特許 6795813 がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6795813

(24)【登録日】2020年11月17日

(45)【発行日】2020年12月2日

(54)【発明の名称】がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20201119BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20201119BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20201119BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20201119BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20201119BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20201119BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20201119BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201119BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 S

   G01N33/574 B

   C12Q1/04ZNA

   A61P1/18

   A61P35/00

   A61K47/66

   A61P1/16

   A61P1/00

   A61K35/74 Z

   A61K45/00

   A61K38/16

   A61K47/42

   A61K45/06

   A61P43/00 121

【請求項の数】11

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2017-544518(P2017-544518)

(86)(22)【出願日】2016年10月5日

(86)【国際出願番号】JP2016079577

(87)【国際公開番号】WO2017061449

(87)【国際公開日】20170413

【審査請求日】2019年8月8日

(31)【優先権主張番号】特願2015-197950(P2015-197950)

(32)【優先日】2015年10月5日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2015-198045(P2015-198045)

(32)【優先日】2015年10月5日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2016-69683(P2016-69683)

(32)【優先日】2016年3月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(72)【発明者】

【氏名】舘野 浩章

(72)【発明者】

【氏名】平林 淳

(72)【発明者】

【氏名】浅島 誠

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 弓弦

(72)【発明者】

【氏名】小沼 泰子

(72)【発明者】

【氏名】小田 竜也

(72)【発明者】

【氏名】大河内 信弘

(72)【発明者】

【氏名】下村 治

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１２６１４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１２８９１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０６５３０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 舘野浩章，ヒトｉＰＳ・ＥＳ細胞特異的プローブｒＢＣ２ＬＣＮの開発，和光純薬時報，２０１３年 ７月１５日，Vol.81,No.3，PP.2-5

【文献】 平林淳ほか，レクチンマイクロアレイによる糖鎖マーカーの開発−がんと多能性幹細胞，がん分子標的治療，２０１４年 ９月２６日，Vol.12,No.3，PP.341-346

【文献】 TATENO Hiroaki et al.，Podocalyxin is a glycoprotein ligand of the human pluripotent stem cell-specific probe rBC2LCN，Stem Cells Translational Medicine，２０１３年 ３月２２日，Vol.2，PP.265-273

【文献】 SCHOPPERLE William M. et al.，The human cancer and stem cell marker podocalyxin interact with the glucose-3-transporter in maligna，Biochem. Biophys. res. com.，２０１０年，Vol.398，PP.372-376

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検試料に対して、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを接触させる手順と、
被検試料中のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在の有無又は存在量を測定する手順と、
を含む、がん細胞の検出方法。

【請求項2】

前記被検試料が、被験個体の体液試料である、請求項１記載の検出方法。

【請求項3】

前記体液試料が、血液由来の試料である、請求項２記載の検出方法。

【請求項4】

前記がん細胞が、大腸がん又は胆管がん細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。

【請求項5】

前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。

【請求項6】

前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、請求項５記載の検出方法。

【請求項7】

被検試料が、被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織、又は生検材料に由来する組織試料又は細胞試料である、請求項１記載の検出方法。

【請求項8】

被検試料中のがん細胞の有無を検出するためのキット又は装置であって、少なくとも下記の（１）〜（３）を含むキット又は装置；
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識化剤、
（３）標識を検出するための手段又は装置。

【請求項9】

がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるとき、被験個体ががんに罹患していると判定するためのデータの収集方法。

【請求項10】

がん治療が施された被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順、及び
当該存在量を、あらかじめ測定された前記治療前の被験個体の被検試料のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量と比較する手順を含み、
治療前に比して治療後の前記存在量が有意に低レベルであるとき、前記治療が有効であると判定するためのデータの収集方法。

【請求項11】

被検試料が、被験個体の体液試料である、請求項９又は１０記載の収集方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がん細胞の検出試薬及び検出方法、がん細胞の分離用試薬及び分離方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、並びにがん治療用組成物等に関する。より詳しくは、がん細胞表面に特異的に発現する糖鎖に結合するレクチンを用いたがん細胞の検出試薬等に関する。
また、本発明は、特定のがん種におけるがん幹細胞などの高悪性度がん細胞を特異的に染色、濃縮可能なレクチンプローブに関し、かつ当該プローブを用いて高悪性度がん細胞の存在を検出、濃縮する方法に関する。
さらに、本発明は、当該レクチンプローブががん細胞内に取り込まれる性質を利用した、当該プローブ融合体による、がん細胞を選択的に除去する方法に関する。
また、本発明は、がん、特に抗がん剤耐性がんを含む高悪性度がんの診断方法及び治療方法に関する。具体的には、高悪性度がん（例えば膵がんなどのがん細胞、特に抗がん剤耐性がん細胞、がん幹細胞）の検出方法、がんの悪性度を診断する方法、及びそのためのがん細胞検出剤、並びにがん細胞を殺傷除去する方法、及び抗がん剤、特に耐性がん用の治療剤に関する。当該方法により、がん治療に有効な新たな治療法を提供することができる。本発明は、がん研究分野、がん診断、がん治療による創薬・医療分野において利用可能である。

【背景技術】

【0002】

がんは日本人の第一の死因である。がんには多くの異なる種類のがん（乳がん、前立腺がん、肺がん、胃がん、大腸がん等）があり、その発症原因も多岐にわたっているため、それぞれの種類のがんで、病理組織／細胞の形態、遺伝子発現、細胞表面タンパク質／糖鎖発現が異なる。また、同一がん組織内においても多様な細胞種（悪性度の程度が異なるがん細胞、がん幹細胞）から構成されていることが多く見られる。それゆえ、標準的な診断方法や有効ながんマーカーの種類もがん細胞種ごとに異なる。

【0003】

たとえば乳がんは日本において、女性のかかるがんの中で第１位であり、日本人女性が一生の間に乳がんと診断される確率は１６人に１人と、発生率は増加する傾向にある。また、乳がん女性患者のおよそ２０％が、この乳がんが原因で死亡しており、その早期発見、効果的な治療を行うための基礎・応用研究が精力的に行われている。乳がんのスクリーニング検査はマンモグラフィ検診等の非侵襲的な診断により行われ、悪性の病変やがんが疑わしい場合には、少量の細胞や組織片を採取する穿刺吸引細胞診や針生検（組織診）が行われる。穿刺吸引細胞診や針生検（組織診）は、組織を採取する外科的生検に比べ患者負担が比較的低い診断方法であるが、診断の正確さは外科的生検におとり、診断がつかない場合もある。

【0004】

前立腺がんは日本において、男性のかかるがんの中で第３位であり、発生率は増加する傾向にある。特に日本では前立腺がんが、がんが原因で死亡する患者の約３．５％を占めており、近年、その対応は急務となっている。前立腺がんは、血液検査（ＰＳＡ検査）によるスクリーニング検査を行い、直腸診、経直腸的前立腺超音波検査等の診断を行った上で、がんが疑わしい場合には、針生検による病理組織診断で評価が行われる。

【0005】

小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）は、気管支原性がんの約１５％を占める。がん細胞の発育や転移が非常に早く、他の肺がん（腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん）と比べて悪性度が高いと言われており、早期の診断と効果的な治療が必須となっている。肺がんは胸部Ｘ線写真によりスクリーニング検査を行い、病変が疑われる場合には、喀痰検査により痰の中のがん細胞の有無を調べる。さらに、内視鏡検査や針生検により病理組織診断で評価が行われる。

【0006】

いずれにせよ、がんの確定診断では生検が必要であるが、上記に述べたように少量の細胞で診断がつかない場合は、追加での組織採取が必要となり患者負担が大きくなる。そこで、穿刺吸引等で得られる少量の細胞でも高効率で確定診断が行えるような染色方法の開発が求められている。特に患者の治療方針を決定する上で、当該がんの悪性度を判断することは、最も重要な診断要件である。

【0007】

また、それぞれの種類のがん細胞は、病理組織／細胞の形態、遺伝子発現、細胞表面タンパク質／糖鎖発現が異なるため、汎用的な抗がん剤や抗体薬を作成することは難しく、ある抗がん剤を選択したとしても、効果を発揮しないことも多々ある。また、抗がん剤にはがん細胞のみを確実にかつ効率的に殺傷、または成長抑制する効果が求められているが、実際は周辺等の正常組織に対する副作用を回避する事が難しい場合が多く、重大な問題となっている。

【0008】

従来、各種がん細胞の表面に存在するタンパク質を認識することで、がん細胞の検出、抗がん剤開発を進めようとする研究は盛んに行われてきたが、正常細胞にも同じタンパク質が同等量発現しているために、特異性の点から効果が思わしくないことが殆どであった。がん細胞への特異性を高める上で、近年、がん患者の血清中の糖タンパク質や糖脂質の糖鎖の変化に着目し、たとえ糖鎖をはやしている基盤であるタンパク質量が同量であったとしても、各種がん特異的に増加する糖鎖を糖鎖エピトープとして認識して検出することが可能な抗糖タンパク質抗体又は抗糖脂質抗体を用いる検出技術の開発が盛んである。また、これら糖鎖抗原を利用したワクチン製造も活発化してきている（非特許文献１）。

【0009】

ところで、各種がん種のうちでも悪性度の高いがんとして最も恐れられているがんの１つに膵がんがある。膵がんとは、一般に膵臓から発生したがんを指す。膵臓には消化酵素（アミラーゼ、トリプシン、リパーゼなど）を分泌する外分泌腺と、ホルモン（インスリンなど）を分泌する内分泌腺がある。膵がんは外分泌系（消化酵素の分泌系）がんと内分泌系（ホルモンの分泌系）がんに大きく２つに分けられるが、外分泌系のがんが９５％を占め、中でも膵管の上皮から発生する浸潤性膵管がんが最も多く、全体の８５％を占める。そのため、一般に膵がんといえばこの浸潤性膵管がんのことを指す。本明細書における「上皮性がん」あるいは「消化器系上皮性がん」には、浸潤性膵管がんが含まれる。

【0010】

膵がんの５年生存率は５．５％とあらゆるがんの中でも極端に生存率が低い。膵がんは早期診断、外科的切除が唯一根治を望める治療である。診断時に切除可能と判断される患者は約２割にとどまる。たとえ全てのがんを外科的切除により切除できたとしても、約９０％の患者が再発すると言われている。これは、膵がんは早い段階で肝臓などへの遠隔転移や腹膜転移するためであると考えられる。
幸運にも外科的切除が可能であっても、膵がんは微小転移を起こしていたり、遺残する可能性が高いため、術後に化学療法などの後療法が必要となる。術後に再発した膵がんに対しても化学療法が行われる。遠隔転移を有する切除の対象とならない膵がんや，手術を行ったが再発してきた膵がんに対する化学療法として、２００１年からは塩酸ゲムシタビン（ＧＥＭ、ジェムザール）を用いた化学療法が標準治療となっている。また２００６年からはティーエスワン（ＴＳ−１、エスワン（Ｓ−１）ともいう。）（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）という抗がん剤が新たに膵がんに対して我が国で保険適用が認められて使用できるようになった。

【0011】

これらの化学療法剤では根治が難しいため、新たな投与薬剤の開発が切望されている。この耐性がん細胞となるがん幹細胞を直接攻撃しようとする試みも乳がんなどを対象に広く行われており、がん幹細胞マーカーＣＤ１７６に対する抗ＣＤ１７６抗体による処置（特許文献１）や、糖脂質ＧｌｏｂｏＨ抗原を含むワクチン（特許文献２）による治療方法などの治療対象として膵がんも例示されているが、膵がんへの実際の適用例はない。
その後、エルロチニブ（分子標的治療薬）や大腸がんの化学療法を強化したＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ療法などの新規治療法も出現してきたが、高額な治療費がかかるうえ、予後が数か月延長するのみで膵がんを根治する意味においては程遠いものである。
以上のことから、膵がんに対する新たな治療法や新たな抗がん剤の開発が切望されていた。

【0012】

このように、膵がんは早い段階で転移が始まる悪性度の高いがんであり、早期治療はその後の予後にも大きな影響を及ぼすことから、早期のがん発見が極めて重要である。また、診断時には切除可能か否かの的確な判断が求められるため、がんの悪性度の正確な判定も重要であるが、生検の必要な膵がん組織中での各種膵がんマーカー遺伝子発現を観察することは被験個体の負担が大きい。そのために非侵襲的な診断が必須であり、膵がんにおいても、血清試料中の膵がんマーカーの検索が従来から活発に行われていた。
特に、膵がん特異的に発現する遺伝子産物であり、血中で観察できる血中タンパク質マーカーが従来から腫瘍マーカーとして注目されてきた。例えば、血漿アポリポタンパク質の１種のＡｐｏＡＩＩ（特許文献３）、修飾α−フィブリノゲンタンパク質（特許文献４）、補体Ｃ３前駆体（特許文献５）、ＣＸＣ−ケモカインファミリーに属するＣＸＣＬ４Ｌ１（特許文献６）、ＲＥＧファミリーに属するＲＥＧ４（特許文献７）、膵臓がん特異的抗原ＰａＣａ−Ａｇ１由来の可溶性抗原３Ｃ４−Ａｇ（特許文献８）、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ１（特許文献９）、タンパク質ミオフェリン（特許文献１０）などの多数の血清タンパク質マーカーが提案されている。

【0013】

最近では、血清中の糖タンパク質や糖脂質の糖鎖の変化に着目し、膵がん特異的に増加する糖鎖を膵がんマーカーとして検出する技術開発も活発化してきている。例えば、複数の特定糖鎖の血清中の存在量を測定することによる膵がん診断方法（特許文献１１、１２）や、ヒトハプトグロビンが有する糖鎖中の特定位置の糖鎖構造が膵がん特異的にフコシル化されることに注目し、当該フコシル化糖鎖構造からなる糖鎖マーカー（特許文献１３）及びフコースα１→６特異的な担子菌由来レクチンを用いた病変ヒトハプトグロビン検出による膵がん診断方法（特許文献１４）が提案されている。
また、膵がんは、術後の再発率が高く、化学療法剤に対する耐性獲得も早いという悪性度が高いがんであるため、予後診断などの目的で、膵がん幹細胞や抗がん剤耐性膵がん細胞を検出しようとする試みも多数なされている。例えば、ＡｎｎｅＸｉｎ−ＩＩタンパク質の免疫組織染色による膵がん用抗がん剤の耐性検査方法（特許文献１５）の他、多数のがん幹細胞で特異的に発現する抗原として同定された腫瘍関連炭水化物抗原（ＣＤ１７６，ＣＤ１７４，ＣＤ１７３）をがん幹細胞マーカーとして検出する方法（特許文献１６）もある。以上のことから、膵がんの診断方法についても、早期の非侵襲的な膵がん診断方法と共に、抗がん剤耐性がんなどの悪性膵がん診断方法の提供が望まれていた。

【0014】

本発明者らは以前、レクチンマイクロアレイを用いて、５種類の異なる体細胞（皮膚、胎児肺、子宮内膜、胎盤動脈、羊膜）から作製したヒトｉＰＳ細胞（１１４検体）と、ヒトＥＳ細胞（９検体）の糖鎖プロファイルを網羅的に解析した。その結果、元の体細胞が組織毎に異なる糖鎖プロファイルを持っていたにもかかわらず、作製されたｉＰＳ細胞は、いずれもほぼ同じ糖鎖プロファイルを示し、初期化遺伝子の導入により一様にＥＳ細胞と類似の糖鎖構造に収束化することを見出した。ヒトＥＳ・ｉＰＳ細胞とヒト体細胞とのレクチンアレイデータを詳細に解析した結果によると、未分化のヒトＥＳ・ｉＰＳ細胞では、体細胞と比較してα２−６Ｓｉａ、α１−２Ｆｕｃ、タイプ１ ＬａｃＮＡｃの発現量が顕著に増加していることが推定された。当該推定は、ＤＮＡアレイを用いた糖転移酵素遺伝子の発現解析、及び質量分析計を用いた方法によって裏付けられた（非特許文献２）。
当該ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメインに対応したＢＣ２ＬＣＮレクチン（ＹＰ＿００２２３２８１８）を形質転換大腸菌で発現させた組換え体であり、複合糖鎖の非還元末端の「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」並びに、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」糖を認識するレクチンである（非特許文献２，３）。
本発明者らは、上述のレクチンアレイを用いた実験において、当該ＢＣ２ＬＣＮレクチンが、全てのヒトＥＳ・ｉＰＳ細胞と反応するものの、分化した体細胞とは全く反応しないことを見出した。当該レクチンは、ヒトＥＳ・ｉＰＳ細胞で高発現しており分化した体細胞ではほとんど発現のない糖鎖である「α１−２Ｆｕｃ」、「タイプ１ ＬａｃＮＡｃ」及び「α２−６Ｓｉａ」のうちの２つ（α１−２Ｆｕｃ、タイプ１ ＬａｃＮＡｃ）を有する「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（＝Ｈタイプ１構造）」及び「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（＝Ｈタイプ３構造）」の糖鎖構造の両者を特異的に反応していると解される。このことから、ＢＣ２ＬＣＮレクチンが認識する２種類の糖鎖リガンドが未分化細胞を特徴付ける新規未分化糖鎖マーカーであり、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、当該未分化糖鎖マーカー「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」及び／又は「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」（以下、両者をあわせて「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」ということもある。）に特異的なプローブとして用いることができることが示唆された。

【0015】

さらに、本発明者らは、ＥＳ・ｉＰＳ細胞は上述の糖鎖構造、とりわけＨタイプ３糖鎖を大量に含有する糖鎖構造が細胞表面全体でクラスター状に大量発現していることを見出し、そのため蛍光標識したＢＣ２ＬＣＮレクチンが、一般的な免疫組織化学の手法によって、ＥＳ・ｉＰＳ細胞のみを特異的に染色することができること、すなわちＥＳ・ｉＰＳ細胞染色用プローブとして利用可能であることを発見した（特許文献１７，１８）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】特表２０１３−５１７４８７号

【特許文献2】特許第５６２８１５８号

【特許文献3】特開２０１０−１７５４５２号

【特許文献4】特開２００９−２９７３１号

【特許文献5】特開２００７−５１８８０号

【特許文献6】特表２０１２−５０９６８３号

【特許文献7】特表２００９−５２８５０７号

【特許文献8】特表２００７−５２５４１０号

【特許文献9】特開２０１０−１８０１７４号

【特許文献10】特表２０１３−５４５９９２号

【特許文献11】特開２０１２−６３１３９号

【特許文献12】特開２０１３−８３４９０号

【特許文献13】特開２００９−１６８４７０号

【特許文献14】ＷＯ２０１１／０８９９８８

【特許文献15】ＷＯ２００６／１２９７２９

【特許文献16】特表２０１３−５１７４８７号

【特許文献17】ＷＯ２０１３／０６５３０２

【特許文献18】ＷＯ２０１３／１２８９１４

【特許文献19】ＷＯ２０１４／１２６１４６

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｈｅｉｍｂｕｒｇ−Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２０１１， ２９（４８）：８８０２−２６．

【非特許文献2】Ｔａｔｅｎｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１１， ２８６（２３）：２０３４５−５３．

【非特許文献3】Ｓｕｌａｋ Ｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ２０１０， １８（１）：５９−７２．

【非特許文献4】Ｃｈａｎｇ ＷＷ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２００８， １０５（３３）：１１６６７−１１６７２．

【非特許文献5】Ｃ． Ｌｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６７， ２００７， １０３０−１０３７．

【非特許文献6】Ｐ． Ｃ． Ｈｅｒｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２００７， １， ３１３−３２３．

【非特許文献7】Ｈｏａｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ． ２０１４ Ａｕｇ ２５； ４７１（１−２）：２２４−３３．

【非特許文献8】Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９９８． ２６３，９４７０−９４７５．

【非特許文献9】Ｔａｔｅｎｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１５， ４（５）：８１１−２０．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

本発明は、がん細胞を特異的に検出、分離又は殺傷するための技術を提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明者らは、今回、以下の知見を得た。
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチンが、乳がん細胞及び前立腺がん細胞の細胞表面に存在する糖タンパク質を認識し、結合すること（実施例１−１、１−２、１−３参照）。
（２）ＢＣ２ＬＣＮレクチンが、乳がん、肺がん、膵がん、大腸がん、胃がん、胆管がん、子宮がん、卵巣がんに反応性を有し、特に上皮性がん、なかでも消化器系上皮性がんと乳がんに反応性を有し、大腸がん及び胆管がんには特に高い反応性を示すこと（実施例１−４、１−５、１−６、１−７、１−８参照）。
（３）ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、正常組織には反応しないこと（実施例１−９参照）。
（４）ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞が、高い足場非依存性増殖能を有し、既知のがん幹細胞マーカーを高発現すること（実施例２）。
（５）ＢＣ２ＬＣＮと細胞殺傷性毒素との融合タンパク質（ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ）がＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞を非常に効率よく殺傷すること（実施例３）。
（６）臨床膵がんに類似の所見を呈するＣａｐａｎ−１細胞（ＢＣ２ＬＣＮ陽性）皮下移植マウスモデルにおいて、抗がん剤処置後に残存するがん細胞でＢＣ２ＬＣＮが強陽性となること（実施例４）、またＢＣ２ＬＣＮと細胞殺傷性毒素との融合タンパク質（ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ及びＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８）が顕著な抗腫瘍効果を示すこと（実施例５）。
（７）細胞の培養上清を用いて該細胞中に含まれるがん細胞を検出できること、がん罹患個体の体液試料を用いて生体内のがんを検出できること（実施例６）。

【0020】

以上の知見に基づき、本発明は、その一側面において、以下の［１］〜［８２］を提供する。
［１］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む、がん細胞検出試薬。
［２］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞、胆管がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は脳腫瘍細胞である、［１］の試薬。
［３］ 前記がん細胞が、上皮性がん細胞である、［２］の試薬。
［４］ 前記がん細胞が、消化器系上皮性がん細胞又は乳がん細胞である、［３］の試薬。
［５］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞又は胆管がん細胞である、［４］の試薬。
［６］ 前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、［１］の試薬。
［７］ 前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、「６」の試薬。
［８］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がん細胞である、［６］の試薬。
［９］ がん細胞検出のために用いられるＢＣ２ＬＣＮレクチン。
［１０］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンのがん細胞検出のための使用。

【0021】

［１１］ 被検試料中のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在の有無又は存在量を測定する手順を含む、がん細胞の検出方法。
［１２］ 被検試料に対して、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを接触させる手順をさらに含む、［１１］の検出方法。
［１３］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞、胆管がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は脳腫瘍細胞である、［１１］又は［１２］の検出方法。
［１４］ 前記がん細胞が、上皮性がん細胞である、［１３］の検出方法。
［１５］ 前記がん細胞が、消化器系上皮性がん細胞又は乳がん細胞である、［１４］の検出方法。
［１６］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞又は胆管がん細胞である、［１５］の検出方法。
［１７］ 前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、［１１］又は［１２］の検出方法。
［１８］ 前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、［１７］の検出方法。
［１９］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がん細胞である、［１８］の検出方法。
［２０］ 被検試料が、被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織、又は生検材料に由来する組織試料又は細胞試料である、［１１］〜［１９］のいずれかの検出方法。
［２１］ 被検試料が、被験個体の体液試料である、［１１］〜［１９］のいずれかの検出方法。
［２２］ 体液試料が、全血、血清及び血漿から選択される血液由来試料である、［２１］の検出方法。
［２３］ 被検試料中のがん細胞の有無を検出するためのキット又は装置であって、少なくとも下記の（１）〜（３）を含むキット又は装置；
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識化剤、
（３）標識を検出するための手段又は装置。

【0022】

［２４］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む、がん細胞分離用試薬。
［２５］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞、胆管がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は脳腫瘍細胞である、［２４］の試薬。
［２６］ 前記がん細胞が、上皮性がん細胞である、［２５］の試薬。
［２７］ 前記がん細胞が、消化器系上皮性がん細胞又は乳がん細胞である、［２６］の試薬。
［２８］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞又は胆管がん細胞である、［２７］の試薬。
［２９］ 前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、［２４］の試薬。
［３０］ 前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、「２９」の試薬。
［３１］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がん細胞である、［３０］の試薬。
［３２］ がん細胞分離のために用いられるＢＣ２ＬＣＮレクチン。
［３３］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンのがん細胞分離のための使用。

【0023】

［３４］ 被検試料に対して、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを接触させる手順と、
ＢＣ２ＬＣＮレクチンが結合した細胞と結合しない細胞とを分離する手順と、を含むがん細胞の分離方法。
［３５］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞、胆管がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は脳腫瘍細胞である、［３４］の分離方法。
［３６］ 前記がん細胞が、上皮性がん細胞である、［３５］の分離方法。
［３７］ 前記がん細胞が、消化器系上皮性がん細胞又は乳がん細胞である、［３６］の分離方法。
［３８］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞又は胆管がん細胞である、［３７］の検出方法。
［３９］ 前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、［３４］の分離方法。
［４０］ 前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、「３９」の分離方法。
［４１］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がん細胞である、［４０］の分離方法。
［４２］ 被検試料が、被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織、又は生検材料に由来する組織試料又は細胞試料である、［３４］〜［４１］のいずれかの検出方法。
［４３］ 被検試料中のがん細胞を分離するためのキット又は装置であって、少なくとも下記の（１）及び（２）を含むキット又は装置；
（１）標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識を検出して標識された細胞を分離するための手段又は装置。

【0024】

［４４］ がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるとき、被験個体ががんに罹患していると判定するためのデータ収集方法。
［４５］ がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるとき、被験個体ががんに罹患していると判定するがんの診断方法。
［４６］ がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人又は悪性度の低いがん患者と比較して高レベルであるとき、被験個体の予後が不良であると判定するためのデータ収集方法。
［４７］ がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人又は悪性度の低いがん患者と比較して高レベルであるとき、被験個体の予後が不良であると判定するがんの予後判定方法。
［４８］ がん治療が施された被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順、及び、
当該存在量を、あらかじめ測定された前記治療前の被験個体の被検試料のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量と比較する手順を含み、
治療前に比して治療後の前記存在量が有意に低レベルであるとき、前記治療が有効であると判定するためのデータの収集方法。
［４９］ がん治療が施された被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順、及び、
当該存在量を、あらかじめ測定された前記治療前の被験個体の被検試料のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量と比較する手順を含み、
治療前に比して治療後の前記存在量が有意に低レベルであるとき、前記治療が有効であると判定する治療効果の判定方法。
［５０］ 前記がんが、大腸がん、胆管がん、膵がん、胃がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん又は脳腫瘍である、［４４］〜「４９」のいずれかの方法。
［５１］ 前記がんが、上皮性がんである、［５０］の方法。
［５２］ 前記がんが、消化器系上皮性がん又は乳がんである、［５１］の方法。
［５３］ 前記がんが、大腸がん又は胆管がんである、［５２］の方法。
［５４］ 前記がんが、高悪性度がんである、［４４］〜「４９」のいずれかの方法。
［５５］ 前記高悪性度がんが、薬剤耐性がんである、「５４」の方法。
［５６］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がんである、「５５」の方法。
［５７］ 被検試料が、被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織、又は生検材料に由来する組織試料又は細胞試料である、［４４］〜［５６］のいずれかの方法。
［５８］ 被検試料が、被験個体の体液試料である、［４４］〜［５６］のいずれかの方法。
［５９］ 体液試料が、全血、血清及び血漿から選択される血液由来試料である、［５８］の方法。

【0025】

［６０］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンと、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに融合する物質と、を含んでなる、前記物質をがん細胞内に導入するための試薬。
［６１］ 前記物質が、がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質である、［６０］の試薬。
［６２］ がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、毒素タンパク質又はその細胞殺傷能力のあるドメインである、［６１］の試薬。
［６３］ がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインである、［６２］の試薬。
［６４］ 緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインが、配列番号３で示されるＤｏｍａｉｎＩ〜ＩＩＩ（ＰＥ３８）である、［６３］の試薬。
［６５］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞、胆管がん細胞、膵がん細胞、胃がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は脳腫瘍細胞である、［６０］〜［６４］のいずれかの試薬。
［６６］ 前記がん細胞が、上皮性がん細胞である、［６５］の試薬。
［６７］ 前記がん細胞が、消化器系上皮性がん細胞又は乳がん細胞である、［６６］の試薬。
［６８］ 前記がん細胞が、大腸がん細胞又は胆管がん細胞である、［６７］の試薬。
［６９］ 前記がん細胞が、高悪性度がん細胞である、［６０］〜［６４］のいずれかの試薬。
［７０］ 前記高悪性度がん細胞が、薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞である、「６９」の試薬。
［７１］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がん細胞である、［６９］の試薬。

【0026】

［７２］ ＢＣ２ＬＣＮレクチンと、がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質とを融合したＢＣ２ＬＣＮ−毒素融合体を有効成分とし、薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする、がん治療用組成物。
［７３］ がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、毒素タンパク質又はその細胞殺傷能力のあるドメインである、［７２］の組成物。
［７４］ がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインである、［７３］の組成物。
［７５］ 細胞殺傷ドメインが、配列番号３で示される緑膿菌の外毒素Ａ由来ＤｏｍａｉｎＩ〜ＩＩＩ（ＰＥ３８）である、［７４］の組成物。
［７６］ 既知のがんに適用可能な治療用組成物と併用して、又は組み合わせて用いられることを特徴とする、［７２］〜［７５］のいずれかの組成物。
［７７］ 前記がんが、大腸がん、胆管がん、膵がん、胃がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん又は脳腫瘍である、［７２］〜［７６］のいずれかの組成物。
［７８］ 前記がんが、上皮性がんである、［７７］の組成物。
［７９］ 前記がんが、消化器系上皮性がん又は乳がんである、［７８］の組成物。
［８０］ 前記がんが、大腸がん又は胆管がんである、［７９］の組成物。
［８１］ 前記がんが、高悪性度がんである、［７２］〜［７６］のいずれかの組成物。
［８２］ 前記高悪性度がん細胞が、膵がんである、［８１］の組成物。

【0027】

また、本発明は、その一側面において、以下の〔１〕〜〔２９〕をも提供する。
〔１〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを有効成分として含む、がん幹細胞検出剤。
ここで、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、直接的又は間接的に標識されていてもよい。また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを基板上に固定化し、オーバーレイする被検試料溶液又は懸濁液を標識化して検出してもよい。
〔２〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを有効成分として含む、悪性度の高い又は薬剤耐性を獲得したがん細胞検出剤。
ここで、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、直接的又は間接的に標識されていてもよく、基板上に固定化されていてもよい。
〔３〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを有効成分として含む、がん診断剤。
ここで、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、直接的又は間接的に標識されていてもよく、基板上に固定化されていてもよい。
〔４〕 がん診断剤が、被験個体におけるがんの罹患の有無もしくはその悪性度を判定するため、又は被験個体の予後を予測するための診断剤である、前記〔３〕に記載の診断剤。
〔５〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを有効成分として含む、「高悪性度がん細胞」を濃縮するための分離精製用試薬。
「高悪性度がん細胞を含有する試料」に対して、標識化されたＢＣ２ＬＣＮレクチンを反応させ、セルソーターを備えたフローサイトメーターを用いることで、「高悪性度がん細胞」を濃縮することができる。また、「高悪性度がん細胞を含有する試料」にＢＣ２ＬＣＮレクチンを結合させた磁気ビーズを反応させて、磁気細胞分離装置により濃縮してもよい。
〔６〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用い、被検試料中のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在の有無又は存在量を測定することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
ここで、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖として典型的な糖鎖は、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」を非還元末端に有している糖鎖である。
また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、直接的又は間接的に標識されていてもよい。また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを基板上に固定化し、オーバーレイする被検試料溶液又は懸濁液を標識化して検出してもよい。
〔７〕 被検試料が、被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織、又は生検材料に由来する組織試料又は細胞試料である、前記〔６〕に記載の検出方法。
〔８〕 被検試料が、被験個体の体液試料である、前記〔６〕に記載の検出方法。
ここで、「体液試料」とは、被験個体の全血、血清、血漿及び関節液を含む血液由来試料、リンパ液、唾液、尿などの体液試料の他、膵臓組織由来抽出液など、腫瘍組織又は腫瘍が疑われる組織由来抽出液も含む。
〔９〕 「高悪性度がん細胞」を含むことが疑われる被検試料に対して、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと接触させる工程を含むことを特徴とする、被検試料中の「高悪性度がん細胞」の有無を判定する方法。
ここで、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、直接的又は間接的に標識されていてもよく、基板上に固定化されていてもよい。
〔１０〕 被検試料中の「高悪性度がん細胞」の有無を判定するためのキット又は装置であって、少なくとも下記の（１）〜（３）を含むキット又は装置；
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識化剤、
（３）標識を検出するための手段又は装置。
ここで、（２）の標識化剤は、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを直接的又は間接的に標識するために用いてもよい。ＢＣ２ＬＣＮレクチンを基板上に固定化する場合は、反応させる被検試料溶液又は懸濁液を標識化するために用いることができる。（３）の検出装置として、例えば、前者の場合は、ＦＡＣＳ機器を用いたフローサイトメトリー解析を適用することができ、また後者の場合は、エバネッセント波励起光検出系を適用することができる。
〔１１〕 被検試料中の「高悪性度がん細胞」を分離、濃縮又は選別するためのキット又は装置であって、少なくとも下記の（１）及び（２）を含むキット又は装置；
（１）標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識を検出して分離するための手段又は装置。
ここで、（２）の分離装置としては、セルソーターを備えたフローサイトメーター、又は磁気細胞分離装置などを用いることができる。
〔１２〕 がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程を含み、当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるとき、被験個体ががんに罹患していると判定するためのデータの収集方法。
本発明は、がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程、及び当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるか否かを判定する工程を含む、がんの罹患の有無を診断する方法に適用できる。
〔１３〕 がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程を含む、被験個体が罹患しているがんががん幹細胞を含む悪性度の高いがん又は薬剤耐性を獲得したがんであるか否かを判定するためのデータの収集方法。
本発明は、がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程、及び被験個体が罹患しているがんががん幹細胞を含む悪性度の高いがん又は薬剤耐性を獲得したがんであるか否かを判定する工程を含む、がんの悪性度診断法、又は最適治療方法の決定方法に適用できる。
〔１４〕 がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程を含む、被験個体の予後を予測するためのデータの収集方法。
本発明は、がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する工程を含む、被験個体の予後の予測方法に適用できる。
〔１５〕 がん治療が施された被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いてＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量を測定する工程、及び当該発現量を、あらかじめ測定された前記治療前の被験個体の被検試料のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量と比較する工程を含む、前記治療効果の有効性を判定するためのデータの収集方法。
本方法は、がんに罹患している被験個体に、手術などの外科的治療、抗がん剤治療などの化学的、免疫学的治療、放射線治療などが施される場合に、治療前の被検試料と治療後の被検試料におけるＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量の差異を観察することにより、施された治療の治療効果の有効性を判定する方法に適用できる。
〔１６〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンを有効成分として含む、「高悪性度がん細胞」の細胞内に化合物を輸送するための「高悪性度がん細胞」導入剤であって、輸送するための化合物がＢＣ２ＬＣＮレクチンと融合していることを特徴とする、「高悪性度がん細胞」導入剤。
〔１７〕 被検細胞試料中の「高悪性度がん細胞」殺傷剤であって、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと細胞内で細胞毒性を発揮できる物質とを融合したＢＣ２ＬＣＮ−毒素融合体を有効成分とする、殺傷剤。
〔１８〕 細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、毒素タンパク質又はその細胞殺傷能力のあるドメインである、前記〔１７〕に記載の殺傷剤。
〔１９〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンとがん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質とを融合した「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体を有効成分として含むことを特徴とする、がん細胞殺傷剤。
〔２０〕 がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインである、前記〔１９〕に記載のがん細胞殺傷剤。
〔２１〕 緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインが、配列番号３で示されるＤｏｍａｉｎＩ〜ＩＩＩ（ＰＥ３８）である、前記〔２０〕に記載のがん細胞殺傷剤。
〔２２〕 がん細胞が膵がん細胞である前記〔１９〕〜〔２１〕のいずれかに記載のがん細胞殺傷剤。
〔２３〕 がん細胞が、悪性度の高い又は薬剤耐性を獲得したがん細胞を含むことを特徴とする、前記〔１９〕〜〔２２〕のいずれかに記載のがん細胞殺傷剤。
〔２４〕 ＢＣ２ＬＣＮレクチンとがん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質とを融合したＢＣ２ＬＣＮ−毒素融合体を有効成分とし、薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする、がんの処置又は治療用組成物。
〔２５〕 がん細胞内で細胞毒性を発揮できる物質が、緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメインである、前記〔２４〕に記載の組成物。
〔２６〕 細胞殺傷ドメインが、配列番号３で示される緑膿菌の外毒素Ａ由来ＤｏｍａｉｎＩ〜ＩＩＩ（ＰＥ３８）である、前記〔２５〕に記載の組成物。
〔２７〕 がんが膵がんである前記〔２４〕〜〔２６〕のいずれかに記載の組成物。
〔２８〕 がんが、がん幹細胞を含む悪性度の高いがん又は薬剤耐性を獲得したがんである前記〔２４〕〜〔２７〕のいずれかに記載の組成物。
〔２９〕 がん治療用組成物が、既知のがんに適用可能な治療用組成物と併用して、又は組み合わせて用いられることを特徴とする、前記〔２４〕〜〔２８〕のいずれかに記載の組成物。

【0028】

本発明における用語の定義は以下のとおりである。
「がん」とは、悪性腫瘍及び肉腫をいう。
「がん幹細胞」とは、「自己複製能」と「分化能（組織形態の再現性）」を備えるがん細胞をいう。
再生医学分野において、「幹（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」は、「自己複製能」と「多分化能」によって定義される。ここでいう「多分化能」とは、１つの細胞が他の多くの種類の細胞に分化する能力をいう。
分化能に関し、がん幹細胞は、上記の「多分化能」は有していない。がん幹細胞が有する「分化能（組織形態の再現性）」とは、がん幹細胞が、当該がん幹細胞の発生由来臓器の細胞へ分化する能力をいうものとする。がん幹細胞が備える「分化能（組織形態の再現性）」は、がん幹細胞が発生由来臓器の組織形態を再現する能力ともいうことができる。
がん幹細胞は、後述する分化度が低い特徴を有する。がん幹細胞は、既知の細胞マーカーを指標として識別することができる。細胞マーカーとしては、ＥＰＣＡＭ（非特許文献４）、ＣＤ２４、ＣＤ４４（非特許文献５）、ＣＤ１３３（非特許文献６）、ＥＲＢＢ２（非特許文献７）などが挙げられる。 本発明におけるがん幹細胞は、未分化幹細胞、すなわち自己複製能に加えて、１つの細胞が他の多くの種類の細胞に分化する能力を意味するところの「多分化能」を備える細胞（例えばＥＳ細胞（胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（誘導性多能性幹細胞））を含むものではない。

【0029】

がんの悪性度の判断指標は、臨床的なものから病理組織学的なものまで種々の指標が用いられる。一般に、がんの発生部位、がんの組織型及びがんの分化度の指標が汎用される。発生部位に関して、胆のう胆道及び膵臓は、進行性、浸潤性及び転移性が高く、予後（５年相対生存率）が悪いため、最も悪性度が高いがんに分類される。一方、前立腺、乳腺及び甲状腺は進行が遅く、転移性が低く、予後が良いため、最も悪性度が低いがんに分類される。子宮体、大腸、子宮頚、胃、卵巣、肺、食道及び肝臓は、この順に５年相対生存率が低く、悪性度が高いとされている。
組織型は、同一組織由来のがんをさらに由来細胞の種類によって分類したものであり、例えば、肺がんは、扁平上皮がん、腺がん、大細胞がん及び小細胞がんに大きく分類することができる。
がんの分化度は、正常な組織あるいは細胞からの異形度であり、がん組織やがん細胞の構造及び形状等が正常な組織や細胞の構造及び形状等から乖離しているほど悪性度が高いと判断される。構造としては、組織の境界が不明瞭であるほど、又は、細胞の配列が不整であるほど悪性と判断される。形状としては、核や細胞質が不整であるほど、細胞質、核又は核小体が大型であるほど、各染色性が増すほど、又は、核小体が多いほど悪性と判断される。
本発明における「高悪性度がん細胞」も、従来用いられている指標に従って悪性度が高いと判断されるがん細胞をいうものであるが、特に足場非依存性増殖能が高いがん細胞、薬剤耐性を有するがん細胞及びがん幹細胞を指す場合がある。
「足場非依存性増殖能」は、細胞外基質（足場）に接着しなくても生存し増殖する能力を意味し、該能力が高い細胞ほど悪性度が高いと判断される。足場非依存性増殖能は、例えば、軟寒天培地を用いたコロニー形成試験により、細胞の増殖数を測定することにより評価することができる。
「薬剤耐性がん細胞」は、化学療法に用いられる抗がん剤に対して抵抗性を示し、死滅することなく生存する細胞をいう。薬剤耐性がん細胞の細胞集団には、がん幹細胞が含まれている場合が多い。抗がん剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、代謝拮抗薬（５−ＦＵ、塩酸ゲムシタビン等）、アルキル化薬（シクロフォスファミド等）、プラチナ製剤（オキサリプラチン、シスプラチン等）、植物アルカロイド（パクリタキセル、ドセタキセル等）、その他各種分子標的治療薬（トラスツズマブ、イマチニブ、ベバシズマブ等）の耐性があげられる。

【0030】

また、本発明において、「細胞毒性」あるいは「細胞障害性」は、細胞に細胞死（アポトーシス及びネクローシス）を誘導する活性に加えて、細胞の分裂、増殖及び分化等の正常な機能を抑制する活性を広く包含するものとする。

【発明の効果】

【0031】

本発明により、がん細胞を特異的に検出、分離又は殺傷するための技術が提供される。本発明により提供された、蛍光等で標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチンは、がん細胞に発現している糖鎖を特異的に検出することができる、優れたがん細胞特異的標識プローブとして用いることができる。本発明のがん細胞特異的標識プローブを病理検体等に対して直接反応させることで、がん細胞を特異的に高感度で標識することができる。したがって、本発明のがん細胞特異的標識プローブを用いることで、患者のがん細胞スクリーニングを、簡便かつ効果的に実施することができ、がんの診断・治療加速化への応用が期待できる。尚、上述の効果は、既存の抗体等の技術と併用／キット化することも可能であり、それにより相乗的にがん細胞を検出・濃縮できると期待される。
このことは、本発明により、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いた、がん細胞の検出方法、特に薬剤耐性を獲得したがん細胞の検出方法が提供できたことでもある。ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、がんの罹患の有無、罹患したがんの悪性度、がん患者の予後などを判定するためのがん診断剤として用いることができ、がん治療の効果を確認するために用いることもできる。さらに、標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンをがん組織切除手術時にあらかじめ患部に投与することで、がん化部分のみを鮮明に染色することができる。

【0032】

一方、ＢＣ２ＬＣＮレクチン自身が持つがん細胞内移行能を利用することで、がん細胞内に毒素を取り込ませることができるため、がん細胞を殺傷可能な強力な抗がん剤を提供できた。具体的には、本発明により、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと毒素との融合体、例えばＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を有効成分とする抗がん剤が提供できた。特に既知の抗がん剤との組み合わせ使用、又は薬剤耐性がん患者への治療用組成物として有用である。さらに、各種研究用因子を取り込ませれば、がん研究用キャリアとしての応用も期待できる。
また、がん細胞に、その悪性度の原因となっていると推定される遺伝子を阻害するようなマイクロＲＮＡ、つまり「形質転換因子」を導入することで、正常な細胞に形質転換するという応用も可能である。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の調製

【図2A】各種がん細胞株に対するＦＩＴＣラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色（ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞）

【図2B】各種がん細胞株、繊維芽細胞株に対するＦＩＴＣラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色（ＤＵ−１４５、ＬＮａＣａｐ、ＰＣ−３及びＴＩＧ３細胞）

【図3】（Ａ）各種がん細胞株、繊維芽細胞株に対するＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ６４７ラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによるフローサイトメトリー解析；（Ｂ）繊維芽細胞株、幹細胞株に対するＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ６４７ラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによるフローサイトメトリー解析

【図4】各種がん細胞の細胞膜タンパク質画分を用いたレクチンアレイ解析

【図5】（Ａ）乳がん組織切片に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色；（Ｂ）肺がん組織切片に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色；（Ｃ）脳腫瘍組織切片に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色

【図6】ヒト臨床膵がん（検体番号１）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図7】ヒト臨床膵がん（検体番号２）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図8】ヒト臨床膵がん（検体番号３）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図9】ヒト臨床大腸がん腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図10A】標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いた各種症例（胃がん、大腸がん、乳腺がん、肝臓がん、膵がん、胆管がん、肺がん）のレクチン染色

【図10B】標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いた各種症例（子宮体がん、子宮頸がん、前立腺がん、腎がん膀胱がん、精巣がん、卵巣がん、内分泌系がん、他臓器がん）のレクチン染色

【図11A】ヒトがん組織アレイを用いた乳がん組織切片におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン結合部位の病理組織学的検査

【図11B】ヒトがん組織アレイを用いた肺がん組織切片におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン結合部位の病理組織学的検査

【図11C】ヒトがん組織アレイを用いた脳腫瘍組織切片におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン結合部位の病理組織学的検査

【図12A】ヒト各種正常組織（膵臓、脾臓、乳房、食道、骨格筋、唾液腺、胆嚢、甲状腺、腎臓、虫垂、子宮、胃）に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色

【図12B】ヒト各種正常組織（胎盤、精巣、口蓋扁桃、大腸、肝臓、脳、皮膚、小腸、副甲状腺、リンパ節、脂肪、動脈）に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色

【図12C】ヒト各種正常組織（膀胱、胸腺、肺、大腸、心臓、前立腺、卵巣、乳房、）に対するＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンによる染色

【図13】（Ａ）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソート後のフローサイトメトリー解析；（Ｂ）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによりソートされた細胞の接着培養観察；（Ｃ）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによりソートされた細胞の増殖検証

【図14】（Ａ）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソートされた細胞の悪性度検証における細胞観察；（Ｂ）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソートされた細胞の非接着培養における増殖検証

【図15】前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソート及びがん幹細胞マーカーの発現解析

【図16A】乳がん細胞ＭＣＦ−７株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16B】乳がん細胞Ｔ−４７Ｄ株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16C】乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−１５７株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16D】前立腺がん細胞ＤＵ−１４５株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16E】前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16F】前立腺がん細胞ＰＣ３株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16G】繊維芽細胞ＴＩＧ３株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図16H】メラノーマ細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果

【図17】ＦＩＴＣ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンの乳がん細胞ＭＣＦ−７株への内在化

【図18】６種の膵がん細胞株のマウス異種移植片の形成されたがん細胞の形態

【図19】高密度レクチンマイクロアレイで得られたＢＣ２ＬＣＮレクチンの６種の膵がん細胞への反応強度

【図20】フローサイトメトリーによる６種の膵がん細胞株へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合

【図21】Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデル腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図22】ヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図23】ＧＥＭ処理後のヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色

【図24】ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の精製

【図25】ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のＣａｐａｎ−１の殺傷効果

【図26】Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のがん細胞殺傷効果

【図27】Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のがん細胞殺傷効果；（Ａ）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のマウス体重への影響；（Ｂ）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の腫瘍抑制効果；（Ｃ）Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８処理後の腫瘍サイズ

【図28】Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８処理後の病理観察

【図29AB】膵がん患者由来がん細胞移植（ＰＤＸ）モデルマウスにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の抗腫瘍効果：（Ａ）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８処理後の腫瘍体積の変化。（Ｂ）腫瘍サイズの経時的変化。

【図29CD】膵がん患者由来がん細胞移植（ＰＤＸ）モデルマウスにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の抗腫瘍効果：（Ｃ）腫瘍重量の変化。（Ｄ）マウスの体重変化。

【図30A】播種性転移モデル：Ｃａｐａｎ−１腹腔内移植マウスの消化管内播種状態（移植後１４日）。

【図30B】播種性転移モデル：Ｃａｐａｎ−１及びＳＵＩＴ−２移植マウスでのＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８による播種抑制効果の比較。

【図30CD】播種性転移モデル：（Ｃ）ヌードマウス消化管内の播種個数計測方法。（Ｄ）Ｃａｐａｎ−１及びＳＵＩＴ−２移植マウスでの播種個数の比較。

【図31】播種性転移モデルの腸管組織片のＨＲＰ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチン染色。

【図32】Ｃａｐａｎ−１移植マウスへのＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の血中投与による抗腫瘍効果：（Ａ）Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＢＣ２ＬＣＮ投与群と比較したＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８投与群での播種消失効果。（Ｂ）マウスの体重変化。（Ｃ）全身状態、腹水貯留状態のＣｏｎｔｒｏｌ群との比較。

【図33】毒性実験：マウス（６週メスＷＴマウス）に、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を１μｇ〜１５μｇ腹腔内投与した場合の致死率

【図34】Ｃａｐａｎ−１の培養上清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った結果を示す図である。

【図35】がん移植マウスの血清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った結果を示す図である。

【図36】がん摘出術前後の患者血清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った結果を示す図である。

【図37】がん摘出術前後の患者血清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った結果を示す図である。

【図38】大腸がん患者の患者血清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

１．がん細胞検出試薬及びがん細胞分離用試薬
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチン
本発明に係るがん細胞検出試薬及びがん細胞分離用試薬は、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む。ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、がん細胞表面に存在する「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（Ｈタイプ１糖鎖）」及び「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（Ｈタイプ３糖鎖）」（以下、両者を併せて「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」ともいう。）に高い親和性をもって結合し、がん細胞に高い特異性をもって反応する。さらに、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、がん組織中のがん細胞あるいは培養がん細胞の細胞表面から遊離して体液中あるいは培養上清中に存在する「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」にも結合する。本発明において「がん細胞特異的プローブ」というとき、「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」を含むプローブをいう。

【0035】

「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」は、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来レクチンであり、ＢＣ２Ｌ−Ｃと呼ばれるタンパク質のＮ末端ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ−ＧＩ登録番号：ＹＰ＿００２２３２８１８）に相当する（非特許文献３）。ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、３量体を形成し、２つのサブユニット間で糖鎖を挟みこむような状態で認識することが知られている。
糖鎖アレイを用いた解析から、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは未分化糖鎖マーカーとして知られるＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを認識することが明らかになっている。
ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、糖鎖を含まないので形質転換細菌によっても大量生産可能である。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ−ＧＩ登録番号：ＹＰ＿００２２３２８１８（Ｇｅｎｏｍｅ ＩＤ：２０６５６２０５５）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするＢＣ２ＬＣＮ遺伝子を宿主に対して最適化し、形質転換大腸菌などから発現させて、通常のタンパク質精製手段により精製することができる。本発明の実施態様で用いた組換え型ＢＣ２ＬＣＮを、以下「ｒＢＣ２ＬＣＮ」ともいう。

【0036】

「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」の糖鎖構造は、ＧｌｃＮＡｃの４位の位置の水酸基は単糖（好ましくはフコース）又は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖（好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖）で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、がん細胞表面では、膜構成成分として、ＧｌｃＮＡｃの１位の位置で糖タンパク質、糖脂質又は糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、体液中あるいは培養上清中に分泌されている糖鎖構造としても、ＧｌｃＮＡｃの１位の位置で、ＯＨ基、又は他の糖類、タンパク質、若しくは脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合していてもよい。すなわち、当該糖鎖構造は、下記（式１）として表すことができる。

【0037】

（式１）

【化1】

（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖、例えば、４αＦｕｃ基を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子を表す。）

【0038】

同様に、「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の糖鎖構造は、ＧａｌＮＡｃの１位の位置の水酸基は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖（好ましくは２〜５の糖からなる糖鎖）で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、がん細胞表面では、膜構成成分として、ＧａｌＮＡｃの１位の位置で糖タンパク質、糖脂質又は糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、体液中あるいは培養上清中に分泌されている糖鎖構造としても、ＧａｌＮＡｃの１位の位置で、ＯＨ基、又は他の糖類、タンパク質、若しくは脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合している。すなわち、当該糖鎖構造は、下記（式２）として表すことができる。

【0039】

（式２）

【化2】

（Ｒ１はＯＨ基、若しくは任意の糖鎖、例えば、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ基を表す。Ｒ２はＯＨ基、又は任意の糖鎖、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子を表す。）

【0040】

本発明において「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」というときＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの糖鎖構造を特異的に認識する特性を維持していれば、配列番号１の全長でないフラグメントであってもよく、タグ配列、標識タンパク質のアミノ酸配列などが付加した融合タンパク質であってもよい。また、配列番号１において全長の１０％未満のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加されている場合であってもよい。すなわち、本発明において「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」というとき、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの改変体も含む。

【0041】

ＢＣ２ＬＣＮレクチンとしては、配列番号１に対応する全長は必要とせず、また配列番号１において部分的に一部のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加されている場合であっても、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを特異的に認識する特性を維持していればよい。
具体的には、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、例えば、以下のように表現することができる。
「配列番号１に示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ又はＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの糖鎖構造を特異的に認識するタンパク質。」
なお、ここで、数個とは２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、特に好ましくは２個を表す。

【0042】

（２）ＢＣ２ＬＣＮレクチンの標識化方法
本発明のＢＣ２ＬＣＮレクチンを標識化するには、常法により蛍光や酵素、核酸鎖、ビオチン、磁気ビーズ等を用いる。用途によって好ましい標識物質種は異なる。例えば細胞染色やフローサイトメトリー解析には蛍光標識が好ましく、その際の好ましい蛍光色素としては、「Ｃｙ３」、「Ｃｙ５」、「ＦＩＴＣ」、「Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ６４７」、「ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ」、「ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ」などが例示できる。ＢＣ２ＬＣＮレクチンを標識化する際に、アミノ酸配列中の任意の部位に蛍光標識アミノ酸を導入する公知の芳坂らの方法（Ｉｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ， １０， ９９９−１００６）を用いれば、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの特定の部位に蛍光標識アミノ酸を導入した変異体を作製することができる。
細胞分離に用いる際は、蛍光色素以外にも磁気ビーズによる標識も有用である。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの手法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｊａ／ｈｏｍｅ／ｃｌｉｎｉｃａｌ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ−ｔｅｓｔ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ−ｉｖｄ−ａｓｓａｙｓ／ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ−ｄｙｎａｂｅａｄｓ−ｏｅｍ−ｓｕｐｐｌｙ．ｈｔｍｌ）等を用いれば、磁気ビーズ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを作製することができる。
また、光が透過しない大きな組織内での分布を検証する際は、「ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ」、「ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ」等の酵素や「ビオチン−アビジン反応を利用した検出システム」を用いることができる。その際、Ｄｏｊｉｎｄｏ社の手法（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｍｉｎｏｗｅｂ．ｄｏｊｉｎｄｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｇｏｏｄｓｒ７．ｎｓｆ／ＢｙＩｔｅｍＬＩｎｆｏ／０８？ＯｐｅｎＤｏｃｕｍｅｎｔ）等を利用して、ＮＨＳ基やマレイミド基で活性化した酵素やビオチンを用いることで、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの一級アミノ基（ＮＨ_２基）やチオール基（ＳＨ基、スルフヒドリル基）に標識することができる。

【0043】

２．がん細胞検出方法及び分離方法
（１）被検試料
本発明に係るがん細胞検出方法及び分離方法において、被検試料は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを細胞表面に発現しているがん細胞（ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞）を含む可能性がある、臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織もしくはその周辺組織とすることができる。また、被検試料は、生検材料に由来する、ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞を含む可能性がある組織試料又は細胞試料であってよい。さらに、被検試料は、ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞を有すると疑われる被検個体から採取された体液試料（全血、血清、血漿等の血液由来の試料、間質液、リンパ液、唾液、胃液、尿、脳脊髄液及び組織抽出液等）であってもよい。中でも、被験個体への負担等を考慮すると、体液試料、特に血液由来試料が好ましい。
腫瘍組織に含まれるがん細胞は、該腫瘍組織を原発巣とするがん細胞に限られず、他の臓器、器官又は組織から転移したがん細胞であってもよい。
ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞には、生体内でがん化した細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離後培養されたがん細胞が包含される。

【0044】

がん細胞としては、舌がん、喉頭がん、咽頭がん、食道がん、肺がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵がん、大腸がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、前立腺が、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、乳がん、甲状腺がん、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞種、骨髄腫、メラノーマなどのがん細胞、並びに、脳腫瘍などの悪性腫瘍及び悪性肉腫などの細胞が挙げられる。
ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、上皮性がん、特に消化器系上皮性がんと乳がんに反応性を有し、なかでも大腸がん及び胆管がんに高い反応性を示すことが明らかになっている（実施例参照）。
従って、がん細胞としては、特に、舌がん、喉頭がん、咽頭がん、食道がん、肺がん、胃がん、十二指腸がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膵がん、大腸がん、腎がん、膀胱がん、尿路上皮がん、前立腺が、子宮がん、卵巣がん、乳がん及び甲状腺がん等の上皮性がんが好ましく、舌がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、肝がん、胆管がん、胆嚢がん、膵がん、及び大腸がん等の消化器系上皮性がんと乳がんがより好ましく、大腸がん及び胆管がんが特に好ましい。

【0045】

また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、高悪性度がん細胞、特に薬剤耐性がん細胞及びがん幹細胞に高い反応性を有することが明らかとなっている（実施例参照）。
従って、がん細胞としては、膵がん、胆管がん、胆嚢がん及び肺がん等の高悪性度がん細胞、及び上述したがん細胞のなかでも薬剤耐性を獲得した細胞あるいはがん幹細胞を挙げることができる。

【0046】

被検細胞の培養方法としては、培養容器内での接着細胞培養法が一般的に用いられる。接着培養に際しては、フィーダー細胞や細胞外基質抽出物等のコート剤でコートした、もしくは無コートのプラスチックディッシュに被検細胞を接着させる場合、及びビーズ表面などに接着して培養容器内に浮遊させる場合がある。また、培養液中に被検細胞を懸濁して直接浮遊させる浮遊細胞培養法、ソフトアガー中で足場無しでの培養を行う方法もありうる。

【0047】

（２）がん細胞検出方法及び分離方法の手順
本発明に係るがん細胞の検出方法は、被検試料に対してＢＣ２ＬＣＮレクチンを接触させる手順（Ａ）と、被検試料中のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ）の存在の有無又は存在量を測定する手順（Ｂ）と、を含む。
また、本発明に係るがん細胞の分離方法は、被検試料に対してＢＣ２ＬＣＮレクチンを接触させる手順（Ａ）と、ＢＣ２ＬＣＮレクチンが結合した細胞と結合しない細胞とを分離する手順（Ｃ）と、を含む。

【0048】

（２−１）手順（Ａ）
被検試料が細胞試料である場合、手順（Ａ）は以下のように実施できる。培養容器内で基材に接着した状態で被検細胞を培養している場合は、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む標識プローブ溶液を、被検細胞を覆っている溶液中に供給すれば、フィーダー細胞等の存在非存在には影響されずに、標識プローブがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに結合する。これによって、がん細胞が標識化される。
また、懸濁状態で被検細胞を培養している場合であっても、溶液中に当該標識プローブ溶液を供給すれば、標識プローブがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに結合する。これによって、がん細胞を標識化できる。

【0049】

被検試料が組織試料である場合、手順（Ａ）は以下のように実施できる。
そのままあるいは化学固定した組織片に、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む標識プローブ溶液を接触させる。これにより、標識プローブがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに結合し、組織片中のがん細胞が標識化される。
また、そのままあるいは化学固定した組織試料を定法に従って薄切し、スライドガラス上に貼り付けて病理切片とし、ここに標識プローブ溶液を接触させてもよい。これにより、標識プローブがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃに結合し、組織切片中のがん細胞が標識化される。
さらに、組織試料を酵素処理して解離させて細胞試料とし、上述した被検試料が細胞試料である場合の手順に従って実施してもよい。

【0050】

被検試料が体液試料である場合、手順（Ａ）は以下のように実施できる。
そのまま体液試料にＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む標識プローブ溶液を接触させる。
或いは、がん細胞特異的プローブを固相化した支持体に体液試料を接触させる。これにより、体液試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃが支持体に固相化されたプローブに捕捉される。支持体には、汎用のプレートやスライドグラス、メンブレン等を用いればよい。

【0051】

（２−２）手順（Ｂ）
被検試料が細胞試料である場合、手順（Ｂ）は以下のように実施できる。
被検細胞を接着培養する場合であっても浮遊培養する場合であっても、本発明のがん細胞特異的標識プローブ溶液を、被検細胞の培養液中に添加した後に、被検細胞表面の標識量を測定することでＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの存在の有無又は存在量を測定できる。これによって、がん細胞の存在を正確に検出、評価することができる。

【0052】

被検試料が組織試料である場合、手順（Ｂ）は以下のように実施できる。
組織試料を組織片のままあるいは組織切片として本発明のがん細胞特異的標識プローブ溶液に接触させた後、組織片表面又は組織切片の標識量を測定することで、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの存在の有無又は存在量を測定できる。これによって、がん細胞の存在を正確に検出、評価することができる。

【0053】

必要に応じ、緩衝液や生理食塩水等で液交換をすることで簡単に培地成分等の影響をとりのぞくことができる。また、がん細胞の標識量の測定は死細胞でも生細胞と同様に可能であるため、あらかじめ細胞をホルマリンなどによって化学固定することにより取り扱いが簡単になる。

【0054】

被検試料が体液試料である場合、手順（Ｂ）は以下のように実施できる。
自体公知の電気泳動法、ＨＰＬＣ等により分離後、標識量を測定することで、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの存在の有無又は存在量を測定できる。
被検試料が体液試料であり、そのままＢＣ２ＬＣＮレクチンを含む標識プローブ溶液を接触させる場合、手順（Ｂ）は、標識プローブが結合したＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを遊離の標識プローブから分離して測定する必要がある。該分離方法としては、例えばクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、例えばＬｉＢＡＳｙｓ（島津製作所（株）製）等の自動免疫分析装置を用いた方法等が挙げられる。その具体的な条件は、標識プローブが結合したＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃが分離できるように設定すればよく、その他の条件は、自体公知の方法に準ずればよい。例えばＨＰＬＣを用いて分離する場合、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５，５，６１３−６１６（１９９３）や特開平９−３０１９９５号に記載の方法に準じて行えばよく、キャピラリー電気泳動法を用いる場合には、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ５９３ ２５３−２５８ （１９９２）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６４ １９２６−１９３２ （１９９２）、ＷＯ２００７／０２７４９５等に記載の方法に準じて行えばよい。また、自動免疫分析装置として例えばＬｉＢＡＳｙｓを用いる場合、生物試料分析２２巻４号３０３−３０８（１９９９）に記載されている方法に準じて行えばよい。分離後、標識プローブが結合したＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ中の標識量を測定することで、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの存在の有無又は存在量を測定できる。
また、被検試料が体液試料であり、がん細胞特異的プローブを固相化した支持体に体液試料を接触させる場合、手順（Ｂ）は以下のように実施できる。
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃが捕捉された支持体に、ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ複合体に結合し得る標識抗体あるいは標識レクチン（例えば、Ｒ−１０Ｇ標識抗体）の溶液をさらに接触させた後、支持体表面の標識量を測定することで、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの存在の有無又は存在量を測定できる。
これによって、体液試料を採取した被検個体内のがん細胞の存在を正確に検出、評価することができる。

【0055】

（２−３）手順（Ｃ）
被検試料が細胞試料である場合、手順（Ｃ）は以下のように実施できる。
懸濁液中の細胞であれば、手順（Ａ）の後そのままセルソーターや磁気細胞分離装置によるがん細胞の単離に適用できる。懸濁液中の細胞であっても標識化できるという本発明のがん細胞特異的標識プローブの高い特異性と親和性は、特にがん細胞を単離する場合に、がん細胞に対する悪影響を少なくし、かつ簡便に行う為には極めて有利な特性であるといえる。

【0056】

以上のように、本発明のがん細胞特異的標識プローブは、生きたがん細胞でも化学固定により死んだがん細胞でも染色可能である。また、接着しているがん細胞でも浮遊しているがん細胞でも染色可能である。ここで、「浮遊しているがん細胞」という場合、「浮遊培養したがん細胞」の他に、「接着培養した後、タンパク質分解酵素処理をして浮遊させたがん細胞」のどちらも含み、培養液中の細胞の場合も、培地成分を取り除いた緩衝液や生理食塩水等の溶液中の細胞のいずれの場合もある。また、「接着しているがん細胞」という場合には、ディッシュ等の基材上で接着培養された状態のがん細胞も、ビーズ等の基材上に接着の上、浮遊培養したがん細胞の場合も含む。

【0057】

生体または死体から取得した試料内に存在するがん細胞の場合、その試料は化学固定されていてもいなくても構わない。また、酵素処理によって解離され、バッファー等に懸濁した形状も含む。また、凍結切片、樹脂等に包埋した上での切片としてスライドグラス等の基材に張り付いた状態も含む。

【0058】

（２−４）基材に接着されたがん細胞を検出する場合の具体的手順
本発明のがん細胞特異的プローブは、ビーズ状、中空糸状もしくは平板状の基材の上で培養したもしくは基材の上に貼り付けたがん細胞群内に存在するがん細胞を検出する場合に適用できる。
その場合は、基材が存在する溶液中にがん細胞特異的標識プローブを添加する。ここでいう「溶液」とは、培養液または、培地成分を除去した後の緩衝液や生理食塩水等であってよい。がん細胞表面で特異的に発現するＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとの反応性を、蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡなどで解析し、がん細胞を検出するのが一般的である。
このような解析方法によれば、生検を行う際に、蛍光などの標識が検出されなかった（バックグラウンド値と同レベルになった）サンプルは、がん細胞が存在していない試料であると評価できる。また、研究用等に維持をしているがん細胞の品質管理のためには、定期的にもしくは必要に応じて細胞サンプルを採取して、本発明のがん細胞特異的標識プローブによる蛍光強度などの標識強度を測定することができる。

【0059】

（２−５）溶液中に懸濁されたがん細胞を検出する場合の具体的手順
本発明のがん細胞特異的プローブは、溶液中のがん細胞を検出する場合にも適用できる。
その場合は、溶液中に、がん細胞特異的標識プローブを添加する。ここでいう「溶液」とは、培養液または、培地成分を除去した後の緩衝液や生理食塩水等であってよい。
本発明のがん細胞特異的標識プローブはがん細胞のみを直接蛍光標識などで標識化するため、フローサイトメトリー測定法が適用できる。
具体的には、生検等で採取した組織を酵素処理して解離し、がん細胞特異的標識プローブと反応させて、ＦＡＣＳ機器を用いてフローサイトメトリー解析を行うことにより、少量の試料でも確実にがん細胞が存在するかどうかの診断システムを提供することができる。
また、ＢＣ２ＬＣＮレクチンをスライドグラスなど透明基板上に固定化しておき、溶液中に懸濁したがん細胞含有被検試料を、そのまま、もしくは希釈して、又はあらかじめタンパク質画分のみに濃縮した後、「Ｃｙ３−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ」などで標識化して固定化ＢＣ２ＬＣＮレクチンと反応させて、プレートリーダー、蛍光スキャナー、エバネッセント波励起蛍光検出系などにより、その結合を測定してもよい。

【0060】

（２−６）がん細胞の分離方法の具体的手順
フローサイトメトリー測定法にセルソーターを併用することで、例えば、セルソーターを備えたフローサイトメーターを用いることで、がん細胞のみを単離することができる。
具体的には、生検等で採取した組織を酵素処理して解離し、がん細胞特異的蛍光標識プローブと反応させて、フローサイトメトリー法によりがん細胞を生きたまま分収出来る。
また、磁気ビーズ標識法で標識された場合には、生検等で採取した組織を酵素処理して解離し、がん細胞特異的磁気ビーズ標識プローブと反応させて磁気細胞分離装置に供給することでがん細胞のみを分収することができる。

【0061】

３．がん細胞の有無の検出用キット又は装置
本発明のがん細胞特異的プローブ（１）を、下記手段（２）及び（３）と共にキット又は装置とすれば、がん細胞の有無の検出用キット又は装置とすることができる。
（１）ＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識化剤、
（３）標識を検出するための手段又は装置。

【0062】

上記（１）及び（２）によれば、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを蛍光色素や酵素、ビオチン等で標識した、高がん細胞特異的標識プローブが提供される。また、（１）及び（２）の代わりに、予め標識化剤で結合したレクチンを、（３）と共にキット又は装置とすることもできる。
上記（３）は、例えば、蛍光標識の場合は、蛍光顕微鏡またはプレートリーダーであり、酵素標識やビオチン標識の場合は、イメージアナライザーなどがある。
また、上記のキット又は装置は、さらにＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖複合体（ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ複合体）に結合する標識抗体、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖複合体に結合する抗体を含んでいてもよい。

【0063】

装置は、がん細胞特異的標識プローブを細胞表面又は組織表面に接触せるか、あるいは体液試料中に当該プローブを添加するための手段（例えば自動分注装置）を有していてもよい。これにより、がん細胞の解析を自動化することができる。ただし、当該手段は手作業でも可能なので必須ではない。

【0064】

４．がん細胞の分離用キット又は装置
下記手段（２）と共にキット又は装置とすれば、細胞表面にＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを発現している高悪性度がん細胞のみを単離すること
（１）標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチン、
（２）標識を検出して標識された細胞を分離するための手段又は装置。

【0065】

上記（１）は、がん細胞特異的標識プローブ（蛍光色素や酵素、ビオチン等もしくは磁気ビーズで標識したＢＣ２ＬＣＮレクチン）である。
上記（２）は、蛍光標識や磁気ビーズ標識等の標識を検出して分離するための手段又は装置である。例えば、セルソーターを備えたフローサイトメトリー、または磁気細胞分離装置である。

【0066】

装置は、がん細胞特異的標識プローブを細胞表面又は組織表面に接触せるか、あるいは体液試料中に当該プローブを添加するための手段（例えば自動分注装置）を有していてもよい。ただし、当該手段は手作業でも可能なので必須ではない。

【0067】

本発明のがん細胞特異的標識プローブによれば、がん細胞を正常細胞から分収することができるため、がん細胞を単離することができる。さらに、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは特に高悪性度がん細胞に高い反応性を有するので、高悪性度がん細胞を、低悪性度がん細胞もしくは正常細胞から分離することもできる。

【0068】

５．がんの診断方法及び治療効果の判定方法並びにこれらの方法のためのデータ収集方法
本発明においては、被験個体から採取した被検試料におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の発現の有無又はその発現量を測定し、がん細胞の有無を判定する。また、その結果から、被験個体ががんに罹患しているか否か、または罹患したがんの予後や治療効果の判定を行う。本発明は、がんの検出、がんの悪性度もしくは薬剤耐性の獲得度の判定、予後や治療効果の判定を行うための検査方法、検査試薬、検査キットを含む。

【0069】

本発明に係るがんの診断方法及び治療効果判定方法に供される被検試料は、上述のがん細胞検出方法及び分離方法における被検試料と同様である。また、被験個体とは、がんに罹患しているか否かが判明していない個体又はがんに罹患していることが判明している個体であり、さらに手術、抗がん剤投与など治療後の個体をも含む。前者の場合は、個体ががんに罹患しているか否かと共にその悪性度もしくは薬剤耐性の獲得度を判定することができ、後者の場合は予後を判定し、あるいは治療効果の判定を行うことができる。

【0070】

本発明に係るがんの診断方法は、がんの罹患が疑われる被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人と比較して有意に高レベルであるとき、被験個体ががんに罹患している又はがんに罹患している可能性が高いと判定する。
本発明に係るがんの診断方法は、がんに罹患している被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順を含み、当該存在量が健常人又は悪性度の低いがん患者と比較して高レベルであるとき、被験個体の予後が不良であると判定することもできる。
本発明に係るがんの治療効果判定方法は、がん治療が施された被験個体の被検試料に対し、ＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量を測定する手順、及び、当該存在量を、あらかじめ測定された前記治療前の被験個体の被検試料のＢＣ２ＬＣＮレクチン結合活性を有する糖鎖の存在量と比較する手順を含み、治療前に比して治療後の前記存在量が有意に低レベルであるとき、前記治療が有効であると判定する。

【0071】

＜組織切片を用いた、がんの診断方法＞
がんに罹患した被験個体の臓器、器官又は組織から摘出した腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作製する。得られた組織切片を酵素、蛍光などで標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチンで染色し、その組織像を顕微鏡観察する。染色が確認できれば、がんの存在が検出でき、レクチンアレイ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡを行うことで定量化でき、がんの悪性度を判定することもできる。

【0072】

＜生検材料を用いたがんの診断方法＞
蛍光標識ＢＣ２ＬＣＮレクチン含有溶液を組織試料又は細胞試料に対して反応させることで、生検材料中にがん細胞が存在するか否かを確認することができ、生検材料中に含まれるがん細胞の含有割合を測定できる。そして、測定された蛍光強度から、生検材料中のがん細胞の悪性度を評価することもできる。その際、組織試料又は細胞試料を固定化して用いてもよいが、固定化していない細胞試料を蛍光標識し、フローサイトメトリー測定法を適用することで、より定量的ながん細胞の悪性度の評価が可能となり、セルソーターを併用することで、蛍光染色されたがん細胞の生検試料中の割合を正確に測定できる。組織試料もしくは細胞試料から、公知の方法で膜タンパク質画分を分離した後、緩衝液もしくは生理食塩水に懸濁させて測定工程に供することもできる。この場合の測定方法は、次に説明する体液試料を用いた測定方法に準ずる。

【0073】

＜体液試料を用いた測定方法＞
被検試料として血液などの体液試料を用いる場合は精製工程を経ることなくそのまま、もしくは希釈して、又はあらかじめタンパク質画分のみに濃縮して測定工程に供することができる。
ＢＣ２ＬＣＮレクチンをスライドグラスなど透明基板上に固定化し、「Ｃｙ３−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ」などで標識化した被検試料溶液を直接反応させて、エバネッセント波励起蛍光検出系で、その結合を測定する。
または、ＢＣ２ＬＣＮレクチンをＥＬＩＳＡプレート、磁気ビーズ、フィルターなどの支持体に固定化したものに対して酵素、蛍光、ビオチンなどで標識化した被検試料を反応させ、両者の結合強度を発色、発光、蛍光などを測定して検出することもできる。その際、被検試料反応後の溶液中に、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖複合体に結合する標識抗体や標識レクチンを添加して反応させるサンドイッチアッセイ法を採用することもできる。特に、「レクチン‐レクチンサンドイッチ法」又は「レクチン−抗体サンドイッチ法」を用いることで、より高感度な測定が可能となる。なかでも、レクチンと抗体を用いる方法が好ましい。 ＢＣ２ＬＣＮレクチンは極めて感度がよいので、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した支持体に対して、被検試料溶液を反応させる際に、被検試料中のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖量は、ピコモル（ｐＭ）又はナノモル（ｎＭ）レベルでも存在、非存在を判別できるため、被検試料が血清の場合、０．１〜１０μｌ程度を採取して測定することも可能である。

【0074】

また、被検試料を、既知のがんマーカーに対する抗体やレクチンを固定化した支持体に被検試料を反応させて、酵素、ビオチン、蛍光などで標識化したＢＣ２ＬＣＮレクチンを反応させ、蛍光染色、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、レクチンブロッティングなどの公知の方法で検出することも可能である。

【0075】

本発明において、上記した方法に用いられる抗体としては、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに対する抗体あるいはＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ複合体（ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖複合体）に結合し得る標識抗体等が挙げられる。このような抗体には、ハイブリドーマＲ−１０Ｇ（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０１）が産生するＩｇＧ抗体が好ましく用いられる。

【0076】

ここで、本発明において「抗体」の用語には、「抗体の機能性断片」も含まれるものとする。「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の機能性断片に含まれる。ただし抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。機能性断片には、抗体タンパク質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生されたタンパク質も含まれる。

【0077】

本発明におけるがん細胞の有無の検出方法の手順には、被検試料とレクチンと抗体とを接触させてレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃと抗体とから構成される複合体を形成させる複合体形成手順と、複合体を検出する検出手順と、が含まれる。以下、ＢＣ２ＬＣＮレクチン及びＲ−１０Ｇ抗体を用いる場合を例に具体的に説明する。

【0078】

複合体形成手順では、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとＲ−１０Ｇ抗体を同時に被検試料と接触させてもよいが、被検試料とＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させた後にＲ−１０Ｇ抗体を反応させることがより好ましい。すなわち、複合体形成手順は、被検試料とレクチンとを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと被検試料に含まれるＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとから構成される第一の複合体（ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ複合体）を形成させる第一手順と、第一の複合体とＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体（ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ−Ｒ−１０Ｇ抗体）を形成させる第二手順と、からなることが好ましい。

【0079】

複合体形成手順は、Ｂ／Ｆ分離を行わないホモジニアスな方法で行っても、不溶性担体を用いてＢ／Ｆ分離を行うヘテロジニアスな方法で行ってもどちらでもよい。

【0080】

ホモジニアスな方法で行う場合は、例えば以下の手順により実施することができる。
〔方法１〕
（ｉ）被検試料と、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のＢＣ２ＬＣＮレクチンと、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体との複合体を形成させ、
（ｉｉ）該複合体の量を測定し、
（ｉｉｉ）得られた該複合体の量に基づいて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ量を測定する。

【0081】

〔方法２〕
（ｉ）被検試料と、（不溶性担体に固定化されていない）遊離のＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＢＣ２ＬＣＮレクチンとの複合体−１を形成させ、次いで
（ｉｉ）該複合体−１と（不溶性担体に固定化されていない）遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体との複合体−２とを形成させ、次いで
（ｉｉｉ）該複合体−２の量を測定し、
（ｉｖ）得られた該複合体−２の量に基づいて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ量を測定する。

【0082】

〔方法３〕
（ｉ）試料と、遊離のＢＣ２ＬＣＮレクチンと、標識物質で標識した遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃと標識Ｒ−１０Ｇ抗体との複合体を形成させ、
（ｉｉ）該複合体中の標識物質量を測定し、
（ｉｉｉ）得られた標識物質量に基づいて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ量を測定する。

【0083】

〔方法４〕
（ｉ）試料と遊離のＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＢＣ２ＬＣＮレクチンとの複合体−１を形成させ、次いで
（ｉｉ）該複合体−１と、標識物質で標識した遊離の標識Ｒ−１０Ｇ抗体とを接触させて、複合体−１と標識Ｒ−１０Ｇ抗体との複合体−２を形成させ、次いで
（ｉｉｉ）該複合体−２中の標識物質量を測定し、
（ｉｖ）得られた標識物質量に基づいて、試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃを測定する。

【0084】

被検試料の量、及びこれらと反応させるレクチン及び抗体の量（濃度）は、細胞の種類、要求される測定感度、用いる測定方法や測定装置などに応じて適宜設定される。

【0085】

不溶性担体を用いてＢ／Ｆ分離を行う方法は、例えば、不溶性担体に結合したＢＣ２ＬＣＮレクチンと、不溶性担体に結合していないＲ−１０Ｇ抗体と、被検試料とを接触させて複合体を形成させることにより行われる。
より具体的には、Ｂ／Ｆ分離を行う方法は、被検試料と、不溶性担体に結合したＢＣ２ＬＣＮレクチンとを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとから構成される第一の複合体を得る第一手順と、第一の複合体と遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを接触させて、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体を得る第二手順と、によって行われる。

【0086】

Ｂ／Ｆ分離のための不溶性担体には、スライドグラス、ＥＬＩＳＡプレート、磁気ビーズ、フィルター、フィルム、メンブレンなど、通常のタンパク質固定化法に用いられる基材を使用できる。基材の材料には、通常、ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン又はポリウレタンなどが用いられる。

【0087】

レクチンを不溶性担体に固定化させる方法は、特に限定されず、化学的結合法（共有結合により固定化する方法）、物理的に吸着させる方法などの公知の方法を適用できる。アビジン−ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用してレクチンを不溶性担体に固定化することも可能である。この場合、レクチンにビオチンを結合したビオチン化レクチンを、ストレプトアビジンをコーティングしたストレプトアビジンプレートに固定化すればよい。また、この分野で通常使用される各種リンカーを介して、レクチンを不溶性担体に固定化させてもよい。

【0088】

不溶性担体を用いてＢ／Ｆ分離を行う方法では、被検試料と不溶性担体に固定化されたＢＣ２ＬＣＮレクチンとを反応させる第一手順の後、第一の複合体と遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを反応させる第二手順を行う前に、固相表面上から不要な物質を除去するための洗浄手順を含んでもよい。また、第二手順の後、検出手順を行う前にも、洗浄手順を含んでもよい。洗浄手順によって、固相表面上から試料中の夾雑物や未反応のＲ−１０Ｇ抗体を除去し、第二の複合体のみを固相表面上に分離できる。

【0089】

Ｂ／Ｆ分離を行わない方法では、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体との複合体を分離するための方法として、例えばクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、例えばＬｉＢＡＳｙｓ（島津製作所株式会社製）等の自動免疫分析装置を用いた方法等を適用できる。
その具体的な条件は、自体公知の方法に準ずればよい。例えばＨＰＬＣを用いて分離する場合、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５，５，６１３−６１６（１９９３）や特開平９−３０１９９５号に記載の方法に準じて行えばよく、キャピラリー電気泳動法を用いる場合には、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ５９３ ２５３−２５８ （１９９２）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６４ １９２６−１９３２ （１９９２）、ＷＯ２００７／０２７４９５等に記載の方法に準じて行えばよい。また、自動免疫分析装置として例えばＬｉＢＡＳｙｓを用いる場合、生物試料分析２２巻４号３０３−３０８（１９９９）に記載されている方法に準じて行えばよい。

【0090】

検出手順は、標識物質を用いてＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとＲ−１０Ｇ抗体とから構成される第二の複合体を検出することにより行うことができる。標識物質としては、例えば、通常の免疫測定法等において用いられる酵素類、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、補酵素又は補酵素と特異的に結合するもの（ビオチン、アビジン）、タグ、紫外部〜赤外部に吸収を有する物質、発色性微粒子、蛍光性微粒子、金属性微粒子、磁性物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質など、通常この分野で用いられている標識物質が挙げられる。

【0091】

標識物質をＢＣ２ＬＣＮレクチン及び／又はＲ−１０Ｇ抗体、好ましくはＲ−１０Ｇ抗体に結合させるには、例えば、通常の免疫測定法等において行われている標識方法を適宜利用して行えばよい。また、１個又は数個のアミノ酸を介して、又は１個又は数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識物質を結合させる方法も採用できる。さらに、標識物質をタンパク質に結合させるキットも各種市販されているので、それらを用い、キットに添付の取扱説明書に従って標識を行ってもよい。

【0092】

例えば、不溶性担体に固定化したＢＣ２ＬＣＮレクチンと、標識物質として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識した遊離のＲ−１０Ｇ抗体とを用いてＢ／Ｆ分離を行う方法は、概略以下の通りである。

【0093】

被検試料を、ＢＣ２ＬＣＮレクチンを固定化した不溶性担体に接触させ、４〜４０℃で３分〜２０時間、反応を行って、固相表面上にＢＣ２ＬＣＮレクチンとＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃとの第一の複合体を生成させる。次に、ＨＲＰで標識したＲ−１０Ｇ抗体を含有する溶液を固相表面上に加え４〜４０℃で３分〜１６時間反応させて、固定化ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ−標識Ｒ−１０Ｇ抗体の第二の複合体を生成させる。続いて、適当な濃度のＴＭＢ（３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を添加し、一定時間反応させる。その後、１Ｍ硫酸等の反応停止液を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。得られた測定値と、予め濃度既知のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの溶液について同様の測定を行って得た検量線とから、被検試料中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ（（式１）又は（式２）で表される糖鎖）の量を求めることができる。

【0094】

また、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ等で標識したＢＣ２ＬＣＮレクチンと、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６４７ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ等で標識したＲ−１０Ｇ抗体を用い、公知の蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ＦＣＣＳ）に従って（式１）又は上記（式２）で表される糖鎖を測定することもできる。

【0095】

また、「ＢＣ２ＬＣＮレクチン−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ−Ｒ−１０Ｇ抗体」の複合体の検出は、標識物質を用いることなく、例えば複合体に由来する性質を利用して測定する方法、具体的には表面プラズモン共鳴などのホモジニアスイムノアッセイ系等の方法によっても行うことが可能である。

【0096】

なお、本発明に係るレクチン‐抗体サンドイッチ法は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系に適用して容易かつ迅速に測定を行うこともできる。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせなどについては、特に制限はなく、適用する自動分析装置の環境や機種に合わせて、あるいは他の要因を考慮に入れて最もよいと思われる試薬類等の組み合わせを選択して用いればよい。さらに、本発明に係るレクチン‐抗体サンドイッチ法は、Ｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：μ−ＴＡＳ、μ総合分析システム）への応用も可能である。

【0097】

上記した体液試料を用いた具体的な測定方法は、本発明のがん細胞の検出方法に於いても用いることができる。

【0098】

＜悪性度の判定＞
がんの悪性度の判定の場合、被験個体の被検試料で測定されたＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖発現量が、健常人又は悪性度の低いがん患者と比較して高レベルであるとき、被験個体のがんの悪性度が高いと判定する。被験個体のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量を測定する際に、健常人又は悪性度の低いがん患者のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量をコントロールとして測定し、比較してもよい。また、あらかじめ健常人又は悪性度の低いがん患者の被検試料中のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量を測定しておき、発現量のカットオフ値を定め、被験個体の被検試料中のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量がカットオフ値を超えた場合に、該被験個体のがんの悪性度が高いと判断することができる。この際、被検試料が細胞試料の場合、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量は、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖を発現している細胞の割合で表してもよい。ＢＣ２ＬＣＮは、特異的にがん細胞を検出することができ、特に悪性度の高いがん細胞との結合活性が高いから、がんの早期の段階での検出、及び悪性度の評価が可能である。本発明は、被験個体ががん、特に悪性度の高いがんに罹患しているかどうかを判断するための検査方法でもあり、被験個体ががん、特に悪性度の高いがんに罹患しているかどうかを判断するためのデータを収集する方法も包含する。

【0099】

＜治療方法の決定＞
がんに罹患している被験個体のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量により、がんの治療効果を判定することもできる。例えば、被験個体のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量に応じて、化学療法、後述する本発明のＢＣ２ＬＣＮ−毒素製剤治療を組み合わせた併用療法、外科的療法等の治療方法を決定することができる。

【0100】

例えば、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量が低い場合、抗がん剤の奏効を期待して化学療法を選択することができ、一方、発現量が高い場合は、悪性度が高く化学療法での延命効果は低いと判断することができ、ＢＣ２ＬＣＮ−毒素製剤治療を組み合わせた併用療法を選択するか、又は疼痛緩和ケアを選択することができる。がん患者の被検試料中のＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量を定期的に測定することにより、その都度適切な治療方法を決定することができる。本発明は、がんに罹患している被験個体の治療方法を選択するための検査方法でもあり、がんに罹患している被験個体の治療方法を選択するためのデータを収集する方法も包含する。

【0101】

＜予後・治療効果の判定＞
膵がんなどがんに罹患している被験個体の被検試料で測定したＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量により、患者の予後を判定できる。例えば、ＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量が高い場合に、予後が不良であると評価することができる。本発明は、被験個体の予後を予測するための検査方法でもあり、被験個体の予後を予測するためのデータを収集する方法も包含する。
また、がんに罹患している被験個体に、手術などの外科的治療、抗がん剤治療などの化学的、免疫学的治療、放射線治療などが施された場合に、治療前の被検試料と治療後の被検試料とのＢＣ２ＬＣＮ陽性糖鎖の発現量の差異を観察することで、施された治療の治療効果の有効性を判定することができる。

【0102】

６．がん細胞内への物質導入試薬
（６−１）ＢＣ２ＬＣＮレクチンの細胞内移行能
本発明者らは、以前、ＢＣ２ＬＣＮレクチンが未分化細胞表面のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ又は当該糖鎖を含有する膜タンパク質もしくは脂質への結合を介して未分化細胞内に移行すること、さらにこの際ＢＣ２ＬＣＮに融合させた化合物が未分化細胞内に導入されることを確認した。そして、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに、細胞内で毒性を発揮する毒素を融合させた「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」薬剤が、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞由来移植用細胞に残存するヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞のみを特異的にかつ効率的に除去できることを見いだした（特許文献１９）。

【0103】

本発明では、新たに、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと細胞殺傷性毒素との融合タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞を非常に効率よく殺傷し、顕著な抗腫瘍効果を示すことが見出された（実施例参照）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるがん細胞障害活性に加えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示すは、臨床応用の面で有利な効果である。なぜなら、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、正常組織への副作用や、プロテアーゼなどにより速やかに分解除去されてしまうなどの課題が存在するためである。
がん細胞への特異性及び親和性に優れたＢＣ２ＬＣＮレクチンに毒素又はその細胞殺傷能力のあるドメインを融合させた融合タンパク質により、がん細胞を処理することでがん細胞を特異的かつ効率的に殺傷できる。

【0104】

（６−２）融合可能な毒素について
本発明のがん細胞殺傷剤としては、特許文献１９に記載の「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体を用いることができる。
ここで、本発明の「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体というときの「毒素」は、がん細胞の内部で毒性を発揮する物質の総称として用いられており、毒素タンパク質や毒性低分子化合物及びＲＮＡｉ物質、アンチセンス核酸、リボザイムなどの細胞障害性の核酸などの他、シクロフォスミドやドセタキセル、又はＧＥＭなど既知の抗がん剤も含まれる。毒素タンパク質は、細胞毒性を有するタンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどを示し、「毒性低分子化合物」というとき、抗生物質、色素など、毒素タンパク質及び核酸以外の毒性化合物の全てを含む。
これら毒素のうち、「ＢＣ２ＬＣＮ」に融合させた「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素融合体」としてがん細胞に作用させた場合に、がん細胞内で細胞障害・殺傷機能を発揮できる毒素、特に細胞内でのタンパク質合成阻害作用を有するタンパク質毒素、ＲＮＡｉ物質などの核酸類、もしくは低分子化合物毒素が好ましい。また一般に、タンパク質合成阻害作用を有する毒素は、細胞表面に特異的レセプターを有しているため、野生型の全長毒素タンパク質を用いると、ＢＣ２ＬＣＮとの融合体としても無差別的に正常細胞に対しても細胞毒性を発揮する可能性があり、大きな副作用が予測される。したがって、あらかじめ毒素タンパク質からレセプター結合ドメインを削除するか、又はタンパク質への変異導入など、毒素タンパク質細胞表面の特異的レセプターへの結合性を失わせる工夫をすることが好ましい。このような改変方法は、当業者にとって周知である。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが産生する外毒素である緑膿菌毒素（ＰＥ）の場合、ＰＥレセプターへの結合部位を有し、正常細胞と結合活性のあるドメインＩ領域を遺伝子レベルで除去したＰＥ改変体が知られている（非特許文献８）。

【0105】

ＢＣ２ＬＣＮレクチンに予想される高次構造への影響をできるだけ少なくし、かつ大きな細胞殺傷効果が期待できる細胞殺傷能力のあるドメインを用いることが好ましい。このようなドメインとして緑膿菌の外毒素Ａ（ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）由来の細胞殺傷ドメイン（ＥＴＡ）領域を利用した、「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ」融合体が好ましく用いられる。具体的には、先の特許文献１９の記載に従い、緑膿菌の外毒素Ａ（ＰＤＢ登録番号：１ＸＫ９）のうち殺傷能力のあるドメイン領域（「ＥＴＡ」）に対応するアミノ酸配列をコードする遺伝子を適宜大腸菌などの宿主に対して最適化し、スペーサー配列などで繋いで「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（配列番号２）」などを設計でき、形質転換した宿主から大量生産することができる。その際、当該細胞殺傷ドメイン領域中の長さは適宜調製し、細胞殺傷活性の高い配列を選択することができる。例えば、本発明の実施例で用いた「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（ＰＥ２３）」融合体は、前記細胞殺傷ドメイン（ＥＴＡ）領域の部分領域２３ ｋＤａ（「ＥＴＡ（ＰＥ２３）」）を「ＧＳＧＧＧ」の２回繰り返し配列をリンカーとしてＢＣ２ＬＣＮと結合させ（配列番号２）、Ｃ末端にＥＲ保留シグナル（配列番号６）を結合するように設計されており、以前に本発明者らにより未分化細胞除去剤としても用いられた（特許文献１９、非特許文献１）。さらに、本実施例では、前記細胞殺傷ドメイン領域の３８ｋＤａ部分（ＰＥ３８）（配列番号３）を図１のように直接ペプチド結合させた「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（ＰＥ３８）」融合体を調製して膵がん細胞殺傷剤として用いている。
ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８は、従来のＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（ＰＥ２３）に比べて１００倍以上もの驚くべき殺傷効果を示す。「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ２３）」は、細胞殺傷能力のあるドメインとして、ＥＴＡの触媒ドメイン（ｄｏｍａｉｎＩＩＩ）のみからなる２３ ｋＤａのドメイン（ＰＥ２３）を用い、ペプチドリンカーによってＢＣ２ＬＣＮと結合させた融合タンパク質である。「ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８」は、ｄｏｍａｉｎＩＩ及びｄｏｍａｉｎＩｂも含む３８ ｋＤａのドメイン領域（ＰＥ３８）を用い、ペプチド結合によってＢＣ２ＬＣＮと結合させた融合タンパク質である。リンカー配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの２回繰り返し配列である（配列番号２）。
融合タンパク質化した「ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ」がＢＣ２ＬＣＮレクチンとほぼ同じ糖鎖結合特性を保持していること、及び「ＢＣ２ＬＣＮ− ＥＴＡ」が、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと同様に、正常なヒト分化細胞には全く影響を与えないことが確認されている（特許文献１９、非特許文献９）。

【0106】

本発明においてＢＣ２ＬＣＮレクチンと融合させることができる他の各種毒素タンパク質の塩基配列、アミノ酸配列も商用データベースから取得できる。具体的には、ジフテリアトキシン（ＰＤＢ登録番号：１ＭＤＴ）、リシン（ＰＤＢ登録番号：２ＡＡＩ）、サポリン（ＰＤＢ登録番号：３ＨＩＳ）、コレラトキシン（ＰＤＢ登録番号：１ＸＴＣ）、エンテロトキシン（ＰＤＢ登録番号：１ＬＴＨ）、百日咳毒素（ＰＤＢ登録番号：１ＰＲＴ）などがある。これら毒素タンパク質全長でなくても、その細胞殺傷能力のあるドメイン領域を含んでいればよい。なお、タンパク質毒素ではない場合でも、リンカーまたはスペーサーを結合することができる毒素化合物であれば、同様に用いることができる。

【0107】

（６−３）融合方法
ＢＣ２ＬＣＮレクチンとがん細胞内に輸送しようとする標的物質とを融合させる方法としては、化学的な方法と遺伝子レベルで連結する方法とがあり、化学的な方法の場合には共有結合の他にビオチン−ストレプトアビジン結合などがある。また、ＦＩＴＣなどの低分子化合物の場合は、ＢＣ２ＬＣＮとの通常の化学反応により、ＢＣ２ＬＣＮの表面の官能基（水酸基、アミノ基など）に対してランダムに共有結合、水素結合などの結合様式により結合し、ＢＣ２ＬＣＮ融合体を形成できる。

【0108】

たとえば、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと毒素との融合法は、共有結合による融合体化が好ましく、低分子化合物も含めて一般的な手法として二価性架橋剤などの化学的な結合方法を用いることができ、ｓｉＲＮＡなどＲＮＡｉ物質を結合させる場合は、ビオチン−ストレプトアビジン結合、もしくはＢＣ２ＬＣＮレクチンと正電荷を帯びたＤＮＡ結合性ペプチド（例えば、プロタミン由来のＡｒｇリッチなクラスター配列；Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ｓｅｐ；８（９）：２６７４−８３）との融合タンパク質などを用いる。
一方、ＲＮＡｉなどの核酸は、通常マイナス電荷を帯びているため、同様にマイナスに荷電しているがん細胞表面に直接接しないように、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと正電荷を帯びたＤＮＡ結合ペプチドとからなる融合タンパク質と核酸との間で予めコンプレックスを形成させるなどの工夫を行うことが好ましい。

【0109】

毒素がタンパク質毒素の場合は、遺伝子レベルで結合することが好ましく、その際には両遺伝子を、直接、又は一般的なＤＮＡリンカーを用い、周知の方法により繋ぐことができる。
ＢＣ２ＬＣＮレクチンを毒素とスペーサー配列を介して融合タンパク質化した際にも、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの多量体形成能や結合特性が変化しないことは以前に確認している（特許文献１９）。遺伝子レベルで結合させた毒素融合タンパク質は、ロット間差のない、均一なタンパク質として調製することが可能なため、安定供給可能ながん細胞除去剤として特に期待される。コンジュゲート法として、ビオチン−ストレプトアビジン系などを用いて後からＢＣ２ＬＣＮレクチンに毒素を連結させることもできるが、手間もかかる上に、ＢＣ２ＬＣＮレクチンにランダムに毒素が導入されることになるために、ロット間差も発生し、均一なタンパク質としての調製が困難であるという課題もある。したがって、化学的結合の場合も、遺伝子レベルで結合させた毒素融合タンパク質のように、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと毒素との共有結合による融合体形成が望ましい。

【0110】

（６−４）リンカーまたはスペーサー
本発明では、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに対してがん細胞内に輸送して働かせたい化合物を融合する際に、リンカー（クロスリンカー）またはスペーサー（スペーサー配列）を用いることができる。ＢＣ２ＬＣＮレクチン本来のがん細胞特異的な結合機能及び侵入機能と、輸送対象化合物本来の機能とのそれぞれを最大限発揮するために、両者の間には一定の距離を保つことが好ましいため、適当な長さのリンカー／スペーサーを介して結合させることが好ましい。適当な長さのリンカー／スペーサーは当業者には周知であって、適宜合成でき、各種市販もされている。
本発明で用いられるペプチド結合のためのスペーサー配列としては、ペプチド結合可能なアミノ酸残基数４〜１０のアミノ酸配列からなる周知のスペーサー配列が用いられ、１〜３回の繰り返し配列として用いる。典型的には、「ＧＳＧＧＧ（配列番号４）」、「ＧＧＧＳ（配列番号５）」などの高次構造を形成しないグリシン及び／又はセリンから構成されるアミノ酸配列が好ましく用いられる。例えば、がん細胞内に毒素タンパク質を輸送する際に、ＢＣ２ＬＣＮレクチン及びそれと融合する毒素又はその細胞殺傷能力のあるドメインを、これらのスペーサー配列を介してペプチド結合させることで、両者間に充分な距離を保つことができ、それぞれの糖鎖結合能力及び細胞殺傷能力を最大限発揮させることができる。

【0111】

また、本発明で化学結合によりコンジュゲートする際にも上記ペプチドリンカーを用いても良いが、好ましいリンカーとしては、ポリエチレングリコール、特に好ましくは還元剤で切断が可能なチオール基を導入したチオールリンカーなどがある。
低分子毒素化合物を結合させるためには二価性架橋剤などの化学的な結合剤が用いられる場合が多いので、これら結合剤由来のリンカーによりＢＣ２ＬＣＮレクチンと低分子毒素化合物が繋がれることになる。
本発明のＢＣ２ＬＣＮレクチンを、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ物質など核酸を細胞内に導入するために用いる場合には、ＢＣ２ＬＣＮと直接的に結合されるのは、核酸ではなく正電荷を帯びたＤＮＡ結合ペプチドなどの核酸キャリアであることが一般的であるため、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと核酸キャリアとの間の適切な距離を保つために適宜リンカー／スペーサーを用いることがある。

【0112】

また、融合体を形成する際に、毒素の側にがん細胞内での輸送したい小器官への輸送シグナルを結合させておくことで、さらに効率的に望みの小器官へ導くことができる（例えば、図１のＣ末端側の小胞体保留シグナルに相当する「ＫＤＥＬ（配列番号６）」配列など）。ＲＮＡｉ物質など輸送対象物質を核内までに輸送する必要がある場合には、核移行シグナルを用いることが有効である。
さらに、ＢＣ２ＬＣＮレクチンとの融合体の状態でも十分にその毒性が発揮できる場合は不要であるが、毒素タンパク質を輸送先で切り離したい場合には、細胞内プロテアーゼによる切断部位を入れておくことで、融合体として輸送していた化合物を細胞内で適宜切り離すことができる。切断部位の導入法は当業者には周知である。例えば、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ）を入れておけば、ｆｕｒｉｎというＣａ２＋依存的膜貫通セリンエンドプロテアーゼによって切断される（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ． ２０１１ Ｄｅｃ；２７８（２３）：４６８３−７００．）。ＤＮＡまたはＲＮＡｉ物質などの核酸を未分化細胞内に導入する場合は、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに結合されたＡｒｇクラスターなどの正電荷物質との電荷電荷相互作用で形成されたコンプレックスの状態で導入すれば、がん細胞の細胞内に到達後には速やかに分離する。

【0113】

（６−５）ＢＣ２ＬＣＮ−毒素タンパク質の製造方法
ＢＣ２ＬＣＮ含有発現ベクターのＢＣ２ＬＣＮ遺伝子の５’もしくは３’末端側にＥＴＡ由来のＤｏｍａｉｎＩ〜ＩＩＩ（ＰＥ３８）遺伝子などの毒素遺伝子を、必要に応じてスペーサーを介して導入することにより毒素融合ＢＣ２ＬＣＮタンパク質発現ベクターを構築する。次に、発現ベクターをコンピーテントセルに形質転換する。そして、形質転換した大腸菌などの宿主を常法により液体培養して、毒素融合ＢＣ２ＬＣＮタンパク質を発現誘導する。

【0114】

（６−６）毒素融合ＢＣ２ＬＣＮタンパク質の精製方法及び確認方法
大腸菌内で発現誘導した毒素融合ＢＣ２ＬＣＮタンパク質は、通常のタンパク質精製方法を適用して精製することができるが、フコース固定化カラムに供して、アフィニティークロマトグラフィーで精製することが好ましい。得られた毒素融合ＢＣ２ＬＣＮタンパク質の精製度は電気泳動やゲル濾過等で確認することができる。

【0115】

（６−７）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８及びその調製方法について
本発明の実施例で用いたＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８は、図１に示す通り、ＢＣ２ＬＣＮレクチン（配列番号１）にＥＴＡのＤｏｍａｉｎＩ〜ＤｏｍａｉｎＩＩＩで構成される３８ｋＤａからなる細胞殺傷能力のあるドメイン（配列番号３）をペプチド結合させ、Ｃ末端にＨＩＳタグと小胞体移行シグナル（ＫＤＥＬ）を付加した融合タンパク質である。
具体的な調製方法は、特許文献１９に記載された方法と同様である。

【0116】

（６−８）がん細胞殺傷剤（ｉｎ ｖｉｔｒｏ系での使用）
本発明においては、前記のように調製された「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体を、培養がん細胞に対して、又は生体外に取り出したがん細胞又は組織に対して用い、がん細胞を特異的に殺傷することができる。
本発明のがん細胞殺傷剤を用いて標的とするがん細胞を殺傷する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系であれば、培地中に終濃度１０〜１００μｇ／ｍｌになるように添加し、２４〜４８時間培養すればがん細胞のみを死滅させることができる。

【0117】

７．抗がん剤（がんの処置及び治療用組成物）
本発明の「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体は、単独で又は既知の抗がん剤と併用して、もしくは組み合わせて、膵がん、大腸がん、胃がんなどの消化器系がんの他、肺がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がんなどの各種上皮性がん、脳腫瘍などの他の悪性腫瘍、悪性肉腫に処置及び治療剤として用いることができる。とりわけ悪性度の高いがんの処置及び治療剤として用いることができる。
本発明の処置及び治療剤は、がん細胞、特に薬剤耐性がん細胞などがん幹細胞を含む悪性度の高いがん細胞を死滅、もしくは減少させることができる上に、正常な臓器細胞に対しては毒性が極めて低いことから、腫瘍の根本的な治療剤となり得る。
すなわち、本発明の「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体を抗がん剤として用いる場合には、がん幹細胞に対する殺傷能力も期待できるから、再発予防効果が高く、治療の予後も改善できる。
また、特に薬剤耐性がん細胞などがん幹細胞を含む悪性度の高いがん細胞に対する殺傷効果が大きいことから、既知の抗がん剤と組み合わせて用いることも有効である。既知の抗がん剤治療を受け、薬剤耐性のために治療を断念した患者に対して適用することができる可能性も高い。ＢＣ２ＬＣＮレクチンと結合させて「ＢＣ２ＬＣＮ−毒素」融合体を形成させる毒素として既知の抗がん剤を用いることも有効である。
本発明の悪性度の高いがんの処置及び治療剤は、さらに薬理学的に許容される担体、賦形剤、または助剤などを含む医薬組成物として投与することが好ましい。その際に用いる薬理学的に許容される担体などは、当業者にとって既知である。投与時期と回数及び投与量も、がんの腫瘍の状態、症状の重軽、患者の状態等によって適宜決められる。

【0118】

以下、典型的な悪性度の高いがんである膵がんについて述べるが、大腸がん、胃がんなどの他の消化器系がん、さらには肺がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がんなどの一般的な上皮性がん、脳腫瘍などの他の悪性腫瘍、悪性肉腫についても同様である。
本発明のＢＣ２ＬＣＮ−毒素タンパク質は、単独又は既知の抗がん剤と組み合わせて膵がんの処置及び治療剤として用いることができる。
本発明の膵がんの処置及び治療剤は、膵がん細胞、特に薬剤耐性がん細胞を死滅、もしくは減少させることができる上に、正常な膵臓細胞に対してはほとんど毒性を有さないことから、膵がんの根本的な治療剤となり得る。
また、膵がん細胞のうちでも特に薬剤耐性がん細胞に対する殺傷効果が大きいことから、既知の膵がん用の抗がん剤と組み合わせて用いることも有効である。既知の抗がん剤治療を受け、薬剤耐性のために治療を断念した患者に対して適用することが特に有効である。さらに、外科手術後の腹腔内に直接投与することで、目視で確認できない膵がん細胞までも確実に殺傷できるから、予後の再発防止効果を高めることができる。
本発明の膵がんの処置及び治療剤は、さらに薬理学的に許容される担体、賦形剤、または助剤などを含む医薬組成物として投与されることが好ましい。

【0119】

本発明の膵がんの処置及び治療剤の投与方法は、静脈内投与、皮内投与、皮下投与などの非経口投与が適用され、直接腹腔内に投与することが最も効果が高い。
投与時期と回数は、膵がんの腫瘍の状態、症状の重軽、患者の状態等によって適宜決められる。例えば、１時間〜１０週間の範囲内で、１回で全て投与しても数回に分けて投与しても良いが、これに限るものでもない。
投与量も、腫瘍の状態、症状の重軽、患者の状態等によって、安全性と有効性の観点から適宜決められる。例えば、１０〜２５０μｇ／体重ｋｇの投与量で投与することが出来るが、この範囲に限るものでもない。
本発明は主としてヒトを対象としているが、ヒトに限られるものではなく、サルなど霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウスなどの齧歯類など広く哺乳動物の膵がん腫瘍を対象とする。

【0120】

膵がんの処置及び治療用医薬組成物を、静脈内投与などの非経口投与に適用するために用いられる薬理学的に許容される担体などは当業者にとって既知であり、例えば注射用蒸留水、生理食塩水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの無菌希釈剤；ベンジルアルコールなどの抗菌剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート剤；リン酸等の緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはＤグルコース等の等張化剤、ｐＨ調整液などを適宜用いることができる。

【0121】

本発明の膵がんの処置及び治療剤は、既知の膵がん用として認可されている抗がん剤と組み合わせて用いることができる。その際、他の抗がん剤と併用したがん治療用医薬組成物として用いてもよいが、他の抗がん剤の投与時期及び／又は投与形態を合わせる必要は無く、異なる投与時期及び投与形態の投与方法を選択しても良い。
特に、本発明の抗がん剤との組み合わせ効果が期待できる抗がん剤は、本発明の実施例で用いたＧＥＭ製剤であるがこれに限られず、ＴＳ−１やエルロチニブなど種々の抗がん剤、免疫製剤（分子標的薬、抗体薬を含む）、症状の緩和のための各種薬剤を用いることができる。例えば、膵がん以外の消化器系がん又は乳がん、前立腺がん、婦人科系がんなどの上皮がんの場合であれば、代謝拮抗薬（５−ＦＵ、メトトレキサート）、アルキル化薬（シクロフォスミド）、タキサン系（パクリタキセル、ドセタキセル）などの抗がん剤、及び各種分子標的薬、抗体医薬との併用が好ましい。

【0122】

８．がん細胞特異的な細胞内輸送システムのその他の利用
毒素や標識用色素化合物以外の、例えば核酸や生理活性タンパク質、脂質、低分子化合物など、特許文献１９に例示されている毒素以外の種々の化合物を、ＢＣ２ＬＣＮと融合させてがん細胞に作用させることで、細胞内に効率良く輸送することができ、それぞれの本来の機能を発揮できる。その際の融合方法としては、上記（６−３）（６−４）などに記載の方法が適用できる。
つまり、本発明には、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに対して、種々の化合物をがん細胞特異的に細胞内に輸送するためのキャリア（細胞内導入剤）として働かせ、ＢＣ２ＬＣＮレクチンをキャリアとして用いるがん細胞特異的な細胞内輸送システムとしての用途がある。上述のがん細胞殺傷剤、抗がん剤としての利用は、そのメカニズムの１つの利用形態であると位置づけることもできる。

【実施例】

【0123】

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
また、本発明で用いた臨床膵がん細胞は、発明者らの所属する臨床機関である筑波大でインフォームド・コンセント受けた患者に由来し、かつ倫理審査を受け、承認されている。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。

【0124】

［実施例１：ＢＣ２ＬＣＮレクチンのがん細胞及びがん組織への結合活性の評価］
（実施例１−１）各種がん細胞株の細胞染色
各種がん細胞株へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
本実験で用いた乳腺がん細胞（ＭＣＦ７株）、乳管がん細胞（Ｔ−４７Ｄ株）、乳腺髄様がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７株）、メラノーマ細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８株）、前立腺がん細胞株（ＤＵ−１４５株、ＬＮａＣａｐ株、ＰＣ−３株）はＡＴＣＣから分譲を受け、ＡＴＣＣの培養法により培養した。胎児肺繊維芽細胞（ＴＩＧ３株）は西村らの培養法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１１ Ｆｅｂ １１；２８６（６）：４７６０−７１．）により培養した。
細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した後、蛍光ラベル化（ＦＩＴＣを結合）したＢＣ２ＬＣＮを加えて室温で１時間反応させた。

【0125】

蛍光ラベル化されたＢＣ２ＬＣＮは２種類の乳がん細胞（ＭＣＦ７株、Ｔ−４７Ｄ株）を強く染色するが（図２Ａ ａ， ｂ）、別の乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７株）、前立腺細胞株（ＤＵ−１４５株、ＬＮａＣａｐ株、ＰＣ−３株）メラノーマ細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８株）及び胎児肺繊維芽細胞（ＴＩＧ３株）においては、強い染色は検出されなかった（図２Ａ ｃ，ｄ 図２Ｂ ｅ−ｈ）。また、Ｔ４７−Ｄ株の染色性はまばらであった（図２Ａ ｂ）。

【0126】

上記実験は細胞を破砕せずに行っているため、ＢＣ２ＬＣＮレクチンが認識している糖鎖構造の「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」は、乳がん細胞で大量に発現している糖タンパク質及び糖脂質の構成糖として、細胞表面を覆うように存在していることが窺われる。ＢＣ２ＬＣＮレクチンが認識している糖鎖構造は細胞表面に存在することから、がん細胞の有無の判定用のキットとしての高い有用性を有していることが実証された。

【0127】

（実施例１−２）各種がん細胞株のＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ６４７ラベル化ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いたフローサイトメトリー解析
さらに、各種がん細胞株へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性をフローサイトメトリーを用いて評価した。
実施例１で用いた細胞株に加えて、本実験で用いた皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ株）はＡＴＣＣから分譲を受け、ＡＴＣＣの培養法により培養した。脂肪由来間葉系幹細胞株（ＡＤＳＣ株）はｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、付属のマニュアルに従い培養した。多能性幹細胞株（２０１Ｂ７株）は理化学研究所バイオリソースセンターから分譲を受け、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｍＴｅＳＲ１の培養法により培養した。上述の細胞を酵素処理して解離し、蛍光ラベル化した（ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７を結合した）ＢＣ２ＬＣＮレクチンを１μｇ／ｍｌの濃度で反応させて、ＦＡＣＳ機器を用いてフローサイトメトリー解析を行った。

【0128】

その結果、ＭＣＦ７株、Ｔ−４７Ｄ株はヒトｉＰＳ細胞と同様に強い染色性を持った細胞集団であることが判明した（図３）。また、図２の細胞染色ではシグナルを検出できなかったＭＤＡ−ＭＢ−１５７株、ＤＵ−１４５株、ＬＮａＣａｐ株、ＰＣ−３株も一部ＢＣ２ＬＣＮ染色性の細胞を含むことが明らかになった。また、ＳＫ−ＭＥＬ−２８株（メラノーマ細胞）は、ＨＤＦ株（皮膚繊維芽細胞株）、ＡＤＳＣ株（脂肪由来間葉系幹細胞株）と同様に、殆ど検出されなかった。

【0129】

（実施例１−３）各種がん細胞の細胞膜タンパク質画分を用いたレクチンアレイ解析
ＭＣＦ７株、ＤＵ−１４５株、ＬＮａＣａｐ株、ＰＣ−３株、ＳＫ−ＭＥＬ−２８株からＣｅｌＬｙｔｉｃ^ＴＭ ＭＥＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｓｉｇｍａ）を用いて、マニュアルに従って細胞膜タンパク質画分を抽出し、それらに対してレクチンアレイ（非特許文献２）を用いてＢＣ２ＬＣＮの反応性を解析した。

【0130】

その結果、細胞染色、フローサイトメトリー解析において強いシグナルが検出されたＭＣＦ７株において、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの強い結合性が検出された（図４）。これより、ＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合ターゲットとなるがん細胞表面抗原は、糖タンパク質であることが示された。

【0131】

（実施例１−４）ＢＣ２ＬＣＮレクチンのヒトがん組織に対する結合
各種がん組織へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
Ｃｙｂｄｒｉ社より購入したヒトがん組織アレイ（ＣＣ０８−１０−００１Ｕ， ＣＣ１７−００−００１）及びＰｒｏｖｉｔｒｏ社より購入したヒトがん組織アレイ（４０１ ２２０４）に対して、ＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮを処理することにより、ヒトがん組織におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン認識部位を解析した。

【0132】

その結果、乳がん（図５Ａ）及び肺がん（図５Ｂ）で、ＢＣ２ＬＣＮレクチンに染色される細胞群が存在することが明らかになった。ＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞は、腫瘍（図５Ｃ）の一部分においても存在した。

【0133】

（実施例１−５）ヒト臨床膵がん（検体番号１）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色
臨床サンプルを用いて、がん組織へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
膵がん患者（検体番号１）〜（検体番号３）から摘出した腫瘍をそれぞれホルマリン固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた各組織切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンで染色して、ヘマトキシリン／エオシン染色した後、その組織像を顕微鏡観察した。

【0134】

その結果、ヒト臨床膵がん（検体番号１）〜（検体番号３）いずれもがん細胞がＨＲＰ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンで強く染色されることが分かり、特に腺管構造部位が強く染色されること、及び周辺の正常膵臓細胞部位は全く染色されないことがわかった（図６〜８）。

【0135】

（実施例１−６）ヒト臨床大腸がん腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色
臨床サンプルを用いて、がん組織へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
大腸がん患者から摘出した腫瘍をそれぞれホルマリン固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた各組織切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンで染色して、ヘマトキシリン／エオシン染色した後、その組織像を顕微鏡観察した。

【0136】

その結果、がん細胞の周辺の正常細胞部位は全く染色されないのに対して、ヒト臨床大腸がん細胞部位全体に亘り一応の染色は見られるものの、大腸がんの核が濃縮されている低分化ながん細胞部位は強く染色され、核の極性が保たれている分化度が高い部位は比較的弱く染色された（図９）。当該低分化部位は、がん幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）に相当する部位であると解される。

【0137】

（実施例１−７）標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いた各種臨床がん組織アレイの染色
臨床サンプルを用いて、がん組織細胞へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
（１−７−１）胃がん、大腸がん、乳腺がん、肝臓がん、膵がん、胆管がん、肺がん由来組織切片の染色
筑波大学附属病院で採取したＦＦＰＥ組織検体（倫理委員会承認済）の胃がん、大腸がん、乳腺がん、肝臓がん、膵がん、胆管がん、肺がん由来の組織切片の癌部、非癌部を打ち抜き組織アレイを作成し、ＨＲＰ標識したＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いて染色した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、対応する臓器の正常組織切片も同様に染色した。

【0138】

その結果、正常組織とと比較して明確に染色されたのが、胃がん、大腸がん、膵がん、胆管がん由来組織及び肺がんのうちの腺がん由来組織であり、乳腺がん、肝臓がん由来組織及び肺がんのうちの扁平上皮がんと大細胞がん由来組織はほとんど染色されなかった（図１０Ａ）。

【0139】

（１−７−２）子宮体がん、子宮頸がん、前立腺がん、腎がん膀胱がん、精巣がん、卵巣がん、内分泌系がん、他臓器がんの染色
筑波大学附属病院で採取したＦＦＰＥ組織検体（倫理員会承認済）の子宮体がん、子宮頸がん、前立腺がん、腎がん膀胱がん、精巣がん、卵巣がん、内分泌系がん、他臓器がん（肝芽腫、悪性中皮腫、骨肉腫、膠芽腫、膵内分泌腫瘍、転移性乳がん、転移性子宮がん）由来組織切片を打ち抜き組織アレイを作成し、ＨＲＰ標識したＢＣ２ＬＣＮレクチンを用いて染色した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、対応する臓器の正常組織切片も同様に染色した。

【0140】

その結果、正常組織と比較して明確に染色されたのが、子宮体がん及び子宮頸がんのうちの腺がん由来組織、並びに卵巣がんのうちの胎児性がん及び卵黄性腫瘍由来組織である。一方、子宮頸がんのうちでも扁平上皮がん由来組織、及び卵巣がんのうちのセミノーマ由来組織、並びに前立腺がん、腎がん膀胱がん、精巣がん、内分泌性がん、及び他臓器がん由来組織（転移肉腫）はほとんど染色されなかった（図１０Ｂ）。

【0141】

（実施例１−８）ヒトがん組織アレイにおけるＢＣ２ＬＣＮレクチン結合部位の病理組織学的検査
各種がん組織細胞へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を免疫組織化学的に評価した。
Ｃｙｂｄｒｉ社より購入したヒトがん組織アレイ（ＣＣ０８−１０−００１Ｕ：乳がん， ＣＣ１７−００−００１：脳腫瘍）及びＰｒｏｖｉｔｒｏ社より購入したヒトがん組織アレイ（４０１ ２２０４：肺がん）に対して、ＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンを処理することにより、ヒトがん組織におけるＢＣ２ＬＣＮ認識部位を染色した。その上で、がん組織アレイの切片中において、がん細胞が染色されているかどうかを明らかにするために、株式会社新組織科学研究所に受託し、病理組織学的検査を行った。

【0142】

その結果、乳がん組織アレイのうち、線維腺腫、浸潤性乳管がん、浸潤性小葉がんの細胞膜及び細胞質で染色されていることが確認された。また、線維腺腫の切片においては、管腔側でも強染色も検出された（図１１Ａ）。また、肺がん組織アレイのうち、肺小細胞がん、一部の肺扁平上皮がん、肺腺がんの細胞膜及び細胞質で染色されていることが確認された（図１１Ｂ）。さらに、脳腫瘍組織アレイのうち、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣芽腫、髄芽腫の細胞膜及び細胞質で、混合型髄膜腫、微小嚢胞性髄膜腫の細胞質で染色されていることが確認された（図１１Ｃ）。図中の組み写真はすべて左側が低倍率、右側が左の写真の一部を拡大したものである。

【0143】

（実施例１−９）ＢＣ２ＬＣＮレクチンのヒト正常組織に対する結合
比較のため、正常組織へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合活性を評価した。
Ｐｒｏｖｉｔｒｏ社より購入したヒト正常組織アレイ（４０１ １１１０）に対して、ＨＲＰラベルしたＢＣ２ＬＣＮレクチンを処理することにより、ヒト正常組織におけるＢＣ２ＬＣＮレクチン認識部位を解析した。

【0144】

その結果、正常な乳房、肺、脳組織、前立腺、子宮、甲状腺、副甲状腺、肝臓、卵巣、リンパ節等の組織においてはＢＣ２ＬＣＮレクチンが染色性を殆ど示さないことを明らかにした（図１２）。がんの疑いがある被験個体より採取した生検サンプルに於いて、一部の正常組織と、がん細胞含有組織とを見分けるためにＢＣ２ＬＣＮレクチンを利用できることが明らかとなった。

【0145】

［実施例２：ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞の悪性度の評価］
（実施例２−１）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソート及び接着培養
上述の通りＢＣ２ＬＣＮレクチンが特定のがん組織に対して染色性を示したが、細胞株／組織の染色性には強弱が観察された。前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）（非特許文献７）をセルソーターによりＢＣ２ＬＣＮ高染色細胞群（以下ＢＣ２ＬＣＮ＋群）とＢＣ２ＬＣＮ低染色細胞群（以下ＢＣ２ＬＣＮ−群）とに分離し、増殖速度、形態及び遺伝子発現を解析した。まず、ＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群の接着培養下での増殖能を評価した。
前立腺がん細胞株（ＰＣ−３株）を培養し、蛍光ラベル化した（ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７を結合した）ＢＣ２ＬＣＮレクチンを１μｇ／ｍｌの濃度で反応させ、ＦＡＣＳ機器を用いてＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群とにソートした（図１３Ａ）。ソート後の細胞をそれぞれ６ｘ１０^４細胞ずつ播種し、培養した。

【0146】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群では、細胞の形態に大きな違いが観察された（図１３Ｂ）。４日間の培養後細胞数を計測したところ、足場が有る限りはＢＣ２ＬＣＮ−群の方が、増殖性が高かった（図１３Ｃ）。本実験はＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群それぞれ４ウェルずつ培養している。その検証を独立して３回繰り返して行うことで、平均値、標準偏差を算出している。

【0147】

（実施例２−２）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソート及び足場非依存性培養
ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞とＢＣ２ＬＣＮ陰性がん細胞の足場非依存性増殖能を評価した。
前立腺がん細胞株（ＰＣ−３株）を実施例２−１と同様の方法で培養及びソートし、ＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群とをそれぞれ、軟寒天コロニー形成試験に供し、がん細胞の悪性度を表す主要要因の一つである「足場非依存性増殖能」の有無を検討した。
軟寒天コロニー形成のための細胞培養及び細胞数の測定は、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂ社より購入した「ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ９６−ｗｅｌｌ 悪性形質転換アッセイ〜軟寒天コロニー形成試験キット〜」を用いた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｓｍｏｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｅｔａｉｌ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｃｂｌ＿２００６０６１３．ａｓｐ？ｅｎｔｒｙ＿ｉｄ＝７３３０）。

【0148】

培養開始７日後に細胞増殖像を比較したところ、ＢＣ２ＬＣＮ＋群の方が足場非依存的に細胞増殖出来ることが観察された（図１４Ａ）。具体的には、ＢＣ２ＬＣＮ−群では、播種した状態のまま殆ど分裂せず、単細胞のまま浮いているのに対し、ＢＣ２ＬＣＮ＋群では分裂し、１０数個の細胞からなるクラスターを形成している。引き続き培養を続け、培養開始１４日後に上記のキットを用いて、細胞数を比色により定量化したところ、ＢＣ２ＬＣＮ＋群の方が、優位に足場非依存的に細胞増殖していた（図１４Ｂ）。本実験はＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群それぞれ３ウェルずつ培養している。その検証を独立して３回繰り返して行うことで、平均値、標準偏差を算出している。ＢＣ２ＬＣＮを用いて、高い足場非依存性増殖能を有する高悪性度がん細胞を検出、濃縮できることが明らかとなった。

【0149】

（実施例２−３）前立腺がん細胞株（ＰＣ−３）のＢＣ２ＬＣＮレクチンによるソート及びがん幹細胞マーカーの発現解析
ＢＣ２ＬＣＮ陽性がん細胞におけるがん幹細胞マーカーの発現を解析した。
前立腺がん細胞株（ＰＣ−３株）を実施例２−１と同様の方法で培養及びソートし、ＢＣ２ＬＣＮ＋群とＢＣ２ＬＣＮ−群からそれぞれＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡマイクロアレイ（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ マイクロアレイキット ８ｘ６０Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ））で網羅的な遺伝子発現の解析を行った（図１５Ａ）。

【0150】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮ−群と比べてＢＣ２ＬＣＮ＋群ではＥＰＣＡＭ（非特許文献４）、ＥＲＢＢ２（非特許文献７）といった既知のがん幹細胞マーカーが高発現していた（図１５Ｂ）。ＢＣ２ＬＣＮ陽性の高悪性度がん細胞は、がん幹細胞の特性を備えるものであった。すなわち、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、創薬／治療のターゲットとして最も価値の高い、「がん幹細胞を選択的に検出、分離することが出来る唯一の進歩的なマーカーであることが明らかになった。

【0151】

［実施例３：ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡのがん細胞障害活性の評価］
（実施例３−１）各種がん細胞株、繊維芽細胞株に対するＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの殺傷効果
乳腺がん細胞（ＭＣＦ７株）、乳管がん細胞（Ｔ−４７Ｄ株）、乳腺髄様がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７株）、メラノーマ細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８株）、前立腺がん細胞株（ＤＵ−１４５株、ＬＮａＣａｐ株、ＰＣ−３株）を培養した。胎児肺繊維芽細胞（ＴＩＧ３株）は西村らの培養法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１１ Ｆｅｂ １１；２８６（６）：４７６０−７１．）により培養した。ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡを終濃度０．１ ｍｇ／ｍｌになるように培養液に添加し、培養中のがん細胞株及び繊維芽細胞株と反応させた。ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ添加の２４， ４８， ７２時間後に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ （４８８／５７０）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、各種細胞の生死判定を行った。

【0152】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞を含むＭＣＦ７株（図１６Ａ）、Ｔ−４７Ｄ株（図１６Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７株（図１６Ｃ）、ＤＵ−１４５株（図１６Ｄ）、ＬＮａＣａｐ株（図１６Ｅ）、ＰＣ−３株（図１６Ｆ）では殺傷された細胞が観察されたが、ＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞を含まないＴＩＧ３株（図１６Ｇ）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８株（図１６Ｈ）では観察されなかった。

【0153】

ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡが正常な細胞には全く影響を与えないことから、ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡの細胞障害活性効果は、がん細胞特異的であると解される。

【0154】

（実施例３−２）ＦＩＴＣ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンの乳がん細胞ＭＣＦ−７株への内在化
乳腺がん細胞（ＭＣＦ７株）を培養した。ＭＣＦ７株の培養液中に、ＦＩＴＣ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを１ μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で２時間反応させ、反応直後（２時間）、４８時間後に、励起光を照射して顕微鏡で位相差観察した。

【0155】

ＦＩＴＣ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンを含まない新しい培地に交換した直後では細胞表面が鮮明に染色されている（図１７、左上）。４８時間後には、細胞内に明確にドット状の染色が観察され（左下）、ＦＩＴＣ標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンが細胞内に取り込まれていることがわかった。ＦＩＴＣ標識ＢＳＡを１ μｇ／ｍＬの濃度で添加した場合は同様の観察はなされず、がん細胞表面に結合したＢＣ２ＬＣＮレクチンが特異的に細胞内に取り込まれることが証明された。

【0156】

一般的にレクチン類は、細胞表面の特定の糖鎖を認識する場合には、細胞表面の糖鎖に特異的に結合した状態で観察されているものの、認識した糖鎖を介して細胞内へ侵入する現象はほとんど知られていない。ＥＴＡと融合した「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」ががん細胞内に侵入する現象は予想外であり、「ＢＣ２ＬＣＮレクチン」の特性として、がん細胞表面の「Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ」に特異的に結合する作用と共に、結合後に糖鎖を介してがん細胞内に侵入する能力も有していると考えられた。
毒素や標識用色素化合物以外の、例えば核酸や生理活性タンパク質、低分子化合物など、特許文献１９に例示されている毒素以外の種々の化合物を、ＢＣ２ＬＣＮレクチンと融合させてがん細胞に作用させることで、がん細胞内に効率良く輸送することができ、それぞれの本来の機能を発揮できることが示唆された。

【0157】

［実施例４：ＢＣ２ＬＣＮレクチンの膵がん細胞への結合活性の詳細評価］
（実施例４−１）６種の膵がん細胞株のマウス異種移植片の形成されたがん細胞の形態
悪性度の高いがんにおける有効な診断方法及び治療方法の開発のため、悪性度の高いがんとして典型的な膵がんを選択し、以下の手順で実験を行った。
代表的な６種の膵がん細胞株（ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、ＭＩＡｐａｃａ−２、ＰＡＮＣ−１、ＳＵＩＴ−２）をマウス皮下に３．０×１０^６細胞／マウスで移植した。移植後１４日間経過後、腫瘍部分を摘出し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋して、ミクロトーム（大和光機（ＹＡＭＡＴＯ ＫＯＨＫＩ）製リトラトーム ＲＥＭ−７００）で５μｍ厚の組織切片を作製して、使用まで室温保存した。脱パラフィン処理後、ヘマトキシリン／エオシン（Ｃａｔ＃０３２−１４６３５、ＷＡＫＯ）染色して、組織像を光学顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製：ＢＺ９０００）で観察した。

【0158】

その結果、Ｃａｐａｎ−１のみが管腔構造（腺管）を形成し、典型的な腺がん様形態を示すことが分かった（図１８）。一方で、他の５種の細胞株では管腔構造は観察されず、臨床膵がん細胞に類似の形態は示さなかった。以上から、６種の膵がん細胞株のうち、Ｃａｐａｎ−１は最も臨床膵がんに近い特徴的な形態形成能を有することが分かった。

【0159】

（実施例４−２）高密度レクチンマイクロアレイで得られたＢＣ２ＬＣＮレクチンの６種の膵がん細胞への反応強度
Ｃａｐａｎ−１に特異的に反応するレクチンを高密度レクチンアレイで探索した。６種の膵がん細胞株からＣｅｌＬｙｔｉｃ^ＴＭ ＭＥＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社、ＣＥ００５０）で疎水性分画を調製し、Ｃｙ３−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケアジャパン、ＰＡ１３１０４）で標識化後、高密度レクチンマイクロアレイに供し、エバネッセント波蛍光型スキャナー（ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ^ＴＭ Ｒｅａｄｅｒ １２００、グライコテクニカ社製）で検出した。得られた結果をＡｒｒａｙ−Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）で数値化した。得られた数値を用いて、腺管形成能を有するＣａｐａｎ−１と他の５種の細胞株の２群に分けて、この２群間で顕著に異なるレクチンをＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔで統計的に抽出した。

【0160】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮレクチンはｐ＝９．４４Ｅ−１７を示し、２群間で最も顕著に異なるレクチンとして抽出された。ＢＣ２ＬＣＮレクチンの膵がん細胞株への結合強度を図１９に示す。ＢＣ２ＬＣＮレクチンはＣａｐａｎ−１に対して最も強い反応性を示した。

【0161】

（実施例４−３）フローサイトメトリーによる６種の膵がん細胞株へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの結合
１×１０^５個の膵がん細胞株を１ μｇ／ｍＬのＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ − ＮＨ２（ＰＥ、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製、ＬＫ２３）標識ＢＣ２ＬＣＮで氷上で１時間反応後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。

【0162】

得られたｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ （ＭＦＩ）をグラフ化した結果を図２０に示す。高密度レクチンマイクロアレイでの解析と同様、ＢＣ２ＬＣＮレクチンはＣａｐａｎ−１に最も強い反応性を示すことが分かった。

【0163】

（実施例４−４）Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデル腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色
Ｃａｐａｎ−１（３．０×１０^６個）をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｎｕ メス ６週）に皮下移植して１４日後に腫瘍を摘出し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた組織切片を脱パラフィン処理、抗原賦活化、ペルオキシダーゼ不活化、ブロッキング後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｃａｔ＃： ＬＫ１１、Ｄｏｊｉｎｄｏ）標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンで室温１時間反応させた。その後、ヒストファイン ＤＡＢ 基質キット （Ｎｉｃｈｉｒｅｉ、４２５０１１）で発色させ、ヘマトキシリン／エオシン（ＷＡＫＯ社製）で染色した後、その組織像を顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社：ＢＺ９０００）で観察した。

【0164】

その結果、形成された腫瘍のうちでも腺がん様形態を示す管腔部位が強く染色されることと共に、周辺の正常細胞は全く染色されないことが分かった（図２１）。

【0165】

（実施例４−５）ヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統）腫瘍部位のＢＣ２ＬＣＮレクチン染色
ヒト臨床膵がん腫瘍を２ｍｍ角に細断し、ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄメス ６週、クレアファーム）に皮下移植したヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統、継代数７〜１０））を移植２８日後に腫瘍を摘出し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた組織切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＢＣ２ＬＣＮで染色して、ヘマトキシリン／エオシン染色した後、その組織像を顕微鏡観察した。

【0166】

その結果、実施例４−４の場合と同様に、形成された腫瘍のうち腺がん様形態を示す管腔形成部位が強く染色され、周辺の正常細胞は全く染色されないことが分かった（図２２）。

【0167】

（実施例４−６）塩酸ゲムシタビン（ＧＥＭ）処理後のヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統）腫瘍部位へのＢＣ２ＬＣＮレクチン染色
膵がんは、再発性が高く、標準治療薬である塩酸ゲムシタビン（ＧＥＭ）で治療しても、膵がんの増殖と転移を完全に抑えることができないことが問題となっており、ＧＥＭ耐性がん細胞に対する抗がん剤の開発が切望されている。そこで、ヒト膵がんマウス移植モデル（ＰＣ−３系統）に対し、ＧＥＭの投与量を変えて残存する薬剤耐性の膵がん細胞へのＢＣ２ＬＣＮレクチンの反応性を検証した。
実施例４−５で用いたと同様に、ヒト臨床膵がん細胞を皮下移植したヒト膵がん移植マウスモデル（ＰＣ−３系統、継代数７〜１０）の移植１０日目に５０ｍｇ及び１００ ｍｇの塩酸ゲムシタビン（ジェムザール注射用（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｊａｐａｎ Ｋ．Ｋ． Ｌｏｔ．Ｃ１７７３３９ＣＡ））を３日おきに計４回尾静脈投与１４日後に腫瘍を摘出し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた組織切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＢＣ２ＬＣＮレクチンで染色して、ヘマトキシリン／エオシン染色した後、その組織像を顕微鏡観察した。

【0168】

その結果、ＧＥＭ処理後に残存する腫瘍も、ＢＣ２ＬＣＮレクチンで強く染色され、しかもＧＥＭ処理後に残存した抗がん耐性細胞での染色がより強まることが分かった（図２３）。この結果から、ＢＣ２ＬＣＮレクチンはＧＥＭ耐性膵がん細胞を標的化するための良いプローブとであることが分かった。

【0169】

［実施例５：ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のがん細胞障害性の評価］
（実施例５−１）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の調製
ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８（図１に記載のタンパク質）を設計して、ｐＥＴ２７ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み込み、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、＃２３０２４５）に導入した。形質転換体を１０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた５ｍＬのＬＢ培地に縣濁して一晩培養した。前培養した培養液５ｍＬを１ＬのＬＢ培地に添加して培養を行い、２−３時間後に（ＯＤ_６００）が０．４前後になったときに１Ｍ ＩＰＴＧ（Ｆｅｒｍｅｎｔｕｓ社、＃Ｒ−０３９２）１ｍＬを最終濃度１ｍＭになるように添加した。２０℃で２４時間、振盪培養した後、遠心分離で菌体を回収し、バッファーに縣濁して超音波処理を行い、タンパク質可溶性画分を抽出した。大腸菌のタンパク質可溶性画分に対して、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏらの方法（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｉ，Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ，Ｓｅｎｏ Ｎ． （１９７９） Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｐｒ；８５（４）：１０９１−８．）により市販セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にフコースを共有結合させることにより作製したフコースセファロースカラムによるアフィニティー精製を行い、０．２Ｍフコースで溶出した。
精製度を確認するため、素通り（Ｔ）、洗浄１回目（Ｗ１）、洗浄２回目（Ｗ２）、洗浄３回目（Ｗ３）、フコース溶出１回目（Ｅ１）、フコース溶出２回目（Ｅ２）、フコース溶出３回目（Ｅ３）の各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて確認した（図２４）。溶出１回目の画分において、約７０ ｋＤａ付近に単一バンドを確認することができたが、この分子量は、精製ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８単量体に相当する。精製したＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）存在／非存在下で９５℃５分処理有り／なしでサンプル調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー染色を行った（図２４）。その結果、いずれの条件でも約５６ｋＤａの単一バンドとして精製ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を確認することができた。

【0170】

（実施例５−２）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のＣａｐａｎ−１の殺傷効果
Ｃａｐａｎ−１の培養液にＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を異なる濃度で添加して、４８時間培養後、Ｃａｐａｎ−１の生細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｃａｔ＃： ＣＫ−０４、Ｄｏｊｉｎｄｏ）で測定して、ＯＤ_４５０を測定した。

【0171】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の濃度依存的にＣａｐａｎ−１が死滅し、１００ ｐｇ／ｍＬの濃度でほぼ完全にＣａｐａｎ−１を死滅することが分かった（図２５）。

【0172】

（実施例５−３）Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のがん細胞殺傷効果
（５−３−１）腫瘍体積の変化
Ｃａｐａｎ−１（３．０×１０^６個）をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｎｕ メス ６週）に皮下移植し、１４日後腫瘍を確認し、短径、長径を測定し、（短径）^２×（長径）／２で体積を求めた。大きさが均一になるように３群（Ｃｏｎｔｏｒｏｌ群、１μｇ／ｂｏｄｙ、１０μｇ／ｂｏｄｙ）に群分け（各群ｎ＝６）した。ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８をＰＢＳで希釈し１μｇ／１００μｌ、１０μｇ／１００μｌの溶液を作成し、Ｄａｙ１より３日おきに計４回、１μｇ／ｂｏｄｙ、１０μｇ／ｂｏｄｙをそれぞれ腫瘍近傍の皮下に局所注射した。

【0173】

１０μｇ／ｂｏｄｙ群では２回投与により著明な腫瘍縮小が得られ、腫瘍が判別できなくなったため、２回のみの投与とした。腫瘍体積を同様の方法で連日測定し、継時的に観察したところ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、１μｇ／ｂｏｄｙ群、１０μｇ／ｂｏｄｙ群ともに明らかな腫瘍縮小効果が認められ、１０μｇ／ｂｏｄｙ投与群では特に著明な効果を示した（図２６）。

【0174】

（５−３−２）マウスの体重変化と腫瘍重量の変化
１４日の腫瘍体積観察の後、マウスの体重を測定した。ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ／ｂｏｄｙ計４回投群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してマウスの体重に有意差はなく、個体の活動も良好であり全身状態は保たれていた。一方、１０μｇ／ｂｏｄｙ計２回投与群では、６匹中２匹がｄａｙ１４に死亡し、残りの４匹の体重はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較し減少が見られた（図２７Ａ）。また腫瘍を摘出し、それぞれの腫瘍の重量を測定したところ、１μｇ群、１０μｇ群ともに有意に減少しており、肉眼的にも著明な縮小を認めていることがわかった（図２７Ｂ、Ｃ）。

【0175】

（５−３−３）摘出腫瘍の病理観察
摘出した腫瘍をホルマリン固定、パラフィン包埋後、組織切片を作製した。得られた組織切片をヘマトキシリン／エオシン染色した後、その組織像を顕微鏡観察した。すると１μｇ投与群では腫瘍は縮小しているものの、Ｃａｐａｎ−１の特徴的な腺管構造を有するがん細胞が遺残していることがわかった。１０μｇ投与群では腺管構造を有するがん細胞は消失し、リンパ球などの炎症細胞浸潤が見られるのみで、がん細胞が完全に消滅したことがわかった（図２８）。

【0176】

（実施例５−４）ＰＤＸマウスモデルにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８のがん細胞殺傷効果
（５−４−１）腫瘍体積の変化
膵がん患者から摘出したがん組織小片を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）に皮下移植し、２１日後腫瘍を確認し、短径、長径を測定し、（短径）^２×（長径）／２で体積を求めた。大きさが均一になるように３群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群、４０ｎｇ／ｍｏｕｓｅ、１μｇ／ｍｏｕｓｅ、１μｇ／ｍｏｕｓｅ（腹腔投与ｉ．ｐ．））に群分け（各群ｎ＝５）た。ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８をＰＢＳで希釈し１μｇ／１００μｌ、５μｇ／１００μｌの溶液を作成し、Ｄａｙ１より２日おきに計５回、１μｇ／ｂｏｄｙ、５μｇ／ｂｏｄｙをそれぞれ腫瘍近傍の皮下に局所注射した。

【0177】

移植する腫瘍細胞数が定量できなかったためばらつきは大きかったものの、１μｇ／ｂｏｄｙ群及び５μｇ／ｂｏｄｙ群のそれぞれで、顕著な腫瘍縮小が観測された（１μｇ；Ｐ＝０．０１１， ５μｇ＝Ｐ＜０．００１）。腫瘍体積を同様の方法で連日測定し、継時的に観察したところ、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対し、１μｇ／ｂｏｄｙ群、５μｇ／ｂｏｄｙ群ともに用量依存的に明らかな腫瘍縮小効果が認められ、５μｇ／ｂｏｄｙ投与群では特に著明な効果を示した（図２９Ａ）。更にＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇを３００μｌのＰＢＳに溶解し、同様に腹腔投与による腫瘍縮小効果を確認したところ、腹腔投与においても同量（１μｇ）の局所投与と同等の効果が得られた（図２９Ａ）。
ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８計５回投与後Ｄａｙ３０に腫瘍を摘出し、腫瘍重量を計測した。腫瘍を摘出し、それぞれの腫瘍の重量を測定したところ、１μｇ群、５μｇ群ともに有意に減少しており、肉眼的にも著明な縮小を認めていることがわかった（図２９Ａ，Ｃ）。また、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ腹腔投与による検討でも局所投与と同等の抗腫瘍効果を確認できた（図２９Ｃ）。

【0178】

（５−４−２）マウスの体重変化（全身への影響）
２１日の腫瘍体積観察の後、マウスの体重を測定した。ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ／ｂｏｄｙ、及び５μｇ／ｂｏｄｙ計５回投群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してマウスの体重に有意差はなく（図２９Ｄ）、個体の活動も良好であり全身状態は保たれていた。

【0179】

（実施例５−５）Ｃａｐａｎ−１移植マウス又はＳＵＩＴ−２移植マウスにおけるＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の抗腫瘍効果
実施例４−１〜実施例４−３でみたように、ＢＣ２ＬＣＮは膵がん細胞株のうちでも、Ｃａｐａｎ−１株への反応性がＳＵＩＴ−２株などと比較して顕著に高い。本実施例では、これら２種類の膵がん細胞株をヌードマウス腹腔内に移植した場合の増殖がん細胞に対して、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の抗腫瘍効果を比較する。

【0180】

（５−５−１）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の腹腔内投与における抗腫瘍効果
ヌードマウス腹腔内に膵癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１またはＳＵＩＴ−２）を２×１０^６個移植し、１４日目に犠牲死させ、消化管を摘出し、播種を観察すると腸間膜の辺縁に乳白色の播種結節の形成を認めた（図３０Ａ）。同様にヌードマウス２０匹に腹膜播種を作成し、１４日目にランダムに４群（Ｃｏｎｔｒｏｌ： ０ｇ， ＢＣ２ＬＣＮ単独１μｇ， ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ ４０ｎｇ， ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ）に分け、３００μｌのＰＢＳで希釈したＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８を４０ｎｇ、１μｇ、２μｇ／ｍｏｕｓｅ、計４回投与した（１４、１８、２２、２６日）。膵癌細胞株腹腔内移植後３０日経過後に、犠牲死とし、開腹し消化管を摘出、回盲部から２ｃｍの位置で小腸を４ｃｍの扇形に開き２７０°の範囲の播種個数を計測した（図３０Ｃ）（各群Ｎ＝４）。

【0181】

その結果、ＢＣ２ＬＣＮに高い反応性を有するＣａｐａｎ−１では播種個数がＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の容量依存的に減少し、１μｇ投与下にはほぼ完全に消失させることに成功した。一方、ＳＵＩＴ−２では抗腫瘍効果は確認できなかった（図３０Ｂ，Ｄ）。また、ＢＣ２ＬＣＮレクチン単独ではいずれの細胞株においても抗腫瘍効果は確認できなかった。

【0182】

（５−５−２）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の抗腫瘍効果：播種性転移モデルの組織片の染色
治療後の腸間膜に残存する微小播種巣を確認する為、腸間膜を全腸管に渡り摘出し、ＨＥ染色で、腫瘍を確認した。ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ投与群においては残存する腫瘍は確認できなかった。またＣｏｎｔｒｏｌ群の腹膜播種腫瘍をＨＲＰ標識したＢＣ２ＬＣＮを用いたレクチン染色を行うと、腹腔面に露出する形で癌細胞特異的に特異的な染色が確認された（図３１）。

【0183】

（実施例５−６）ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の血中投与（尾注）投与による抗腫瘍効果
実施例５−５−１では、ヌードマウス腹腔内に膵癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１）を２×１０^６個移植した場合の１４日目の消化管での観察結果では腸間膜の辺縁に乳白色の播種結節の形成が認められた（図３０Ａ）。実施例５−５−１と同様にヌードマウス２０匹に腹膜播種を作成し、１４日目にランダムに以下のように５群に分けた。腹腔投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ： ０ｇ， ＢＣ２ＬＣＮ単独１μｇ， ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ ４０ｎｇ， ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ）、血中投与群（ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ）とし、各群ｎ＝１０とした。実施例５−５−１と同様に計４回の治療後に、Ｃａｐａｎ−１移植から３０日目に腸間膜の播種を観察した。

【0184】

Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＢＣ２ＬＣＮ単独群、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ ４０ｎｇ群では腫瘍が確認されたが、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８ １μｇ投与群では血中および腹腔投与いずれも腫瘍が消失していた（図３２Ａ）。また、全身状態、腹水貯留が治療群で大幅に改善しており、播種後４５日目の体重では有意に治療群で増加していた（腹腔投与群；Ｐ＝０．０００５９， 血中投与群；Ｐ＝０．０００５２， ｖｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ群）（図３２Ｂ，Ｃ）。

【0185】

マウスの全生存期間（中央値）は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群で６２日、４０ｎｇ腹腔投与群では６５日で、統計学的に有意ではないものの（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定）、延長する傾向にあった。１μｇ血中投与群及び１μｇ腹腔投与群では、それぞれ９０日、１０５日といずれも有意に生存期間の延長を確認できた（Ｐ＜０．０００１， Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定）。

【0186】

（実施例５−７）毒性実験
野生型マウス（Ｃ５７ＢＪ／６Ｊ ６週メス）に、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｏｕｓｅ〜１５μｇ／ｍｏｕｓｅ腹腔内に１回単回投与し、１４日間観察し致死率を計測した（各群Ｎ＝１０）。Ｃｏｎｔｒｏｌ群として、同量のＢＣ２ＬＣＮを投与したが、ｒＢＣ２ＬＣ単独では毒性が無く死亡するマウスは確認できなかった。結果、半数致死量（ＬＤ５０）は、７．１４４μｇ／ｍｏｕｓｅ（３５７．２μｇ／ｋｇ）であり、最低致死量は５μｇ／ｍｏｕｓｅ（２５０μｇ／ｋｇ）であった（図３３）。

【0187】

ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８は、ｉｎ ｖｉｖｏの系でも、生存に影響を与えることなく膵がん細胞のみを殺傷除去する効果が検証できたので、抗がん剤として有効である。しかも、ＢＣ２ＬＣＮレクチンは、薬剤耐性がん細胞への結合活性が高いという知見からみて、ＢＣ２ＬＣＮ−ＰＥ３８の殺傷効果も薬剤耐性がん細胞又はがん幹細胞に対してより強く働くことが期待できるから、特に、薬剤耐性がん患者への治療のため、又は既知の抗がん剤と組み合わせて用いるためのがん治療用組成物としての用途が期待できる。

【0188】

［実施例６：培養上清あるいは被検個体体液試料を用いたがん細胞の検出］
（実施例６−１）培養上清を用いたがん細胞の検出
ビオチン化ｒＢＣ２ＬＣＮを０．３ｕｇ／ｍＬの濃度でアビジンプレート（住友ベークライト社製）に固定化した。Ｃａｐａｎ−１の培養上清をプレートに反応させた後、１ ｕｇ／ｍＬのペルオキシダーゼで標識したＲ−１０Ｇ抗体（和光純薬工業社製）を反応させて、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。コントロールには、細胞培養に供していない培地を用いた。

【0189】

結果、Ｃａｐａｎ−１の培養上清では、コントロールと比べて優位に高いシグナルが検出され、Ｃａｐａｎ−１の培養上清中でＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃが検出されることが明らかとなった（図３４参照）。これにより、細胞の培養上清を用いて、該細胞中に含まれるがん細胞を検出できることが明らかとなった。

【0190】

（実施例６−２）がん移植マウスの血清を用いたがんの検出
ビオチン化ｒＢＣ２ＬＣＮを０．３ ｕｇ／ｍＬの濃度でアビジンプレート（住友ベークライト社製）に固定化した。コントロールマウス血清とＣａｐａｎ−１移植マウスモデルの血清を段階希釈してプレートに反応させた後、１ ｕｇ／ｍＬのペルオキシダーゼで標識したＲ−１０Ｇ抗体（和光純薬工業社製）を反応させて、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。コントロールには、正常マウスの血清を用いた。

【0191】

結果、コントロールマウス血清では反応性が確認されなかったものの、Ｃａｐａｎ−１移植マウスモデル血清では高いシグナルが検出され、がん移植マウスの血清中でＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃが検出されることが明らかとなった（図３５参照）。これにより、がん罹患個体の血清を用いて、生体内のがんを検出できることが明らかとなった。

【0192】

（実施例６−３）がん患者の血清を用いたがんの検出
ビオチン化ｒＢＣ２ＬＣＮを０．３ ｕｇ／ｍＬの濃度でアビジンプレート（住友ベークライト社製）に固定化した。肝外胆管がん患者２名からがん摘出手術の前後に血清を採取した。血清をＰＢＳで１０倍希釈してプレートに反応させた後、１ ｕｇ／ｍＬのペルオキシダーゼで標識したＲ−１０Ｇ抗体（和光純薬工業社製）を反応させて、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。

【0193】

２名の患者の結果をそれぞれ図３６，図３７に示す。いずれの患者においても手術前に採取した血清では高いシグナルが検出されたが、がん摘出後の血清では顕著なシグナル強度の減少が確認された。術後の顕著なシグナル強度の減少はがんの摘出に起因するものと考えらえる。シグナル強度は術後徐々に上昇する傾向が認められ、摘出しきれずに残存したがんが再度進展している可能性が考えられた。これらの結果は、がん罹患個体の血清を用いて生体内のがんを検出できることを支持するものであり、治療前後のシグナル強度の比較によって治療の有効性を判定できることを示すものである。

【0194】

さらに、同様にして、各種がん患者のがん摘出術後（患者ＩＤ：１５０４２４００６８８１のみ術前）の血清中のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃの検出を行った。コントロールには、緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。

【0195】

その結果、試験を行った肝外胆管がん、胃がん、食道がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）の患者血清で高いシグナルが検出された。大腸がん患者での結果を図３８に示す。図横軸の「ＰＢＳ」はコントロールの吸光度を示し、番号は患者ＩＤを示す。大腸がんの臨床所見は各患者で均一ではないものの、術後患者の多くでで依然として有意なシグナルが検出されている。

【配列表フリーテキスト】

【0196】

配列番号１：ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列。
配列番号２：ＢＣ２ＬＣＮ−ＥＴＡ（ＰＥ２３）のアミノ酸配列。
配列番号３：緑膿菌の外毒素Ａ由来の細胞殺傷ドメイン（Ｄｏｍａｉｎ Ｉ〜ＩＩＩ：ＰＥ３８）のアミノ酸配列。
配列番号４：スペーサー配列。
配列番号５：スペーサー配列。
配列番号６：ＥＲ保留シグナル配列。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29AB】

【図29CD】

【図30A】

【図30B】

【図30CD】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]