合物またはｓｇＲＮＡのループ３の後のＭｓ２ループの付加と比較して）。

【0965】

Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５％のＨｙＣｌｏｎｅ熱不活化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補給されたＧｌｕｔａＭａｘおよびピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する高グルコースＤＭＥＭとを、１：１の比で含有する培地中で成長させ、１：５において２日ごとに継代した。形質移入１８〜２０時間前、１２０，０００個の細胞を２４ウェルプレートのそれぞれのウェル中でプレーティングした。細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ形質移入試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により製造業者の指示書に従って形質移入した。プラスミドＤＮＡをＭＳ２−ＶＰ６４およびＣａｓ９構築物の形質移入に使用した一方、ＰＣＲ産物をガイドＲＮＡ発現カセットについて形質移入した。

【0966】

ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用してＲＮＡを抽出し、ｑＳｃｒｉｐｔ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して試料当たり１ｍｇのＲＮＡを逆転写させた。標的化された遺伝子および内因性対照としてのＧＡＰＤＨに特異的なＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により相対ｍＲＮＡレベルを計測した。ｄｄＣｔ分析を使用してＧＦＰのみにより形質移入された陰性対照に対する倍率変化を得た。

【0967】

結果は、テトラループおよびループ２中の両方の挿入物が有効であることならびに最も効率的な組合せは、ｄＣａｓ９−ｖｐ６４およびＭＳ２−ｖｐ６４構築物との組合せでｓｇＲＮＡのテトラループおよびループ２の両方中のＭＳ２ループの挿入物を使用することを示した。この新たなアクチベーター設計（図４４に説明され、図４５にＴＬ＋Ｌ２：Ｍｓ２ガイドについて赤色バーとして示される）は、従来の設計（図４３に説明され、図４５に標準ガイドについて緑色バーとして示される）と比較してかなり高い標的遺伝子上方調節を媒介することが見出された。

【0968】

ＭＳ２パイロット配列を以下に示す：
Ｎｅｕｒｏｇ２標的配列
ＧＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣ
テトラループＭＳ２ステムループ挿入ｓｇＲＮＡ足場
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＣＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＧｇｇｃａｃｃｇＡＧＴｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴ
ループ２ＭＳ２ステムループ挿入ｓｇＲＮＡ足場
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃａａｇｔｇｇｃａｃｃｇＡＧＴｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴ
テトラループおよびループ２ＭＳ２ステムループ挿入ｓｇＲＮＡ足場

【化121】

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標準ガイド足場
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔＧＡＡＡａａｇｔｇｇｃａｃｃｇＡＧＴｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴ
ＭＳ２−ｖｐ６４配列

【化122】

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【0969】

実施例１４：ｓｇＲＮＡ骨格またはアーキテクチャーを改変することによる機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のさらなる最適化
本出願人らは、２つの追加の遺伝子標的（ヒトＡＳＣＬ１およびヒトＭＹＯＤ１）に対するテトラループおよびループ２ＭＳ２ループ挿入の効率を試験し、ＶＰ６４のＣａｓ９への標準Ｃ末端融合物と比較して実施例１３に記載のｓｇＲＮＡ設計の増加した有効性を裏付けた（図４６および４７参照）。本出願人らは、２つの異なる活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４およびＰ６５について）の組合せが相乗作用をもたらし、したがって同一の総数の単一タイプの活性化ドメインの使用と比較して標的遺伝子上方調節の増加した効率をもたらし得る仮定をさらに試験した。本出願人らは、遺伝子活性化のコンテクストにおけるＣｈｅｎ，Ｂａｏｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｃｅｌｌ １５５．７（２０１３）：１４７９−１４９１におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓイメージングのために最適化された代替ガイドアーキテクチャーも試験した。

【0970】

方法：
標的配列
ＡＳＣＬ１
ＧＣＡＧＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧ
ＭＹＯＤ１
ＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧ

【0971】

細胞培養および形質移入ならびに遺伝子発現分析
熱不活化を特徴とする１０％のＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補給されたＧｌｕｔａＭａｘおよびピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する高グルコースＤＭＥＭ中でヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を維持した。細胞を、１対２または１対２．５の比において毎日継代した。ＭＳ２／ｄＣａｓ９アクチベーター実験のため、２０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ポリ−ｄ−リジンコート９６ウェルプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１００μＬの培養培地中でプレーティングした。プレーティング２４時間後、細胞を、１：１：１の質量比において、以下のものにより形質移入した：
・遺伝子特異的標的化配列を有するｓｇＲＮＡ骨格プラスミドまたはｐＵＣ１９対照プラスミド
・ＭＳ２−ＶＰ６４プラスミドまたはＭＳ２−ｐ６５プラスミドまたはｐＵＣ１９対照プラスミド
・ｄＣａｓ９プラスミドまたはｄＣａｓ９−ＶＰ６４プラスミドまたはｄＣａｓ９−ｐ６５プラスミドまたはｐＵＣ１９対照プラスミド

【0972】

１ウェル当たりの総プラスミド質量は、０．３マイクログラムであった。形質移入は、１．５ｕＬのＬｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示書に従って用いて実施した。細胞培地を形質移入５時間後に交換した。形質移入４８時間後、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞溶解および逆転写を実施した。Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲプローブ（ＬＩｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して遺伝子発現レベルを定量した。ＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１発現レベルをＧＡＰＤＨ発現レベルに対して計算した。遺伝子発現レベル倍率は、ＧＦＰプラスミドのみにより形質移入された試料との比較により決定した。

【0973】

結果は、本出願人らが、２つの追加の遺伝子標的に対するテトラループおよびループ２ＭＳ２ループ挿入物の効率を検証し、Ｃａｓ９へのＶＰ６４の標準Ｃ末端融合物と比較してその設計の増加した有効性を裏付けたことを示す。本出願人らは、２つの異なる活性化ドメインの組合せが標的遺伝子活性化を改善し得る仮定をさらに裏付けた（相乗作用を介して、例えば、異なるエピジェネティックモジュレーター、基本転写因子およびコアクチベーターのリクルートによる）。本出願人らは、Ｃｈｅｎ，Ｂａｏｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｃｅｌｌ １５５．７（２０１３）：１４７９−１４９１におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９イメージングのために最適化された代替ガイドアーキテクチャーが、標準アーキテクチャーに対していかなる改善も示さないことも決定した。

【0974】

まとめると、これらの実験は、改善されたＣａｓ９アクチベーターアーキテクチャーが、ＭＳ２−ＶＰ６４およびｄＣａｓ９−Ｐ６５またはＭＳ２−Ｐ６５およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４のいずれかとの組合せでテトラループおよびループ２中のＭＳ２ループ挿入物を有するｓｇＲＮＡからなることを示した。

【0975】

ＭＳ２ｓｇＲＮＡ足場配列情報
以下の全ての配列において、
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
は、それぞれのｓｇＲＮＡの遺伝子座特異的標的化配列を表す。
ｐＳＡＭｃａ００６標準ｓｇＲＮＡ骨格
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴＴ
Ｚｈａｎｇ研究室ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刊行物において使用される＋８３ヌクレオチドキメラ骨格
ｐＳＡＭｃａ００２テトラループステム伸長＋ＡＵフリップｓｇＲＮＡ骨格
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔａａｇａｇｃｔａｔｇｃｔｇＧＡＡＡｃａｇｃａｔａｇｃａａｇｔｔｔａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴＴ

【0976】

Ｃｈｅｎ，Ｂａｏｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｃｅｌｌ １５５．７（２０１３）：１４７９−１４９１
におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９イメージングのために最適化された骨格。
＋５位（標的配列の後の５番目のヌクレオチド）におけるＴを、＋３６位におけるＡと交換した。著者らは、この変化が＋２から＋５位における推定Ｕ６末端部位を除去することによりｓｇＲＮＡ濃度を増加させるはずであると示唆する。
ＴＧＣＴＧは、標準骨格の＋１２位の後に付加され、ＣＡＧＣＡは、標準骨格の＋２１位の後に付加される。これらの挿入物は、互いにペア形成してテトラループの塩基において伸長ステムを作出する。著者らは、このステム伸長がｓｇＲＮＡの安定化に役立ち得ることを示唆する。

【0977】

テトラループおよびステムループ２ｓｇＲＮＡ骨格上のｐＳＡＭｃａ００９ＭＳ２結合ループ

【化123】

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ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６およびヌクレオチド＋５３から＋５６を置き換える。得られる構造は、テトラループおよびステムループ２配列がＭＳ２結合ループにより置き換えられたｓｇＲＮＡ足場である。テトラループおよびステムループ２は、Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造から得られた情報に基づき置換のために選択した。具体的には、テトラループおよびステムループ２は、Ｃａｓ９タンパク質から突出していることが見出され、その結果、ＭＳ２結合ループの付加がいかなるＣａｓ９残基も干渉しないことを示唆した。さらに、ＤＮＡへのテトラループおよびステムループ２部位の近位性は、それらの局在への局在化がＤＮＡと、任意のリクルートされるタンパク質、例えば、転写アクチベーターとの間の高程度の相互作用をもたらすことを示唆した。

【0978】

テトラループおよびステムループ２上のｐＳＡＭｃａ０１０ＭＳ２結合ループ＋テトラループステム伸長＋ＡＵフリップｓｇＲＮＡ骨格

【化124】

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標準ｓｇＲＮＡ骨格の＋５位におけるＴを、標準ｓｇＲＮＡ骨格の＋３６位におけるＡと交換した。ステムループ伸長およびＭＳ２結合ループ配列ｔｇｃｔｇｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃｃａｇｃａは、標準ｓｇＲＮＡ骨格ヌクレオチド＋１３から＋１６を置き換える。ＭＳ２結合ループ配列ｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋５３から＋５６を置き換える。得られる構造は、ｐＳＡＭｃａ００２およびｐＳＡＭｃａ００９について記載される仮定を組み合わせる。

【0979】

テトラループおよびステムループ２上のｐＳＡＭｃａ０１１ＭＳ２結合ループ＋ＡＵフリップｓｇＲＮＡ骨格

【化125】

[この文献は図面を表示できません]

標準ｓｇＲＮＡ骨格の＋５位におけるＴを、標準ｓｇＲＮＡ骨格の＋３６位におけるＡと交換した。ＭＳ２結合ループ配列ｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６およびヌクレオチド＋５３から＋５６を置き換える。得られる構造は、ｐＳＡＭｃａ００９について記載される仮定を、ｐＳＡＭｃａ００２（推定Ｕ６終結部を除去）のＡＵフリップ仮定と組み合わせる。この構築物は、それがｐＳＡＭｃａ００２からの追加のｔｇｃｔｇテトラループステム伸長を含まないという点でｐＳＡＭｃａ０１０と異なり、テトラループステムの過剰伸長がｐＳＡＭｃａ０１０の場合においてｓｇＲＮＡ機能性を縮小するか否かを決定する。

【0980】

テトラループ上のｐＳＡＭｃａ００３ＭＳ２結合ループ＋ステムループ２ＧＣトラクトスイッチｓｇＲＮＡ骨格
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＣＧＣＣｇａａａＧＧＣＧｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴＴ
ＭＳ２結合ループ配列ｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６を置き換える。配列ＣＧＣＣは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋４９から＋５２を置き換える。配列ＧＧＣＧは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋５７から＋６０を置き換える。テトラループＭＳ２結合ループ挿入は、上記ｐＳＡＭｃａ００９について記載のものと同一の根拠により設計した。ＣＧＣＣおよびＧＧＣＧ配列は、ステムループ２のステム部分を置き換える。元のＡＣＴＴ−ＡＡＧＴステムと比較してＣＧＣＣ−ＧＧＣＧステムの増加した塩基対形成強度は、ステムループ２構造に追加の安定性を提供し、それによりｓｇＲＮＡ性能または寿命を増加させると仮定された。

【0981】

ステムループ２ＧＣトラクトなしのテトラループ上のｐＳＡＭｃａ０１３ＭＳ２結合ループスイッチｓｇＲＮＡ骨格
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴＴ
ＭＳ２結合ループ配列ｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６を置き換える。テトラループＭＳ２結合ループ挿入は、上記ｐＳＡＭｃａ００９について記載のものと同一の根拠により設計した。

【0982】

テトラループおよびステムループ２上のｐＳＡＭｃａ０２５ＭＳ２結合ループ＋３’テールｓｇＲＮＡ骨格上の２つのＭＳ２結合ループ

【化126】

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短鎖リンカーにより離隔している２つのＭＳ２結合ループを含む配列ＴＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴを、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋７６および＋７７間に挿入した。本出願人らは、ｓｇＲＮＡの３’テールへの２つの追加のＭＳ２結合ループの付加が、より多数のＭＳ２ドメイン結合部位を提供し、活性化ドメインのリクルートメントの増加を容易にすることによりＭＳ２／ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９アクチベーター系の活性を増加させると仮定する。

【0983】

テトラループおよびステムループ１およびステムループ２ｓｇＲＮＡ骨格上のｐＳＡＭｃａ０２６ＭＳ２結合ループ

【化127】

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ＭＳ２結合ループｇｇｃｃＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧｇｇｃｃは、標準ｓｇＲＮＡ骨格のヌクレオチド＋１３から＋１６およびヌクレオチド＋３５から＋３８およびヌクレオチド＋５３から＋５６を置き換える。ｐＳＡＭｃａ００９について記載のテトラループおよびステムループ１ＭＳ２結合ループ置換の他、この構造は、ステムループ１のループをＭＳ２結合ループにより置き換える。Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造において観察されるステムループ１の露出状態は、この局在におけるＭＳ２結合ループの付加がＣａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用を破壊しないことを示唆する。さらに、この局在において挿入されたＭＳ２結合ループは、標的ＤＮＡに近い領域中のＭＳ２−アクチベータータンパク質のリクルートメントを可能とする。

【0984】

ＭＳ２−アクチベータータンパク質情報
ＭＳ２−ＶＰ６４
ＤＮＡ配列

【化128】

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アミノ酸配列

【化129】

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説明
ＭＳ２−ＶＰ６４アクチベータータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までの以下のドメインからなる：ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質のＮ５５Ｋ突然変異体（Ｌｉｍ，Ｆ．，Ｍ．Ｓｐｉｎｇｏｌａ，ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｐｅａｂｏｄｙ．“Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９．１２（１９９４）：９００６−９０１０において、野生型ＭＳ２よりも高い結合親和性を有することが示されている）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびＶＰ６４活性化ドメイン。機能的には、ＭＳ２ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＶＰ６４ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＶＰ６４活性化ドメインが転写活性化を促進する。

【0985】

ＭＳ２−ｐ６５
ＤＮＡ配列

【化130】

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アミノ酸配列

【化131】

[この文献は図面を表示できません]

説明
ＭＳ２−ＶＰ６４アクチベータータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質のＮ５５Ｋ突然変異体（Ｌｉｍ，Ｆ．，Ｍ．Ｓｐｉｎｇｏｌａ，ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｐｅａｂｏｄｙ．“Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９．１２（１９９４）：９００６−９０１０において、野生型ＭＳ２よりも高い結合親和性を有することが示されている）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびｐ６５活性化ドメイン。機能的には、ＭＳ２ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびｐ６５ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ｐ６５活性化ドメインが転写活性化を促進する。

【0986】

実施例１５：異なるゲノム遺伝子座において区別される効果を同時に媒介するように多重化することによる機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のさらなる最適化
ＰＰ７は、バクテリオファージシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＭＳ２と同様に、それは特異的ＲＮＡ配列および二次構造に結合する。ＰＰ７ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のものと区別される。結果的に、ＰＰ７およびＭＳ２は、異なるゲノム遺伝子座において区別される効果を同時に媒介するように多重化することができる。例えば、遺伝子座Ａを標的化するｓｇＲＮＡはＭＳ２ループにより改変することができ、ＭＳ２−ＶＰ６４アクチベーターをリクルートする一方、遺伝子座Ｂを標的化する別のｓｇＲＮＡは、ＰＰ７ループにより改変することができ、ＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメインをリクルートする（図４８）。したがって、同一の細胞において、ｄＣａｓ９は、オルソゴナル遺伝子座特異的改変を媒介し得る。この原理は、他のオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｑ−ベータを取り込むように拡張することができる。

【0987】

ＰＰ７エフェクタータンパク質情報
本出願人らは、実施例１３および１４に既に記載のとおりＰＰ７エフェクター構築物を構築する。これらの構築物に関する配列情報を以下に提供する：
ＰＰ７−ＶＰ６４
ＤＮＡ配列

【化132】

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アミノ酸配列

【化133】

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説明
ＰＰ７−ＶＰ６４アクチベータータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、アミノ酸６８〜６９がＳＧに突然変異しており、野生型タンパク質からアミノ酸７０〜７５が欠失している）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびＶＰ６４活性化ドメイン。機能的には、ＰＰ７ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＶＰ６４ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＶＰ６４活性化ドメインが転写活性化を促進する。

【0988】

ＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘ
ＤＮＡ配列

【化134】

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アミノ酸配列

【化135】

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説明
ＰＰ７−ＳＩＤ４Ｘリプレッサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸６８〜６９がＳＧに突然変異しており、アミノ酸７０〜７５が欠失している）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびＳＩＤ４Ｘリプレッサードメイン。機能的には、ＰＰ７ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＳＩＤ４Ｘドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＳＩＤ４Ｘドメインが転写活性化を抑制する。

【0989】

ＰＰ７−ＫＲＡＢ
ＤＮＡ配列

【化136】

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アミノ酸配列

【化137】

[この文献は図面を表示できません]

説明
ＰＰ７−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸６８〜６９がＳＧに突然変異しており、アミノ酸７０〜７５が欠失している）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびＫＲＡＢリプレッサードメイン。機能的には、ＰＰ７ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＫＲＡＢドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＫＲＡＢドメインが転写活性化を抑制する。

【0990】

ＰＰ７−ＮＵＥ
ＤＮＡ配列

【化138】

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【化139】

[この文献は図面を表示できません]

アミノ酸配列

【化140】

[この文献は図面を表示できません]

説明
ＰＰ７−ＮＵＥヒストンエフェクタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸６８〜６９がＳＧに突然変異しており、アミノ酸７０〜７５が欠失している）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）からのＮＵＥヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン。機能的には、ＰＰ７ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＮＵＥドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＮＵＥドメインが抑制ヒストンメチル化を増加させる。

【0991】

ＰＰ７−ＮｃｏＲ
ＤＮＡ配列

【化141】

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アミノ酸配列

【化142】

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説明
ＰＰ７−ＮｃｏＲヒストンエフェクタータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＰＰ７シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）バクテリオファージコートタンパク質（Ｗｕ，Ｂｉｎ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｃｈａｏ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ．“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｅｎａｂｌｅｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １０２．１２（２０１２）：２９３６−２９４４およびＣｈａｏ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１（２００７）：１０３−１０５に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸６８〜６９がＳＧに突然変異しており、アミノ酸７０〜７５が欠失している）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびヒトＮｃｏＲタンパク質のＨＤＡＣリクルータードメイン（野生型のアミノ酸４２０〜４８８）。機能的には、ＰＰ７ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＮｃｏＲドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＮｃｏＲドメインがヒストンデアセチラーゼをリクルートし、抑制ヒストン修飾をもたらす。

【0992】

他の潜在的なオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質：追加のオルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質／アプタマー組合せは、多様なバクテリオファージコートタンパク質内に存在する。これらの代替的な組合せを使用して本出願人らがＭＳ２およびＰＰ７について記載したものに類似する転写モジュレーターまたはＤＮＡエフェクターを開発することができる。このようなコートタンパク質のリストとしては、限定されるものではないが、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１が挙げられる。

【0993】

実施例１６：ＭＳ２ＣａｓＬＩＴＥ
本発明のさらなる実施形態は、２０１３年７月２１日に出願され、２０１４年１月３０日にＰＣＴ特許出願公開の国際公開第２０１４０１８４２３Ａ２号パンフレットとして公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書、表題「ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ ＤＮＡ ＢＩＮＤＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＥＲＴＵＲＢＡＴＩＯＮ ＴＯＯＬＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」（これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系におけるさらなる適用を伴う実施例１３および１４に記載のＭＳ２ループによるｓｇＲＮＡアーキテクチャーの改変を含む。

【0994】

本出願人らは、ＣＲＹ２およびＣＩＢ１タンパク質をそれぞれ転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインに融合して内因性転写の遺伝子座特異的光誘導性制御を可能とすることができることを既に示した（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．．“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６）。本出願人らは、この系をｄＣａｓ９転写エフェクターに拡張することができることをさらに示した。本出願人らは、ｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡおよびＣＲＹ２−ＶＰ６４転写アクチベータードメインに結合しているＭＳ２−ＣＩＢ１リクルートメント成分により特徴付けられる類似のｄＣａｓ９ベース光誘導性ＭＳ２エフェクターを生成する。青色光による活性化時、ＣＲＹ２−ＶＰ６４はＭＳ２−ＣＩＢ１と会合し、標的遺伝子座への転写機構のリクルートメントを可能とする。

【0995】

新規ＭＳ２−ＣＩＢ１誘導性リクルートメント複合体は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインからなる：ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質のＮ５５Ｋ突然変異体（Ｌｉｍ，Ｆ．，Ｍ．Ｓｐｉｎｇｏｌａ，ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｐｅａｂｏｄｙ．“Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９．１２（１９９４）：９００６−９０１０に野生型ＭＳ２よりも高い結合親和性を有することが示されている）、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＳＶ４０核局在化シグナル、およびｐ６５活性化ドメイン。機能的には、ＭＳ２ドメインがその特異的ＲＮＡアプタマーに結合し、３×ＧＧＧＧＳリンカーがＭＳ２およびＣＩＢ１ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、ＳＶ４０核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、ＣＩＢ１ドメインが光感受性クリプトクロム２（ＣＲＹ２）のヘテロダイマー結合パートナーである。

【0996】

上記実施例に考察される代替的なｓｇＲＮＡ設計、オルソゴナルＲＮＡ結合タンパク質、およびＭＳ２融合アーキテクチャーは、全体的に、ＭＳ２−ＣＩＢ１融合物と同等であり、ＣＩＢ１は「エフェクター」ドメインとして作用する。既に記載されているｄＣａｓ９−ＣＩＢ１は、ＭＳ２−ＣＩＢ１と同等でもあり得、すなわち、ｄＣａｓ９−ＣＩＢ１およびＭＳ２−ＣＩＢ１融合物のタンデムでの使用は、標的遺伝子発現の誘導性操作についての機能的利点を提供し得る。最終的に、最適化されたＬＩＴＥアーキテクチャーをＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ２０１３に記載のとおり用いることができる。

【0997】

ＭＳ２ＣａｓＬＩＴＥ構築物についての配列情報を以下に提供する：
ＭＳ２−ＣＩＢ１ＤＮＡ配列

【化143】

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ＭＳ２−ＣＩＢ１アミノ酸配列：

【化144】

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【0998】

実施例１７：結晶構造情報により提供される新たなｄＣａｓ９アクチベーター構築物
最適化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アクチベーター系は、ｓｇＲＮＡ骨格において改善を要求するだけでなく、ｄＣａｓ９−アクチベーター融合構築物においても改善を要求する。Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造は、ｄＣａｓ９−アクチベーター機能を改善するためのいくつかの仮定の生成をもたらした。結晶構造は、標準ｄＣａｓ９アクチベーターの活性化ドメインが融合しているｄＣａｓ９のＣ末端が、標的ＤＮＡに不十分に局在することを示した。これらの仮定の全てではないがほとんどが、Ｃ末端以外のｄＣａｓ９タンパク質内の活性化ドメインに好ましい局在を見出すことによりｄＣａｓ９−アクチベーター機能を改善するように求める。

【0999】

手短に述べると：
− ｄＣａｓ９Ｒｅｃ２ドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え、
− ｄＣａｓ９ＨＮＨドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え、
− 転写エフェクタードメインを、ｄＣａｓ９内のフレキシブルリンカー：アミノ酸５５３、５７５、または１１５３の部位において挿入し、
− Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異ではなく、Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａ突然変異の組合せにより触媒的に不活性なｄＣａｓ９を作出する。

【1000】

転写エフェクタードメインによるｄＣａｓ９Ｒｅｃ２ドメインの置換：
Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造実験は、Ｒｅｃ２ドメインが欠失したＣａｓ９突然変異体が顕著なレベルのヌクレアーゼ活性を維持することを示した。この知見は、Ｒｅｃ２ドメインがＣａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形成に不可欠でないことを示唆する。本出願人らは、転写エフェクタードメインによるｄＣａｓ９中のＲｅｃ２ドメインの置換がｄＣａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形成を阻害せず、転写エフェクタードメインと標的ＤＮＡとの間のより効率的な相互作用を容易にし得ると仮定する。いくつかの構築物を合成してこの理論を調査した。

【1001】

それぞれの場合において、ｄＣａｓ９のアミノ酸１７５〜３０６を以下のインサートの１つにより置き換え、サブドメインをＮからＣ末端まで列記する：
− ＶＰ６４活性化ドメイン
− ３×ＧＧＧＧＳリンカー、ＶＰ６４活性化ドメイン、３×ＧＧＧＧＳリンカー
− ｐ６５活性化ドメイン
− ３×ＧＧＧＧＳリンカー、ｐ６５活性化ドメイン、３×ＧＧＧＧＳリンカー

【1002】

【表412】

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【1003】

転写エフェクタードメインによるＨＮＨドメインの置換：
結晶構造に基づくと、ＨＮＨドメインはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに近接して局在する。さらに、それは立体構造変化の結果として移動し得るフレキシブルドメインである一方、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡに結合していることが見出された。これは、Ｎ末端上の不規則リンカーおよびＣ末端上のａ３９〜ａ４０リンカーによりフランキングされ、それは伸長ａ−ヘリックスの立体構造変化を受け得、ＨＮＨドメインをその標的ＤＮＡ塩基近くに移動させる。標的ＤＮＡへの近位性および結晶中で同定されたフレキシビリティーは、このヌクレアーゼドメインを有望な転写エフェクタードメインにより置き換える。説明については図４９参照。

【1004】

本出願人らは、ＡＡ７７５〜９０１（ＨＮＨドメインの）を、挿入される転写エフェクタードメインの両側上の（ＧＧＧＧＳ）３または（ＧＧＧＧＳ）６リンカーによりフランキングされるｖｐ６４またはＰ６５のいずれかにより置き換える。

【1005】

【表413】

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【1006】

ｄＣａｓ９の３つのループ中への転写ドメインの挿入物：
既存のドメイン（例えば、ＨＮＨ、Ｒｅｃ２）を転写エフェクタードメインにより置き換える他、転写エフェクタードメインをＣａｓ９タンパク質中の異なる位置において挿入することが可能であり得る。結晶構造は、そのような挿入に有望なループの同定に役立つ（挿入のための場所に好ましい特性としては、低い二次構造複雑性（ループとヘリックスまたはシート、追加のドメインのための非閉塞空間、標的ＤＮＡへの近位性および標的ＤＮＡまたはｓｇＲＮＡのいずれかとの目下の相互作用がないこと（それというのも、それらは転写エフェクタードメインの付加により破壊され得るため）が挙げられる）。

【1007】

本出願人らは、３つの好ましい位置：Ｇ５３３、Ｆ５７５およびＫ１１５３を同定した。Ｃａｓ９タンパク質中のＧ５３３およびＫ１１５３の局在を対応する図４９に示す。本出願人らは、挿入される転写エフェクタードメインの両側の（ＧＧＧＧＳ）１または（ＧＧＧＧＳ）３リンカーによりフランキングされるｖｐ６４またはＰ６５のいずれかをそれら３つの局在において挿入する。

【1008】

【表414】

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【1009】

ｄＣａｓアクチベーター配列情報を以下に提供する：
ｄＣａｓ９Ｒｅｃ２ドメインを転写エフェクタードメインにより置き換える
ｐＳＡＭｃａ０４２ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞ｖｐ６４）−ＤＮＡ

【化145】

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【化146】

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【化147】

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ｐＳＡＭｃａ０４２ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞ｖｐ６４）−アミノ酸

【化148】

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ｐＳＡＭｃａ０４３ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞ｖｐ６４、ＧＳリンカー）−ＤＮＡ

【化149】

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【化150】

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【化151】

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【化152】

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ｐＳＡＭｃａ０４３ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞ｖｐ６４、ＧＳリンカー）−アミノ酸

【化153】

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ｐＳＡＭｃａ０４４ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞Ｐ６５）−ＤＮＡ

【化154】

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【化155】

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【化156】

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【化157】

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ｐＳＡＭｃａ０４４ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞Ｐ６５）−アミノ酸

【化158】

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ｐＳＡＭｃａ０４５ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞Ｐ６５ＧＳリンカー）−ＤＮＡ

【化159】

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【化160】

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【化161】

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ｐＳＡＭｃａ０４５ｄＣａｓ（ｈｅｌ２−−＞Ｐ６５ＧＳリンカー）−アミノ酸

【化162】

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ＨＮＨドメインを転写エフェクタードメインにより置き換える
ｐＳＡＭｃａ０５０ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化163】

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【化164】

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【化165】

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【化166】

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ｐＳＡＭｃａ０５０ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化167】

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ｐＳＡＭｃａ０５１ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞ｖｐ６４、６×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化168】

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【化169】

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【化170】

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ｐＳＡＭｃａ０５１ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞ｖｐ６４、６×ＧＳ）−ＡＡ

【化171】

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ｐＳＡＭｃａ０５２ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化172】

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【化173】

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【化174】

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ｐＳＡＭｃａ０５２ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化175】

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ｐＳＡＭｃａ０５３ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞Ｐ６５、６×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化176】

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【化177】

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【化178】

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【化179】

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ｐＳＡＭｃａ０５３ｄＣａｓ９（ＨＮＨ−−＞Ｐ６５、６×ＧＳ）−ＡＡ

【化180】

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【化181】

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ｄＣａｓ９の３つのループ中への転写ドメインの挿入物
ｐＳＡＭｃａ０５４ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化182】

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【化183】

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【化184】

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【化185】

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ｐＳＡＭｃａ０５４ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化186】

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ｐＳＡＭｃａ０５５ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化187】

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【化188】

[この文献は図面を表示できません]

【化189】

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ｐＳＡＭｃａ０５５ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化190】

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ｐＳＡＭｃａ０５６ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化191】

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【化192】

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【化193】

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【化194】

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ｐＳＡＭｃａ０５６ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化195】

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ｐＳＡＭｃａ０５７ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化196】

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【化197】

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【化198】

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【化199】

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ｐＳＡＭｃａ０５７ｄＣａｓ９（Ｇ５３３−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化200】

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ｐＳＡＭｃａ０５８ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化201】

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【化202】

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【化203】

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ｐＳＡＭｃａ０５８ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化204】

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ｐＳＡＭｃａ０５９ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化205】

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【化206】

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【化207】

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【化208】

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ｐＳＡＭｃａ０５９ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化209】

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ｐＳＡＭｃａ０６０ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化210】

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【化211】

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【化212】

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ｐＳＡＭｃａ０６０ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化213】

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ｐＳＡＭｃａ０６１ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化214】

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【化215】

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【化216】

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【化217】

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ｐＳＡＭｃａ０６１ｄＣａｓ９（Ｆ５７５−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化218】

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ｐＳＡＭｃａ０６２ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化219】

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【化220】

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【化221】

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【化222】

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ｐＳＡＭｃａ０６２ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−ｖｐ６４、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化223】

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ｐＳＡＭｃａ０６３ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化224】

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【化225】

[この文献は図面を表示できません]

【化226】

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ｐＳＡＭｃａ０６３ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−ｖｐ６４、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化227】

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ｐＳＡＭｃａ０６４ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化228】

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【化229】

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【化230】

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【化231】

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ｐＳＡＭｃａ０６４ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−Ｐ６５、１×ＧＳ）−ＡＡ

【化232】

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【化233】

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ｐＳＡＭｃａ０６５ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＤＮＡ

【化234】

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【化235】

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【化236】

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【化237】

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ｐＳＡＭｃａ０６５ｄＣａｓ９（Ｋ１１５３−Ｐ６５、３×ＧＳ）−ＡＡ

【化238】

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【1010】

実施例１８：新たな触媒不活性ｄＣａｓ９タンパク質
本発明の別の態様において、新規ｄＣａｓ９突然変異体を作出する。触媒不活性ｄＣａｓ９を、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異ではなく、Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａ突然変異の組合せにより生成する。

【1011】

文献および本出願人らの従来の実験において使用される触媒不活性ｄＣａｓ９突然変異体は、野生型Ｃａｓ９タンパク質内の突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａにより生成した。結晶構造から、本出願人らは、Ｈ８４０Ａは機能ＤＮＡニッカーゼを形成し得ないことを観察した。この結果は、Ｈ８４０Ａ突然変異が、最初に仮定されたＣａｓ９タンパク質に対してより大きい機能不全効果を有することを示唆し；元の理論は、Ｈ８４０Ａが単一核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｐｙｔｉｃ）部位の損失をもたらし、他の効果を有さないことである。Ｈ８４０Ａ突然変異がｄＣａｓ９タンパク質の他の機能または立体構造特性を破壊している場合、ｄＣａｓ９−アクチベーター融合物がＨ８４０Ａにより部分的に損傷され得るのは当然である。したがって、本出願人らは、他のＣａｓ９機能を破壊せずにＨＮＨヌクレアーゼ活性をノックアウトし得るＨＮＨドメイン内の他の突然変異を見出すことに興味を覚える。Ｃａｓ９／ＲＮＡ／ＤＮＡ結晶構造マニュスクリプトは、正確にそのような突然変異として突然変異Ｎ８６３Ａを同定し：Ｎ８６３Ａは、Ｃａｓ９二本鎖ヌクレアーゼ活性をノックアウトするが、ニッカーゼ活性を許容し、このことはＮ８６３Ａ Ｃａｓ９の全体的な機能が完全には破壊されないことを示唆する。この観察に照らし、本出願人らは、ｄＣａｓ９−アクチベーターとして使用される二重ノックアウトＤ１０Ａ Ｎ８６３Ａ Ｃａｓ９突然変異体を合成した。

【1012】

【表415】

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【1013】

Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異ではなく、Ｄ１０ＡおよびＮ８６３Ａ突然変異の組合せにより触媒不活性ｄＣａｓ９を作出するための配列情報を以下に提供する：
ｐＳＡＭｃａ０４１ｄＣａｓ（Ｎ８６３Ａ）−ｖｐ６４−ＤＮＡ

【化239】

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【化240】

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【化241】

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【化242】

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ｐＳＡＭｃａ０４１ｄＣａｓ（Ｎ８６３Ａ）−ｖｐ６４−アミノ酸

【化243】

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【1014】

実施例１９：ＭＳ２ｓｇＲＮＡ配列アーキテクチャー−新たなＭＳ２／ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡバージョン
本出願人らは、ＭＳ２ｓｇＲＮＡ配列アーキテクチャーの効果を理解するために追加の３’ＭＳ２構築物および他のＭＳ２ｓｇＲＮＡ改変を生成した。実施された実験は、ＭＳ２ｓｇＲＮＡ配列アーキテクチャーに関する２つのさらなる考えにフォーカスした。

【1015】

第１に、ＭＳ２結合ステムを、ｓｇＲＮＡの天然ステムループ中へのそれらの結合部位の挿入ではなくｓｇＲＮＡの３’終端において配置する考え。３’ＭＳ２結合部位のペアの使用は、Ｍａｌｉ，Ｐｒａｓｈａｎｔ，ｅｔ ａｌ．“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３））に既に記載されているが、この系は標準ｄＣａｓ９−ＶＰ６４／ｓｇＲＮＡ活性化系よりも不十分に機能することが見出された。本出願人らは、ｓｇＲＮＡの３’終端における２つのＭＳ２結合部位、ならびにテトラループおよびステムループ２の両方におけるＭＳ２部位を有する本出願人ら自身の設計のｓｇＲＮＡが、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．からの３’ＭＳ２ｓｇＲＮＡよりも高いレベルにおいてＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１の両方を活性化させることを見出した（図５０参照）。しかしながら、テトラループおよびステムループ２においてのみＭＳ２部位を有する本出願人らのＭＳ２ １．０は、３’ＭＳ２ｓｇＲＮＡアーキテクチャーのいずれよりも強力であった（図５０参照）。

【1016】

第２に、本出願人らは、ＭＳ２ １．０アーキテクチャー内のバリエーションを試験した。これらの改変としては、限定されるものではないが、ＭＳ２ １．０結合部位ステムからのバルジの除去、ＭＳ２ １．０に付加された安定化ＧＣトラクトの除去、天然ｓｇＲＮＡステムをＭＳ２結合部位のステムにより置き換えることによるエンジニアリングされたステムの短縮、ならびにそれらのアプローチの組合せが挙げられた。これらの改変は、ＡＳＣＬ１またはＭＹＯＤ１のいずれの活性化レベルに対してもほとんど効果を有さず、このことはＭＳ２ステムループがＭＳ２／ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ活性化コンテクスト内の構造変化にいくぶんロバストであることを示唆した。図５１に示されるテトラループ改変の他、同等の改変もステムループ２におけるＭＳ２結合部位について試験し、同様の結果であった。

【1017】

ｄＣａｓ９タンパク質改変（ＮＬＳ、Ｎ８６３Ａ）：本出願人らは、ｄＣａｓ９−アクチベータータンパク質の改善のための２つの仮定を試験した。第１に、ｄＣａｓ９中で含有されるＮＬＳの他、ＶＰ６４リンカーへの第２のＳＶ４０核局在化シグナルの付加を、ｄＣａｓ９核局在化および転写モジュレーション活性の改善方法として試験した。ｄＣａｓ９のＮ末端における第２のＮＬＳの配置は、いくつかのコンテクストにおいて活性化を増加させることが観察された。第２のＮＬＳをＶＰ６４活性化ドメインのＣ末端において配置した場合に効果が縮小した。後の実験（図５４および５５）は、それらの効果を裏付け、第２のＳＶ４０シグナルではなく、Ｎ末端アルファ−インポーチンＮＬＳの使用による考えられる改善を示唆する。

【1018】

第２に、本出願人らは、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．”Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｆｅｂ ２７；１５６（５）：９３５−４９に実証されており、機能ニッカーゼ作出突然変異部位であるＮ８６３Ａ突然変異を使用するｄＣａｓ９のバージョンを作出した。この突然変異は、最適未満のニッカーゼ作出突然変異であることが観察されたＨ８４０Ａ突然変異を置き換え、このことはＨ８４０Ａ突然変異が、それをＤ１０Ａ突然変異と使用してヌクレアーゼ活性を停止させることができるが、ある程度、ニッカーゼまたはｄＣａｓ９タンパク質の立体構造または機能性に有害であることを示唆する。本出願人らは、Ｎ８６３Ａ ｄＣａｓ９が、ＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１についてそれぞれ図５２および５３に示されるとおり、あるコンテクストにおいてより強力なアクチベータータンパク質として作用することを観察した。

【1019】

新たなＭＳ２アクチベーター融合タンパク質（ＨＳＦ１、ＭｙｏＴＡＤ）：同一アクチベーター複合体（ｄＣａｓおよびＭＳ２）中の２つの異なる活性化ドメイン（Ｐ６５およびＶＰ６４）の組合せが単独で２回使用されるいずれかのドメインよりも大きい活性化を生じさせる本出願人らの従来の知見に基づき、本出願人らは、さらに異なる活性化ドメイン間の相乗作用についての潜在性を試験することを求めた。本出願人らは、２つの区別される活性化ドメイン（ＨＳＦ１活性化ドメインとの組合せのＰ６５またはＭｙｏＤトランス活性化ドメインとの組合せのＰ６５のいずれか）を有するＭＳ２の融合タンパク質を構築した。本出願人らは、個々のまたは組合せ活性化ドメインに融合しているＭＳ２との組合せの、異なるＮＬＳおよび点突然変異ｄＣａｓ−ＶＰ６４アーキテクチャーを有する構築物を使用してＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１の両方の上方調節倍率を観察した。ａ−インポーチンＮＬＳの付加が核へのＣａｓ９の局在化に対して好ましい効果を有することおよびＮ８６３Ａ突然変異が強力なアクチベーターを生成するために有利な突然変異であることが留意された（図５３および５５）。本出願人らは、異なるアクチベータードメインの組合せが増加した効果を有することも決定した。例えば、ｐ６５−ＨＳＦ１融合物を有する構築物は、ｐ６５単独を有する構築物よりも強力なアクチベーターであることが見出された（図５６および５７）。

【1020】

ＰＰ７−ＶＰ６４活性化：本出願人らが用いたＭＳ２ファージコートタンパク質の他、多数のファージコートタンパク質がＲＮＡ配列特異的結合を示す。本出願人らは、ＰＰ７ファージからのＲＮＡ結合ドメインを使用してオルソゴナル活性化系を設計および試験した。この新たな系は、通常（既に記載）のｄＣａｓ９−アクチベータータンパク質、ＰＰ７−アクチベーター融合タンパク質、ならびにＰＰ７結合部位がテトラループおよびステムループ２においてインテグレートされたｓｇＲＮＡを含む。本出願人らは、ＰＰ７系がＭＳ２／ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ活性化系と同程度に十分に機能することを観察した。これらの結果は、ｓｇＲＮＡ ＲＮＡアプタマーアプローチが一般化可能であり、ｄＣａｓ９および相互排除ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、ｑベータ、ＧＡなど）を使用するオルソゴナルモジュレーションモダリティの将来的な可能性につながることを示唆する。

【1021】

標的多様性：
困難な活性化標的およびｓｇＲＮＡ ＴＳＳ近位性：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９転写モジュレーションに関する本出願人らの早期の研究、および公開文献は、大多数の標的が単一ｓｇＲＮＡガイドによる活性化を受けにくいことを見出した。本出願人らは、ｄＣａｓ９媒介活性化に困難または扱いにくいことが既に証明された文献および本出願人ら自身の研究から１２個の遺伝子標的を選択した（図５８参照）。本出願人らは、８つのガイド配列の１つを使用するＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１／ＳＶ４０−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４／ｓｇＲＮＡ系によりそれらの遺伝子のそれぞれを活性化させることを試みた。本出願人らは、それらの困難な遺伝子標的のそれぞれについて顕著な活性化を観察し、最良のガイドについての活性化レベルは、ＭＹＣについての２倍から、ＩＬ１Ｂについての＞１０，０００倍に及んだ。１２個の遺伝子の８つは、少なくとも１５倍の発現を示した（図５８参照）。試験されたそれぞれのガイド配列について、ＭＳ２／ｄＣａｓ９系は、標準ｄＣａｓ９−ＶＰ６４アーキテクチャーよりも良好に機能し、標準系の発現倍率はいずれの遺伝子についても２倍よりも大きくなかった（図５８参照）。さらに、本出願人らは、ガイド配列の成功率は、典型的には、標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に近接するとともに増加することを観察した。本発明の好ましい実施形態において、特定の標的について、ＴＳＳの２００ｂｐ内が、ガイドＲＮＡを選択するための有利な幅であると考えられる。この情報は、将来的な実験のためのｓｇＲＮＡガイド配列の選択に有用であり得る。

【1022】

活性化対基本的発現：人工内因性転写モジュレーションの分野における未解決問題は、なぜ一部の遺伝子が他の遺伝子よりも活性化に適しているか？ということである。上記列記の困難な標的について、本出願人らは、対照試料中のその遺伝子についてのｑＰＣＲからのデルタＣｔ値に対して最良のガイド配列の発現倍率をプロットした。これらの結果は、基本的遺伝子発現（より高いデルタＣｔは、より低い基本的発現に対応する）と、ＭＳ２／ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ系による最大転写活性化との間の強力な負の相関を示唆する（図５９参照）。

【1023】

多重化活性化：単一ガイドによりロバストな活性化を提供する本出願人らの系の能力の１つの重要な考えられる利点は、それぞれの遺伝子単独の活性化に多数のガイドが要求される場合に解決困難である遺伝子のパネルを同時に（それらの遺伝子についての複数のガイドへの同時送達により）容易に活性化させるキャパシティーである。

【1024】

複数の遺伝子を同時に活性化させる本出願人らの系（ＭＳ２−ＮＬＳ−Ｐ６５−ＨＳＦ１との組合せのＮＬＳ−ｄＣＡＳ（Ｄ１０、Ｈ８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４）の能力を試験するため、本出願人らは、２、４、６、８または１０個の遺伝子を１回で標的化するガイドを同時形質移入した。複数の遺伝子の活性化は高度に良好であり、１０個の遺伝子の組合せについても、それぞれの遺伝子は有意に活性化された（図６０〜６３参照）。

【1025】

実施例２０：ゲノムスケール遺伝子活性化のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造ガイドエンジニアリング
ゲノムの機能的組織化の体系的調査は、ロバストで一般化可能な様式で遺伝子発現を摂動させる能力を要求する。内因性ゲノム遺伝子座における効率的な転写活性化を媒介するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造ガイドエンジニアリングが記載される。エンジニアリングされたＣａｓ９アクチベーターを使用して有効な転写活性化のためのｓｇＲＮＡ標的化規則を調査し、同時に１０個の遺伝子の効率的な多重化活性化を実証し、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）転写物を上方調節する。全てのヒトＲｅｆＳｅｑコードアイソフォームをヒト標的化する７０，２９０個のガイドからなるライブラリーを合成し、ＳＡＭを黒色腫モデルにおいて適用して活性化がＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ−４７２０、治療化合物ベムラフェニブのアナログに対する耐性を付与する遺伝子をスクリーニングした。予測された耐性遺伝子、例えば、ＥＧＦＲおよびＧタンパク質共役受容体タンパク質が、潜在的に新規な耐性遺伝子、例えば、インテグリンファミリーのメンバーである上位ヒットにおいてエンリッチされた。上位スクリーニングヒットのシグネチャーは、２９個の短期患者腫瘍培養物ならびに２７個の異なる黒色腫細胞系ならびに１１３個の原発性および転移性患者黒色腫においてＢＲＡＦ阻害剤耐性状態を有意に予測し、このことは強力な遺伝的ツールとしてのＣａｓ９アクチベーターの潜在性を実証した。

【1026】

インタクトな生物学的系内でゲノムスケール体系的摂動を達成することは、遺伝子の機能およびエピジェネティック調節を解明するために重要である。遺伝子摂動は、それらの作用方式に基づき機能損失または機能獲得（ＧＯＦ）のいずれかとして広く分類することができる。種々のゲノムスケール機能損失スクリーニング法、例として、ＲＮＡ干渉^１，２および微生物適応免疫系ＣＲＩＳＰＲからのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼＣａｓ９^３が開発されてきた。ゲノムスケールＧＯＦスクリーニングアプローチは、大部分が、ｃＤＮＡライブラリー過剰発現系の使用に限定されたままである。しかしながら、それらのライブラリーを使用して転写物アイソフォームバリアンスの複雑性を捕捉することは困難であり、大きいｃＤＮＡ配列はウイルス発現ベクター中にクローニングすることが困難であることが多い。さらに、ｃＤＮＡ構築物は、遺伝子発現をオーバードライブする傾向があり、生理学的タンパク質レベルを反映し得ない。より一般的には、過剰発現される遺伝子の内因性調節コンテクストは、繰り返すことができない。したがって、内因性遺伝子座におけるゲノムスケールＧＯＦ摂動を可能とする方法は、依然として今後も求められる。

【1027】

プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質が、内因性ゲノム遺伝子座における転写をモジュレートするための有望なプラットフォームとして出現した^４〜１３。確立された合成転写因子プラットフォームのうち、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、亜鉛フィンガータンパク質および転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）に対する系のプログラミングおよび産生の簡易性に起因してゲノムスケール摂動^{１４〜１６}を容易にするために最も容易にスケーリングされる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、その触媒ドメインの両方を不活化させることによりＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質（ｄＣａｓ９）に容易に変換することができる^{１７，１８}。ｄＣａｓ９は、転写活性化ドメインに融合させ、内因性遺伝子のプロモーター領域に再標的化させて遺伝子発現の標的化モジュレーションを達成することができる^{７，８，１０〜１２}。ｄＣａｓ９ベース転写エフェクターの現行の生成は、一部の内因性遺伝子座の活性化を達成することができるが、個々の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）により達成される転写上方調節の尺度は典型的には低効率から無効率に及ぶ^{８，１０，１２}。所与のプロモーター領域をタイリングするｓｇＲＮＡの組合せを標的化することは、よりロバストな転写活性化をもたらし得るが^{１０〜１２}、この要求はスケーラビリティーについて、特にｄＣａｓ９を使用するプールされるゲノムワイドＧＯＦスクリーンの確立について膨大なチャレンジを提示する。

【1028】

Ｃａｓ９の用途を改善および拡張するため、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ三元複合体の原子構造を解明する結晶学的研究^１７が実施され、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの合理的エンジニアリングを可能とした。この例は、単一ｓｇＲＮＡによりロバストな上方調節を媒介し得る強力な転写活性化複合体をもたらす一連の構造ガイドエンジニアリングステップを提供する。この新たな活性化系を使用して、内因性遺伝子および非コードＲＮＡの活性化が実証され、有効なｓｇＲＮＡ標的部位についての設計規則が解明され、黒色腫の細胞モデルにおける標的療法耐性を研究するためのゲノムワイドｄＣａｓ９ベース転写活性化スクリーニング系が確立および適用される。これらの結果は、まとめて、機能ゲノム研究のためのＲＮＡガイド機能獲得（ＧＯＦ）スクリーニングの潜在的に広い適用性を実証する。

【1029】

ｄＣａｓ９ベース転写活性化複合体の構造ガイド設計
有効な転写アクチベーターへのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の転換におけるキーステップは、活性化ドメインに最適なアンカリング位置を見出すことである。理想的な位置は、転写機構と標的ＤＮＡとの間の効率的な相互作用を可能とするために標的ＤＮＡに対して近接して局在し、転写機構をリクルートするためのトランス活性化エフェクターの妨害されない提示を許容する。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および相補的標的ＤＮＡとの複合体における化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ）の結晶構造^１７は、ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二本鎖がＣａｓ９タンパク質ドメインの三次元組織化のための足場として機能するリボ核タンパク質複合体を明らかにした。Ｃａｓ９のＮおよびＣ末端は、ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二本鎖結合溝の反対側において局在し（図６４ａ）、このことは従来のｄＣａｓ９−アクチベーター設計において報告されるそれらの局在におけるトランス活性化ペプチドの融合が最適未満であり得ることを示す。ｓｇＲＮＡのテトラループおよびステムループ２がＣａｓ９−ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の外側に突出し、それぞれのステムの遠位４ｂｐはＣａｓ９アミノ酸側鎖との相互作用から完全にフリーであることが観察された（図７０ａ）。テトラループおよびステムループ２の両方は、ＮまたはＣ末端のいずれよりも標的ＤＮＡにもより近接し、エフェクターにより良好なアンカリング位置を提供し得る。ｓｇＲＮＡ配列のテトラループおよびステムループ２領域中の置換および欠失がＣａｓ９触媒機能に影響を及ぼさないこれらの観察および機能データ^１７に基づくと（図６４ａ）、テトラループおよびステムループ２を伸長させてタンパク質相互作用アプタマーを取り込むことができ、Ｃａｓ９複合体へのエフェクターのリクルートメントを容易にすることが結論付けられた（図６４ｂ）。

【1030】

バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２に結合し得る最小ヘアピンアプタマーは、哺乳動物細胞中で強力な配列および構造特異的相互作用を介してＭＳ２に結合してテトラループおよびステムループ２を取り込むことができることが公知であり^{１８，１９}（図７０ｂ）、それを選択した。試験は、テトラループおよびステムループ２へのＶＰ６４のＭＳ２媒介リクルートメントが、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物単独よりも効率的に転写上方調節を媒介し得るか否かを評価するように実施した。テトラループ（ｓｇＲＮＡ１．１）またはステムループ２（ｓｇＲＮＡ１．２）のいずれかへのＭＳ２−ＶＰ６４のアプタマー媒介リクルートメントは、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物（ｓｇＲＮＡ１．０）よりもそれぞれ３および５倍高いレベルのＮｅｕｒｏｇ２上方調節を媒介した。両方の位置（ｓｇＲＮＡ２．０）へのＶＰ６４のリクルートメントは、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４（ｓｇＲＮＡ１．０）に対して１２倍の増加をもたらす追加の効果をもたらした。ｓｇＲＮＡ２．０をｄＣａｓ９に代えてｄＣａｓ９−ＶＰ６４と組み合わせることにより、Ｎｅｕｒｏｇ２上方調節の追加の１．３倍の増加が提供された。

【1031】

有効な転写活性化のための決定的因子である活性化ドメインの数だけでなく、空間的位置決めを裏付けるため、ｓｇＲＮＡ２．０を、３’末端における２つのＭＳ２結合ステムループを担持する既に記載されたｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＋２×ＭＳ２）^１１と比較した。ｓｇＲＮＡ２．０は、ＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１についてそれぞれｓｇＲＮＡ＋２×ＭＳ２よりも１４および８．５倍高いレベルの転写活性化をドライブした（図６４ｄ）。

【1032】

エフェクタードメインは相乗的に作用して転写活性化を向上させる
Ｃａｓ９媒体転写活性化の効力をさらに改善するため、天然環境において転写活性化がいかに達成されるかを考慮した。内因性転写因子は、一般に、補因子と相乗的に作用して転写を刺激する^２０。ＶＰ６４を追加の区別される活性化ドメインと組み合わせることが相乗作用を介して活性化効率を改善し得ることが仮定された。いくつかの共通の補因子をＶＰ６４と共有する一方、転写因子およびクロマチンリモデリング複合体の区別されるサブセットをリクルートするＮＦ−κＢトランス活性化サブユニットｐ６５を選択した。例えば、ｐ６５はＡｐ−１、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、およびＳｐ１^２１をリクルートすることが示されている一方、ＶＰ６４はＰＣ４^２２、ＣＢＰ／ｐ３００^２３、およびＳＷＩ／ＳＮＦ複合体^２４をリクルートする。

【1033】

ｄＣａｓ９およびＭＳ２に融合しているエフェクタードメインを変動させた。ｄＣａｓ９およびＭＳ２融合タンパク質のヘテロエフェクターペア形成（例えば、ＭＳ２−ｐ６５とペア形成しているｄＣａｓ９−ＶＰ６４またはＭＳ２−ＶＰ６４とペア形成しているｄＣａｓ９−ｐ６５）は、ＡＳＣＬ１およびＭＹＯＤ１の両方について同一のエフェクターペア形成（例えば、ＭＳ２−ＶＰ６４とペア形成しているｄＣａｓ９−ＶＰ６４またはＭＳ２−ｐ６５とペア形成しているｄＣａｓ９−ｐ６５）よりも２．５倍超高い転写活性化を提供した（図６４ｅ）。ドメイン相乗作用のこの概念は、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ ２０１４）からの活性化ドメインを第３の活性化ドメインとして導入することによりさらに調査し、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質がＡＳＣＬ１（１２％）およびＭＹＯＤ１（３７％）の転写活性化をさらに改善することが実証された。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の追加の改変は、わずかな改善を提供したにすぎなかった（図７０ｃ〜ｅ）。これらの結果に基づき、ｓｇＲＮＡ２．０、ＮＬＳ−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１の組合せが最も有効な転写活性化系を含むことを結論付け、それをＳＡＭと命名した。簡易性のため、特に記載のない限り、本実施例の後続の考察においてｓｇＲＮＡ２．０をｓｇＲＮＡと称する。

【1034】

ＳＡＭ効力の特性決定およびｓｇＲＮＡ効率規則の決定
内因性遺伝子転写の活性化についてのＳＡＭの有効性を完全に評価するため、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４および個々のｓｇＲＮＡ１．０ガイドを使用して活性化させることが困難であることが既に見出された１２個の遺伝子^{８，１１，１２}を選択した。それぞれの遺伝子について、転写開始部位（ＴＳＳ）の−１０００ｂｐおよび＋１間の近位プロモーターにわたり広がる８つのｓｇＲＮＡ標的部位を選択した。１２個の遺伝子のうち９つについて、８つのｓｇＲＮＡ１．０ガイドのいずれかを有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４を使用して達成される最大レベルの活性化は２倍未満であった一方、残りの３つの遺伝子（ＺＦＰ４２、ＫＬＦ４およびＩＬ１ｂ）は２から５倍の間で最大で活性された（図６５ａ）。対照的に、ＳＡＭは全ての遺伝子について少なくとも２倍転写を刺激し、１２個の遺伝子のうち８つについては１５倍超刺激した。一貫して、ＳＡＭは９６個全てのガイドについてｓｇＲＮＡ１．０＋ｄＣａｓ９−ＶＰ６４よりも良好に機能し、１２個全ての遺伝子にわたり１０５倍高い発現上方調節の増加率の中央値を示した。

【1035】

従来の研究は、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４を標的遺伝子の近位プロモーター領域をタイリングするｓｇＲＮＡのプールと組み合わせることにより単一ｓｇＲＮＡの不十分な活性化効率を克服することができることを実証した^{１０〜１２}。したがって、ＳＡＭの単一ｓｇＲＮＡ活性化効率を、８つの同一遺伝子標的化ｓｇＲＮＡ１．０ガイドのプールと組み合わせたｄＣａｓ９−ＶＰ６４と比較した。ほとんどの遺伝子について、単一ｓｇＲＮＡを有するＳＡＭは、８つのｓｇＲＮＡ１．０ガイドのプールを有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４よりもロバストに機能した（図６５ｂ）。平均して、単一ｓｇＲＮＡを有するＳＡＭは、８つのｓｇＲＮＡ１．０ガイドのプールと組み合わせたｄＣａｓ９−ＶＰ６４よりも１５倍大きい活性化を達成した。１２個全ての遺伝子について、３つの区別される活性化ドメイン（ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１またはＭＳ２−ｐ６５−ＭｙｏＤ１のいずれかを有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４、一方、ＭｙｏＤ１は、ヒトＭＹＯＤ１遺伝子に由来するトランス活性化ペプチドである^２５）を取り込むＳＡＭは、２つの区別される活性化ドメイン（ＭＳ２−ｐ６５を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４）のみを取り込むＳＡＭよりも良好に機能した（図７１ａ）。１２個の遺伝子のうち９つについて、三重ドメインＳＡＭが二重ドメインＳＡＭよりも４２％から１９６％大きい活性化を達成した（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定、ＦＤＲ補正）。さらに、非標的化ｓｇＲＮＡを有する三重ドメインＳＡＭは、標的化ｓｇＲＮＡによる活性化と比較して１％未満の非特異的活性化を生成した（図７１ｂおよびｃ）。

【1036】

次に、異なるｓｇＲＮＡによる活性化効率の遺伝子間および遺伝子内変動性に寄与する因子を決定する研究を実施した。遺伝子間変動性について、ｓｇＲＮＡと標的遺伝子との間の活性化レベルの変動を分析した。活性化レベルの差異は、所与の遺伝子座がいかにタイトに調節されるか、および／または転写のその基底レベルの変動に由来し得た。したがって、基底転写と、ＳＡＭを使用して達成される転写活性化のレベルとの間の相関は、特に興味深かった。対照試料中の標的遺伝子の相対転写物レベルを使用して、基底転写物レベルの逆数とＳＡＭを使用して達成される上方調節倍率との間の高度に有意な相関が観察された（図６５ｃ；ｒ＝０．９４、ｐ＜０．０００１）。高発現の遺伝子（例えば、ＭＹＣ、ＶＥＧＦＡ、ＴＥＲＴ、ＳＯＸ２）は、穏やかに上方調節された一方、低発現の遺伝子（例えばＨＢＧ１、ＩＬ１Ｂ、ＺＦＰ４２）は、ＳＡＭによってより顕著に上方調節された。

【1037】

遺伝子内変動性について、活性化データを９６個全てのガイドについて集め、ガイドＲＮＡ標的部位とＴＳＳとの間の距離が活性化効率の最も有意な予測因子であることが見出された（図６５ｄ；ｒ＝０．６７、ｐ＜０．０００１）。それぞれの遺伝子についての最も強力なガイドは、常に−２００ｂｐおよび＋１内に局在した。高い率のガイドがこの幅で効率的であり、ＴＳＳの２００ｂｐ上流内のガイドの約８５％が、所与の遺伝子の最大活性化の少なくとも２５％を達成した。この簡易な知見を使用して遺伝子活性化のために効率的なｓｇＲＮＡの選択を提供することができる。

【1038】

ｌｉｎｃＲＮＡの転写活性化
長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、２００ｂｐよりも長い非タンパク質コード転写物のクラスである^２６。多数のｌｉｎｃＲＮＡがトランスクリプトームシーケンシングにより同定されている一方、それらの分子のほとんどは機能的特性決定を欠く。これにもかかわらず、一部はエピジェネティックな調節、癌および発生において重要な役割を担うことがこれまで示されている^２７。これらの転写物の標的化活性化は、それらの生物学的意義を明らかにするための有価なツールである。ＳＡＭがｌｉｎｃＲＮＡを活性化させ得るか否かを試験するため、公知の機能を有する３つの標的（ＴＩＮＣＲ^２８、ＨＯＴＴＩＰ^２９、およびＰＣＡＴ^３０）および不明の機能を有する３つの標的（ＬＩＮＣ００９２５、ＬＩＮＣ００５１４およびＬＩＮＣ０００２８）を選択した。従来のｍＲＮＡ上方調節実験と同様に、ＲｅｆＳｅｑアノテーションを使用してそれぞれのｌｉｎｃＲＮＡの近位プロモーター（−８００ｂｐ＋１）から８つのｓｇＲＮＡ標的部位を選択した。実際、ＳＡＭはｌｉｎｃＲＮＡ転写物の有意な上方調節を、ＰＣＡＴの３倍の上方調節からＬＩＮＣ００５１４の３６０倍の上方調節まで媒介した（図６６ａ）。興味深いことに、およびｍＲＮＡデータとは対照的に、ｌｉｎｃＲＮＡ標的化ガイドのＴＳＳまでの距離と活性化倍率との間の有意な相関は見出されなかった（図６６ｂ）。考えられることに、この相違は、非コード転写物の複合体アイソフォーム構造から生じ得、標的は全て、報告される異なるＴＳＳ^３１を有する少なくとも２つのアイソフォームを有する。

【1039】

ｌｉｎｃＲＮＡに有効な活性化ドメインを見出すため、異なるトランスアクチベーター成分の効力を比較した。４８個のｌｉｎｃＲＮＡ標的化ガイドのそれぞれについて、ＶＰ６４単独、ｐ６５単独、ｐ６５−ＨＳＦ１、およびｐ６５−ＭｙｏＤ１へのＭＳ２融合物の比較を実施した（図７２）。三重ドメインＳＡＭ、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１またはＭＳ２−ｐ６５−ＭｙｏＤ１に結合しているｄＣａｓ９−ＶＰ６４は、６つ全てのｌｉｎｃＲＮＡに最良なガイドについて二重ドメインＳＡＭ（ＭＳ２−Ｐ６５を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４）よりも顕著に高い活性化をもたらした（ｐ＜０．０１）。単一ドメインＳＡＭ、ＭＳ２−ＶＰ６４を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４は、６つ全てのｌｉｎｃＲＮＡについて最悪に機能し、このことは相乗ドメインの複合体による活性化が試験ドメインに基づく非コードＲＮＡの効率的な人工上方調節に重要であり得ることを示唆した。

【1040】

ＳＡＭは、複数の遺伝子の同時活性化を媒介する
遺伝子ネットワークおよび転写調節の複雑性を研究するため、複数の遺伝子座における遺伝子発現の同時モジュレーションのためのツールが必要とされる。これは、シグナリング経路の複数のエレメントまたは疾患状態でシグナリングを調整する遺伝子のセットの標的化を可能とする。その目的のため、ＳＡＭが複数の遺伝子を同時に活性化させ、性能の多重化に影響を及ぼす因子を特性決定し得るか否かを試験することが求められた。２、４、６または８つの遺伝子の３つのセットおよび１０個の遺伝子の１つのセットの同時活性化を、ｓｇＲＮＡの組合せの同時発現により試験した（図７３）。１０個の遺伝子の同時活性化を含む試験された全ての遺伝子組合せについて、全ての遺伝子の良好な活性化（＞２倍）が観察された（図６７ａおよび６７ｂ）。ほとんどの遺伝子（ＩＬ１Ｒ２を除く）は、他の９つの遺伝子と同時に標的化された場合に達成される上方調節の量の降下を示した（図６７ａおよび６７ｂ）。興味深いことに、それぞれの遺伝子の相対活性化レベルは、多重活性化および単一遺伝子活性化実験間で変化した。例えば、ＮＡＮＯＧは単一遺伝子活性化の間、１０個の標的化遺伝子のうち５番目にランクした一方、それは１０多重化活性化実験においては１０番目にランクした。一部の遺伝子は、遺伝子の数の増加とともに同時に標的化された場合に活性化の変化を示さず、または穏やかで段階的な降下のみを示した（例えば、ＩＬ１Ｒ２、ＭＹＯＤ１、ＡＳＣＬ１）。しかしながら、他のものは、単一の遺伝子パートナー組み合わせた場合にも上方調節の急な減少を示した（例えば、ＬＩＮ２８Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＮＡＮＯＧ）。遺伝子間でこれらの区別される挙動は、一般に異なる遺伝子ペア形成にわたり観察された（図７３）。

【1041】

１０個の遺伝子の多重化の間の標的の低減した活性化が、遺伝子当たりで利用可能なｓｇＲＮＡまたはＳＡＭタンパク質成分の量の低減に起因するか否かを評価した。驚くべきことに、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを単一遺伝子活性化実験において１０倍だけ希釈すると、全ての遺伝子について活性化は低減しなかった（図６７ｄ）。例えば、１０個の遺伝子のうち４つ（ＩＬ１Ｒ２、ＫＬＦ４、ＡＳＣＬ１、およびＭＹＯＤ１）についての活性化は、１０倍希釈のｓｇＲＮＡ発現プラスミドを用いて平均９０％だけ増加した。残り６つの遺伝子は、平均５１％だけ減少した。ｓｇＲＮＡ希釈の結果として活性化が低減した遺伝子は、多重化によっても減衰した（図６７ｅ；ｒ＝、０．９４、ｐ＜０．００１）。

【1042】

ＳＡＭの活性化効率は、一般に、そのタンパク質成分（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１）の希釈に安定であった。両方の成分についての発現プラスミドの量の１０倍だけの低減は、活性化効率の２６％の平均降下をもたらした（図７４ａ）。活性化効率は、３つ全ての成分（ｓｇＲＮＡを含む）を希釈した場合に特に安定であり、５０倍の希釈範囲にわたり平均１００％の活性化効率を保持した（図７４ｂ）。ＳＡＭが低い形質移入濃度においても高度に効率的であるという知見は、単一コピーレンチウイルスインテグレーションに依存するゲノムスケールプールスクリーンにおける適用に特に有望であった。

【1043】

ゲノムスケールプール転写活性化スクリーンの開発
単一ｓｇＲＮＡを使用して標的遺伝子を活性化させる能力は、プールゲノムスケールプール転写活性化スクリーニングを実施する可能性を開く。ＳＡＭベーススクリーンの開発に向かう第１のステップとして、３つ全ての成分をレンチウイルスベクター中にクローニングした（図６８ａ）。それぞれのベクターは、ユニークな選択マーカー（ブラスチシジン、ハイグロマイシン、およびＺｅｏｃｉｎまたはピューロマイシン）をコードして３つ全てのＳＡＭ成分を同時発現する細胞の選択を可能とする。低い感染多重度（ＭＯＩ）においてレンチウイルスを介して送達される場合にＳＡＭの効率を評価するため、３つの検証遺伝子を標的化した：弱く活性化されるＭＹＣ；ならびに穏やかにのみ活性化されるＫＬＦ４およびＭＹＯＤ１。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をレンチ−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびｌｅｎｔｉ−ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１とＭＯＩ＜１において同時形質導入し、ブラスチシジンおよびハイグロマイシンにより同時に７日間選択した。次いで、Ｃａｓ９−ＶＰ６５−およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１発現細胞をレンチウイルスｓｇＲＮＡベクター（ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ）により低いＭＯＩ（＜０．２）において形質導入し、ピューロマイシンまたはＺｅｏｃｉｎのいずれかを使用して良好に形質導入された細胞を選択した。標的遺伝子発現レベルを形質導入４日後に計測した。３つ全ての遺伝子が、一過的ＳＡＭ形質移入後に観察されるものと同等なレベル（ＭＹＯＤ１）またはそれよりも大きいレベル（ＭＹＣおよびＫＬＦ４）に効率的に上方調節された。特に、ｓｇＲＮＡ構築物上のピューロマイシンまたはＺｅｏｃｉｎ耐性マーカーにより達成される発現レベルは、同等でなかった（図６８ｂ）。

【1044】

ｌｅｎｔｉＳＡＭ構築物（ｌｅｎｔｉ−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｌｅｎｔｉ−ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１、およびｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ）を検証したら、ＲｅｆＳｅｑデータベースから全てのコードアイソフォーム（２３４３０個のアイソフォーム）を標的化するゲノムスケールｓｇＲＮＡライブラリーを設計した。アイソフォーム当たり３つのｓｇＲＮＡを設計し、より効率的な活性化を提供することが既に決定された（図６５ｄ）ＴＳＳの２００ｂｐ上流内の標的部位を選択した。最終ライブラリーは７０，２９０個のガイドを含有し、Ｚｅｏｃｉｎ（ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｚｅｏ）またはピューロマイシン（ｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｐｕｒｏ）耐性を有する２つの別個のライブラリーを生成した。遺伝子活性化は増殖および細胞生存に対して負および正の効果の両方を有し得るため、細胞成長のエフェクターについてのゲノムワイドスクリーンを実施した。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４およびＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１成分の両方を構成的に発現するポリクローナルＡ３７５黒色腫細胞系を生成し、それらの細胞をゲノムスケールｌｅｎｔｉ−ｓｇＲＮＡ−Ｚｅｏライブラリーにより０．２のＭＯＩにおいて形質導入した（図６８ｃ）。ゲノムＤＮＡをｓｇＲＮＡレンチウイルスによる形質導入の３および２１日後に抽出し、ガイドカウント数はＮＧＳにより決定した。これら２つの時点についてのｌｏｇ_２正規化ガイドカウント数を比較した。選択下の集団について予測されるとおり、ガイドカウント数の分布は、培養物の２１日後の増加したバリアンスを示し、ガイドの大部分は枯渇を示した（図６８ｄ）（ウィルコクソン順位和検定、ｐ＜０．０００１）。上位１０００個の枯渇ｓｇＲＮＡについての機能遺伝子カテゴリーのエンリッチメントを分析し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓを使用して上位１０００個の枯渇遺伝子（所与の遺伝子に標的化された３つ全てのガイドの平均枯渇に基づき決定）を分析した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ補正後にｐ＜０．０１を有するカテゴリーを図６８ｅに示す。癌および多能性関連遺伝子カテゴリー（例として、癌調節に関与するＰＴＥＮ^３２およびＳＴＡＴ３^３３シグナリング経路）のエンリッチメントが観察された。これらの結果は、それらの遺伝子カテゴリーのメンバーの機能不全が黒色腫増殖に負に影響を及ぼし得ることおよびＳＡＭを枯渇スクリーニングに使用することができることを示唆する。

【1045】

ＢＲＡＦ阻害剤耐性に関与する遺伝子を同定するためのゲノムスケール転写活性化スクリーンの使用
既に、Ｃａｓ９媒体遺伝子ノックアウトを使用するゲノムスケールスクリーニングが、黒色腫の細胞系モデルにおいてＢＲＡＦ阻害剤耐性を付与する機能損失突然変異の同定を容易にし得ることが実証されている^１４。ＳＡＭを使用する相補的ゲノムスケール転写活性化スクリーンは、黒色腫薬物耐性に関与する機能獲得摂動の同定を可能とする。ゲノムワイド陽性選択スクリーニングについてのＳＡＭの効率を試験するため、１つの目的は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}突然変異黒色腫におけるＢＲＡＦ阻害剤耐性の発生に関与する遺伝子を同定することであった。Ａ３７５黒色腫細胞系は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}突然変異を保有し、ＢＲＡＦ阻害剤、例えば、ＰＬＸ４７２０（ＰＬＸ）および密接に関連する市販の治療薬ベムラフェニブに天然で感受性である。したがって、ＰＬＸ耐性をもたらす遺伝子を活性化させるｓｇＲＮＡを保有する細胞はその薬物の存在下で継続培養後にエンリッチされるはずである一方、そのような効果はビヒクルのみにより処理された細胞中で観察されないはずである。ベースライン時点（感染３日後）およびＰＬＸまたはビヒクルのいずれかによる処理１４日後におけるインプットｓｇＲＮＡ−ｚｅｏライブラリーについての正規化ガイドカウント数を分析した。ｓｇＲＮＡ分布は、２つの独立感染レプリケートスクリーンについてＰＬＸおよびビヒクルにより処理された細胞間で有意に異なり、ｓｇＲＮＡの大多数は低減した提示を示し、ガイドの小さいセットはＰＬＸ処理細胞の高いエンリッチメントを示す（ウィルコクソン順位和検定、Ｐ＜０．０００１、ＤＭＳＯに対するＰＬＸについて中央値−１．３）（図６９ａ）。

【1046】

多数の遺伝子標的について、同一遺伝子についてのいくつかのｓｇＲＮＡがＰＬＸ処理細胞中でエンリッチされ（図６９ｂ）、このことはＰＬＸ耐性の形成についてのそれらの遺伝子の重要性を示唆した。複数のｓｇＲＮＡにわたり一貫して高いエンリッチメントを示す遺伝子を決定するため、ＲＮＡｉ遺伝子エンリッチメントランキング（ＲＮＡｉ Ｇｅｎｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｒａｎｋｉｎｇ）（ＲＩＧＥＲ）アルゴリズム（図６９ｃ）を用いた。１０個の最も重要なヒットがゲノム全体に分布した（図６９ｃ）。上位２０個のＲＩＧＥＲヒットの５０％を、ｓｇＲＮＡライブラリーに対してｚｅｏではなくｐｕｒｏ選択を使用する検証スクリーンにおいて複製させた（図７５）。上位１００個のＲＩＧＥＲヒットのｐ値の有意性は、ＧｅＣＫＯスクリーニング^１４について観察されるものと同等であり、このことは、ＳＡＭ機能獲得活性化スクリーンから得られる結果がＣａｓ９ヌクレアーゼベースノックアウトスクリーニングと比較して類似の統計力を有することを示す（図６９ｄ）。さらに、ｚｅｏおよびｐｕｒｏスクリーン間の上位１０個の共有ヒットについて、遺伝子当たりの効率的にエンリッチされるガイド（全てのガイドの上位５％に存在）の率は極めて高く、ｚｅｏについて９７％、ｐｕｒｏについて８１％であった（上位１０個のＧＥＣＫＯヒットについての７８％±２７％と比較して全体で８９％±１０．７％、図６９ｅ）。

【1047】

両方のスクリーンからの上位ヒットの異所性発現（ＥＧＦＲ）が、ＢＲＡＦと並行する経路中でＡＫＴを活性化させることによりＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}突然変異を保有する腫瘍タイプにおいてＰＬＸ耐性を引き起こすことを既に示された^３４。さらに、患者由来ＢＲＡＦ突然変異黒色腫は、ＥＧＦＲおよびＡＫＴ阻害剤により処理した場合、ＰＬＸに感作された^３５。さらに、第１のスクリーンからの上位１０個のヒットのうち４つは、Ｇタンパク質共役受容体のファミリーに属する（ＧＰＲ３５、ＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ５、およびＰ２ＲＹ８）。ＧＰＣＲは、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．^３６によるｃＤＮＡ過剰発現を使用する近年のスクリーンにおいて黒色腫細胞中で複数のＭＡＰキナーゼ阻害剤に対する耐性を付与する上位ランクタンパク質クラスとしても出現した。ＧＰＲ３５およびＬＰＡＲ１は、ｃＤＮＡを介して過剰発現させた場合にＡ３７５細胞中でＰＬＸ耐性を媒介することが既に見出されている^３６。ＧＰＲ３５、ＬＰＡＲ１およびＬＰＡＲ５は、下流標的としてＧα１３を共有し^{３７，３８}、ＥＲＫ／ＧＳＫ３β／β−カテニン経路を介して細胞増殖を誘導し、複数の癌タイプにおいて成長利点をもたらす^{３９，４０}。Ｐ２ＲＹ８作用についての正確な分子機序は同定されていないが、Ｐ２ＲＹ８は、白血病細胞中で豊富に発現される^４１。ｃＤＮＡによるＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＰ２ＲＹ８の過剰発現は、増加したＣＲＥＢ、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｆｏｓ、およびｃ−Ｍｙｃ活性をもたらし、このことはＰ２ＲＹ８がＥＲＫ経路を介して細胞増殖を誘発し得ることを示唆した^４１。ＥＲＫのＲＡＦ非依存性活性化が、ＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性機序として既に示されている^４２。両方のスクリーンの上位２０個のヒットに存在するタンパク質の第２のファミリーは、ＧＰＣＲの下流でＧα１３に対しても作用するＲｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（ＡＲＨＧＥＦ１およびＡＲＨＧＥＦ２）である。ＧＰＣＲ経路の活性化は、ＣＲＥＢおよびＡＴＦ１を介する転写のｃＡＭＰ／ＰＫＡ媒介活性化を介するＢＲＡＦ阻害療法に対する耐性についての非依存性機序として作用することが示された^３６。上位ヒットの２つ（ＧＰＲ３５およびＬＰＡＲ１）のみが、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎスクリーン^３６からの上位ヒットと重複する一方、上位ヒットにおいてエンリッチされたＧＰＣＲ経路の多くの新規メンバーは、ＧＰＣＲ経路活性化がＭＡＰＫ経路阻害剤に対する耐性を媒介し得るモデルと一致した。さらに、上位ヒットは、腫瘍発生および悪性腫瘍において役割を有する複数のインテグリン遺伝子（ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＢ３、およびＩＴＧＢ５）を含む。特に、３つ全てのインテグリンヒットは、ＭＡＰＫシグナリングをドライブし、悪性腫瘍、足場非依存性、ならびに黒色腫および種々の癌腫の遊走を促進し得る^{４３〜４６}。さらに、ＩＴＧＢ３は、ＮＦ−κＢ経路活性化を介して癌性細胞をステム様状態にドライブし得、これはＢＲＡＦ阻害療法に対する耐性を媒介することが示されている^４７（図６９ｆ）。したがって、これらのインテグリン上位ヒットは、耐性を促進し、ＲＡＦの下流でＭＡＰＫを再活性化させて悪性腫瘍を促進することが公知のアクセサリー経路の活性化によりＢＲＡＦ阻害の迂回において役割を担い得る。

【1048】

ゲノムワイドスクリーンからの上位ヒットの生物学的関連を確認するため、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）のＢＲＡＦ^ｖ６００突然変異黒色腫細胞系からの遺伝子発現データのコレクション^４８、患者腫瘍の短期培養物^４９、ならびにＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／）からの原発性および転移性患者黒色腫試料のコレクションを試験した。既に示されたとおり^４７、区別される転写状態は、感受性および耐性状態が内因性ＭＩＴＦ／関連マーカー（例えば、ＰＭＥＬ）およびＮＦ−κＢ−経路活性／関連マーカー（例えば、ＡＸＬ）それぞれの活性化により記載されるＢＲＡＦ阻害感受性／耐性を定義する（図６ｆ）。２９個の黒色腫短期培養物からの遺伝子発現プロファイルを使用して、ＳＡＭスクリーンからの上位遺伝子が耐性状態内で有意に同時発現されることおよび上位ヒットを表す遺伝子発現シグネチャーがこのＢＲＡＦ阻害剤耐性転写状態を予測することが見出された（図６９ｆ、ｚｅｏおよびｐｕｒｏスクリーンからの重複ヒットについてｐ＜０．０００１）。

【1049】

遺伝子発現および薬理学的データが利用可能であるＣＣＬＥからの２７個のＢＲＡＦ^Ｖ６００突然変異黒色腫細胞系における上位ヒットの発現をさらに調査した。活性化スクリーンからの上位ヒットの遺伝子発現はエンリッチされ、ＳＡＭスクリーンからの上位ヒットシグネチャーと同様にＢＲＡＦ阻害（ＰＬＸ４７２０）に対する耐性と有意に関連する（図７７；ｚｅｏおよびｐｕｒｏスクリーンからの重複ヒットについてｐ＝０．００７）。上位ヒットがインビボで耐性状態を表したことを裏付けるため、ＴＣＧＡからの１１３個の原発性および転移性黒色腫試料からの遺伝子発現データ（図７８）を分析した。同一遺伝子および上記のシグネチャーマーカーを使用して感受性および耐性転写状態を定義し、ＳＡＭスクリーンからの上位ヒットおよびシグネチャーがＢＲＡＦ阻害剤耐性表現型と有意に関連することが見出された（図７８、ｚｅｏおよびｐｕｒｏスクリーンの両方についてｐ＜０．０００１）。したがって、インビトロ（患者黒色腫試料の短期培養物および樹立黒色腫細胞系のパネル）およびインビボ（ＴＣＧＡ）の両方において、ヒットは、潜在的に新規な治療標的によるＢＲＡＦ阻害耐性と関連する転写状態の理解を拡張する。

【1050】

まとめると、ロバストな単一ｓｇＲＮＡ媒介遺伝子上方調節を達成するためにｄＣａｓ９ベース転写活性化系を設計する構造ガイドアプローチが採用された。タンパク質相互作用アプタマーを取り込むようにｓｇＲＮＡをエンジニアリングすることにより、天然転写活性化プロセスをより密接に模倣する複数の区別されるエフェクタードメインからなる合成転写活性化複合体をアセンブルした。追加の開発は、区別されるタイプのエフェクターをリクルートするための異なるアプタマーを有する一連のｓｇＲＮＡ足場を確立するためのｓｇＲＮＡ足場のモジュラリティおよびカスタム可能性を利用し得る。例えば、ＭＳ２ステムループのＰＰ７相互作用ステムループによる置換を使用して転写抑制エレメントをリクルートすることができる。

【1051】

本実施例において提供される強力なｓｇＲＮＡについての選択規則の定義に向かう例示的ステップは、当業者がガイド効力に有用な追加の選択基準、例えば、配列固有特性（図７９）を明らかにすることを可能とする。

【1052】

標的化特異性のさらなる特性決定および改善された理解も、Ｃａｓ９またはＳＡＭの継続有用性に有用である。ゲノムワイドｄＣａｓ９結合の近年の分析は、有意な濃度依存性オフターゲット結合を明らかにした^５０。

【1053】

個々の遺伝子摂動のコンテクストにおける、またはゲノムスケール遺伝子活性化ライブラリーとしてのＣａｓ９転写活性化複合体の適用は、タンパク質コード遺伝子から非コードｌｉｎｃＲＮＡエレメントに及ぶ多くのタイプの遺伝子エレメントの詳細分析をさらに可能とする。さらに、ＳＡＭをＣａｓ９媒介ゲノム編集またはｄＣａｓ９媒介遺伝子抑制と組み合わせることにより、発生および再生から多くの疾患に跨るコンテクストにおける多様な生物学的プロセスにおける遺伝子相互作用を研究するための強力なアプローチを可能とする。

【1054】

一過的形質移入実験：Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、５％のＨｙＣｌｏｎｅ熱不活化ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補給されたＧｌｕｔａＭａｘおよびピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する高グルコースＤＭＥＭとを、１：１の比で含有する培地中で成長させ、１：５において２日ごとに継代した。

【1055】

熱不活化を特徴とする１０％のＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補給されたＧｌｕｔａＭａｘおよびピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する高グルコースＤＭＥＭ中で、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を維持した。細胞を、１：２または１：２．５の比において毎日継代した。遺伝子活性化実験のため、２０，０００個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞／ウェルをポリ−ｄ−リジンコート９６ウェルプレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１００μＬの培地中でプレーティングした。プレーティング２４時間後、細胞を、１：１：１の質量比において、以下のものにより形質移入した：
・遺伝子特異的標的化配列を有するｓｇＲＮＡプラスミドまたはｐＵＣ１９対照プラスミド
・ＭＳ２エフェクタープラスミドまたはｐＵＣ１９。
・ｄＣａｓ９プラスミド、ｄＣａｓ９−エフェクタープラスミド、またはｐＵＣ１９。
１．５ｕＬ／ウェルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示書に従って使用して０．３ｕｇ／ウェルの総プラスミド質量を形質移入した。細胞培地を形質移入５時間後に交換した。形質移入４８時間後、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞溶解および逆転写を実施した。Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲプローブ（ＬＩｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する逆転写および定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により相対ＲＮＡ発現レベルを定量した。ｑＰＣＲは、５ｕＬの多重化反応および３８４ウェルフォーマットで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩを使用して実施した。データをΔΔＣ_ｔ法により分析し：標的Ｃｔ値（ＦＡＭ色素）をＧＡＰＤＨ Ｃｔ値（ＶＩＣ色素）に正規化し、標的遺伝子発現の変化倍率をＧＦＰ形質移入実験対照と比較することにより決定した。

【1056】

レンチウイルス産生：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞について上記のとおり培養した。形質移入１日前、細胞を約４０％のコンフルエンシーにおいて播種した（ライブラリースケール産生については１２個のＴ２２５フラスコ、個々のガイド産生については１つのＴ７５フラスコ）。細胞を翌日に約８０〜９０％のコンフルエンシーにおいて形質移入した。それぞれのフラスコについて、１００ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００および２００ｕＬのＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して目的ベクターを含有する２０ｕｇのプラスミド、１０ｕｇのｐＶＳＶＧ、および１５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ）を形質移入した。形質移入５時間後に培地を交換した。ウイルス上清を形質移入４８時間後に回収し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濾過し、アリコート化し、−８０℃において貯蔵した。

【1057】

レンチウイルス形質導入：Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補給されたＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、１日おきに１：４の比において継代した。細胞をレンチウイルスにより１２ウェルプレート中のスピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を介して形質導入した。８ｕｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ）が補給された２ｍＬの培地中の３×１０^６個の細胞をそれぞれのウェルに添加し、レンチウイルス上清を補給し、１０００ｇにおいて２時間遠心分離した。スピンフェクションの２４時間後、細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により剥離させ、計数した。細胞を低密度（Ｔ２２５フラスコ当たり７．５×１０^６個の細胞）において再プレーティングし、選択剤を直ちに（ｚｅｏｃｉｎ、ブラスチシジンおよびハイグロマイシン、全てＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはプレーティングの３時間後（ピューロマイシン）のいずれかで添加した。選択剤についての濃度は、殺滅曲線を使用して決定した：０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン、２００ｕｇ／ｍＬのｚｅｏｃｉｎ、２ｕｇ／ｍＬのブラスチシジン、および３００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシン。培地を２日目にリフレッシュし、細胞を再プレーティング後４日目から開始して１日おきに継代した。選択の持続期間は、ピューロマイシンについては４日間、ｚｅｏｃｉｎ、ハイグロマイシンおよびブラスチシジンについては７日間であった。レンチウイルス力価は、０から６００ｕＬに及ぶ６つの異なる容量のレンチウイルスによる細胞のスピンフェクションおよび完全選択後（３〜６日間）の生存細胞数の計数により決定した。

【1058】

ＳＡＭライブラリーの設計およびクローニング：ユニークＴＳＳを有するＲｅｆＳｅｑコード遺伝子アイソフォーム（合計２３４３０個のアイソフォーム）を、７０３００個のガイドの総ライブラリーについてそれぞれ３つのガイドにより標的化した。ガイドは、それぞれのＴＳＳの最初の２００ｂｐ上流を標的化するように設計し、続いてＧＣ含有率＞２５％および標的配列の最小の重複についてフィルタリングした。フィルタリング後、残りのガイドをＨｓｕ ｅｔ ａｌ．に基づく予測オフターゲットマッチによりスコアリングし、最良のオフターゲットスコアを有する３つのガイドを選択した。ＳＡＭｓｇＲＮＡライブラリーのクローニングは、既に記載のとおり^１４実施し、最小の提示は１００個の形質転換コロニー／ガイドであった。

【1059】

枯渇およびＰＬＸスクリーン：ＳＡＭＣａｓ９およびエフェクター成分により安定的にインテグレートされたＡ３７５細胞を、０．２のＭＯＩにおいて上記のＳＡＭｓｇＲＮＡライブラリーにより形質導入し、最小の提示は５００個の形質導入細胞／ガイドであった。細胞を後続の継代の間、＞１０００個の細胞／ガイドにおいて維持した。７ＤＰＩ（完全選択、上記参照）において、細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）およびＰＬＸ４７２０条件（ＤＭＳＯ中に溶解している２ｕＭのＰＬＸ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）中に分割した。細胞を薬物処理の合計１４日間、２日ごとに継代した。＞１０００個の細胞／ガイドをｇＤＮＡ抽出のためにベースラインとして３ＤＰＩ（処理４日前）および２１ＤＰＩ（処理１４日後）において回収した。Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡミディキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ウイルスによりインテグレートされたガイドのＰＣＲを、＞５００個の細胞／ガイドの当量において、ＮＥＢｎｅｘｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を２２サイクルの単一ステップ反応で使用する９６個の並行反応においてｇＤＮＡに対して実施した。プライマーを以下に列記する：
フォワードプライマー：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮ（１−１０ｂｐ ｓｔａｇｇｅｒ）ＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ
８ｂｐバーコードを赤色で示す
リバースプライマー：
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣ ＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴ
８ｂｐインデックスリードバーコードを赤色で示す

【1060】

９６個全ての反応からのＰＣＲ産物をプールし、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲル抽出した。得られるライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｓｅｑおよびＨｉｓｅｑプラットフォーム上でディープシンケンシングし、合計＞３５００万のリードのカバレッジがライブラリー当たりフィルターをパスした。

【1061】

ＮＧＳおよびスクリーンヒット分析：ユニークインデックスリードを使用してＮＧＳデータを脱多重化した。ガイドカウント数を完全にマッチしたシーケンシングリードのみに基づき決定した。それぞれの条件について、ガイドカウント数は条件当たりのカウント数の総数に正規化し、それらの値に基づきｌｏｇ_２カウント数を計算した。条件間のカウント数の比を、正規化カウント数に基づきｌｏｇ_２（（カウント１＋１）／（カウント２＋１））として計算した。

【1062】

ＲＩＧＥＲ分析は、２つの独立感染レプリケートにわたり平均化された正規化１４日目ｌｏｇ２比（ＰＬＸ／ＤＭＳＯ）に基づきＧＥＮＥ−Ｅを使用して実施した。全てのＲＩＧＥＲ分析は、既に記載^５１のコルモゴロフ−スミルノフ法を使用し、但し重み付き平均法を使用してその方法により決定されたＧｅＣＫＯ値との比較を可能とした図６ｃを除く。

【1063】

遺伝子発現および薬理学的検証分析：ＳＡＭスクリーンからの上位遺伝子ヒットの生物学的関連性をより良好に理解するため、遺伝子発現データ（ＣＣＬＥ、ＴＣＧＡ、短期培養物）および薬理学的データ（ＣＣＬＥ、短期培養物）を分析した。ＣＣＬＥデータセット^４８において、ＢＲＡＦ^Ｖ６００突然変異黒色腫細胞系からの遺伝子発現データ（ＲＮＡシーケンシング）および薬理学的データ（ＭＡＰＫ経路阻害剤についての活性面積）を使用してＰＬＸ−４７２０耐性と上位ヒットのそれぞれの遺伝子発現との間の関連を算出した。さらに、上位ヒットに含まれる遺伝子発現シグネチャーは、単一試料遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）^{５２，５３}を使用して生成し、ＰＬＸ−４７２０耐性とそれらのシグネチャー間の関連を算出した。

【1064】

短期黒色腫培養物（ＳＴＣ）からの遺伝子発現データ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＴ−ＨＧＵ１３３）およびＰＬＸ−４７２０薬理学的データ（ＧＩ_５０；試料のサブセットについてのみ）^４９も、上位ヒットの遺伝子発現およびそれらのｓｓＧＳＥＡシグネチャースコアをプロットするために使用した。ＳＴＣ試料についての発現データを遺伝子当たりの最大プローブ値に分解し、ロバストなスプライン正規化を使用して予備処理した。

【1065】

遺伝子発現（ＲＮＡシーケンシング）およびゲノタイピングデータを、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／）からの１１３個のＢＲＡＦ^Ｖ６００突然変異原発性および転移性患者腫瘍から収集し、このデータを耐性と上位ヒットの発現／ｓｓＧＳＥＡシグネチャースコアとの間の関連の決定に同様に使用した。ＳＴＣ（サブセットのみがＰＬＸ−４７２０データを有した）およびＴＣＧＡ黒色腫試料について薬理学的データは利用可能でなかったため、転写状態はマーカー遺伝子およびシグネチャー^４７を使用してプロットしてどの試料がＢＲＡＦ阻害に対して耐性であるかを同定した。

【1066】

単一試料遺伝子セットエンリッチメント分析：上位の個々のＳＡＭスクリーンヒットの一部の過剰発現と、３つの外部癌データセットにおける耐性との間の有意な関連が存在する一方、いかなる単一遺伝子からも独立したよりロバストなスコアリング系が求められた。遺伝子発現シグネチャーは、２つのＳＡＭスクリーンのそれぞれからの上位ヒットのセットに基づき、およびそれらの間の重複について生成した。単一試料遺伝子セットエンリッチメント分析（ｓｓＧＳＥＡ）を使用して、その試料中のＳＡＭスクリーン遺伝子発現シグネチャーのエンリッチメントを表すそれぞれの試料およびそれらの遺伝子が協調的に上方または下方調節される程度についてスコアを生成した。さらに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）^５４からのシグネチャー遺伝子セットを使用して既に記載^４７の短期培養物およびＴＣＧＡデータセットにおける転写ＢＲＡＦ阻害剤耐性／感受性状態を完全にマッピングした。

【1067】

外部データセットにおける関連を計測するための情報係数：外部癌データセットにおける異なる特徴（例えば、シグネチャースコア、遺伝子発現、または薬物耐性データ）間の相関を計測するため、情報理論的アプローチ（情報係数（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；ＩＣ）を使用し、既に記載^４７の並べ替え検定（ｎ＝１０，０００）を使用して有意性を計測した。ＩＣは、それぞれのデータセットにおける試料（列）をソートするために使用される特徴と、ヒートマップ（薬理学的データ、遺伝子発現、およびシグネチャースコア）にプロットされる特徴のそれぞれとの間で計算した。

【1068】

ｓｇＲＮＡ配列分析：それぞれのｓｇＲＮＡの枯渇を、３日目と２１日目との間のカウント数（「ＮＧＳおよびスクリーンヒット分析」参照）の比として計算した。ｓｇＲＮＡ−ｐｕｒｏおよびｓｇＲＮＡ−ｚｅｏライブラリーの有意な枯渇（ＲＩＧＥＲ分析によるｐ＜＝．０５）を有する遺伝子に対応するｓｇＲＮＡを、分析のために選択した。選択されたｓｇＲＮＡをｓｇＲＮＡ配列中のヌクレオチド発生率について計数し、それぞれのヌクレオチドタイプについて、カウント数のｓｇＲＮＡ比との相関および有意性を最小二乗線形回帰により計算した。

【1069】

参照文献（実施例２０により規定）
１ Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ＲＮＡｉ ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４２８，４３１−４３７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０２３７１（２００４）．
２ Ｂｏｕｔｒｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ＲＮＡｉ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，８３２−８３５， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０９１２６６（２００４）．
３ Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７−１７０， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７９５５５（２０１０）．
４ Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．＆Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，１３５−１４１， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０２０２−１３５（２００２）．
５ Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．＆Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ．Ｔｏｗａｒｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｗｉｌｌ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ−２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５，１４６２８−１４６３３（１９９８）．
６ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１４９−１５３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１７７５（２０１１）．
７ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２−４５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０６．０４４（２０１３）．
８ Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５００，４７２−４７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２４６６（２０１３）．
９ Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＴＡＬＥ−ＴＥＴ１ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，１１３７−１１４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７２６（２０１３）．
１０ Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，９７７−９７９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２５９８（２０１３）．
１１ Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３３−８３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６７５ （２０１３）．
１２ Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，９７３−９７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６００（２０１３）．
１３ Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，２３９−２４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２３６１（２０１３）．
１４ Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，８４−８７，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４７００５（２０１４）．
１５ Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．＆Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，８０−８４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）．
１６ Ｋｏｉｋｅ−Ｙｕｓａ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｔａｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｖｅｌａｓｃｏ−Ｈｅｒｒｅｒａ Ｍｄｅｌ，Ｃ．＆Ｙｕｓａ，Ｋ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＲＩＳＰＲ−ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，２６７−２７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８００（２０１４）．
１７ Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ １５６， ９３５−９４９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０２．００１（２０１４）．
１８ Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．Ｓ．Ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ １２，５９５−６００（１９９３）．
１９ Ａｕｓｌａｎｄｅｒ，Ｓ．，Ａｕｓｌａｎｄｅｒ，Ｄ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｍ．＆Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４８７，１２３−１２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１１４９（２０１２）．
２０ Ｌｅｍｏｎ，Ｂ．＆Ｔｊｉａｎ，Ｒ．Ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ： ａ ｓｙｍｐｈｏｎｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４，２５５１−２５６９（２０００）．
２１ ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ，Ｄ．，Ｅｎｇｉｓｔ，Ｂ．，Ｎａｔｏｌｉ，Ｇ．＆Ｓａｃｃａｎｉ， Ｓ． Ｔｗｏ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｐ６５．ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ ７，ｅ７３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００００７３ （２００９）．
２２ Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｍ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．＆Ｍｅｉｓｔｅｒｅｒｎｓｔ，Ｍ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｖｉｒａｌ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ ７８，５２５−５３４（１９９４）．
２３ Ｉｋｅｄａ，Ｋ．，Ｓｔｕｅｈｌｅｒ，Ｔ．＆Ｍｅｉｓｔｅｒｅｒｎｓｔ，Ｍ．Ｔｈｅ Ｈ１ ａｎｄ Ｈ２ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １６ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｖｏｔｅｄ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ７，４９−５８（２００２）．
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２９ Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ａｃｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｔｏ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｈｏｍｅｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４７２，１２０−１２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９８１９（２０１１）．
３０ Ｐｒｅｎｓｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ａ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｈｏｒｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＰＣＡＴ−１，ａｎ ｕｎａｎｎｏｔａｔｅｄ ｌｉｎｃＲＮＡ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，７４２−７４９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１９１４（２０１１）．
３１ Ｃａｂｉｌｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２５，１９１５−１９２７，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１７４４６６１１（２０１１）．
３２ Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＴＥＮ，ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ，ｂｒｅａｓｔ，ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１９４３−１９４７（１９９７）．
３３ Ｂｏｗｍａｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｔ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｙｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｒｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＤＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９８，７３１９−７３２４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１５６８８９８（２００１）．
３４ Ｐｒａｈａｌｌａｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｏ ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｅｅｄｂａｃｋ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦＲ．Ｎａｔｕｒｅ ４８３，１００−１０３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０８６８（２０１２）．
３５ Ｈｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３，５２−６７，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１２−０４０８（２０１３）．
３６ Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５０４，１３８−１４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２６８８（２０１３）．
３７ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｇｏｎｉｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲ３５ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ ａｎｄ ｉｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｖｉａ Ｇａｌｐｈａ（１）（３）ａｎｄ ｂｅｔａ−ａｒｒｅｓｔｉｎ−２．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １６２，７３３−７４８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．２０１０．０１０８２．ｘ（２０１１）．
３８ Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＬＰＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ５０，１５７−１８６，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐｈａｒｍｔｏｘ．０１０９０９．１０５７５３（２０１０）．
３９ Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｏｕｇｈ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆ｌｙｍｐｈｏｍａ ５０，２０３８−２０４８，ｄｏｉ：１０．３１０９／１０４２８１９０９０３２７５５８６（２００９）．
４０ Ｏｋａｂｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｏｆ ｒａｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ５０，６３５−６４２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｃ．２０７５０（２０１１）．
４１ Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐ２Ｙ，Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ，８ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆ｌｙｍｐｈｏｍａ ４８，９７８−９８６，ｄｏｉ：１０．１０８０／１０４２８１９０７０１２２５８８２（２００７）．
４２ Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＣＯＴ ｄｒｉｖｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４６８，９６８−９７２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６２７（２０１０）．
４３ Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｏｏｍｍｅｎ，Ｓ．，Ａｕｂｒｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｐ．＆Ｖｌａｈａｋｉｓ，Ｎ．Ｅ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ９ｂｅｔａ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２，１４１−１５０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃ．２０１２．４１（２０１３）．
４４ Ｂａｏ，Ｗ．＆Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ，Ｓ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａｖ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ａ ＭＥＫ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １６７，７４５−７５６，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２００４０４０１８（２００４）．
４５ Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．＆Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ １０，９−２２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ２７４８（２０１０）．
４６ Ｓｅｇｕｉｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ（３）−ＫＲＡＳ−ＲａｌＢ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｒｉｖｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＥＧＦＲ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １６，４５７−４６８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ２９５３（２０１４）．
４７ Ｋｏｎｉｅｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｓｔａｔｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４，８１６−８２７，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１３−０４２４（２０１４）．
４８ Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４８３，６０３−６０７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１００３（２０１２）．
４９ Ｌｉｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８，６６４−６７３，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０７−２６１５（２００８）．
５０ Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，６７０−６７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）．
５１ Ｌｕｏ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０５，２０３８０−２０３８５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１０４８５１０５（２００８）．
５２ Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ： ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０２，１５５４５−１５５５０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０６５８０１０２（２００５）．
５３ Ｂａｒｂｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＫＲＡＳ−ｄｒｉｖｅｎ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ＴＢＫ１．Ｎａｔｕｒｅ ４６２，１０８−１１２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８４６０（２００９）．
５４ Ｌｉｂｅｒｚｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）３．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，１７３９−１７４０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ２６０（２０１１）．

【1070】

実施例２１：誘導性構造設計活性化メディエータートランスジェニックマウス
Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），１５９（２）：４４０−４５５、または本明細書に引用されるＰＣＴ特許出願公開、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に基づき、誘導性構造設計活性化メディエータートランスジェニックマウスを樹立する。ＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質のコード領域の上流でＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットによりエンジニアリングされたマウスを樹立する。ＳｐＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質のコード領域の上流で、およびＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質のコード領域の上流でＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットによりエンジニアリングされた第２のマウスを樹立する。

【1071】

実施例２２：細胞およびトランスジェニックマウス中で誘導性構造設計活性化メディエーターを使用する機能獲得表現型のスクリーニング
実施例２１において樹立されたマウスを、Ｃｒｅ（例えば、Ｕ６プロモーターの制御下）をコードおよび発現し、ＡＡＶを介して本発明による改変ｓｇＲＮＡ（例えば、Ｕ６改変ｓｇＲＮＡ）もコードおよび発現するＡＡＶ−Ｃｒｅ構築物により形質移入する。ｓｇＲＮＡは、不明機能のｌｉｎｃＲＮＡのＴＴＳの１０００ヌクレオチド上流内のプロモーター領域を標的化するように設計する。動物を異常な表現型についてスクリーニングする。

【1072】

ＰＣＴ出願、とりわけ、２０１４年６月１０日に出願された米国指定出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書、およびこのＰＣＴ出願の系列における出願（すなわち、ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が優先権を主張する出願におけるガイド）（全て参照により本明細書に組み込まれる）のヒトガイドおよびマウスガイドは、本明細書に記載のアクチベーター、または本明細書に記載のリプレッサーを含有するように改変する。

【1073】

Ｃａｓ９を含有し、またはそれを構成的に発現し、もしくは誘導的に発現するように改変されたヒト細胞を、ＰＣＴ出願、とりわけ、２０１４年６月１０日に出願された米国指定出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書、およびこのＰＣＴ出願の系列の出願（すなわち、ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が優先権を主張する出願におけるガイド）のヒトｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ構築物により形質移入し、ガイドは、本明細書の記載により少なくとも１つのリプレッサーまたは少なくとも１つのアクチベーターのいずれかを、プロモーター、例えば、本発明によるＵ６改変ｓｇＲＮＡの制御下およびそれに作動可能に結合させて含み；Ｃａｓ９が誘導的に発現されるそのような細胞の場合、Ｃｒｅは発現を誘導し、構築物は、ＡＡＶを介して、例えば、Ｕ６プロモーターに作動可能に結合させてコードすることによりＣｒｅもコードおよび発現する。ｓｇＲＮＡがアクチベーターを有する細胞を機能獲得についてモニタリングし、ｓｇＲＮＡがリプレッサーを有する細胞を機能損失についてモニタリングする。改変ｓｇＲＮＡがアクチベーターを有する細胞は機能獲得を示し、改変ｓｇＲＮＡがリプレッサーを有する細胞は機能損失を示す。この様式において、ヒト細胞をスクリーニングすることができる。

【1074】

実施例２１、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），１５９（２）：４４０−４５５、または本明細書に引用されるＰＣＴ出願公開、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＣａｓ９マウスを、Ｃｒｅ（例えば、Ｕ６プロモーターの制御下）をコードおよび発現し、さらにはＰＣＴ出願、とりわけ、２０１４年６月１０日に出願された米国指定出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書、およびこのＰＣＴ出願の系列の出願（すなわち、ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が優先権を主張する出願におけるガイド）の改変マウスｓｇＲＮＡ（例えば、Ｕ６改変ｓｇＲＮＡ）をコードおよび発現するＡＡＶ−Ｃｒｅ構築物により形質移入し、ガイドは、本明細書の開示による少なくとも１つのリプレッサーまたは少なくとも１つのアクチベーターのいずれかを含む。ｓｇＲＮＡがアクチベーターを有するマウスを機能獲得についてモニタリングし、ｓｇＲＮＡがリプレッサーを有するマウスを機能損失についてモニタリングする。改変ｓｇＲＮＡがアクチベーターを有するマウスは機能獲得を示し、改変ｓｇＲＮＡがリプレッサーを有するマウスは機能損失を示す。この様式において、マウスをスクリーニングすることができる。

【1075】

一態様において、本発明の方法におけるベクター系は、１つ以上のレンチウイルスベクターを含む。好ましい実施形態において、１つ以上のレンチウイルスベクターは、コドン最適化核局在化シグナル（ＮＬＳ）、コドン最適化Ｐ２Ａバイシストロニックリンカー配列および最適に配置されたＵ６ドライブガイドＲＮＡカセットを含み得る。別の態様において、ベクター系は、２つのレンチウイルスベクターを含み、一方のレンチウイルスベクターは、Ｃａｓ９酵素を含み、他方のレンチウイルスベクターは、本発明のライブラリーから選択されるガイドＲＮＡを含む。本発明の一実施形態において、それぞれのベクターは、異なる選択マーカー、例えば、異なる抗生物質耐性マーカーを有する。本発明はまた、本発明のライブラリーを含むキットを包含する。ある態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むベクターを含む単一容器を含む。他の態様において、キットは、本発明のライブラリーを含むプラスミドを含む単一容器を含む。本発明はまた、本発明のライブラリーからのユニークＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイド配列の選択を含むパネルを含み、選択は、特定の生理学的状態を示すキットを包含する。好ましい実施形態において、標的化は、約１００個以上の配列、約１０００個以上の配列または約２０，０００個以上の配列または全ゲノムである。他の実施形態において、標的配列のパネルは、関連または所望の経路、例えば、免疫経路または細胞分裂にフォーカスされる。

【1076】

実施例２３：ペア形成ニッカーゼＦｏｋ１
ＣＲＩＳＰＲ酵素が「不機能」（非突然変異Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ酵素の多くとも５％のヌクレアーゼ活性を有する）であり、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼがｓｇＲＮＡに作動可能に結合している突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素を有するペア形成ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を細胞に送達し、ペアにおいて、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞中の第１の遺伝子座において切断を行い、第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞中の第２の遺伝子座において切断を行い；２つのＦｏｋ１酵素は、例えば、第１および第２の遺伝子座が互いに向き合い、または互いに近く存在するが、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖上に存在する場合に二本鎖分解を提供し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、特定の特異的切断または二本鎖切断を提供し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、未改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体よりもオフターゲット切断のより大きい低減を有する。ペア形成ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体は、二本鎖ＤＮＡの２つの鎖を切断し得、その結果、ＨＤＲが生じ得る。テンプレートＤＮＡを細胞中に導入する実施形態において、二本鎖切断が行われたテンプレートＤＮＡを挿入する相同組換えが存在する。

【1077】

実施例２４：３成分キメラＣａｓ９酵素
キメラＣａｓ９酵素を構築および試験した。キメラ酵素は、ＳｐＣａｓ９からのＮ’およびＣ’末端ドメインを有したが、内部ドメインはＳａまたはＳｔ３ドメインについてスワップアウトしてＳｐ−Ｓｔ３−ＳｐまたはＳｐ−Ｓａ−Ｓｐキメラ３成分酵素を提供した。

【1078】

一連のガイドをそれぞれのキメラ酵素と試験した。ガイドは純粋なＳｐ、ＳａもしくはＳｔ３野生型のいずれかであり、またはそれらは、それらがＳｐとＳａまたはＳｔ３とのハイブリッドになるようにエンジニアリングした。酵素が１つ以上のＳｔ３内部ドメインを含んでＳｐ−Ｓｔ３−Ｓｐキメラ３成分酵素を形成する場合、ハイブリッドガイドは、Ｓｐ骨格（ＢＢ）およびＳｔ３標的化配列（ＴＧＳ）；またはＳｔ３骨格（ＢＢ）およびＳｐ標的化配列（ＴＧＳ）のいずれかを含んだ。１つ以上のＳａ内部ドメインをスワップインしてＳｐ−Ｓａ−Ｓｐキメラ３成分酵素を形成した場合、ガイドは、Ｓｐ骨格（ＢＢ）およびＳａ標的化配列（ＴＧＳ）；またはＳａ骨格（ＢＢ）およびＳｐ標的化配列（ＴＧＳ）のいずれかを含むようにエンジニアリングした。骨格は、ｓｇＲＮＡ足場（またはｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト）およびｓｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー部分からなる標的化配列（ＤＮＡ標的に特異的）を含む。

【1079】

スワップインまたはアウトされたドメインは、それらが完全および部分ドメインを含むという点で必ずしも完全なドメインではなかった。Ｒｅｃローブの完全なスワップは本発明の範囲内である一方、説明目的のため、この研究は、Ｒｅｃローブの部分スワップにフォーカスした。Ｎｕｃローブは、ＲｕｖＣＩドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、ＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣＩＩＩドメインおよびＰＩドメインを含む一方、Ｒｅｃローブは、ＢＨ、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含む。

【1080】

方法
細胞培養および形質移入
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞系ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはマウスＮｅｕｒｏ２ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）細胞系を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ_２インキュベーションで維持した。

【1081】

細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、形質移入２４時間前に１２０，０００個の細胞／ウェルの密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を８０〜９０％のコンフルエンシーにおいて形質移入した。合計５００ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび１００ｎｇのＵ６−ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物を形質移入した。

【1082】

ゲノム改変のためのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ
２９３ＦＴおよびＨＵＥＳ６２細胞を、上記ＤＮＡにより形質移入した。形質移入後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化された細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間、６８℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。

【1083】

それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域を、以下のとおりプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：

【1084】

【表416】

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【1085】

ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２マイクロリットルの１０×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０マイクロリットルの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼおよびＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づくものであった。インデル割合は、式：
１００×（１−（１−（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））^１／２）
（式中、「ａ」は、未消化ＰＣＲ産物のインテグレート強度であり、「ｂ」および「ｃ」は、それぞれの開裂産物のインテグレート強度である）により決定した。

【1086】

結果
ヘリカルドメイン、例えば、本明細書に上記のＨＤ２またはヘリカルドメイン２は、１３６８アミノ酸ＳｐＣａｓ９の初期アノテーションであり、現在の専門用語は、３つのドメイン：ＲＥＣ１（ＳｐＣａｓ９を参照して残基９４〜１７９）、ＲＥＣ２（ＳｐＣａｓ９を参照して残基１８０〜３０７）およびブリッジヘリックスと称される長鎖アルファへリックス（ＳｐＣａｓ９を参照して残基６０〜９３）（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ参照）を有する認識またはＲｅｃローブも含む。本実施例の結果を図８６に示す。図８６は、結晶構造に基づくＳｐ、ＳａおよびＳｔ３Ｃａｓ９間のキメラの試験を示す。Ａ）ＳｐＣａｓ９のドメイン組織化およびアミノ酸（ＡＡ）位置。ＲＥＣローブは、Ｃａｓ９の新たに同定された構造成分である。Ｂ）Ｎｕｃローブの部分または完全スワップのキメラマップ、キメラ境界のＡＡ位置を示す、Ｃ）左側のそれぞれの対応するキメラを用いて達成されたインデル％。標識は、使用されたｓｇＲＮＡを示す。ＴＧＳ＝標的化配列（ｓｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー部分）、ＢＢ＝ｓｇＲＮＡ骨格。本出願人らは、少なくとも３つの成分からなる異なるＣａｓ９タンパク質（異なる種に由来）間のキメラを構築することが可能であり、それにより内部ドメインのスワップアウトを可能とすることを見出した。本出願人らは、本明細書に提供される結晶構造に基づき新たに同定されたＣａｓ９の内部ＲＥＣローブに対して実施されたスワップによりこれを説明した。

【1087】

本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、それらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、特許請求の範囲により包含されるものとする。

【1088】

参照文献：
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４４．Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｇ．＆Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ， ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３，３４５−３４８（１９９５）．
４５．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３−３４５（２００９）．
４６．Ｇａｒｎｅａｕ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｌｅａｖｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７−７１（０４ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０）
４７．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｍａｒ ２３；３１５（５８１９）：１７０９−１２．
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５２．Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ，Ｃ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｈｅｒｉｎｇａ，Ｊ．（２０００）．Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０２，２０５−２１７．
５３．Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｉｏｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｎ．Ｗ．，Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｎ．Ｋ．，ａｎｄ Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．（２００２）．ＰＨＥＮＩＸ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｎｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５８，１９４８−１９５４．
５４．Ａｒｉｙｏｓｈｉ，Ｍ．，Ｖａｓｓｙｌｙｅｖ，Ｄ．Ｇ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．（１９９４）．Ａｔｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＲｕｖＣ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ：ａ ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌ ７８，１０６３−１０７２．
５５．Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ，Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，ａｎｄ Ｓｕｃｋ，Ｄ．（２００７）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｔ４ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＶＩＩ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ａ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４４９，６１６−６２０．
５６．Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｉｎ，Ｚ．，ａｎｄ Ａｉｈａｒａ，Ｈ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲｕｖＣ ｄｉｍｅｒ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｓｔｒａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１，６４８−６５６．
５７．ｄｅｌａＦｏｒｔｅｌｌｅ，Ｅ．，ａｎｄ Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ｇ．（１９９７）．Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｈｅａｖｙ−ａｔｏｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６，４７２−４９４．
５８．Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２１２６−２１３２．
５９．Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｌｅ Ｒｈｕｎ，Ａ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，Ｌｅｃｒｉｖａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂｚｄｒｅｎｇａ，Ｊ．，Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１３）．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｕａｌ−ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ａｍｏｎｇ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
６０．Ｆｕ，Ｙ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２２−８２６．
６１．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｍｏｒｓｕｔ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．，Ｂｒａｎｄｍａｎ，Ｏ．，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ １５４，４４２−４５１．
６２．Ｇｏｒｅｃｋａ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋａ，Ｗ．，ａｎｄ Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｍ．（２０１３）．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲｕｖＣ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１，９９４５−９９５５．
６３．Ｇｒａｔｚ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ａ．Ｍ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｈａｍｍ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｌ．Ｋ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｗｉｌｄｏｎｇｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．Ｍ．（２０１３）．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９４，１０２９−１０３５．
６４．Ｈｏｌｍ，Ｌ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｍ，Ｐ．（２０１０）．Ｄａｌｉ ｓｅｒｖｅｒ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ３Ｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８，Ｗ５４５−５４９．
６５．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２７−８３２．
６６．Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ｆｕ，Ｙ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｙｅｈ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１３）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，２２７−２２９．
６７．Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．（２０１０）．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６６，１２５−１３２．
６８．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｍ．，Ｃｏｎｇ，Ｌ．， Ｐｌａｔｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１３）．Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５００，４７２−４７６．
６９．Ｌｉ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｏｒ，Ｌ．Ｉ．，Ｃｈａｎｇ，Ｚ．Ｆ．，Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｚ．，ａｎｄ Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｓ．（２００３）．ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖｖｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ａ ｋｎｏｗｎ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ２２，４０１４−４０２５．
７０．Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．，Ｆｕ，Ｙ．，Ｈｏ，Ｑ．Ｈ．，ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，９７７−９７９．
７１．Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ， Ｌ．，ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３ａ）．ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３３−８３８．
７２．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．（２００８）．ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１８４３−１８４５．
７３．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．（２０１０）．ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１，１８１−１９０．
７４．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ−Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，ａｎｄ Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．（２００９）．Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３−７４０．
７５．Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａ，Ｅ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｖｅａｌｓ ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８３９−８４３．
７６．Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｄ．Ｄ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｆ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｇｌａｓｓ，Ｋ．Ａ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０，９７３−９７６．
７７．Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．， ａｎｄ Ｌｉｍ，Ｗ．Ａ．（２０１３）．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３−１１８３．
７８．Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ １５４，１３８０−１３８９．
７９．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｓａｒｏｊ，Ｓ．Ｄ．，Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，Ａ．Ｃ．，Ｔｚｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｄ．Ｓ．（２０１３）．Ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４９７，２５４−２５７．
８０．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．， Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｒｏｏｔ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，８４−８７．
８１．Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．（２００８）．Ａ ｓｈｏｒｔ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＳＨＥＬＸ．Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６４，１１２−１２２．
８２．Ｓｐｉｌｍａｎ，Ｍ．，Ｃｏｃｏｚａｋｉ，Ａ．，Ｈａｌｅ，Ｃ．，Ｓｈａｏ，Ｙ．，Ｒａｍｉａ，Ｎ．，Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．，Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｔａｇｇ，Ｓ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ５２，１４６−１５２．
８３．Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｄａｗｌａｔｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５３，９１０−９１８．
８４．Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，８０−８４．
８５．Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｋ．，Ｊｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ，Ｊ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｅ．（２０１１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ ４７７，４８６−４８９．
８６．Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｂａｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．， ＭｃＣｏｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６７，２３５−２４２．
８７．Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｓｈｉ，Ｌ．，ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５４，１３７０−１３７９．

【図1】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図2D】

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【図2E-F】

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【図3A-C】

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【図3D】

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【図4A-B】

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【図4C-E】

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【図4F】

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【図4G】

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【図5】

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【図6A-B】

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【図6C】

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【図7】

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【図8A-B】

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【図9A-C】

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【図10A-C】

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【図10D】

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【図11A-C】

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【図12A-B】

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【図13A-B】

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【図14】

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【図15】

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【図16A】

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【図16B】

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【図16C】

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【図17A-B】

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【図18】

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【図19A】

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【図19B】

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【図19C】

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【図19D】

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【図20A】

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【図20B】

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【図20C】

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【図20D】

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【図20E】

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【図20F】

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【図21A】

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【図21B】

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【図21C】

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【図21D】

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【図22A】

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【図22B】

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【図23A】

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【図23B】

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【図23C】

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【図23D】

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【図23E】

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【図23F】

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【図23G】

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【図23H】

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【図23I】

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【図23J】

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【図23K】

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【図23L】

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【図23M】

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【図24A-C】

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【図25A-B】

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【図26A】

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【図26B】

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【図27A-C】

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【図28】

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【図29】

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【図30A-D】

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【図31A-E】

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【図32A-F】

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【図33A-D】

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【図34A】

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【図34B-K】

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【図35A-D】

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【図37】

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【図39】

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【図40A】

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【図40B】

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【図41】

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【図42】

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【図43】

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【図44】

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【図45】

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【図46】

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【図47】

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【図48】

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【図49】

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【図50】

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【図51】

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【図52】

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【図53】

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【図54】

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【図55】

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【図56】

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【図57】

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【図58】

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【図59】

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【図60】

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【図61】

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【図62】

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【図63】

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【図64A-F】

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【図65A-D】

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【図66A-B】

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【図67A-E】

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【図68A-E】

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【図69A-F】

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【図70A-E】

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【図71A-C】

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【図72】

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【図73】

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【図74A-B】

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【図75A-B】

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【図76A-D】

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【図77】

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【図78】

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【図79A-D】

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【図80A】

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【図80AA】

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【図80B】

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【図80BB】

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【図80C】

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【図80CC】

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【図80D】

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【図80DD】

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【図80E】

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【図80EE】

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【図80F】

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【図80G】

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【図80H】

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【図80I】

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【図80J】

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【図80K】

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【図80L】

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【図80M】

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【図80N】

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【図80O】

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【図80P】

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【図80Q】

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【図80R】

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【図80S】

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【図80T】

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【図80U】

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【図80V】

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【図80W】

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【図80X】

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【図80Y】

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【図80Z】

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【図81A】

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【図81B】

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【図81C】

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【図81D】

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【図81E】

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【図82A】

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【図82B】

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【図82C】

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【図82D】

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【図82E】

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【図82F】

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【図82G】

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【図82H】

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【図82I】

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【図83A】

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【図83B】

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【図83C】

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【図84A】

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【図84B】

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【図84C】

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【図85】

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【図86】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]