特許 6797415 薬剤送達用キャリア及びこれを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6797415

(24)【登録日】2020年11月20日

(45)【発行日】2020年12月9日

(54)【発明の名称】薬剤送達用キャリア及びこれを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/34 20170101AFI20201130BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20201130BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201130BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/34

   A61K9/107

   A61K9/50

   A61K47/18

   A61K47/26

   A61K45/00

【請求項の数】32

【全頁数】58

(21)【出願番号】特願2017-526464(P2017-526464)

(86)(22)【出願日】2016年7月1日

(86)【国際出願番号】JP2016069725

(87)【国際公開番号】WO2017002979

(87)【国際公開日】20170105

【審査請求日】2019年5月9日

(31)【優先権主張番号】62/187,816

(32)【優先日】2015年7月2日

(33)【優先権主張国】US

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ▲１▼平成２８年５月１０日 ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｏｕｄ．ｄｙｎａｃｏｍ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｐｓｊ２０１６／ を通じて発表 ▲２▼平成２８年５月２５日 第６５回高分子学会年次大会 神戸国際会議場・展示場においてポスターをもって発表

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業センター・オブ・イノベーション（ＣＯＩ）プログラム、ＣＯＩ拠点「スマートライフケア社会への変革を先導するものづくりオープンイノベーション拠点」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】片岡 一則

(72)【発明者】

【氏名】安楽 泰孝

(72)【発明者】

【氏名】堀 真緒

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０７５９４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０８４３７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０９９６６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 渡邉拓也ら，中枢神経系細胞への選択的取り込みを志向したデュアルリガンド型高分子ミセルシステムの構築，高分子学会予稿集，２０１５年 ８月，Vol.64, No.2，2Pc093

【文献】 BINAULD, S. et al.，Acid-degradable polymers for drug delivery: a decade of innovation，Chemical Communications，２０１３年，Vol.49，p.2082-2102，ISSN 1359-7345

【文献】 MIUIRA, Y. et al.，Cyclic RGD-Linked Polymeric Micelles for Targeted Delivery of Platinum Anticancer Drugs to Glioblast，ACS Nano，２０１３年，Vol.7, No.10，p.8583-8592，ISSN 1936-0851

【文献】 GUO, Y. et al.，Cell Microenvironment-Controlled Antitumor Drug Releasing-Nanomicelles for GLUT1-Targeting Hepatocel，ACS Applied Materials & Interfaces，２０１５年 ２月，Vol.7，p.5444-5453，ISSN 1944-8244

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーとを含有するキャリアであって、
前記第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第１のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第１の分子で修飾されてなり、
前記第２のブロックコポリマーは、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第２のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第２の分子で修飾されてなり、
前記第１の分子はＧＬＵＴ１リガンドであり、前記第２の分子は、前記第１の分子とは異なるリガンドであり、
前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長く、
前記第１のブロックコポリマーが、前記第１の非荷電性セグメントと前記第１の複合体形成セグメントとの間に、還元環境下で切断される結合またはｐＨ６．５以下で切断される結合を有し、
還元環境下またはｐH６．５以下で前記結合が開裂すると、第一の非荷電性セグメントが除去され、これにより第二のリガンドがキャリアの外表面に露出する、または当該露出の割合が増加する、
キャリア。

【請求項2】

第１の複合体形成セグメント及び第２の複合体形成セグメントが荷電性セグメントである、請求項１に記載のキャリア。

【請求項3】

第２の荷電性セグメントが前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有する、請求項２に記載のキャリア。

【請求項4】

前記第１の荷電性セグメント及び前記第２の荷電性セグメントのうち少なくとも一方が、ポリアミノ酸である、請求項２又は３に記載のキャリア。

【請求項5】

前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じである、請求項１〜４の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項6】

前記還元環境下で切断される結合が、ジスルフィド結合である、請求項１〜５の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項7】

第１の非荷電性セグメント及び第２の非荷電性セグメントのうち少なくとも一方が、ポリアルキレングリコールセグメントである、請求項１〜６の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項8】

前記第２の分子が、脳実質中の組織又は細胞への取り込みを促進する、請求項１〜７の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項9】

前記第２の分子が、脳実質中の特定の組織又は細胞に特異的な親和性を有する、請求項８に記載のキャリア。

【請求項10】

前記第２の分子が、アスパラギン酸又はその誘導体である、請求項１〜９の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項11】

前記ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、請求項１〜１０の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項12】

前記グルコースが６位の炭素を介して第１の非荷電性セグメントと連結されている、請求項１１に記載のキャリア。

【請求項13】

小胞である、請求項１〜１２の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項14】

小胞が直径４００ｎｍ以下の小胞である、請求項１３に記載のキャリア。

【請求項15】

前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長いと共に、前記第１のブロックコポリマーの１０モル％以上４０モル％未満がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１〜１４の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項16】

前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであると共に、前記第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の１０モル％以上４０モル％未満がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１〜１５の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項17】

前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長いと共に、前記第１のブロックコポリマーの４０〜１００モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１〜１５の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項18】

前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであると共に、前記第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の４０〜９９モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、請求項１〜１５の何れか一項に記載のキャリア。

【請求項19】

請求項１〜１８の何れか一項に記載のキャリアと、当該キャリアに内包された薬剤とを含有する、組成物。

【請求項20】

前記薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記薬剤を脳内に送達するための、請求項１９又は２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記薬剤を脳血管内皮細胞及び／又は脳実質部に送達するための、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記薬剤を脳実質中の特定の組織又は細胞に送達するための、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記薬剤に血液脳関門を通過させるための、請求項１９又は２０に記載の組成物。

【請求項25】

前記薬剤に血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させるための、請求項１９又は２０に記載の組成物。

【請求項26】

治療用途に用いられる、請求項１９〜２５の何れか一項に記載の組成物。

【請求項27】

診断用途に用いられる、請求項１９〜２５の何れか一項に記載の組成物。

【請求項28】

請求項１９又は２０に記載の組成物を非ヒト対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の脳内へ送達する方法。

【請求項29】

薬剤が脳血管内皮細胞及び／又は脳実質部に送達される、請求項２８記載の方法。

【請求項30】

薬剤が脳実質中の特定の組織又は細胞に送達される、請求項２９記載の方法。

【請求項31】

請求項１９又は２０に記載の組成物を非ヒト対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の血液脳関門を通過させる方法。

【請求項32】

請求項１９又は２０に記載の組成物を非ヒト対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬剤送達用キャリア及びこれを含む組成物に関する。また、本発明は、当該キャリア又は組成物を用いた薬剤の送達方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血液と脳との間には、物質交換を制限する血液脳関門が存在することが知られている。これは脳血管内皮細胞が密着結合を形成し、細胞の隙間が極めて狭いこと、並びに、細胞自体が選択的な物質の取り込みおよび排出を行なっていることによると考えられている。

【0003】

血液脳関門の透過選択性は高く、一部の物質（例えば、アルコール、カフェイン、ニコチンおよびグルコース）を除いてはほとんど通過することができない。そして、このことが、脳治療薬による脳疾患の治療、脳診断薬による脳疾患の診断または造影剤による脳の造影を困難なものにしてきた。

【0004】

グルコースが血液脳関門を通過する特性を利用して、抗体を脳へ送達する技術が開発されている（特許文献１）。しかしながら、この技術は、単に抗体をグリコシル化するにとどまるため、効果は限定的である。

【0005】

本発明者らは、低血糖を誘発させた対象に、グルコースでその外表面を修飾したミセルなどの小胞に薬剤を内包させて投与し、その後、血糖値を上昇させることにより、薬剤を内包する小胞を脳に効率良く送達する技術を開発している（特許文献２）。しかしながら、脳内の所望の部位、例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に対して、より選択的に薬剤を送達する技術が求められていた。

【0006】

トランスフェリンとナノパーティクルコアとの間に酸で切断可能な結合を有するナノパーティクルを用いることにより、標的化したナノパーティクルの脳内への取り込みが上昇したことが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、脳内の特定の組織や細胞に対して、選択的にナノパーティクルを送達することについては記載されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００７／０６８４２９号

【特許文献2】国際公開第２０１５／０７５９４２号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 6;112(40):12486-91

【発明の概要】

【0009】

本発明は、薬剤送達用キャリア及びこれを含む組成物を提供する。

【0010】

本発明者らは、グルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ１）リガンドで修飾した第１のブロックコポリマーと、別のリガンドで修飾した第２のブロックコポリマーとを含有するキャリアを用いることにより、脳内の所望の部位、例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に対して、より選択的に薬剤を送達することが可能となるのを見出した。本発明は、この知見に基づく発明である。

【0011】

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーとを含有するキャリアであって、
前記第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第１のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第１の分子で修飾されてなり、
前記第２のブロックコポリマーは、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第２のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第２の分子で修飾されてなり、
前記第１の分子はＧＬＵＴ１リガンドであり、前記第２の分子は、前記第１の分子とは異なるリガンドである、キャリア。
［２］第１の複合体形成セグメント及び第２の複合体形成セグメントが荷電性セグメントである、［１］に記載のキャリア。
［３］第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有する、［２］に記載のキャリア。
［４］前記第１の荷電性セグメント及び前記第２の荷電性セグメントのうち少なくとも一方が、ポリアミノ酸である、［２］又は［３］に記載のキャリア。
［５］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長い、［１］〜［４］の何れかに記載のキャリア。
［６］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じである、［１］〜［４］の何れかに記載のキャリア。
［７］前記第１のブロックコポリマーは、前記第１の非荷電性セグメントと前記第１の複合体形成セグメントとの間に、ｐＨ６．５以下で切断される結合を有する、［１］〜［６］の何れかに記載のキャリア。
［８］前記第１のブロックコポリマーは、前記第１の非荷電性セグメントと前記第１の複合体形成セグメントとの間に、還元環境下で切断される結合を有する、［１］〜［６］の何れかに記載のキャリア。
［９］前記還元環境下で切断される結合が、ジスルフィド結合である、［８］に記載のキャリア。
［１０］第１の非荷電性セグメント及び第２の非荷電性セグメントのうち少なくとも一方が、ポリアルキレングリコールセグメントである、［１］〜［９］の何れかに記載のキャリア。
［１１］前記第１の非荷電性セグメントの配向と、前記第２の非荷電性セグメントの配向とが同じである、［１］〜［１０］の何れかに記載のキャリア。
［１２］前記第１のブロックコポリマーが、前記第２のブロックコポリマーを内包している、［１］〜［１１］の何れかに記載のキャリア。
［１３］前記第２の分子が、脳実質中の組織又は細胞への取り込みを促進する、［１］〜［１２］の何れかに記載のキャリア。
［１４］前記第２の分子が、脳実質中の特定の組織又は細胞に特異的な親和性を有する、［１３］に記載のキャリア。
［１５］前記第２の分子が、アスパラギン酸又はその誘導体である、［１］〜［１４］の何れかに記載のキャリア。
［１６］前記ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、［１］〜［１５］の何れかに記載のキャリア。
［１７］前記グルコースが６位の炭素を介して第１の非荷電性セグメントと連結されている、［１６］に記載のキャリア。
［１８］小胞である、［１］〜［１７］の何れかに記載のキャリア。
［１９］小胞が直径４００ｎｍ以下の小胞である、［１８］に記載のキャリア。
［２０］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長いと共に、前記第１のブロックコポリマーの１０モル％以上４０モル％未満がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、［１］〜［１９］の何れかに記載のキャリア。
［２１］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであると共に、前記第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の１０モル％以上４０モル％未満がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、［１］〜［１９］の何れかに記載のキャリア。
［２２］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長いと共に、前記第１のブロックコポリマーの４０〜１００モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、［１］〜［１９］の何れかに記載のキャリア。
［２３］前記第１の非荷電性セグメントの鎖長は、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであると共に、前記第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の４０〜９９モル％がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、［１］〜［１９］の何れかに記載のキャリア。
［２４］［１］〜［２３］の何れかに記載のキャリアと、当該キャリアに内包された薬剤とを含有する、組成物。
［２５］前記薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、［２４］に記載の組成物。
［２６］前記薬剤を脳内に送達するための、［２４］又は［２５］に記載の組成物。
［２７］前記薬剤を脳血管内皮細胞及び／又は脳実質部に送達するための、［２６］に記載の組成物。
［２８］前記薬剤を脳実質中の特定の組織又は細胞に送達するための、［２７］に記載の組成物。
［２９］前記薬剤に血液脳関門を通過させるための、［２４］又は［２５］に記載の組成物。
［３０］前記薬剤に血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させるための、［２４］又は［２５］に記載の組成物。
［３１］治療用途に用いられる、［２４］〜［３０］の何れかに記載の組成物。
［３２］診断用途に用いられる、［２４］〜［３０］の何れかに記載の組成物。
［３３］［２４］又は［２５］に記載の組成物を対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の脳内へ送達する方法。
［３４］薬剤が脳血管内皮細胞及び／又は脳実質部に送達される、［３３］に記載の方法。
［３５］薬剤が脳実質中の特定の組織又は細胞に送達される、［３４］に記載の方法。
［３６］［２４］又は［２５］に記載の組成物を対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の血液脳関門を通過させる方法。
［３７］［２４］又は［２５］に記載の組成物を対象に投与することを含む、該薬剤を該対象の血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門を通過させる方法。

【0012】

［１’］第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーを含有するキャリアであって、
前記第１のブロックコポリマーは、第１の分子で修飾された、第１のポリエチレングリコールと第１の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第１のポリエチレングリコールと前記第１の荷電性セグメントとの間にジスルフィド結合を有し、
前記第２のブロックコポリマーは、第２の分子で修飾された、第２のポリエチレングリコールと第２の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、
前記第１のポリエチレングリコールの鎖長は、前記第２のポリエチレングリコールの鎖長より長く、
前記第１の分子と前記第２の分子は異なり、
前記第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有することを特徴とするキャリア。
［２’］前記第１のブロックコポリマーは、前記第２のブロックコポリマーを内包している［１’］に記載のキャリア。
［３’］前記第１のポリエチレングリコールと前記第２のポリエチレングリコールの配向が同じである［２’］に記載のキャリア。
［４’］第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち、少なくとも一方は、ポリアミノ酸である［１’］〜［３’］のいずれかに記載のキャリア。
［５’］前記第１の分子は、グルコースである［１’］〜［４’］のいずれかに記載のキャリア。
［６’］前記第２の分子は、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、及び抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種である［１’］〜［５’］のいずれかに記載のキャリア。
［７’］［１’］〜［６’］のいずれかに記載のキャリアと生理活性物質を含有することを特徴とする医薬組成物。
［８’］脳疾患治療用又は脳疾患診断用である［７’］に記載の医薬組成物。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、脳内の所望の部位、例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に対して、より選択的に薬剤を送達することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の概要を示す。

【図2】血液脳関門（ＢＢＢ）を効率よく突破し、かつ脳内精密標的能を有するＤＤＳキャリア開発の概要を示す。先行研究では、グルコース修飾したミセルと血糖値制御により高効率なＢＢＢ突破が可能であることが明らかとなったが、このグルコース修飾ミセルはＢＢＢ突破後には脳全体に分布してしまい細胞種や部位選択性を有していない。そこで、ＢＢＢ突破のためのグルコースリガンドに加え、第二のリガンドを適切に選択することにより、ＢＢＢ突破後の脳組織内精密標的能を有する新規キャリアを開発することにした。このとき、グルコースが結合している側のポリマーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の長さを、第二のリガンドが結合しているポリマーのＰＥＧよりも長くしておくことによって、血中において第二のリガンドを保護するとともに、第二のリガンドによる血中滞留性の低下やＢＢＢ突破効率の低下を防ぐことが可能である。

【図3】ＤＤＳキャリアによる脳血管関門（ＢＢＢ）の効率的な突破、及び脳内精密標的化の一例を示す。ＢＢＢ突破後の脳実質内には、還元作用を有するグルタチオンが血中の数十〜数百倍存在することを利用し、グルコース−ＰＥＧと荷電性セグメント（正負のどちらでも可）の間に還元環境下で開裂するジスルフィド結合を導入することで、ＢＢＢ突破後にグルコース−ＰＥＧが脱離するシステムを考えた。これにより、ＢＢＢ突破後にはセカンドリガンドのみが露出することとなり、より高い細胞種・部位選択性の実現が可能である。

【図4】ＳＳ結合を分子内に有する還元環境応答性ポリマーの合成を示す。ＢＢＢ突破後の脳実質内には、還元作用を有するグルタチオンが血中の数十〜数百倍存在することを利用し、グルコース−ＰＥＧと荷電性セグメント（正負のどちらでも可）の間に還元環境下で開裂するジスルフィド結合を導入することで、ＢＢＢ突破後にグルコース−ＰＥＧが脱離するシステムを考えた。これにより、ＢＢＢ突破後にはセカンドリガンドのみが露出することとなり、より高い細胞種・部位選択性の実現が可能である。

【図5】ＰＥＧ−ＣＯＯＨの合成スキームを示す。まず、ＰＥＧ−ＮＨ_２（ＰＥＧの分子量１２ｋＤａ，８００ｍｇ，０．０６６７ｍｍｏｌ，日油株式会社）をジクロロメタン（１６ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、ＤＭＦ（４ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解した無水コハク酸（１４０ｍｇ，０．７１４ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）を加え、３５℃で〜時間反応させた。反応溶液を分画分子量６−８ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア，フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後、凍結乾燥することで白色粉末を得た（収率９４％）。これを１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分析した結果、反応は定量的に進行し、全ての末端アミノ基がカルボキシル基に変換されていることが確認された（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）。

【図6】ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成スキームを示す。次に、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（５００ｍｇ，０．０４０７ｍｍｏｌ）を純水（１０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを中性付近（６．５〜７．５）に調製した後、シスタミン２塩酸塩（１８３ｍｇ，０．９７６ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）と塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（１５６ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）を粉のまま加え、室温で１２時間反応させた。反応溶液を分画分子量６−８ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア， フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後（外液０．０１％ ＨＣｌ ａｑ）、凍結乾燥することで白色粉末を得た（収率９４％）。これを１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分析した結果、反応は定量的に進行し、上記のように分子内にジスルフィド結合を有する重合開始剤（ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２・ＨＣｌ）が得られたことがわかった。

【図7】ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成スキームを示す。ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ２・ＨＣｌを再度純水に溶解し、分画分子量６−８ｋＤａの透析膜を用いて透析処理した後（外液０．０１％アンモニア水溶液）、凍結乾燥することでＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ２を得た。これを開始剤として、既報に従いＮＣＡ−ＢＬＡの重合を行った。具体的には、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ２（９４ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．７ｍＬ，関東化学株式会社）に溶解した後、ＤＭＦ（０．３ｍＬ，関東化学株式会社）とジクロロメタン（２ｍＬ，関東化学株式会社）の混合溶媒に溶解したＮＣＡ−ＢＬＡ（１５２ｍｇ，０．６００ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で２日間反応させた。この反応溶液を、ヘキサン：酢酸エチル＝２：３（体積比，どちらも株式会社ゴードー）に滴下し、沈殿物を吸引ろ過により回収した。これを一晩減圧乾燥することでＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡを得た。次に、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡ（２００ｍｇ，０．００６９ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１０ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、５℃に冷却した。一方で、１，５−ジアミノペンタン（６ｍＬ，東京化成工業）も同様にＮＭＰ（６ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、５℃に冷却した後、これに対してポリマー溶液を滴下し、５℃で１時間反応させた。この反応溶液を分画分子量１５ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア，フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後（外液０．０１％ ＨＣｌ ａｑ）、凍結乾燥することにより白色粉末を得た（収率８９％，平均重合度７２）。これを１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とサイズ排除カラムクロマトグラフィーにより分析したところ、約１割のＳＳ結合の開裂がみられたものの、ほぼ定量的にＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））が得られたことが分かった。

【図8】ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の還元環境応答性の評価を示す。先に合成したＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））の還元環境応答性を評価するため、まず１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、これに対して脳内のグルタチオン濃度（３ｍＭ）と同程度の還元環境となるようにＤＴＴ溶液を添加し、ピペッティングにより攪拌した後に静置した。この溶液を５分後、１５分後、５０分後にそれぞれサンプリングし、ＨＰＬＣを用いて分子量の変化を評価した。その結果、時間経過に伴い分解したフラクションであるＰＥＧ−ＳＨ（２０ｍｉｎ）、Ｓｈ−Ｐ（Ａｓｐ−Ａｐ）（２２ｍｉｎ）の割合が増大し、５０分後にはほぼすべてのＳＳ結合が開裂したことが示唆された。

【図9】ＳＳ結合を有するミセルの調製スキームを示す。先に合成したＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））よりも短いＰＥＧ（分子量２Ｄａ）と反対電荷を有する荷電性セグメント（今回は負の荷電連鎖）からなるブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ）を既報に従い合成した。これら２種類のポリマーを、それぞれ１０ｍＭのリン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、電荷の釣り合う点で混合した後、室温で２分間攪拌することで長さの異なる２種類のＰＥＧで覆われたミセルを調製した。その後、縮合剤であるＥＤＣを純水に１−１０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、これをミセル溶液に同量添加することで、ミセルのコア部分を固定化した（架橋）。これらのミセルをそれぞれ動的光散乱測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）により評価したところ、平均粒径５０ｎｍ程度で単分散な粒子が得られたことがわかった。これらのミセル溶液に還元剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業）溶液（５ｍＭ）を同量添加して室温で２時間静置し、同様に動的光散乱測定を行った。その結果、ＥＤＣの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下の場合には、ミセルコア部分の固定化が十分でなく、ＰＥＧの脱離に伴う形態変化が確認された。一方で、３−１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液を添加した場合には、コアが十分に固定化され、ミセルの形状を保持したまま、ＰＥＧの脱離に伴う粒径減少が確認された。

【図10】ＳＳ結合を有するミセルの還元環境応答性の評価を示す。先に調製したミセルのうち、最もコア部分が強く固定化されていることが予想される１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加したミセル溶液を用いて、さらに還元環境応答性を詳細に評価した。グルタチオン濃度０．０２〜６ｍＭに相当する還元力となるよう、還元電位をもとにＤＴＴを１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈することでＤＴＴ溶液を作成した。ミセル溶液に、同量のＤＴＴ溶液をそれぞれ添加し、動的光散乱測定によりミセルの粒径変化を評価した。その結果、脳内のグルタチオン濃度に相当する領域（１−３ｍＭ）では、粒径の減少が確認された。これは、ジスルフィド結合の開裂に伴い、分子量１２ｋＤａのＰＥＧが脱離し、２ｋＤａのＰＥＧのみが表層にとどまったことを示唆するものである。また、２ｋＤａのＰＥＧを表層に有するミセルの粒径が３０ｎｍ程度であることも、この仮定を裏付けている。さらに、血液中のグルタチオン濃度に相当する領域（０．０１ｍＭ）では、粒径に変化はなかったことから、このミセルは血液中においてはその構造を安定に保持し、ＢＢＢ突破後の脳実質内においてのみＰＥＧが脱離するという機能を発揮する可能性を有していると言える。

【図11】アスパラギン酸リガンドのポリマーへの導入のスキームを示す。

【図12】（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ−ＰＡｓｐからのＢｏｃの脱離を示す。

【図13】Ａｓｐ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐの合成スキームを示す。

【図14】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞へのミセルの取り込みを示す。

【図15】脳切片中でのミセルの分布を示す。（Ａ）Ｇｌｃ修飾ミセル、（Ｂ）Ａｓｐ修飾ミセル、（Ｃ）Ａｓｐ−ＤＢＣＯ修飾ミセル。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．定義
本発明では、「薬剤輸送体」とは、薬剤送達のためのキャリアを意味し、薬剤を内包できる微粒子、例えば、小胞、デンドリマー、ハイドロゲルおよびナノスフェアなどが挙げられる。薬剤輸送体は、一般的には、直径１０ｎｍ〜４００ｎｍの大きさを有する。

【0016】

本明細書では、「小胞」とは、ミセルや中空微粒子を意図している。小胞は、好ましくは生体適合性の外殻を有し、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾を受けている。これにより、小胞は、ＧＬＵＴ１と相互作用することができる。

【0017】

本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。

【0018】

本明細書では、「リポソーム」とは、２層の分子膜により形成される小胞を意味する。分子膜は通常はリン脂質による二重膜である。

【0019】

本明細書では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」（以下、「ＰＩＣｓｏｍｅ」ともいう）とは、ポリイオンコンプレックスにより形成され、膜によって包囲された空隙部を有し、内部に物質を包有しうる微粒子を意味する。ＰＩＣｓｏｍｅは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。

【0020】

本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、アニオン性ポリマー（ポリアニオン）とカチオン性ポリマー（ポリカチオン）とが静電相互作用により結合又は集合することにより形成される複合体を意味する。該複合体は、難水溶性又は非水溶性であり得る。例えば、非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ）とアニオン性ポリマーとのブロックコポリマーと、非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ）とカチオン性ポリマーとのブロックコポリマーとを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロックコポリマーのカチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの間でポリイオンコンプレックスが形成される。ＰＥＧ等の非荷電性ポリマーと上記の荷電性ポリマーとを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧ等の非荷電性セグメントがナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことが期待される。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ部分）を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよい。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つが非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ）とのブロックコポリマーを形成しており、その両方が非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ）とのブロックコポリマーを形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を増加させるとＰＩＣミセルが形成されやすく、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすいことが知られている。ポリイオンコンプレックスの作製によく用いられるアニオン性ポリマー（またはセグメント）としては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸および核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）等）が挙げられ、カチオン性ポリマー（またはセグメント）としては、例えば、ポリリジンおよびポリ（５−アミノペンチルアスパラギン酸）が挙げられる。ここで、ｍＲＮＡとは、翻訳によりタンパク質合成に用いられるメッセンジャーＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）を意味する。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。

【0021】

本明細書では、「ブロックコポリマー」とは、複数のポリマーが直列に連結されることにより形成されるポリマーを意味する。ブロックコポリマーに含まれる各ポリマー部分をセグメント又はブロックと称する。ブロックコポリマーを構成する各セグメントは、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。

【0022】

本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中滞留時間を、裸の薬剤の血中滞留時間と比べて長期化する作用を利用した用途を意味することがある。

【0023】

本明細書では、「低血糖を誘発させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、絶食、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。

【0024】

本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。

【0025】

本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。

【0026】

本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。

【0027】

本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、運動神経障害、例えば、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症、および、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。

【0028】

本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。

【0029】

本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２−Ｎ−４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイル−１，３−ビス（Ｄ−マンノース−４−イルオキシ）−２−プロピルアミン（ＡＴＢ−ＢＭＰＡ）、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）、４，６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−Ｏ−メチルグルコース、1，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子（グルコース誘導体と称する場合がある）もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。

【0030】

本発明におけるＧＬＵＴ１リガンド（グルコース等）の役割は、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ１に結合することであると考えられる。従って、本発明では、グルコース以外のＧＬＵＴ１リガンドもグルコースと同じ役割を果たすことができる。本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドは、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターに結合することができるように、その外表面に露出するようにキャリア上に配置することができる。ＧＬＵＴ１にＧＬＵＴ１リガンドを提示することができるキャリア（複合体および小胞その他）は、ＧＬＵＴ１と結合し得、結合後にグルコースによりＧＬＵＴ１が細胞内に取り込まれる際に、一緒に血管内皮細胞内に取り込まれるものと考えられる。また、血管内皮細胞に取り込まれると、取り込まれた小胞は、血液脳関門を通過して脳実質に移行する。キャリアを修飾するグルコース分子が多いと、脳実質に到達する小胞の割合がわずかであるが低下した。このことは、キャリアを修飾するグルコース分子が多いと、キャリアがエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、そのまま、脳実質に向けて細胞を通過すること、および、キャリアが血管内皮細胞から脳実質に移行する際に、キャリアと血管内皮細胞との解離の効率が低下することを示唆するものである。言い換えれば、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれたキャリアの一部は、脳血管内皮細胞と解離せず、脳血管内皮細胞に蓄積する。従って、本発明のキャリアまたは組成物は、脳血管内皮細胞に送達することにも用いることができる。また、本発明におけるＧＬＵＴ１リガンドの役割は、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、同様である。特に、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、低血糖時の血管内皮細胞にはＧＬＵＴ１が発現する。従って、本発明のキャリアまたは組成物は、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門を通過させるために用いることができる。本発明のキャリアまたは組成物はまた、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門に存在する血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。

【0031】

２．キャリア
本発明は、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーとを含有するキャリアであって、前記第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第１のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第１の分子で修飾されてなり、前記第２のブロックコポリマーは、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第２のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第２の分子で修飾されてなり、前記第１の分子はＧＬＵＴ１リガンドであり、前記第２の分子は、前記第１の分子とは異なるリガンドである、キャリアを提供する。

【0032】

本発明者らは、第１の分子としてＧＬＵＴ１リガンドで修飾した第１のブロックコポリマーと、第２の分子、即ち第２のリガンドで修飾した第２のブロックコポリマーとを含有する上記のキャリアにより、脳内の所望の部位、例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に対して選択的に薬剤を送達することが可能となるのを見出し、本発明に到達したものである。

【0033】

本発明者らは既に、グルコース等のＧＬＵＴ１リガンドで外表面を修飾したキャリアにより、脳への蓄積が見られることを、国際公開第２０１５／０７５９４２号において詳細に報告している（本明細書はその全体が引用により本明細書に組み込まれる。）。但し、かかるＧＬＵＴ１リガンドのみを標的化リガンドとして用いたキャリアの場合、血液脳関門の通過後、キャリアは通常はニューロン及び／又はミクログリアに移行するが、選択的な移行は行われず、且つ、アストロサイトには移行しない。更には、どの細胞にも取り込まれないキャリアも存在する。一方、本発明では、第１のブロックコポリマーを修飾するＧＬＵＴ１リガンドにより、上記と同様の機序でキャリアに血液脳関門を通過させると共に、第２のブロックコポリマーを修飾する第２のリガンドにより、脳内の所望の部位、例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に、キャリアを選択的に移行させる。このように２種類のリガンドを用いることにより、脳内への侵入と脳内の所望の部位への選択的移行とを共に達成しうることは、従来は全く知られておらず、本発明者らが初めて見いだした驚くべき知見である。

【0034】

以下、具体的に説明する。
第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーであり、第２のブロックコポリマーは、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとのブロックコポリマーである。以下、第１のブロックコポリマー及び第２のブロックコポリマーを総称して、単にブロックコポリマーという場合があり、第１の非荷電性セグメント及び第２の非荷電性セグメントを総称して、単に非荷電性セグメントという場合があり、また、第１の複合体形成セグメント及び第２の複合体形成セグメントを総称して、単に複合体形成セグメントという場合がある。

【0035】

非荷電性セグメントは、非荷電の性質を有するポリマーセグメントである。ここで「非荷電」とは、セグメントが全体として中性であることをいう。例としてはセグメントが正・負の電荷を有さない場合が挙げられる。また、セグメントが正・負の荷電を分子内に有する場合であっても、局所的な実効電荷密度が高くなく、自己組織化によるベシクルの形成を妨げない程度にセグメント全体の荷電が中和されていれば、やはり「非荷電」に該当する。
また、非荷電性セグメントは、親水性であることが好ましい。ここで「親水性」とは、水性媒体に対して溶解性を示すことをいう。

【0036】

非荷電性セグメントの種類は限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。非荷電性セグメントの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）、等電点が７付近のペプチド、タンパク質及びそれらの誘導体等が挙げられる。

【0037】

中でも、第１及び第２の非荷電性セグメントのうち少なくとも一方、好ましくは両方が、ポリアルキレングリコールであることが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールは直鎖状であっても、分岐鎖状（例、ＰＥＧａｓｕｓ）であってもよいが、好ましくは直鎖状である。

【0038】

非荷電性セグメントの長さは、脳内の所望の組織又は細胞への選択的送達が可能である限り特に限定されないが、ポリエチレングリコールの場合、重合度が通常５以上（例えば、１０以上、４０以上）であり、且つ２０，０００以下（例えば、５，０００以下、１，０００以下、５００以下、２００以下）に相当する長さである。ポリエチレングリコール以外の非荷電性セグメントの長さは、上述の重合度のポリエチレングリコールに相当する長さであり得る。

【0039】

第１の非荷電性セグメントと第２の非荷電性セグメントとは、同じ種類であってもよく、異なる種類であってもよい。また、第１の非荷電性セグメント及び第２の非荷電性セグメントは各々、単一種類の非荷電性セグメントであってもよく、複数種類の非荷電性セグメントが混在していてもよい。

【0040】

複合体形成セグメントは、第１のブロックコポリマー及び第２のブロックコポリマーが集合し、本発明のキャリアを形成する際に、キャリアを構成する構成要素と相互作用（結合等）して、小胞（ミセル、リポソーム、ＰＩＣミセル、ＰＩＣsome、ポリマーソーム等）のコア構造の形成に寄与するセグメントを意味する。複合体形成セグメントには、疎水性セグメント及び荷電性セグメントが含まれる。疎水性セグメントは、疎水性相互作用を介して、他の疎水性セグメントと共にミセル、リポソーム、ポリマーソーム等を形成することにより、キャリアの形成に寄与する。荷電性セグメントは、ポリイオンコンプレックス形成によるＰＩＣミセル、ＰＩＣsomeなどを形成することにより、キャリアの形成に寄与する。第１及び第２のブロックコポリマー中の疎水性セグメントを、それぞれ、第１の疎水性セグメント及び第２の疎水性セグメントと呼ぶ。第１及び第２のブロックコポリマー中の荷電性セグメントを、それぞれ、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントと呼ぶ。

【0041】

疎水性セグメントの種類は限定されず、単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。疎水性セグメントとしては、ポリ乳酸、側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸を構成単位とするポリアミノ酸又はその誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸としては、好ましくは２５℃の水１００ｇに対する溶解度が５ｇ以下、さらに好ましくは４ｇ以下であるアミノ酸が挙げられる。このようなアミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性天然アミノ酸や、側鎖に疎水性基が導入されたアミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。アミノ酸の疎水性誘導体としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。上記導入される疎水性基としては、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはステリル基が好ましく例示され得る。側鎖に疎水性基を有する疎水性アミノ酸を構成単位とするポリアミノ酸としては、例えば、ポリ(ベンジル-L-アスパルテート）（ＰＢＬＡ）を挙げることができる。

【0042】

一方、荷電性セグメントは、荷電を有するセグメントである。セグメント全体としての荷電の種類により、カチオン性セグメントと、アニオン性セグメントとに分けられる。
カチオン性セグメントは、カチオン基を有し、カチオン性（陽イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、カチオン性セグメント全体としてのカチオン性を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。

【0043】

カチオン性セグメントの種類は限定されず、単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。カチオン性セグメントとしては、アミノ基を含有するモノマーユニットを含むポリマー等を挙げることができるが、特にこれに限定されない。アミノ基を含有するモノマーユニットは、好ましくは、側鎖にアミノ基を含有するモノマーユニットである。アミノ基を含有するモノマーユニットを含むポリマーとしては、ポリアミン、側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体等が挙げられ、特に限定されないが、側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体が好ましい。側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられ、特に限定されないが、ポリアスパルタミド又はその誘導体及びポリグルタミド又はその誘導体が好ましい。ポリアスパラギン酸（又はポリグルタミン酸）を１，５−ジアミノペンタンと反応させることにより、アスパラギン酸（グルタミン酸）の側鎖カルボン酸にアミノペンタン（ＡＰ）を導入することにより得られる、ポリ（Ａｓｐ−ＡＰ）（又はポリ（Ｇｌｕ−ＡＰ）；ポリアスパラギン酸（又はポリグルタミン酸）をＤＥＴ（Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ‐ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）と反応させることにより、アスパラギン酸（又はグルタミン酸）の側鎖カルボン酸にＤＥＴを導入することにより得られる、ポリ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）（又はポリ（Ｇｌｕ−ＤＥＴ））等が好適に使用される。

【0044】

一方、アニオン性セグメントは、アニオン基を有し、アニオン性（陰イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、アニオン性セグメント全体としてのアニオン性を妨げない範囲で、多少のカチオン基を有していてもよい。

【0045】

アニオン性セグメントの種類も限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。アニオン性セグメントとしては、カルボキシル基を含有するモノマーユニットを含むポリマー、硫酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマー、リン酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマー等を挙げることができるが、これらに限定されない。カルボキシル基を含有するモノマーユニットは、好ましくは、側鎖にカルボキシル基を含有するモノマーユニットである。硫酸基を含有するモノマーユニットは、好ましくは、側鎖に硫酸基を含有するモノマーユニットである。側鎖にカルボキシル基を含有するモノマーユニットを含むポリマーとしては、側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体等が挙げられるがこれらに限定されない。側鎖に硫酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマーとしては、硫酸化多糖類等が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマーとしては、核酸等が挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性セグメントは、好ましくは、側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体、核酸等である。

【0046】

側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、前述の側鎖にアミノ基を有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体の側鎖アミノ基にアコニチン酸無水物やシトラコン酸無水物を適当量作用させて得られるポリアミノ酸、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体は、好ましくは、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸である。

【0047】

核酸としては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。核酸は、ベシクルの用途に応じた機能性核酸であってもよい。機能性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ酵素等が挙げられる。これらはベシクルの用途に応じて選択される。例えば、ベシクルをＲＮＡｉ用のＤＤＳに用いる場合、核酸としてはｓｉＲＮＡが用いられる。また、核酸は修飾されたものでもよい。

【0048】

複合体形成セグメントの長さは、脳内の所望の組織又は細胞への選択的送達が可能である限り特に限定されないが、ポリアミノ酸の場合、重合度が通常５以上（例えば、１０以上、４０以上）であり、且つ２０，０００以下（例えば、５，０００以下、１，０００以下、５００以下、２００以下）である。ポリアミノ酸以外の複合体形成セグメントの長さは、上述の重合度のポリアミノ酸に相当する長さであり得る。

【0049】

第１の複合体形成セグメントと第２の複合体形成セグメントとは、同じ種類であってもよく、異なる種類であってもよい。また、第１の複合体形成セグメント及び第２の複合体形成セグメントは各々、単一種類の複合体形成セグメントであってもよく、複数種類の複合体形成セグメントが混在していてもよい。

【0050】

複合体形成セグメントが荷電性セグメントである場合、第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとは、同じ種類であってもよく、異なる種類であってもよい。また、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントは各々、単一種類の荷電性セグメントであってもよく、複数種類の荷電性セグメントが混在していてもよい。また、第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとは、同一の荷電を有していてもよい（即ち、何れもカチオン性セグメント、又は、何れもアニオン性セグメント）し、反対の荷電を有していてもよい（即ち、一方がカチオン性セグメント、他方がアニオン性セグメント）。第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとは、好ましくは、反対の荷電を有している（即ち、一方がカチオン性セグメント、他方がアニオン性セグメント）。また、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち少なくとも一方、好ましくは両方が、ポリアミノ酸又はその誘導体であることがより好ましい。

【0051】

本発明においては、第１のブロックコポリマーの少なくとも一部がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている（即ち、ＧＬＵＴ１リガンドが、第１のブロックコポリマーの少なくとも一部に連結されている）。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、上述のものを挙げることができるが、好ましくはグルコースである。１分子の第１のブロックコポリマーに１分子のＧＬＵＴ１リガンドが連結されていてもよく、１分子の第１のブロックコポリマーに複数分子のＧＬＵＴ１リガンドが連結されていてもよい。本発明のキャリアの脳内への選択的送達が可能である限り、第１のブロックコポリマー中のＧＬＵＴ１リガンド連結部位は特に限定されないが、キャリアの外表面にＧＬＵＴ１リガンドを効率的に提示する観点から、好ましくは、第１のブロックコポリマー中の第１の非荷電性セグメントがＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている。第１の非荷電性セグメント中のＧＬＵＴ１リガンドにより修飾される部位は特に限定されないが、キャリアの外表面にＧＬＵＴ１リガンドを効率的に提示する観点から、第１の非荷電性セグメントの末端（第１の複合体形成セグメントが連結されていない側）に、ＧＬＵＴ１リガンドが連結されている。即ち、好ましい態様において、第１のブロックコポリマーにおいては、ＧＬＵＴ１リガンド、第１の非荷電性セグメント及び第１の複合体形成セグメントが、末端から、ＧＬＵＴ１リガンド−第１の非荷電性セグメント−第１の複合体形成セグメントの順で連結されている。

【0052】

ＧＬＵＴ１リガンドとしてグルコースを使用する場合、グルコースは、その１位、２位、３位、４位、および６位の炭素原子のいずれか１つの炭素原子を介して、第１のブロックコポリマー（好ましくは、第１の非荷電性セグメント、より好ましくは、第１の非荷電性セグメントの末端）に連結することができる。ＧＬＵＴ１とグルコースとの結合には、１位、３位および４位の炭素原子の置換基であるＯＨ基が強く関与していることが知られているので、ＧＬＵＴ１との結合への関与が低い２位又は６位の炭素原子を介して、グルコースを第１のブロックコポリマー（好ましくは、第１の非荷電性セグメント、より好ましくは、第１の非荷電性セグメントの末端）に連結することが好ましい。ＧＬＵＴ１との結合への関与が低い２位や６位の炭素原子を介してグルコースを第１のブロックコポリマーに連結することにより、キャリアの脳への取り込み効率の向上することが期待できる（国際公開第２０１５／０７５９４２号）。本明細書では、ｎ位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（ｎ）」｛但し、ｎは、１〜４および６のいずれかの整数である｝と表記することがある。例えば、本明細書では、６位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（６）」と表記し、２位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（２）」と表記し、３位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（３）」と表記することがある。

【0053】

なお、第１のブロックコポリマーは、その全部がＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていてもよく、一部のみがＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていてもよい。なお、以下、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された第１のブロックコポリマーを、修飾型の第１のブロックコポリマーと略称し、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていない第１のブロックコポリマーを、非修飾型の第１のブロックコポリマーと略称する。第１のブロックコポリマー中の修飾型の第１のブロックコポリマーの割合は、通常、１０〜１００％であり、送達を意図する脳内の部位や、非荷電性セグメントと複合体形成セグメントとの連結様式等に応じて、適宜変更可能である（下に詳述する）。

【0054】

本発明においては、第２のブロックコポリマーの少なくとも一部が第２の分子（第２のリガンド）により修飾されている（即ち、第２の分子が、第２のブロックコポリマーの少なくとも一部に連結されている）。第２の分子は、前記第１の分子（即ち、ＧＬＵＴ１リガンド）とは異なるリガンドである。１分子の第２のブロックコポリマーに１分子の第２の分子が連結されていてもよく、１分子の第２のブロックコポリマーに複数分子の第２の分子が連結されていてもよい。本発明のキャリアの脳内の所望の組織又は細胞への選択的送達が可能である限り、第２のブロックコポリマー中の第２の分子連結部位は特に限定されないが、脳内への移行後にキャリアの外表面に第２の分子を効率的に提示する観点から、好ましくは、第２のブロックコポリマー中の第２の非荷電性セグメントが第２の分子により修飾されている。第２の非荷電性セグメント中の第２の分子により修飾される部位は特に限定されないが、脳内への移行後にキャリアの外表面に第２の分子を効率的に提示する観点から、第２の非荷電性セグメントの末端（第２の複合体形成セグメントが連結されていない側）に、第２の分子が連結されている。即ち、好ましい態様において、第２のブロックコポリマーにおいては、第２の分子、第２の非荷電性セグメント及び第２の複合体形成セグメントが、末端から、第２の分子−第２の非荷電性セグメント−第２の複合体形成セグメントの順で連結されている。

【0055】

第２のブロックコポリマーを修飾する第２の分子、即ち第２のリガンドは、脳内の所望の組織又は細胞（標的組織又は標的細胞という場合がある）の表面に発現している特定の分子（例、受容体、輸送体、細胞表面マーカー等）に特異的な親和性を有する化合物（リガンド）であり得る。第２の分子としては、低分子、抗体、アプタマー、ペプチド等、種々のリガンドを用いることが可能であり、キャリアを選択的に移行させるべき脳内の所望の組織又は細胞に応じて、その組織又は細胞の表面に発現している分子に特異的な親和性を有するリガンドを適宜選択することができる。脳内の所望の組織又は細胞の具体例としては、制限されるものではないが、例としては、脳実質内の部位として例えば海馬や小脳、脳実質内の細胞として例えば神経系細胞（ニューロン、アストロサイト、ミクログリア等）や、血管内皮細胞等が挙げられる。そして、例えばニューロンの中でも更に種類選択的な移行を所望することも可能である。かかる脳内の所望の組織又は細胞の表面に発現する分子に特異的な親和性を有するリガンドの具体例としては、脳実質中のニューロン等に発現する神経伝達物質受容体に特異的な親和性を有するリガンド、脳実質中の特定の細胞の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する抗体又はその結合性断片等が挙げられる。例えば、グルタミン酸受容体に特異的な親和性を有するアスパラギン酸又はその誘導体を第２の分子として用いることにより、グルタミン酸受容体発現細胞への選択的な送達が可能となる。グルタミン酸受容体は脳実質内の多様な細胞（例、神経系細胞（ニューロン、グリア細胞等）、血管内皮細胞）に発現しているので、アスパラギン酸又はその誘導体を第２の分子として用いることにより、脳実質内のこれらの細胞へのキャリアの取り込みを促進することにより、キャリアが脳実質内の間隙に浮遊してしまい脳実質細胞へ十分に取り込まれないという課題を解決し得る。細胞腫や部位によって、グルタミン酸受容体のサブタイプや発現量が異なり、サブタイプごとに認識できる構造が異なるので、それぞれのサブタイプに応じたリガンドを用いることにより、細胞腫や部位の標的化が達成され得る。アミノ酸、アセチルコリン、モノアミン等の低分子（例えば、分子量１０００以下）の神経伝達物質の受容体は、低分子のリガンドにより特異的に認識される。そのような低分子のリガンドは、第２のブロックコポリマーの製造時等における取扱いが容易であり、また低分子のため、キャリア全体の構造や安定性への影響を抑制することができるため、好ましい。

【0056】

第２の分子としてアスパラギン酸又はその誘導体を用いる場合、第２のブロックコポリマー中のアスパラギン酸又はその誘導体の残基は、例えば、以下の式：

【0057】

【化1】

【0058】

（式中、Ｒ_１ａ及びＲ_１ｂは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ_１−１２アルキル基（好ましくは、Ｃ_１−６アルキル基）を、Ｒ_２は、水素原子又は未保護もしくは保護されたアミノ基を表す。）で表される基である。直鎖もしくは分枝のＣ_１−１２としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。またアルキル基が置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ_１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。アミノ基が保護された場合の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（-Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（-ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（-Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（-Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（-Ａｌｌｏｃ）、トリフルオロアセチル基（ＣＦ_３ＣＯ−）、フタロイル基（-Ｐｈｔ）、ｐ−トルエンスルホニル基（-ＴｓまたはＴｏｓ）、２−ニトロベンゼンスルホニル基（-Ｎｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0059】

好ましくは、Ｒ_１ａ及びＲ_１ｂは、それぞれ独立して水素原子又はＣ_１−１２アルキル基（好ましくは、Ｃ_１−６アルキル基）であり、Ｒ_２は、水素原子又は未保護もしくは保護されたアミノ基である。アミノ基が保護された場合の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（-Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（-ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（-Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（-Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（-Ａｌｌｏｃ）、トリフルオロアセチル基（ＣＦ_３ＣＯ−）、フタロイル基（-Ｐｈｔ）、ｐ−トルエンスルホニル基（-ＴｓまたはＴｏｓ）、２−ニトロベンゼンスルホニル基（-Ｎｓ）等を挙げることができる。

【0060】

このアスパラギン酸又はその誘導体は、グルタミン酸受容体による認識部位に特別な修飾を施していないため、多様なサブタイプのグルタミン酸受容体に認識され得る。従って、発現するグルタミン酸受容体のサブタイプの種類に関わらず、脳実質内の多様な細胞（例、神経系細胞（ニューロン、グリア細胞等）、血管内皮細胞）へのキャリアの取り込みを促進し得る。

【0061】

一態様において、脳内の所望の組織又は細胞の表面に発現する分子に対する第２の分子の結合親和性についてのＫ_Ｄ値が１×１０^−３Ｍ以下（例えば、１×１０^−４Ｍ以下、１×１０^−５Ｍ以下、１×１０^−６Ｍ以下、１×１０^−７Ｍ以下、１×１０^−８Ｍ以下、１×１０^−９Ｍ以下、１×１０^−１０Ｍ以下、１×１０^−１１Ｍ以下）である。

【0062】

なお、第２のブロックコポリマーは、その全部が第２の分子で修飾されていてもよく、一部のみが第２の分子で修飾されていてもよい。なお、以下、第２の分子で修飾された第２のブロックコポリマーを、修飾型の第２のブロックコポリマーと略称し、第２の分子で修飾されていない第２のブロックコポリマーを、非修飾型の第２のブロックコポリマーと略称する。第２のブロックコポリマー中の修飾型の第２のブロックコポリマーの割合は、通常、１０％以上、好ましくは、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、最も好ましくは１００％である。

【0063】

第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとの間に（１）血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合、（２）ｐＨ６．５以下で切断される結合、又は（３）還元環境下で切断される結合を有し得る。生体内において分解され難い安定な結合は、当業者に周知であり、これを血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合として使用することができる。第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとは、直接共有結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば１〜３０個、好ましくは１〜１０個の炭素−炭素結合に相当する距離を与え得る。ｐＨ６．５以下で切断される結合及び還元環境下で切断される結合については、下に詳述する。

【0064】

第２のブロックコポリマーにおいて、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとの間の結合は、好ましくは、血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合である。好ましくは、第２の非荷電性セグメントと第２の複合体形成セグメントとの間には、ｐＨ６．５以下で切断される結合及び還元環境下で切断される結合が存在しない。第２の非荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとは、直接共有結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば１〜３０個、好ましくは１〜１０個の炭素−炭素結合に相当する距離を与え得る。

【0065】

第１のブロックコポリマーにおけるＧＬＵＴ１リガンド修飾は、好ましくは、血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合を介したものである。好ましくは、第１のブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドとの間には、ｐＨ６．５以下で切断される結合及び還元環境下で切断される結合が存在しない。第１のブロックコポリマーとＧＬＵＴ１リガンドとは、直接共有結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば１〜３０個、好ましくは１〜１０個の炭素−炭素結合に相当する距離を与え得る。

【0066】

第２のブロックコポリマーにおける第２の分子による修飾は、好ましくは、血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合を介したものである。好ましくは、第２のブロックコポリマーと第２の分子との間には、ｐＨ６．５以下で切断される結合及び還元環境下で切断される結合が存在しない。第２のブロックコポリマーと第２の分子とは、直接共有結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば１〜３０個、好ましくは１〜１０個の炭素−炭素結合に相当する距離を与え得る。

【0067】

本発明のキャリアによれば、少なくとも血液脳関門通過時には、ＧＬＵＴ１リガンドを機能させるべく、ＧＬＵＴ１リガンドの少なくとも１部（例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２５％以上）がキャリア外表面に露出していることが好ましい。また、少なくとも血液脳関門通過後にキャリアが選択的に移行すべき脳内の所望の部位においては、第２のリガンドの少なくとも一部（例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２５％以上）がキャリア外表面に露出していることが好ましい。かかるキャリア外表面へのリガンドの露出状態を達成する態様は、特に限定されるものではないが、好ましくは以下の２態様が挙げられる。

【0068】

（１）第１の態様：
第１の態様では、第１及び第２の非荷電性セグメントの鎖長を実質的に同程度とする。実質的に同程度とは、例えば鎖長の差が±２０％以下、好ましくは±１０％以下の範囲である。本態様においては、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとの間の結合は、血液、血管内皮細胞及び脳実質内で切断されない安定な結合、又はキャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位またはキャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位に到達するまでに通過する部位の環境条件下（例えば、脳実質内、又は血管内皮細胞内のエンドソーム内の環境条件下）で特異的に切断される結合（下に詳述する）であり得る。本態様においては、キャリアの外表面に、ＧＬＵＴ１リガンド及び第２のリガンドが同時に露出されている。その結果、キャリアはＧＬＵＴ１リガンドを介して脳血管内皮細胞上のＧＬＵＴ１と結合して、血液脳関門を通過し、脳実質内に移行し、引き続きキャリア上の第２のリガンドを介して、脳実質中の所望の組織又は細胞の表面に結合する。

【0069】

（２）第２の態様：
第２の態様では、ＧＬＵＴ１リガンドが結合する第１の非荷電性セグメントを、キャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位またはキャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位に到達するまでに通過する部位の環境条件下（例えば、脳実質内、又は血管内皮細胞内のエンドソーム内の環境条件下）で特異的に切断することにより、第２のリガンドを事後的にキャリア外表面に露出させ、或いは露出割合を増加させる。本態様の場合、前記第１のブロックコポリマーにおいて、前記第１の非荷電性セグメントと前記第１の複合体形成セグメントとを、キャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位またはキャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位に到達するまでに通過する部位の環境条件下（例えば、脳実質内、又は血管内皮細胞内のエンドソーム内の環境条件下）で特異的に切断される結合により連結する（なお、こうした結合を有する第１のブロックコポリマーを、以下、切断型の第１のブロックコポリマーと略称し、こうした結合を有しない第１のブロックコポリマーを、以下、非切断型の第１のブロックコポリマーと略称する。）。好ましい例としては、血管内皮細胞内のエンドソーム内で切断される応答性官能基、及び、脳実質内で切断される応答性官能基が挙げられる。

【0070】

血管内皮細胞内のエンドソーム内で切断される結合としては、ｐＨの変化によって切断される結合が挙げられる。即ち、脳血管内のｐＨは約７．０〜７．４程度であるのに対し、エンドソーム内のｐＨは約６．５以下であるところ、約７．０〜７．４のｐＨ環境下では切断されず、約６．５以下のｐＨ環境下で切断される結合を用いればよい。例としては、

【0071】

【化2】

【0072】

（Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 6;112(40):12486-91）、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_２−Ｏ−等が挙げられる。本態様においては、ＧＬＵＴ１リガンドが結合する第１の非荷電性セグメントが、血管内皮細胞内のエンドソーム内で切断されることにより、ＧＬＵＴ１リガンドがキャリア外表面から消失し、エンドソーム内表面上のＧＬＵＴ１から解放され、自由に動くことができるようになり、トランスサイト−シスによる脳実質内へ放出が促進される。また、上記切断により、第２のリガンドが事後的にキャリア外表面に露出されるので、露出した第２のリガンドを介して、キャリアが脳実質中の所望の組織又は細胞の表面に結合する。

【0073】

脳実質内で切断される結合としては、還元環境下で切断される結合が挙げられる。「還元環境下で切断される結合」とは、０．０２ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは３ｍＭ以上の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度と同程度の還元環境下で切断される結合を意味する。「還元環境下で切断される結合」に該当するか否かは、例えば、評価対象の結合を有する化合物を、０．０２ｍＭ以上（例えば、０．０２ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ）の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度と同程度の還元環境にある、ＤＴＴ溶液（１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中）に溶解し、５０分間、室温（２５℃）にてインキュベートし、評価対象の結合が切断されずに残存する未分解化合物の残存量を、ＤＴＴ非添加時と比較することにより、評価することができる。本評価系において、未分解化合物の残存量が、ＤＴＴ非添加時の例えば、３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下の場合、評価対象の結合を「還元環境下で切断される結合」とすることができる。脳血管内は例えばグルタチオン濃度約０．０１ｍＭ程度の非還元環境であるのに対し、脳実質内は例えばグルタチオン濃度約１〜３ｍＭ程度の還元環境であるところ、グルタチオン濃度約０．０１ｍＭ程度の非還元環境下では切断されず、グルタチオン濃度約１〜３ｍＭ程度の還元環境下で切断される結合を用いればよい。例としてはジスルフィド結合が挙げられるが、これに限定されない。本態様においては、トランスサイト−シスによりキャリアが脳実質内まで運搬された後、ＧＬＵＴ１リガンドが結合する第１の非荷電性セグメントが、脳実質内で切断されることにより、ＧＬＵＴ１リガンドがキャリア外表面から消失し、エンドソーム内表面上のＧＬＵＴ１から解放され、自由に動くことができるようになり、脳実質内へ放出が促進される。また、上記切断により、第２のリガンドが事後的にキャリア外表面に露出されるので、露出した第２のリガンドを介して、キャリアが脳実質中の所望の組織又は細胞の表面に結合する。

【0074】

なお、第２の態様の場合には、前記第１の非荷電性セグメントの鎖長と、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長との関係は任意であるが、前記結合の切断前にはＧＬＵＴ１リガンドをキャリア外表面に効率的に露出させる一方で、前記結合の切断後には第２のリガンドをキャリア外表面に効率的に露出させるためには、前記第１の非荷電性セグメントの鎖長を、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じとするか、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長よりも長くすることが好ましい。一態様において、本発明のキャリア中で、第２の分子が第１のブロックコポリマーに内包されるのに十分な程度に（例えば、本発明のキャリア中に含まれる第２の分子のうち、キャリア表面上に提示される第２の分子の割合が、例えば５０％未満（好ましくは４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満）となるように、第１の非荷電性セグメントの鎖長を第２の非荷電性セグメントの鎖長よりも長くする。第２の分子の大きさによって、それを内包するのに必要な第１の非荷電性セグメントの長さは変動するので、第１の非荷電性セグメントと第２の非荷電性セグメントの長さの差異を一概に数値で特定することは困難である。しかしながら、例えば、第２の分子が低分子（分子量１０００以下）であり、非荷電性セグメントが直鎖ＰＥＧの場合、第１の非荷電性セグメントは、第２の非荷電性セグメントよりも数平均分子量で５ＫＤａ以上、好ましくは１０ＫＤａ以上長ければ、第２の分子を第１のブロックコポリマー中に内包し得ると見積もられる。第１の非荷電性セグメントが直鎖ＰＥＧ以外の場合は、このＰＥＧの分子量差に相当する長さの差があればよい。

【0075】

以下、第１及び第２のブロックコポリマーの具体例及びその製造方法を説明する。
尚、複合体形成セグメントが荷電性セグメントである場合を例示的に示すが、これに限定されるものではなく、複合体形成セグメントが疎水性セグメントの場合も、荷電性セグメントの場合と同様に、第１及び第２のブロックコポリマーを製造し得る。

【0076】

まず、非修飾型且つ非切断型の第１のブロックコポリマー、及び、非修飾型の第２のブロックコポリマー（以下、非修飾型ブロックコポリマーと略称する場合がある。）について説明する。
非修飾型ブロックコポリマーは、荷電性セグメントがアニオン性セグメントである態様（以下、非修飾型アニオン性ブロックコポリマーと略称する場合がある。）と、荷電性セグメントがカチオン性セグメントである態様（以下、非修飾型カチオン性ブロックコポリマーと略称する場合がある。）とに分けられる。

【0077】

非修飾型アニオン性ブロックコポリマーの例としては、以下のブロックコポリマーが挙げられる。

【0078】

【化3】

【0079】

ここで、一般式(I)及び(II)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（以降「ＰＥＧセグメント」と表示する場合がある）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ」の部分と「ｙ」の部分とを合わせたセグメントがポリアニオン由来のアニオン性セグメント（以降「ポリアニオンセグメント」と表示する場合がある）である。

【0080】

一般式(I)及び(II)中、Ｒ^1a及びＲ^1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ_1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ_1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ_2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ_1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。

【0081】

一般式(I)及び(II)中、Ｌ¹及びＬ²は、連結基を表す。具体的には、Ｌ¹は−（ＣＨ₂）_b−ＮＨ−（ここで、ｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ²は−（ＣＨ₂）_c−ＣＯ−（ここで、ｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ^2c及びＲ^2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ^2a及びＲ^2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ^2c及びＲ^2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ^2a及びＲ^2b（Ｒ^2b及びＲ^2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ^2c及びＲ^2d（Ｒ^2d及びＲ^2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。

【0082】

一般式(I)及び(II)中、Ｒ³は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ³は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ⁴は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ⁴が−ＮＨ−Ｒ⁹（ここで、Ｒ⁹は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ_1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｎ及びｙは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。但し、ｙはｎより大きくないものとする。

【0083】

一般式(I)及び(II)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリアニオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、３，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは５，０００〜２０，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリアニオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜２０，０００である。

【0084】

一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ^1aＯ−又はＲ^1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ^1aＯ−又はＲ^1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をアニオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、アニオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。

【0085】

一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したアニオン性基を有する側鎖となるように置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。

【0086】

本発明において、一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、非荷電性セグメントであるポリエチレングリコール（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（以降「Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）とからなる下記式のアニオン性ブロックコポリマー（以降「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる（なお、以降の式では対カチオンの例としてＮａ⁺を示す場合があるが、対カチオンはこれに限定されるものではない）。

【0087】

【化4】

【0088】

上記式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表す整数である。
ｎはＰ（Ａｓｐ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）としては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）：２，０００、ポリアニオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は７５であるものが特に好ましい。

【0089】

一方、非修飾型カチオン性ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式(III)及び／又は(IV)で示されるものが好ましく挙げられる。

【0090】

【化5】

【0091】

ここで、一般式(III)及び(IV)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（ＰＥＧセグメント）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ−ｚ」の部分と「ｙ」の部分と「ｚ」の部分とを合わせたセグメントがポリカチオン由来のカチオン性セグメント（以下、ポリカチオンセグメント）である。

【0092】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ^1a及びＲ^1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ_1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ_1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ_2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ_1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：又はアルデヒド基）に転化できる。

【0093】

一般式(III)及び(IV)中、Ｌ¹及びＬ²は、連結基を表す。具体的には、Ｌ¹は−（ＣＨ₂）_b−ＮＨ−（ここで、ｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ²は−（ＣＨ₂）_c−ＣＯ−（ここで、ｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。

【0094】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ^2c及びＲ^2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ^2a及びＲ^2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ^2c及びＲ^2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ^2a及びＲ^2b（Ｒ^2b及びＲ^2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ^2c及びＲ^2d（Ｒ^2d及びＲ^2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。

【0095】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ³は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ³は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。

【0096】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ⁴は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ⁴が−ＮＨ−Ｒ⁹（ここで、Ｒ⁹は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ_1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。

【0097】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ^5a、Ｒ^5b、Ｒ^5c及びＲ^5dは、それぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。

【0098】

Ｒ^5aとＲ^5bとの総数及びＲ^5cとＲ^5dとの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ₂）₂）_e−ＮＨ₂（但しｅは０〜５の整数）である）であるものが、少なくとも２つ以上存在することが好ましく、上記総数の５０％以上存在することがより好ましく、上記総数の８５％以上存在することがさらに好ましい。
また、Ｒ^5a、Ｒ^5b、Ｒ^5c及びＲ^5dのすべて又は一部が、−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基（ここで、ａは２であり、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ₂）₂）_e−ＮＨ₂（但しｅは１）である）ことが好ましい。

【0099】

さらに、Ｒ⁴並びにＲ^5a、Ｒ^5b、Ｒ^5c及びＲ^5dの例示として上記した−ＮＨ−（ＣＨ₂）_a−Ｘ基において、Ｘが下記の各式で表される基から選ばれるものである場合が特に好ましい。

【0100】

【化6】

【0101】

ここで、上記の各式中、Ｘ²は、水素原子又はＣ_1-6アルキル基もしくはアミノＣ_1-6アルキル基を表し、Ｒ^7a、Ｒ^7b及びＲ^7cは、それぞれ独立して水素原子又はメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは、０〜１５の整数を表し、ｇは０〜１５の整数を表し、Ｒ^8a及びＲ^8bは、それぞれ独立して水素原子又は保護基を表す。ここで、当該保護基は、通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。

【0102】

一般式(III)及び(IV)中、Ｒ^6a及びＲ^6bは、それぞれ独立して水素原子、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ₂、又は保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。また、一般式(III)及び(IV)中、ｔは２〜６の整数であることが好ましく、より好ましくは３又は４である。

【0103】

一般式(III)及び(IV)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数である。ｎは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。ｙ及びｚは、０又は５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。但し、ｙとｚとの合計（ｙ＋ｚ）は、ｎより大きくないものとする。

【0104】

一般式(III)及び(IV)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリカチオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。

【0105】

一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリカチオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜３０，０００である。

【0106】

一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ^1aＯ−又はＲ^1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ^1aＯ−又はＲ^1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。

【0107】

一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等で置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。

【0108】

一方、切断型の第１のブロックコポリマーは、上記各手順にて非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを連結する際に、所望の切断可能な結合を介して連結すればよい。かかる連結の手段は、切断可能な結合の種類に応じて種々公知の手法を適宜選択すればよい。例えば、切断可能な結合としてジスルフィド結合を導入する場合は、Ｈ_２Ｎ−Ｒ^１０ａ-Ｓ−Ｓ−Ｒ^１０ｂ−ＮＨ_２（ここで、Ｒ^１０ａ及びＲ^１０ｂは、同一又は異なって、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１、２、３又は４の、直鎖又は分岐鎖アルキレン基を表す）（例、Ｈ_２Ｎ−Ｃ_２Ｈ_５-Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_５−ＮＨ_２）等のジスルフィド結合を含む二官能性試薬を用いて、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを連結すればよい。尚、下のスキームにて、非荷電性セグメントとしてポリエチレングリコールを、荷電性セグメントとしてポリ（Ａｓｐ−ＡＰ）を用いた例を示すが、これら以外の非荷電性セグメント及び荷電性セグメントにも適用可能であることは、当業者は容易に理解できる。例えば、末端にアミノ基を導入した非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ−ＮＨ_２）を無水コハク酸と反応し、末端アミノ基を−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯＯＨに置換することにより、末端にカルボキシル基が導入された非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）を得る。

【0109】

【化7】

【0110】

次に、末端にカルボキシル基を有する非荷電性ポリマー（例、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）をシスタミン２塩酸塩及び塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と反応させることにより、末端にアミノ基を有し、分子内に非荷電性セグメント及びジスルフィド結合を有する重合開始剤（例、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２）を得ることが出来る。

【0111】

【化8】

【0112】

次に、得られた重合開始剤のアミノ酸末端に、所望の荷電性ポリマー（例、ポリアニオン、ポリカチオン）を構成するモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をアニオン性基又はカチオン性基を含むように置換又は変換する。例えば、ポリアスパラギン酸又はその誘導体を連結する場合、得られた上記で得られた重合開始剤（例、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２）にＮＣＡ−ＢＬＡを加えることにより、重合反応が生じ、前記非荷電性セグメントとポリ（β−ベンジル−L−アスパラギン酸エステル）（即ち、ＰＢＬＡ）とが、ジスルフィド結合を介して連結されたブロックコポリマー（例、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡ）を得ることが出来る。更に、このブロックコポリマーを１，５−ジアミノペンタンと反応させることにより、アスパラギン酸の側鎖に、カチオン性基であるアミノペンタン（ＡＰ）を導入し、前記非荷電性セグメントとポリ（Ａｓｐ−ＡＰ）とがジスルフィド結合を介して連結されたブロックコポリマー（例、ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））を得ることができる。

【0113】

【化9】

【0114】

このような反応シリーズの結果、一般式(I)、(II)、(III)及び(IV)中、Ｌ¹及びＬ²が、ジスルフィド結合を有するリンカー（例、−ＨＮ−Ｒ^１０ａ-Ｓ−Ｓ−Ｒ^１０ｂ−ＮＨ−（例、−ＨＮ−Ｃ_２Ｈ_５-Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_５−ＮＨ−））に置換されたブロックコポリマーを得ることができる。

【0115】

また、切断可能な結合としてｐＨ６．５以下で切断される結合を導入する場合は、例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 6;112(40):12486-91に記載された方法に準じて、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを連結すればよい。その結果、一般式(I)、(II)、(III)及び(IV)中、Ｌ¹及びＬ²が、

【0116】

【化10】

【0117】

で表される、リンカーであるブロックコポリマーを得ることができる。

【0118】

第１のブロックコポリマーのＧＬＵＴ１リガンドによる修飾は、当業者に周知の手法により行うことができる。かかる手法の一例として、グルコースにより修飾された高分子（特に、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロックコポリマーまたはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロックコポリマー）の調製方法の例を以下に説明する。Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロックコポリマーまたはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロックコポリマーは、例えば、グルコースの６位以外の炭素上の水酸基を保護した上で、グルコースにブロックコポリマーを重合させて得ることができる（国際公開第２０１５／０７５９４２号）。

【0119】

スキーム１Ａは、ｎ_１が４４であり、ｍ_１が８０である、式(I)の化合物の合成スキームを例示する。
スキーム１Ａ

【0120】

【化11】

【0121】

スキーム１Ａでは、ＥＯは、エチレンオキサイドを示し；Ｋ−Ｎａｐｈは、カリウムナフタレンを示し；ＴＥＡは、トリエチルアミンを示し；ＭｓＣｌは、メタンスルホニルクロリドを示し；ＮＨ_３ａｑ．は、アンモニア水を示し；ＮＣＡ−ＢＬＡは、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を示す。

【0122】

以下、スキーム１Ａを簡単に説明する。グルコースの保護基の導入は、例えば、１，２−Ｏ−イソプロピリデン５，６−Ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＢＩＧ」という）により達成される。例えば、ＰＩＣミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅを作製する場合には、ＢＩＧにエチレンオキサイドを重合させて、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨを合成する。ＢＩＧは、例えば、１，２−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（以下、「ＭＩＧ」という）の３位と５位の炭素の置換基であるＯＨ基をベンジル基で保護することにより得られる。具体的には、ＢＩＧは、ＭＩＧとベンズアルデヒドを反応させ、酢酸エチルで抽出することにより得られる。次に、ＰＥＧの分子量を一定に揃える観点では、重合反応前に、反応容器内でＢＩＧ−ＯＨをベンゼンで凍結乾燥させ、その後、減圧乾燥（例えば、７０℃で一晩の減圧乾燥）させて、ＢＩＧ−ＯＨを容器壁面に付着させることが好ましい。また、重合度は添加するエチレンオキサイドの量により適宜調節することができる。重合後、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨのＯＨ基をアミノ化してＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ_２を得て、さらに、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ_２のＮＨ_２基に対してポリカチオン若しくはポリアニオンまたは保護されたその前駆体（例えば、ポリアスパラギン酸の保護された単量体であるβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）または、ポリグルタミン酸の保護された単量体である、γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＧ−ＮＣＡ））を重合させて、ＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）またはＢＩＧ−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）を得ることができる。重合度は、ポリカチオン若しくはポリアニオンまたは保護されたその前駆体の量により適宜調節することができる。最後にグルコースおよびアニオンまたはカチオンの保護基を脱保護して、グルコース−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）またはグルコース−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）を得ることができる。グルコースを結合したコポリマーは、ＰＩＣミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅの調製に用いることができる。具体的には、水溶液中で電荷を中和する比率でポリカチオンブロックを有するポリマーとポリアニオンブロックを有するポリマーとを混合すると、ＰＩＣミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅが自発的に形成される。このようにすることで、ポリイオンコンプレックスが生体適合性部分により覆われ、その生体適合性部分はグルコースにより修飾を受けたＰＩＣミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅを得ることができる。

【0123】

同様に、Ｇｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（３）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）は、上記においてＢＩＧの代わりに、例えば、１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノース（ＤＩＧ）を出発物質として用いて合成することができ、その他の部分は、上記と全く同一である（スキーム１Ｂ参照）。また、同様に、Ｇｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）およびＧｌｃ（２）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）も当業者であれば適宜合成することができる。

【0124】

スキーム１Ｂでは、ｎ_１が４４であり、ｍ_１が８０である、式(X)の化合物の合成スキームを例示する。スキーム１Ｂは、出発物質としてＢＩＧの代わりにＤＩＧを用いる以外は、スキーム１Ａと同一である。
スキーム１Ｂ

【0125】

【化12】

【0126】

スキーム１Ｂでは、ＥＯは、エチレンオキサイドを示し；Ｋ−Ｎａｐｈは、カリウムナフタレンを示し；ＴＥＡは、トリエチルアミンを示し；ＭｓＣｌは、メタンスルホニルクロリドを示し；ＮＨ_３ａｑ．は、アンモニア水を示し；ＮＣＡ−ＢＬＡは、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を示す。

【0127】

また、第２のブロックコポリマーの第２の分子による修飾も、第２の分子の種類に応じて、当業者に周知の手法を種々選択して行うことができる。第２の分子と第２のブロックコポリマーとの結合は、直接または間接的に、すなわち架橋剤由来の基（リンカー）を介さずにまたは介して、化学的に行うことができる。

【0128】

第２の分子と第２のブロックコポリマーとを直接的に結合する様式としては、−ＣＯＯ−〔例えば、第２の分子中のカルボキシル基と第２の非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ）中の水酸基とをエステル結合して得られる〕、−Ｏ−（例えば、第２の分子中の水酸基と第２の非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ）中の水酸基とをエーテル結合して得られる）、−ＣＯＮＨ−（例えば、第２の分子中のカルボキシル基と第２の非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ）に導入したアミノ基とをアミド結合して得られる）、−ＣＨ＝Ｎ−（例えば、第２の分子中のアルデヒド基と、第２の非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ）に導入したアミノ基とをシッフ結合して得られる）、−ＣＨ_２ＮＨ−（シッフ結合をさらに還元して得られる）、−ＮＨ−等が挙げられる。

【0129】

第２の分子と第２のブロックコポリマーとの化学的結合においては、直接結合できない場合には、公知の縮合剤、第２の分子や第２のブロックコポリマー（好ましくは、第２の非荷電性セグメント（例、ＰＥＧ））中の官能基を活性化させる活性化剤、二価性架橋剤等を用いることもできる。縮合剤および活性化剤として、カルボジイミド類〔例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等〕、スクシンイミド類〔例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳＳ）、ジベンジルシクロオクチン−Ｎ−スクシンイミドエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル）等〕、アジ化ナトリウム等が例示される。二価性架橋剤としては、同反応性の架橋剤、異反応性の架橋剤が挙げられる。同反応性のものとして、例えば、ジメチルアジピンイミデート、ジスクシンイミジルスベレート等が例示され、異反応性のものとして、例えば、スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノエート等が例示される。

【0130】

例として、第２の分子としてアスパラギン酸リガンドを導入する場合、例えばカルボキシル基をエチル基で保護したアスパラギン酸と末端アルキニル基とを有する下記構造等のアスパラギン酸導入試薬等を用い、当該試薬の末端アルキニル基を、非荷電性セグメント側の末端にＮ_３基を有する第２のブロックコポリマーの末端Ｎ_３基と反応させることにより、非荷電性セグメント側末端にカルボン基保護アスパラギン酸リガンドを導入し、次いでカルボキシル基を脱保護することにより、所望のアスパラギン酸リガンドを導入することができる。

【0131】

【化13】

【0132】

他の例として、カルボキシル基をアルキル基（例、エチル基）で保護したアスパラギン酸のアミノ基に、ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルを用いて、ＤＢＣＯを導入する。このＤＢＣＯと、非荷電性セグメント側の末端にＮ_３基を有する第２のブロックコポリマーの末端Ｎ_３基とをクリック反応させることにより、非荷電性セグメント側末端にカルボン基保護アスパラギン酸リガンドを導入する。次いでカルボキシル基を脱保護することにより、所望のアスパラギン酸リガンドを導入することができる。

【0133】

以上の手順により調製された、全部又は一部がＧＬＵＴ１リガンドで修飾された第１のブロックコポリマーと、全部又は一部が第２の分子で修飾された第２のブロックコポリマーとを混合することにより、本発明のキャリアが調製される。

【0134】

本発明のキャリアの態様としては、薬剤送達用のミセル、リポソームおよびＰＩＣｓｏｍｅなどの小胞、並びにデンドリマー、ナノスフェアおよびハイドロゲルが挙げられる。本発明において、薬剤送達用のキャリアを用いる利点は、例えば、キャリア内部に薬剤を内包させ、標的部位での薬剤濃度を高めること、または、標的部位以外での薬剤による副作用を低減することである。本発明で用いられるキャリアは、特に限定されないが、例えば、その平均粒子径（直径）が４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下または８０ｎｍ以下であり、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上または４０ｎｍ以上である。本発明で用いられるキャリアは、例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または、例えば３０ｎｍ〜１００ｎｍの平均粒子径を有する。

【0135】

本発明において、キャリアの平均粒子径は、市販の動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。

【0136】

本発明で用いられるミセルとしては、薬剤送達用のミセルが挙げられる。薬剤送達用のミセルとしては、ブロックコポリマーにより形成されるミセルが知られている。ミセルを形成するブロックコポリマーは、特に限定されないが、ポリイオンコンプレックス型ミセル（ＰＩＣミセル）の場合、荷電性ポリマーブロック（例えば、ポリアニオンブロックまたはポリカチオンブロック）と非荷電性（生体適合性）ブロック（例えば、ポリエチレングリコールブロック）とのコポリマーまたは薬学的に許容可能なその塩とすることができる。また、ブロックコポリマーとしては、生分解性であるブロックコポリマーを用いることが好ましく、そのようなコポリマーとしては様々なコポリマーが知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロックコポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸、およびポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロックコポリマーなどを用いることができる。ＰＩＣミセルとして、ポリアニオンとポリカチオンとの静電的相互作用により形成されるポリイオンコンプレックス層を有するミセルが知られている。疎水性部分同士をミセル内部で安定化させる観点で、それぞれの荷電性ブロックには、外殻を形成するＰＥＧとは別の末端にコレステリル基などの疎水性部分を連結させてもよい（例えば、実施例のｓｉＲＮＡミセルを参照）。蛍光色素でのブロックコポリマーへのラベルは、ブロックコポリマーのポリエチレングリコール側と反対の末端を蛍光色素で修飾することにより行なうことができる。

【0137】

本発明で用いられるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームとしては、薬剤送達用のＰＩＣｓｏｍｅが挙げられる。薬剤送達用のＰＩＣｓｏｍｅとしては、ブロックコポリマーにより形成されるＰＩＣｓｏｍｅが知られている。ＰＩＣｓｏｍｅを形成するブロックコポリマーとしては、非荷電性ブロック（例、ＰＥＧブロック）とポリカチオンブロックとのブロックコポリマーおよびホモポリアニオンの組み合わせ、または、非荷電性ブロック（例、ＰＥＧブロック）とポリアニオンブロックとのブロックコポリマーおよびホモポリカチオンとの組み合わせ等が挙げられる。本発明では、第１及び第２のブロックコポリマーの各非荷電性セグメント及び荷電性セグメントとして、それぞれ上述のようなＰＥＧブロック等とポリカチオンブロック又はポリアニオンブロックとを用いることにより、ＰＩＣｓｏｍｅを形成することができる（なお、切断型の第１のブロックコポリマーの場合は、非荷電性ブロック（例、ＰＥＧブロック）と荷電性ブロック（ポリカチオンブロック又はポリアニオンブロック）との間に、切断可能な結合が介在することになる。）。なお、ブロックコポリマーとしては、生分解性であるブロックコポリマーを用いることが好ましく、そのようなコポリマーとしては様々なコポリマーが知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロックコポリマーとしては、例えば、ポリ（アスパラギン酸−テトラエチレンペンタアミン（Ａｓｐ−ＴＥＰ））ブロックコポリマー、および、ポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロックコポリマーを用いることができる。ＰＩＣｓｏｍｅでは、第１のブロックコポリマーの第１の非荷電性セグメント側の末端及び第２のブロックコポリマーの第２の非荷電性セグメント側の末端に、それぞれＧＬＵＴ１リガンド及び第２の分子を連結させ、第１の非荷電性セグメント及び第２の非荷電性セグメントの鎖長を調整することで、ＧＬＵＴ１リガンド及び第２の分子をＰＩＣｓｏｍｅの外表面に露出させることが可能となる。

【0138】

本発明で用いられるリポソームとしては、特に限定されないが、リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）により形成されるリポソームが挙げられる。リポソームは、古くから様々なものが知られ、当業者であれば適宜調製することが可能である。当業者であれば、リポソームに薬剤を適宜内包させることができる。

【0139】

小胞は、上記重合体を用いて周知の方法により形成させることができる。一般的に小胞は、上記の第１及び第２のブロックコポリマーを一定濃度以上の濃度で溶解させた溶液を攪拌して得ることができる。また、ポリイオンコンプレックスに基づいて形成される小胞（ＰＩＣミセル、ＰＩＣｓｏｍｅ等）の場合は、ポリカチオン部分を有する高分子とポリアニオン部分を有する高分子とを同割合で混合して得ることができる。
例えば、第２の荷電性セグメントが、第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有する場合（即ち、どちらか一方がカチオン性セグメントであり、他方が、アニオン性セグメントの場合）、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーとを、電荷が中和するように混合することにより、両ブロックコポリマーのカチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの間でポリイオンコンプレックスが形成され、ポリイオンコンプレックスに基づいて形成される小胞（ＰＩＣミセル、ＰＩＣｓｏｍｅ等）を得ることができる。第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーに加えて、カチオン性ポリマー（例、ホモポリカチオン）及び／又はアニオン性ポリマー（例、ホモポリアニオン）を添加し、第１の荷電性セグメント、第２の荷電性セグメント、並びにカチオン性ポリマー（例、ホモポリカチオン）及び／又はアニオン性ポリマー（例、ホモポリアニオン）の全体として、電荷が中和されるように混合することによっても、ポリイオンコンプレックスを形成し、ポリイオンコンプレックスに基づいて形成される小胞（ＰＩＣミセル、ＰＩＣｓｏｍｅ等）を得ることができる。第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとが、同一の荷電を有する場合（即ち、何れもがカチオン性セグメント、又はアニオン性セグメントの場合）、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーに加えて、第１及び第２の荷電性セグメントと反対の電荷を有するカチオン性ポリマー（例、ホモポリカチオン）又はアニオン性ポリマー（例、ホモポリアニオン）を添加し、第１の荷電性セグメント、第２の荷電性セグメント、並びにカチオン性ポリマー（例、ホモポリカチオン）又はアニオン性ポリマー（例、ホモポリアニオン）の全体として、電荷が中和されるように混合することによって、ポリイオンコンプレックスを形成し、ポリイオンコンプレックスに基づいて形成される小胞（ＰＩＣミセル、ＰＩＣｓｏｍｅ等）を得ることができる。一態様において、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーに加えて添加されるカチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマーは、上述の非修飾型ブロックコポリマーである。この追加的な非修飾型ブロックコポリマーにおける非荷電性セグメントの長さは、第１及び第２の非荷電性セグメントのうち、短い方の非荷電性セグメントの長さと実質的に同じか、これよりも短い方が好ましい。小胞に薬剤を内包させる方法は当業者に周知であり、本発明でも周知の方法を用いることができる。例えば、ＰＩＣミセルに薬剤を内包させるには、ミセル形成後、薬剤をミセル溶液に添加すればよい。薬剤は、その荷電により自発的にＰＩＣミセルに内包される。また、例えば、ＰＩＣｓｏｍｅの場合は、ＰＩＣｓｏｍｅを形成する高分子と薬剤との混合液を調製し、攪拌混合すれば、薬剤はＰＩＣｓｏｍｅに内包される。リポソームも、リポソームを形成する高分子と薬剤との混合液を調製し、攪拌混合すれば、薬剤はリポソームに内包される。ポリイオンコンプレックス中に含まれるアニオン性ブロックとカチオン性ブロックとを架橋することもできる。この目的に用いられる架橋剤としては、特に限定されないが例えば、アミノ基とカルボキシ基とを縮合させることができる１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が好ましく用いられ得る。

【0140】

なお、小胞を形成するブロックコポリマーのうち、非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーにおけるＧＬＵＴ１リガンド結合ポリマーの割合が１０モル％以上４０モル％未満であるときには、とりわけ組成物の脳実質への送達効率が高い。上記の非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーにおけるＧＬＵＴ１リガンド結合ポリマーの割合は、１０モル％以上４０モル％未満、好ましくは２０〜３０モル％、より好ましくは２２〜２８モル％、さらに好ましくは２４〜２６モル％（例えば、約２５モル％）とすることができる。また、上記の非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーにおけるＧＬＵＴ１リガンド結合ポリマーの割合が４０％以上のときには、とりわけ組成物の脳血管内皮細胞への送達効率が高い。特に、上記の非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーにおけるＧＬＵＴ１リガンド結合ポリマーの割合は、４０〜１００モル％、例えば４０〜８０モル％、例えば４０〜６０モル％とすることができる。

【0141】

なお、上述の非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーとは、以下の様に定義される。即ち、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、第２の非荷電性セグメントの鎖長より長い場合には、通常は第１の非荷電性セグメントに第２の非荷電性セグメントが内包されるため、第１のブロックコポリマーが、非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーに該当する。一方、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同一である場合には、第１及び第２のブロックコポリマーの双方が、非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーに該当する。但し、第２の非荷電性セグメントの鎖長が、第１の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じ又は第１の非荷電性セグメントの鎖長よりも長い場合でも、第１のブロックコポリマーが剛直であり、第２のブロックコポリマーが柔軟である場合には、第１のブロックコポリマーが第２のブロックポリマーを内包する構造を取る場合がある。かかる場合には、第１のブロックコポリマーが、非荷電性セグメントがキャリア外側に露出するブロックコポリマーに該当する。

【0142】

一態様において、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長より長く、且つ前記第１のブロックコポリマーの１０モル％以上４０モル％未満（好ましくは２０〜３０モル％、より好ましくは２２〜２８モル％、さらに好ましくは２４〜２６モル％（例えば、約２５％））がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている。本態様において、第１のブロックコポリマーは、非切断型であり得る。上述のように、キャリアを修飾するグルコース分子が多いと、キャリアが血管内皮細胞から脳実質に移行する際に、キャリアと血管内皮細胞との解離の効率が低下し、脳実質に到達するキャリアの割合が低下する可能性がある。そこで、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー全体の１０モル％以上４０モル％未満程度に設定することにより、キャリアと血管内皮細胞との解離の効率の低下を回避し、脳実質内へのキャリアの移行の効率を高め得る。

【0143】

一態様において、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであり、且つＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合が、第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の１０モル％以上４０モル％未満（好ましくは２０〜３０モル％、より好ましくは２２〜２８モル％、さらに好ましくは２４〜２６モル％（例えば、約２５モル％））である。本態様において、第１のブロックコポリマーは、非切断型であり得る。ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー及び前記第２のブロックコポリマーの合計の１０モル％以上４０モル％未満程度に設定することにより、キャリアと血管内皮細胞との解離の効率の低下を回避し、脳実質内へのキャリアの移行の効率を高め得る。

【0144】

一態様において、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、第２の非荷電性セグメントの鎖長より長く、且つ第１のブロックコポリマーの４０〜１００モル％（好ましくは、６０〜１００モル％、より好ましくは８０〜１００モル％、さらに好ましくは９０〜１００モル％）がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている。本態様において、第１のブロックコポリマーは、切断型であり得る。切断型の第１のブロックポリマーを使用することにより、脳血管内皮細胞中のエンドソーム内、または、脳実質内への移行後に、キャリアから、ＧＬＵＴ１リガンドを含む部位が切断されるため、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー全体の４０〜１００モル％まで上昇させても、キャリアが血管内皮細胞から効率的に解離され、脳実質内へ移行し得る。また、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー全体の４０〜１００モル％まで上昇させることにより、血液から脳血管内皮細胞への移行効率を高め得る。

【0145】

一態様において、第１の非荷電性セグメントの鎖長が、前記第２の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じであり、且つＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合が、第１のブロックコポリマー及び第２のブロックコポリマーの合計の４０〜９９モル％（好ましくは、６０〜９９モル％、より好ましくは８０〜９９モル％、さらに好ましくは９０〜９９モル％）である。本態様において、第１のブロックコポリマーは、切断型であり得る。切断型の第１のブロックポリマーを使用することにより、脳血管内皮細胞中のエンドソーム内、または、脳実質内への移行後に、キャリアから、ＧＬＵＴ１リガンドを含む部位が切断されるため、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー及び第２のブロックコポリマーの合計の４０〜９９モル％まで上昇させても、キャリアが血管内皮細胞から効率的に解離され、脳実質内へ移行し得る。また、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている第１のブロックコポリマーの割合を、第１のブロックコポリマー及び第２のブロックコポリマーの合計の４０〜９９モル％まで上昇させることにより、血液から脳血管内皮細胞への移行効率を高め得る。

【0146】

なお、調製されたキャリアにおいて、第１の非荷電性セグメントの配向、及び第２の非荷電性セグメントの配向は、キャリア外側に向かった配向であることが好ましく、第１の非荷電性セグメントの配向と、第２の非荷電性セグメントの配向とは、同じであることが好ましい。但し、上述のように第２の非荷電性セグメントの鎖長が、第１の非荷電性セグメントの鎖長と実質的に同じ又は第１の非荷電性セグメントの鎖長よりも長い場合であって、第１のブロックコポリマーが剛直であり、第２のブロックコポリマーが柔軟である場合には、第１の非荷電性セグメントがキャリア外側に向かって配向するのに対し、第２の非荷電性セグメントがキャリア内側で折れ曲がって存在することにより、第１のブロックコポリマーが第２のブロックポリマーを内包する構造を取ることが好ましい。よってこの場合は、第１の非荷電性セグメントの配向と、第２の非荷電性セグメントの配向とは、異なることが好ましい。

【0147】

第１のブロックコポリマーが第２のブロックポリマーを内包する構造を取ることによって、血中において第２のリガンドを保護するとともに、第２のリガンドによる血中滞留性の低下やＢＢＢ突破効率の低下を防ぐことが期待できる。

【0148】

一態様において、本発明のキャリアは、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーを含有し、
前記第１のブロックコポリマーは、第１の分子で修飾された、第１のポリエチレングリコールと第１の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、前記第１のポリエチレングリコールと前記第１の荷電性セグメントとの間にジスルフィド結合を有し、
前記第２のブロックコポリマーは、第２の分子で修飾された、第２のポリエチレングリコールと第２の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、
前記第１の分子と前記第２の分子は異なる。

【0149】

本態様において、好ましくは、前記第１の分子は、グルコースである。

【0150】

本態様において、好ましくは、第２の分子は、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、及び抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種である。第２の分子は、脳組織内（好ましくは脳実質内）の標的細胞表面の標的分子に結合し得る。

【0151】

本態様において、好ましくは、前記第１のポリエチレングリコールの鎖長は、前記第２のポリエチレングリコールの鎖長より長い。

【0152】

本態様において、好ましくは、前記第１のブロックコポリマーは、前記第２のブロックコポリマーを内包している。

【0153】

本態様において、好ましくは、前記第１のポリエチレングリコールと前記第２のポリエチレングリコールの配向が同じである。

【0154】

本態様において、好ましくは、前記第２の荷電性セグメントは、前記第１の荷電性セグメントの電荷と反対の電荷を有する。

【0155】

本態様において、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち、少なくとも一方、好ましくは両方が、ポリアミノ酸である。

【0156】

一態様において、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち、少なくとも一方が、ポリアスパラギン酸である。

【0157】

一態様において、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち、少なくとも一方が、ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）である。

【0158】

一態様において、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうち、一方が、ポリアスパラギン酸であり、他方がポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）である。

【0159】

新たな局面において、本発明は、第１のブロックコポリマーと第２のブロックコポリマーとを含有するキャリアであって、
第１のブロックコポリマーは、第１の非荷電性セグメントと第１の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、第１のブロックコポリマーの少なくとも一部は、第１の分子で修飾されてなり、
第２のブロックコポリマーは、第２の非荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとのブロックコポリマーであり、
第１の分子はＧＬＵＴ１リガンドであり、
第１のブロックコポリマーは、前記第１の非荷電性セグメントと前記第１の荷電性セグメントとの間に、ｐＨ６．５以下で切断される結合を有し、
第２のブロックコポリマーは、前記第２の非荷電性セグメントと前記第２の荷電性セグメントとの間に、ｐＨ６．５以下で切断される結合を有し、且つ
第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうちの一方又は両方が、ポリ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）又はポリ（Ｇｌｕ−ＤＥＴ）である
キャリアをも提供する。各用語の定義は、第２のブロックコポリマーの少なくとも一部が第２の分子で修飾されていることを要せず、第２の非荷電性セグメントと前記第２の荷電性セグメントとの間に、ｐＨ６．５以下で切断される結合を有することを除き、上述の本発明のキャリアにおけるものと同一である。本態様のキャリアは、ＧＬＵＴ１リガンドの効果により、脳血管内皮細胞のエンドソームに選択的に取り込まれたあと、エンドソーム内酸性環境下で、第１の非荷電性セグメントと第１の荷電性セグメントとの間、及び第２の非荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとの間に存在するｐＨ６．５以下で切断される結合が切断されることにより、ＧＬＵＴ１から解離し、キャリア表面に荷電性セグメントが露出する。ポリ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）（又はポリ（Ｇｌｕ−ＤＥＴ））は、エンドソーム内酸性環境下では膜傷害性を有するので、脳血管内皮細胞内でのエンドソーム脱出が促進される。従って、本態様のキャリアは、薬剤を脳血管内皮細胞へ選択的に送達するためのキャリアとして有用である。

【0160】

３．組成物
本発明は、上記のキャリアと、前記キャリアに内包された薬剤とを含有する、組成物をも提供する。前記組成物は、前記薬物を脳内に送達するための組成物であることが好ましく、中でも、前記薬物に血液脳関門、血液神経関門、血液網膜関門、または血液髄液関門を通過させ、及び／又は、脳内の所望の部位に選択的に前記薬物を送達するための組成物であることが好ましい。脳内の所望の組織又は細胞の具体例としては、制限されるものではないが、例としては、脳実質内の部位として例えば海馬や小脳、脳実質内の細胞として例えばニューロン、アストロサイト、ミクログリアや、血管内皮細胞等が挙げられる。そして、例えばニューロンの中でも更に種類選択的な移行を所望することも可能である。かかる脳内の所望の部位に選択的に前記薬物を送達するための組成物は、当該脳内の所望の組織又は細胞に選択的に移行されるキャリアを用いて構成することができる。かかるキャリアの詳細については、上に説明したとおりである。本発明の組成物の調製方法は特に限定されないが、例えば、本発明のキャリアと薬剤とを混合し、キャリアに薬剤を後担持させる手法や、本発明のキャリアを構成する、全部又は一部がＧＬＵＴ１リガンドで修飾された第１のブロックコポリマー、及び、全部又は一部が第２の分子で修飾された第２のブロックコポリマーを、薬剤と混合することにより、本発明のキャリアを形成させると同時に、キャリア内に薬剤を担持させる手法等を用いることができる。

【0161】

本発明で用いられる薬剤としては、特に限定されないが、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。本発明では、薬剤を選択性高く脳に送達し、脳内の所望の部位（例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞）に選択性高く送達することができる。従って、薬剤としては、特に限定されないが、例えば、脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸、脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。例えば、薬剤として脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸を用いた本発明の組成物は、医薬組成物として提供され得る。薬剤として脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いた本発明の組成物は、診断薬として提供され得る。

【0162】

本発明によれば、薬剤として脳疾患治療薬または予防薬を用いることができる。この場合、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ脳疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ末梢神経疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、末梢神経疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ網膜疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、網膜疾患の治療または予防方法が提供される。一態様において、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含む。一態様において、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。

【0163】

従って、本発明によれば、脳疾患治療薬または予防薬を含んでなる、脳疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の脳への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は脳疾患の治療または治療に有用であることが明らかである。本発明によればまた、末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、末梢神経疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の末梢神経への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は末梢神経疾患の治療または予防に有用であることが明らかである。本発明によればさらに、網膜疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、網膜疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の網膜への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は網膜疾患の治療または予防に有用であることが明らかである。本発明によれば、上記治療薬または予防薬は、キャリアに内包された形態で組成物に含まれ得る。

【0164】

脳疾患としては、脳疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる脳疾患、例えば、不安、うつ病、睡眠障害、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などが挙げられる。従って、本発明では、これらの脳疾患を治療するために、抗不安剤、抗うつ剤、睡眠導入剤、アルツハイマー治療薬、パーキンソン病治療薬および多発性硬化症治療薬などの脳疾患治療薬または予防薬が用いられ得る。アルツハイマー病治療薬としては、例えば、Ａβ抗体がよく知られ、パーキンソン病治療薬としては、例えば、ドーパミン受容体アゴニストおよびＬ−ドーパがよく知られ、多発性硬化症治療薬としては、例えば、副腎ステロイド薬、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、および免疫抑制剤がよく知られ、これらの治療薬が本発明で用いられ得る。末梢神経疾患としては、末梢神経疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる末梢神経疾患、例えば、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーが挙げられる。網膜疾患としては、網膜疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる網膜疾患、例えば、網膜色素変性症、脳回状網脈膜萎縮、コロイデレミア、クリスタリン網膜症、先天黒内障、先天性停在性夜盲、小口病、白点状眼底、白点状網膜症、色素性傍静脈網脈絡膜萎縮、スターガルト病、卵黄状黄斑ジストロフィー、若年網膜分離症、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、家族性滲出性硝子体網膜症および網膜色素線条が挙げられる。

【0165】

複合体形成セグメントとして、荷電性セグメントを使用する場合、本発明のキャリアは、親水性の薬剤の送達に有利である。例えば、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントのうちの少なくとも一方、好ましくは両方が、ポリカチオンである場合、核酸や負の電荷を有するタンパク質やペプチドやその他の親水性の薬剤の送達に有利である。一方、複合体形成セグメントとして、疎水性セグメントを使用する場合、本発明のキャリアは、疎水性の薬剤の送達に有利である。

【0166】

本発明者らの従前の知見によれば、ＧＬＵＴ１リガンドでその外表面を修飾したキャリアは、対象に投与するだけでも脳への蓄積を示す。従って、本発明のキャリア及びこれに薬剤を内包させた組成物を用いた投与計画では、絶食等による低血糖を誘発させなくてよく、および／または、血糖値の上昇を誘発させなくてもよい。また、本発明者らの従前の知見によれば、ＧＬＵＴ１リガンドが表面に露出するようＧＬＵＴ１リガンドでその外表面を修飾したキャリア、具体的にはミセルまたはポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム（ＰＩＣｓｏｍｅ）などの小胞をある投与計画に従って投与すると、顕著にこれらのキャリアが血液脳関門を超えて脳内（脳実質部）に送達される。従って、一態様において、本発明のキャリア及びこれに薬剤を内包させた組成物を用いた投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含む。一態様において、本発明のキャリア及びこれに薬剤を内包させた組成物を用いた投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与すること、および該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。一態様において、本発明のキャリア及びこれに薬剤を内包させた組成物を用いた投与計画では、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に該対象に投与され得る。投与計画は、該対象への組成物の投与と該対象における血糖値の上昇の誘発との間にインターバルを有してもよいし、有さなくてもよい。該組成物が該対象における血糖値の上昇の誘発と同時に投与される場合には、該組成物は、血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤と混合した形態で該対象に投与してもよいし、該対象における血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤とは別の形態で投与してもよい。また、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、連続してまたは逐次的に該対象に投与される場合には、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与してもよいし、後に投与してもよいが、好ましくは、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与することができる。該対象への該組成物の投与よりも先に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象において血糖値の上昇を誘発させてから、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象に該組成物を投与することが好ましい。また、該対象への該組成物の投与よりも後に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象に該組成物を投与してから、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象において血糖値の上昇を誘発させることが好ましい。上記の投与計画のサイクルは、２回以上行なってもよい。グルコース投与とサンプル投与の前後関係は、血液脳関門を通過させるタイミングにより決定することができる。

【0167】

大脳皮質は６層で構成され、表層から、分子層（第１層）、外顆粒層（第２層）、外錐体細胞層（第３層）、内顆粒層（第４層）、内錐体細胞層（第５層）および多形細胞層（第６層）が存在するが、本発明によれば、これらのいずれの層においても脳実質にキャリアを送達することができる。これらの層の中では特に、外錐体細胞層（第３層）および内顆粒層（第４層）において、本発明によるキャリアの送達が顕著に有効である。

【0168】

本発明では、ミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅのような巨大なキャリア（直径約３０ｎｍ〜１００ｎｍ）が、効率良く血液脳関門を効果的に通過し、脳内の所望の部位（例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞）に選択性高く送達できる。

【0169】

本発明のキャリア又は組成物は、対象にそのまま投与することもできるが、以下に説明する特定の投与計画に基づき投与することもできる。かかる投与計画では、一態様において、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与する。本発明による投与計画では、一態様において、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させる。ここで、本発明による投与計画では、該対象への該組成物の投与は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に行なわれ得る。低血糖状態の誘発は、ＧＬＵＴ１を血管内皮細胞（例えば、脳血管内皮細胞）の内表面に発現させるために有用であると考えられる。但し、本発明によれば、本発明のキャリア又は組成物は、投与対象における血糖値の上昇がこれらの脳への送達に極めて効果的である。なお、本発明者らの以前の検討によれば、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象における本発明のキャリア又は組成物の血中濃度が一定値以上であるときに、血糖値を上昇させることにより、本発明のキャリア又は組成物が極めて効果的に脳内に送達できるのである。また、対象において血糖値の上昇を誘発させた後もしばらくの間は本発明のキャリア又は組成物は該対象の脳内へ送達され得る。

【0170】

本発明のキャリア又は組成物の血中濃度を一定値以上に保つ観点では、本発明のキャリア又は組成物を対象に輸液投与することが好ましい。このようにすることで、血中滞留時間の短いキャリア又は組成物であっても、一定の血中濃度を確保し易い。例えば、血中滞留時間の短いｓｉＲＮＡを内包するｓｉＲＮＡミセルは、輸液により対象に投与すると効果を上げやすい。輸液投与は、好ましくは、１０分以上、１５分以上、３０分以上、４５分以上、６０分以上、９０分以上、または２時間以上行なうことができる。輸液投与は、好ましくは一定の輸液速度で行なう。例えば、精密投与ポンプを用いれば、一定の輸液速度による投与が可能である。輸液投与は、対象における血糖値の上昇の誘発と同時になされてもよく、輸液投与中に対象において血糖値の上昇を誘発させてもよい。

【0171】

本発明のキャリア又は組成物は、本発明による投与計画に基づき投与すると、脳への送達効率が選択的に高まる。従って、本発明のキャリア又は組成物は、脳に薬剤を送達するために用いることができる。特に、本発明のキャリア又は組成物は、脳内の所望の部位（例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞）に選択的に、薬剤を送達するために用いることが出来る。本発明のキャリア又は組成物はまた、薬剤に血液脳関門を通過させることができる。従って、本発明のキャリア又は組成物は、従来は送達が困難であった脳実質に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。特に、本発明のキャリア又は組成物は、脳実質内の特定の組織や細胞に選択的に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。本発明のキャリア又は組成物はまた、薬剤を脳血管内皮細胞に蓄積させることができる。従って、本発明のキャリア又は組成物は、従来は送達が困難であった脳血管内皮細胞に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を選択的に送達することに用いることができる。また、本発明のキャリア又は組成物は、脳血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。同様に、本発明のキャリア又は組成物は、網膜、末梢神経および／または髄液に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明のキャリア又は組成物はまた、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞に生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明のキャリア又は組成物は、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。血管内皮細胞間の接着を弱め、または破壊することにより、関門の機能を弱め、様々な薬剤に関門を通過させることができるようになる。

【0172】

本発明のキャリア又は組成物は、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与または腹腔内投与）により投与することができる。

【0173】

本発明によれば、キャリアには、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を内包することができ、これにより、キャリアに内包された薬剤を脳、末梢神経組織、網膜および／または髄液に効果的に送達することが可能である。

【0174】

本発明のキャリア又は組成物を対象に投与すると、第１のブロックコポリマーを修飾するＧＬＵＴ１リガンドの作用により、キャリア又は組成物は血液脳関門を通過して脳内に侵入する。その後、第２のブロックコポリマーを修飾する第２の分子であるリガンドの作用によって、キャリア又は組成物は脳内の所望の部位（例えば血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞）に選択的に移行する。ここで、切断型の第１のブロックコポリマーを用いた場合には、第１の非荷電性セグメントと第１の複合体形成セグメントとを連結する切断可能な結合が、キャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位またはキャリアが選択的に移行すべき脳内所望部位に到達するまでに通過する部位（例えば、脳実質内、又は血管内皮細胞内のエンドソーム内の環境条件下）で特異的に切断されることにより、第１の非荷電性セグメントが除去され、第２の分子であるリガンドで修飾された第２の非荷電性セグメントが、キャリア外方に効率的に露出することになる。その結果、本発明の組成物に担持された薬剤を、脳内の所望の部位に選択的に送達することが可能となる。かかる本発明の組成物を用いた薬剤の送達方法も、本発明により提供される。

【実施例】

【0175】

［試験例１］ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の製造
（１）ＰＥＧ−ＣＯＯＨの合成
まず、ＰＥＧ−ＮＨ_２（ＰＥＧの分子量１２ｋＤａ，８００ｍｇ，０．０６６７ｍｍｏｌ，日油株式会社）をジクロロメタン（１６ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、ＤＭＦ（４ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解した無水コハク酸（１４０ｍｇ，０．７１４ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）を加え、３５℃で反応させた。反応溶液を分画分子量６−８ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア，フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後、凍結乾燥することで白色粉末を得た（収率９４％）。これを^１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分析した結果、反応は定量的に進行し、全ての末端アミノ基がカルボキシル基に変換されていることが確認された（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）（図５）。

【0176】

（２）ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成
次に、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（５００ｍｇ，０．０４０７ｍｍｏｌ）を純水（１０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを中性付近（６．５〜７．５）に調製した後、シスタミン２塩酸塩（１８３ｍｇ，０．９７６ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）と塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（１５６ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ，東京化成工業株式会社）を粉のまま加え、室温で１２時間反応させた。反応溶液を分画分子量６−８ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア，フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後（外液０．０１％ ＨＣｌ ａｑ）、凍結乾燥することで白色粉末を得た（収率９４％）。これを^１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分析した結果、反応は定量的に進行し、上記のように分子内にジスルフィド結合を有する重合開始剤（ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２・ＨＣｌ）が得られたことがわかった（図６）。

【0177】

（３）ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成
ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２・ＨＣｌを再度純水に溶解し、分画分子量６−８ｋＤａの透析膜を用いて透析処理した後（外液０．０１％アンモニア水溶液）、凍結乾燥することでＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２を得た。これを開始剤として、既報に従いＮＣＡ−ＢＬＡの重合を行った。具体的には、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２（９４ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．７ｍＬ，関東化学株式会社）に溶解した後、ＤＭＦ（０．３ｍＬ，関東化学株式会社）とジクロロメタン（２ｍＬ，関東化学株式会社）の混合溶媒に溶解したＮＣＡ−ＢＬＡ（１５２ｍｇ，０．６００ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で２日間反応させた。この反応溶液を、ヘキサン：酢酸エチル＝２：３（体積比，どちらも株式会社ゴードー）に滴下し、沈殿物を吸引ろ過により回収した。これを一晩減圧乾燥することでＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡを得た。次に、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡ（２００ｍｇ，０．００６９ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１０ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、５℃に冷却した。一方で、１，５−ジアミノペンタン（６ｍＬ，東京化成工業）も同様にＮＭＰ（６ｍＬ，ナカライテスク株式会社）に溶解し、５℃に冷却した後、これに対してポリマー溶液を滴下し、５℃で１時間反応させた。この反応溶液を分画分子量１５ｋＤａの透析膜（スペクトラ／ポア，フナコシ株式会社）を用いて透析処理した後（外液０．０１％ ＨＣｌ ａｑ）、凍結乾燥することにより白色粉末を得た（収率８９％，平均重合度７２）。これを^１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子株式会社）とサイズ排除カラムクロマトグラフィーにより分析したところ、約１割のＳＳ結合の開裂がみられたものの、ほぼ定量的にＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））が得られたことが分かった（図７）。

【0178】

［試験例２］ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の還元環境応答性の評価
試験例１で合成したＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））の還元環境応答性を評価するため、まず１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、これに対して脳内のグルタチオン濃度（３ｍＭ）と同程度の還元環境となるようにＤＴＴ溶液を添加し、ピペッティングにより攪拌した後に静置した。この溶液を５分後、１５分後、５０分後にそれぞれサンプリングし、ＨＰＬＣを用いて分子量の変化を評価した。その結果、時間経過に伴い分解したフラクションであるＰＥＧ−ＳＨ（２０ｍｉｎ）、Ｓｈ−Ｐ（Ａｓｐ−Ａｐ）（２２ｍｉｎ）の割合が増大し、５０分後にはほぼすべてのＳＳ結合が開裂したことが示唆された（図８）。

【0179】

［試験例３］ＳＳ結合を有するミセルの調製
試験例１で合成したＰＥＧと荷電性セグメントの間にジスルフィド結合を有する新規ポリマー（ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））よりも短いＰＥＧ（分子量２ｋＤａ）と反対電荷を有する荷電性セグメント（今回は負の荷電連鎖）からなるブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ）を既報に従い合成した。これら２種類のポリマーを、それぞれ１０ｍＭのリン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、電荷の釣り合う点で混合した後、室温で２分間攪拌することで長さの異なる２種類のＰＥＧで覆われたミセルを調製した。その後、縮合剤であるＥＤＣを純水に１−１０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、これをミセル溶液に同量添加することで、ミセルのコア部分を固定化した（架橋）。これらのミセルをそれぞれ動的光散乱測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）により評価したところ、平均粒径５０ｎｍ程度で単分散な粒子が得られたことがわかった（図９）。これらのミセル溶液に還元剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業）溶液（５ｍＭ）を同量添加して室温で２時間静置し、同様に動的光散乱測定を行った。その結果、ＥＤＣの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下の場合には、ミセルコア部分の固定化が十分でなく、ＰＥＧの脱離に伴う形態変化が確認された。一方で、３−１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液を添加した場合には、コアが十分に固定化され、ミセルの形状を保持したまま、ＰＥＧの脱離に伴う粒径減少が確認された（図９）。

【0180】

［試験例４］ＳＳ結合を有するミセルの還元環境応答性の評価
試験例３で調製したミセルのうち、最もコア部分が強く固定化されていることが予想される１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加したミセル溶液を用いて、さらに還元環境応答性を詳細に評価した。グルタチオン濃度０．０２〜６ｍＭに相当する還元力となるよう、還元電位をもとにＤＴＴを１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈することでＤＴＴ溶液を作成した。ミセル溶液に、同量のＤＴＴ溶液をそれぞれ添加し、動的光散乱測定によりミセルの粒径変化を評価した。その結果、脳内のグルタチオン濃度に相当する領域（１−３ｍＭ）では、粒径の減少が確認された（図１０）。これは、ジスルフィド結合の開裂に伴い、分子量１２ｋＤａのＰＥＧが脱離し、２ｋＤａのＰＥＧのみが表層にとどまったことを示唆するものである。また、２ｋＤａのＰＥＧを表層に有するミセルの粒径が３０ｎｍ程度であることも、この仮定を裏付けている。さらに、血液中のグルタチオン濃度に相当する領域（０．０１ｍＭ）では、粒径に変化はなかったことから、このミセルは血液中においてはその構造を安定に保持し、ＢＢＢ突破後の脳実質内においてのみＰＥＧが脱離するという機能を発揮する可能性を有していると言える（図１０）。

【0181】

［試験例５］Ｇｌｃ-ＰＥＧ_（２Ｋ）-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）と（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ-ＰＡｓｐとからなるＰＩＣミセル（キャリアＡ）の製造
本試験例では、グルコースリガンドで修飾された非切断型の第１のブロックポリマーであるＧｌｃ-ＰＥＧ_（２Ｋ）-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）と、Ｂｏｃ−アミノ基修飾アスパラギン酸で修飾された第２のブロックコポリマーである（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐを含むＰＩＣミセルの製造を行った。

【0182】

（１）Ｇｌｃ-ＰＥＧ_（２Ｋ）-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成
1，２−Ｏ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｆｒａｎｏｓｅ１０．１３ｇをフラスコに移し、ピリジン６０ｍＬを加え、続いてジクロロメタン６０ｍＬを加え、完全に溶解させた。その後、塩化ピバロイル５．５ｍＬを滴下し、室温で５時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、純水を加えて生成物を析出させ、フィルターろ過により回収した。続いて、６５℃のオイルバス中で、６５℃に温めておいたメタノールを少しずつ加え、完全に溶解したところでオイルバスの電源を切り、室温まで冷却させた。さらに、４℃の冷蔵庫に移して生成物を析出させ、吸引ろ過により生成物であるＭＩＧ−Ｐｉｖ９．２５ｇ回収した。ＭＩＧ−Ｐｉｖ９．２５ｇをフラスコに移し、Ａｃｅｔｏｎｅ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｌ２３０ｍＬを加え、続いてＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ２９２ｍｇを加えた。これを７５℃で３０分間ｒｅｆｌｕｘし、室温に冷却した後、トリエチルアミン１ｍＬを滴下し、続いてトルエン５０ｍＬを加えた。これを減圧下で濃縮した後、さらにトルエン５０ｍＬを加え、同様に濃縮、トルエンの追加を３回繰り返した。その後、ジクロロメタンに生成物を抽出し、硫酸ナトリウムで脱水の後に吸引ろ過し、減圧乾燥により回収した。これをシリカゲルカラムにより精製し、生成物であるＤＩＧ−Ｐｉｖ１０．４ｇを回収した。ＤＩＧ−Ｐｉｖ１０．４ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させ、続いて５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍＬを加え、７０℃で４０分間ｒｅｆｌｕｘした。この反応溶液をジクロロメタンに抽出し、硫酸ナトリウムで脱水・フィルターろ過した後、減圧下で濃縮した。これにエタノールを加え、ドライヤーで加熱した後、純水を少しずつ加え、生成物が析出したところで４℃に冷却し、再結晶により生成物であるＤＩＧ（６）を得た。続いて、ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成を行った。具体的には、ＤＩＧ（６）２６０ｍｇをＴＨＦ１５ｍＬに溶解し、カリウムナフタレン２．６８ｍＬを滴下した。これにエチレンオキシド２．６８ｍＬを加え、３５℃で２４時間反応させた。これをジエチルエーテルに対して再沈殿させて、吸引ろ過により回収し、ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＯＨ（分子量２０００Ｄａ）を得た。続いて、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＯＨ２．１ｇをＴＨＦ２４ｍＬに溶解し、ＴＥＡ０．７ｍＬを加えた後、ＭｓＣｌ／ＴＨＦ（０．４ｍＬ／２．７ｍＬ）を加えて水浴中で３０分間攪拌後、室温で３時間攪拌した。これをジエチルエーテルに対して再沈殿し、吸引ろ過によりいったん回収した後、２８％ＮＨ_３水溶液１３８ｍＬを加えて室温で４日間攪拌した。これを減圧下で濃縮し、透析により精製した後、凍結乾燥により回収してＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ_２を得た。続いて、ＢＬＡ−ＮＣＡ ９．５ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）７５ｍＬで希釈した。一方で、先に合成したＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ_２（分子量２，０００）１．０ｇをＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加えた。この混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル２Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡを得た。次に、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡからポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥をしたＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡ １ｇをＮＭＰ １０ｍＬに溶解した。１，５−ジアミノペンタン（ＤＡＰ） ８ｍＬをＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液に加えた。混合溶液を５℃に保ちながら１時間反応させた。その後、反応液に２０重量％の酢酸水溶液１５．２ｍＬを添加し、透析膜（分画分子量６，０００〜８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ） ９５４ｍｇ（収率８１％）を得た。

【0183】

（２）（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐの合成
まず、Ｎ_３−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡの合成を行った。具体的には、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ（分子量，２０００）６．７５ｇをベンゼンに溶解し、凍結後に減圧下で乾燥させた。これをＴＨＦ４５ｍＬに溶解し、ＴＥＡ１．８３ｍＬを加えた後、さらにＭｓＣｌ／ＴＨＦ（１．１３ｍＬ／２２．５ｍＬ）を加えて水浴中で３０分、室温で１時間反応させた。これをエーテル（１．３Ｌ）に対して再沈殿し、真空乾燥することでＴＨＰ−ＰＥＧ−Ｍｓを回収した。ＴＨＰ−ＰＥＧ−Ｍｓ６．５５ｇをＤＭＦ４４ｍＬに溶解し、アジ化ナトリウム３．７ｇを加えて４５℃で３日間反応させた。これに対して純水３０ｍＬを加えた後、透析により精製、真空乾燥することでＴＨＰ−ＰＥＧ−Ｎ_３を得た。ＴＨＰ−ＰＥＧ−Ｎ_３４．８７ｇをＭｅＯＨ６８ｍＬに溶解し、１ＮのＨＣｌ４２ｍＬを加えて室温で５時間反応させた。その後、アンモニア水により過剰量の酸を中和し、透析と再沈殿により精製し、減圧下で乾燥させてＮ_３−ＰＥＧ−ＯＨを得た。Ｎ_３−ＰＥＧ−ＯＨ３．８７ｇをＴＨＦ３６ｍＬに溶解し、ＴＥＡ１．３ｍＬを加えた後、ＭｓＣｌ／ＴＨＦ（０．７８ｍＬ／５．４ｍＬ）を加えて水浴中で３０分間攪拌後、室温で３時間攪拌した。これをエーテルに対して再沈殿し、吸引ろ過によりいったん回収した後、２８％ＮＨ_３水溶液２７６ｍＬを加えて室温で４日間攪拌した。これを減圧下で濃縮し、透析により精製した後、凍結乾燥により回収してＮ_３−ＰＥＧ−ＮＨ_２を得た。（３．７ｇ）続いて、ＢＬＡ−ＮＣＡ １８．９ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１９ｍＬに溶解し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）１５０ｍＬで希釈した。一方で、先に合成したＮ_３−ＰＥＧ−ＮＨ_２（分子量２，０００）２．０ｇをＤＭＦ ２０ｍＬに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加えた。この混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル３．８Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してＮ_３−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡを得た。

【0184】

次に、Ｎ_３−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡから（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡを合成した。具体的には、ｍｅｓｏ−２，３−ｄｉａｍｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ２３４ｍｇをエタノール５０ｍＬに分散させた後、氷冷しながら塩化チオニル３ｍＬを滴下し、３日間ｒｅｆｌｕｘした。これを減圧乾燥した後、水／ジオキサン（２ｍＬ／５ｍＬ）に溶解し、ＴＥＡ２３４μＬと（Ｂｏｃ）_２Ｏ２１４μＬを順に加え、５０℃で一晩反応させた。これを減圧下で濃縮した後、シリカゲルカラムにより分子内のアミノ基のうち、一つはＢｏｃ保護され、一つは残存した化合物のフラクションのみを抽出した。一方で、５−Ｈｅｘｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ８３９ｍｇをＤＭＦ８ｍＬに溶解し、ＮＨＳ１．５ｇとＥＤＣ２ｇを加えて、室温で一晩反応させた。これを抽出により精製し、減圧下で濃縮した後、シリカゲルカラムにより目的物である５−Ｈｅｘｙｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒを得た。このようにして得た下式の化合物２０ｍｇとＮ_３−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡ５００ｍｇをＤＳＭＯ２５ｍＬ中に溶解させ、１Ｍ硫酸銅(II)水溶液６０μＬ及び１Ｍアスコルビン酸水溶液６０μＬの存在下、４℃で凍結後に３０℃に昇温して一晩反応させ、Ｅｔ_２−Ｂｏｃ−ＡｓｐをＰＥＧ末端に導入した（Ｅｔ_２−Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡを合成した。その後、１Ｎ水酸化ナトリウムの存在下、室温で三時間反応させ、カルボキシル基を脱保護した後、過剰量のＥＤＴＡ・２Ｎａを加えて室温で一晩放置することにより銅イオンを除去し、（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡ４３８ｍｇを合成した。

【0185】

【化14】

【0186】

次に、（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡからＡｓｐ−ＰＥＧ_（２Ｋ）−Ｐ（Ａｓｐ）を合成した。具体的には、（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＰＢＬＡ １００ｍｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解した。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥して（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−Ｐ（Ａｓｐ） ５５ｍｇ（収率７８％）を得た。ＮＭＲスペクトルによる確認の結果、ほぼ全てのポリマーのＰＥＧ末端にＢｏｃ−Ａｓｐリガンドが導入されたことが確認された（図１１）。その後、８０％ＴＦＡにより処理することで、Ｂｏｃ保護基を脱保護し、Ａｓｐ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）４０ｍｇを得た。ＮＭＲスペクトルによる確認の結果、ほぼ全てのＢｏｃ基が脱保護されたことが確認された（図１２）。

【0187】

（３）ＰＩＣミセルの形成
上記手順にて合成したＧｌｃ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ） ５０ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭＮａＣｌ）５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＧｌｃ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）溶液を調製した。同様に、上記手順にて合成した（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ ５０ｍｇをＰＢ ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ溶液を調製した。上記２種類の水溶液、即ちＧｌｕ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）溶液４ｍＬと（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ溶液７．０ｍＬを、５０ｍＬのコニカルチューブに添加し、ボルテックスで２分間攪拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマーおよびＥＤＣの副生成物などを除去した。

【0188】

［試験例６］Ａｓｐ修飾ミセルの調製
試験例５（３）に準じ、Ａｓｐ−ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＰＡｓｐ又はＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＰＡｓｐと、ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、荷電比が釣り合う点で混合し、室温で２分間攪拌した。１０当量のＥＤＣを添加し、室温で１２時間静置し、ポリイオンコンプレックスのコアを架橋した。限外濾過により、ミセルを精製した。得られたミセルをそれぞれ動的光散乱測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）により評価したところ、平均粒径２５〜３０ｎｍ程度で単分散な粒子が得られたことがわかった（表１）。

【0189】

【表1】

【0190】

この結果から、Ｂｏｃ基を脱保護したポリマーを用いた場合でも、Ａｓｐ修飾ミセルが調製できることが示された。

【0191】

［試験例７］Ｇｌｃ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）と（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ-ＰＡｓｐとからなるＰＩＣミセルの製造
本試験例では、グルコースリガンドで修飾された切断型の第１のブロックポリマーであるＧｌｃ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）と、Ｂｏｃ−アミノ基修飾アスパラギン酸で修飾された第２のブロックコポリマーである（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐを含むＰＩＣミセルの製造を行った。

【0192】

（１）Ｇｌｃ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成
まず、ポリエチレングリコール（分子量１２，０００）の末端にジスルフィド結合を有する官能基を導入した。具体的には、メトキシ基の末端とアミノエチル基の末端を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＮＨ_２）（分子量１２，０００）５００ｍｇをＤＭＦ２ｍＬ／ＤＣＭ８ｍＬの混合溶媒に溶解し、その溶液に無水コハク酸７０ｍｇを加えて反応させ、ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＣＯＯＨ４７０ｍｇを合成した（収率９４％）。^１Ｈ−ＮＭＲ及びイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}末端にカルボン酸基を有する上記所望の基が導入されたことを確認した。次に、得られたＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＣＯＯＨ４８０ｍｇを純水に溶解し、ｐＨ＝７となるよう１Ｎ ＮａＯＨにより調整した後、Ｈ_２Ｎ−Ｃ_２Ｈ_４−Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ_２・２ＨＣｌ１３８ｍｇとＥＤＣ１１７ｍｇを加え、室温で一晩反応させることでＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ−Ｃ_２Ｈ_４−Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ_２・ＨＣｌ４７８ｍｇ（以下ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−ＮＨ_２と略す。）を合成した（収率９５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ及びイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}末端にジスルフィド結合を含む所望の基が導入されたことを確認した。

【0193】

次に、上記ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−ＮＨ_２からポリエチレングリコール−ジスルフィド−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））を合成した。具体的には、上記ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−ＮＨ_２４７８ｍｇとＮＣＡ−ＢＬＡ３７０ｍｇとを、ＤＭＦ０．４ｍＬ／ＤＣＭ４ｍＬの混合溶媒に溶解し、３５℃で２日間反応させ、再沈殿により精製・回収した。次いでＨ_２Ｎ-Ｃ_５Ｈ_１０-ＮＨ_２５０当量を加えて５℃で１時間反応させて、上記ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−ＮＨ_２のＮＨ_２側末端に（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸を重合させてＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を作成した（収率８９％）。^１Ｈ−ＮＭＲによる測定の結果、Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）ブロックの重合度は７２であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、ほぼ単分散のＰＥＧ_{（１２Ｋ）}−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）であることが確認された。

【0194】

（２）（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐの合成
上記試験例５と同様の手順で合成を行い、（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐを合成した。

【0195】

（３）ＰＩＣミセルの形成
上記手順にて合成したＧｌｕ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）５０ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭＮａＣｌ）５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＧｌｕ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）溶液を調製した。同様に、上記手順にて合成した（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ５０ｍｇをＰＢ ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ溶液を調製した。上記２種類の水溶液、即ちＧｌｕ-ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）溶液４ｍＬと（Ｂｏｃ−Ａｓｐ）-ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＰＡｓｐ溶液７．０ｍＬを、５０ｍＬのコニカルチューブに添加し、ボルテックスで２分間攪拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置しポリイオンコンプレクスのコアを架橋した。その後、分画分子量１００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ミセル形成に関与していないポリマーおよびＥＤＣの副生成物などを除去した。

【0196】

［試験例８］ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の製造
1，２−Ｏ−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｆｒａｎｏｓｅ １０．１３ｇをフラスコに移し、ピリジン６０ｍＬを加え、続いてジクロロメタン６０ｍＬを加え、完全に溶解させた。その後、塩化ピバロイル５．５ｍＬを滴下し、室温で５時間攪拌した。反応溶液を減圧下で濃縮した後、純水を加えて生成物を析出させ、フィルターろ過により回収した。続いて、６５℃のオイルバス中で、６５℃に温めておいたメタノールを少しずつ加え、完全に溶解したところでオイルバスの電源を切り、室温まで冷却させた。さらに、４℃の冷蔵庫に移して生成物を析出させ、吸引ろ過により生成物であるＭＩＧ−Ｐｉｖ９．２５ｇ回収した。ＭＩＧ−Ｐｉｖ９．２５ｇをフラスコに移し、Ａｃｅｔｏｎｅ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｌ２３０ｍＬを加え、続いてＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ ２９２ｍｇを加えた。これを７５℃で３０分間ｒｅｆｌｕｘし、室温に冷却した後、トリエチルアミン１ｍＬを滴下し、続いてトルエン５０ｍＬを加えた。これを減圧下で濃縮した後、さらにトルエン５０ｍＬを加え、同様に濃縮、トルエンの追加を３回繰り返した。その後、ジクロロメタンに生成物を抽出し、硫酸ナトリウムで脱水の後に吸引ろ過し、減圧乾燥により回収した。これをシリカゲルカラムにより精製し、生成物であるＤＩＧ−Ｐｉｖ１０．４ｇを回収した。ＤＩＧ−Ｐｉｖ １０．４ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させ、続いて５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍＬを加え、７０℃で４０分間ｒｅｆｌｕｘした。この反応溶液をジクロロメタンに抽出し、硫酸ナトリウムで脱水・フィルターろ過した後、減圧下で濃縮した。これにエタノールを加え、ドライヤーで加熱した後、純水を少しずつ加え、生成物が析出したところで４℃に冷却し、再結晶により生成物であるＤＩＧ（６）を得た。続いて、ＤＩＧ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成を行った。具体的には、ＤＩＧ（６）２６０ｍｇをＴＨＦ１５ｍＬに溶解し、カリウムナフタレン２．６８ｍＬを滴下した。これにエチレンオキシド２．６８ｍＬを加え、３５℃で２４時間反応させた。これをジエチルエーテルに対して再沈殿させて、吸引ろ過により回収し、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＯＨ（分子量２０００Ｄａ）を得た。続いて、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＯＨ２．１ｇをＴＨＦ２４ｍＬに溶解し、ＴＥＡ０．７ｍＬを加えた後、ＭｓＣｌ／ＴＨＦ（０．４ｍＬ／２．７ｍＬ）を加えて水浴中で３０分間攪拌後、室温で３時間攪拌した。これをジエチルエーテルに対して再沈殿し、吸引ろ過によりいったん回収した後、２８％ＮＨ_３水溶液１３８ｍＬを加えて室温で４日間攪拌した。これを減圧下で濃縮し、透析により精製した後、凍結乾燥により回収してＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＮＨ_２を得た。続いて、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ_２の合成を行った。具体的には、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＮＨ_２ ３００ｍｇをＤＭＦ４ｍＬ／ＤＣＭ１６ｍＬの混合溶媒に溶解し、その溶液に無水コハク酸７０ｍｇを加えて反応させ、ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＣＯＯＨを合成した。^１Ｈ−ＮＭＲ及びイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ_（２Ｋ）末端にカルボン酸基を有する上記所望の基が導入されたことを確認した。次に、得られたＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＣＯＯＨ２００ｍｇを純水に溶解し、ｐＨ＝７となるよう１Ｎ ＮａＯＨにより調整した後、Ｈ_２Ｎ−Ｃ_２Ｈ_４−Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ_２・２ＨＣｌ １３８ｍｇとＥＤＣ１１７ｍｇを加え、室温で一晩反応させることでＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ−Ｃ_２Ｈ_４−Ｓ−Ｓ−Ｃ_２Ｈ_４−ＮＨ_２・ＨＣｌ（以下ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}-ＳＳ−ＮＨ_２と略す。）を合成した。^１Ｈ−ＮＭＲ及びイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ_{（１２Ｋ）}末端にジスルフィド結合を含む所望の基が導入されたことを確認した。

【0197】

次に、上記ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＳＳ−ＮＨ_２・ＨＣｌからポリエチレングリコール−ジスルフィド−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））を合成した。具体的には、上記ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＳＳ−ＮＨ_２・ＨＣｌを０．０１％アンモニア水溶液に対して透析することで脱塩した。ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＳＳ−ＮＨ_２ ３０ｍｇとＮＣＡ−ＢＬＡ８０当量とを、ＤＭＦ０．４ｍＬ／ＤＣＭ４ｍＬの混合溶媒に溶解し、３５℃で２日間反応させ、再沈殿により精製・回収した。次いでＨ_２Ｎ-Ｃ_５Ｈ_１０-ＮＨ_２５０当量を加えて５℃で１時間反応させて、上記ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）-ＳＳ−ＮＨ_２のＮＨ_２側末端に（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸を重合させてＤＩＧ（６）−ＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を作成した。^１Ｈ−ＮＭＲによる測定の結果、Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）ブロックの重合度は４０であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、ほぼ単分散のＤＩＧ（６）−ＰＥＧ_（２Ｋ）−ＳＳ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）であることが確認された。

【0198】

［試験例９］Ａｓｐ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐの製造
図１３のスキームに従い、Ａｓｐ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐを製造した。反応は定量的に進行し、単分散なポリマーが得られた。

【0199】

［試験例１０］ＧＬＵＴ１発現細胞へのミセル取り込み評価
（試薬）
＜ブロックコポリマー＞
（ａ）ＭｅＯ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）
（ｂ）Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にグルコースリガンドを有する
（ｃ）Ａｓｐ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にアスパラギン酸リガンドを有する
（ｄ）Ａｓｐ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンドを有する
（ｅ）ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）_（７２）
（ｆ）ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）_（７２）−Ｃｙ５

【0200】

＜ミセル試料＞
（Ａ）Ｇｌｃ（２５％）／ｍ：表層に２５％の割合でグルコースリガンドを含むミセル
（Ｂ）Ｇｌｃ（２５％）＋Ａｓｐ（２５％）／ｍ：表層にそれぞれ２５％の割合でグルコースリガンドとアスパラギン酸リガンドを含むミセル
（Ｃ）Ｇｌｃ（２５％）＋Ａｓｐ−ＤＢＣＯ（２５％）／ｍ：表層にそれぞれ２５％の割合でグルコースリガンドとアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンドを含むミセル

【0201】

＜ミセルの調製方法＞
（１）すべてのポリマーをそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ−７．４）に溶解した。
（２）ミセルを蛍光標識化するため、（ｅ）：（ｆ）＝６：１（体積比）で混合し、ポリカチオン溶液を調製した。
（３）（２）のポリカチオン溶液と同モル数の荷電を有するポリアニオン溶液を混合しミセルを調製した。このとき用いるポリアニオン溶液はサンプルごとに異なり、（Ａ）については（ａ）と（ｂ）を、（Ｂ）については（ｂ）と（ｃ）を、（Ｃ）については（ｂ）と（ｄ）を、各リガンド結合ブロックコポリマー数がミセル表層のブロックコポリマー（ＰＥＧ）の総量のうち２５モル％の割合となるようにあらかじめ混合したうえで、ポリカチオン溶液と混合、室温で２分間攪拌した。
（４）（３）のミセル溶液中のカルボキシル基に対して、１０当量の縮合剤（ＥＤＣ）を加え、ミセルのコアを固定化した。
（５）（４）を限外ろ過により精製し、溶媒を１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換した（最終濃度３ｍｇ／ｍＬ、蛍光強度の定量から算出したポリマー濃度）。

【0202】

＜細胞取り込みアッセイ＞
（１）ＧＬＵＴ１を多く発現する細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。
（２）上記のミセル溶液４０μＬをそれぞれ培地２６０μＬと混合し、１ｗｅｌｌにつき５０μＬ（ｎ＝６）を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。
（３）ミセル溶液と培地の混合液を除去し、Ｄ−ＰＢＳ（−）により細胞外のミセルを洗い流した後、培地５０μＬを添加した。
（４）蛍光プレートリーダー（インフィニットＭ１０００ ＰＲＯ， ＴＥＣＡＮ）により細胞内に取り込まれたミセルの蛍光量を定量した。

【0203】

その結果、評価した３つのミセルは、いずれもＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に取り込まれた（図１４）。表層にグルコースリガンドに加えてアスパラギン酸リガンド（Ｂ）又はアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンド（Ｃ）を含むミセルも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に取り込まれた。このことは、第１の非荷電性セグメントと、第２の非荷電性セグメントとが実質的に同じ長さであることにより、キャリアがその表面にＧＬＵＴ１リガンドに加えて第２の分子（第２のリガンド）を含む場合であっても、ＧＬＵＴ１を介して、ＢＢＢを突破し得ることを示唆する。但し、表層にグルコースリガンドに加えてアスパラギン酸リガンド又はアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンドを含むミセル（Ｂ及びＣ）は、表層にグルコースリガンドのみを含むミセル（Ａ）と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への取り込みが低かった。このことは、キャリアがその表面にＧＬＵＴ１リガンドに加えて第２の分子（第２のリガンド）を含む場合、第２の分子（第２のリガンド）の種類によっては、ＧＬＵＴ１リガンドのＧＬＵＴ１との結合を阻害する可能性を示唆する。従って、第１の非荷電性セグメントの鎖長を、第２の非荷電性セグメントの鎖長より長くして、第２の分子（第２のリガンド）よりも、ＧＬＵＴ１リガンドをキャリアの外側に配置することにより、ＢＢＢ通過の際に、第２の分子（第２のリガンド）によるＧＬＵＴ１リガンド／ＧＬＵＴ１結合の阻害を防ぎ、効率的なＢＢＢ通過が期待できる。

【0204】

［試験例１１］ミセルの脳実質への選択的送達能の評価
（試薬）
＜ブロックコポリマー＞
（ａ）ＭｅＯ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）
（ｂ）Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にグルコースリガンドを有する
（ｃ）Ａｓｐ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にアスパラギン酸リガンドを有する
（ｄ）Ａｓｐ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ_（４８）−ＰＡｓｐ_（７２）：ＰＥＧ末端にアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンドを有する
（ｅ）ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）_（７２）
（ｆ）ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）_（７２）−Ｃｙ５

【0205】

＜ミセル試料＞
（Ａ）Ｇｌｃ（２５％）／ｍ：表層に２５％の割合でグルコースリガンドを含むミセル
（Ｂ）Ａｓｐ（２５％）／ｍ：表層に２５％の割合でアスパラギン酸リガンドを含むミセル
（Ｃ）Ａｓｐ−ＤＢＣＯ（２５％）／ｍ：表層に２５％の割合でアスパラギン酸−ＤＢＣＯリガンドを含むミセル

【0206】

＜ミセルの調製方法＞
（１）すべてのポリマーをそれぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ−７．４）に溶解した。
（２）ミセルを蛍光標識化するため、（ｅ）：（ｆ）＝６：１（体積比）で混合し、ポリカチオン溶液を調製した。
（３）（２）のポリカチオン溶液と同モル数の荷電を有するポリアニオン溶液を混合しミセルを調製した。このとき用いるポリアニオン溶液はサンプルごとに異なり、（Ａ）については（ａ）と（ｂ）を、（Ｂ）については（ａ）と（ｃ）を、（Ｃ）については（ａ）と（ｄ）を、各リガンド結合ブロックコポリマー数がミセル表層のブロックコポリマー（ＰＥＧ）の総量のうち２５モル％の割合となるようにあらかじめ混合したうえで、ポリカチオン溶液と混合、室温で２分間攪拌した。
（４）（３）のミセル溶液中のカルボキシル基に対して、１０当量の縮合剤（ＥＤＣ）を加え、ミセルのコアを固定化した。
（５）（４）を限外ろ過により精製し、溶媒を１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換した（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、蛍光強度の定量から算出したポリマー濃度）。

【0207】

＜脳切片の調製＞
（１）生後４日目のマウスを低温麻酔し、脳を摘出した。
（２）（１）をアガロースゲルに包埋した後、半球ごとにトリミングした。
（３）ＶＴ１２００（Ｌｅｉｃａ社）を用いて厚さ４００μｍの脳切片を作成した。
（４）周りのアガロースゲルをはがした後、ＭｉｌｌｉＣｅｌｌ（登録商標）に載せて１０日間培養した。

【0208】

＜脳切片中のミセルの分散の評価＞
（１）先に調製したミセル溶液５μＬをそれぞれ脳切片に接触させ、３時間３７℃でインキュベートした。
（２）核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔを（１）の切片に接触させた。
（３）ＭｉｌｌｉＣｅｌｌ(R)の膜ごと切片を切り出し、培養皿にグリースを用いて固定した。
（４）Ｄ−ＰＢＳ（−）で培養皿を満たし、二光子ｉｎ ｖｉｖｏリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。

【0209】

その結果、グルコースリガンド修飾ミセル（Ａ）と比較して、Ａｓｐリガンド修飾ミセル（Ｂ）及びＡｓｐ−ＤＢＣＯリガンド修飾ミセルは、有意に脳内の実質細胞に取り込まれた（図１５）。

【0210】

以上の結果から、アスパラギン酸リガンドは、脳内の実質細胞への取り込みを促進することが示唆された。グルコースリガンドのみで修飾したミセルは、脳実質内での細胞への取り込みが十分ではなく、間質に漂っている状態のものが多かった。これに対して、本試験において使用したアスパラギン酸リガンドは、全体として、脳実質細胞への取り込みを促進する効果を有することが明らかになった。本試験において使用したアスパラギン酸リガンドは、多様なサブタイプのグルタミン酸受容体に認識され、発現するグルタミン酸受容体のサブタイプの種類に関わらず、脳実質内の多様な細胞（例、神経系細胞（ニューロン、グリア細胞等）、血管内皮細胞）へのキャリアの取り込みを促進することが示唆された。

【0211】

また、試験例１０及び１１の結果から、本発明のキャリアが、血液脳関門通過能、及び脳内の所望の部位（例えば、脳血管内皮細胞、脳実質内の特定の組織又は細胞）への選択的送達能を併せ持つことが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0212】

本発明によれば、脳内の所望の部位、例えば脳血管内皮細胞や脳実質内の特定の組織や細胞に対して、より選択的に薬剤を送達することが可能となる。

【0213】

本出願は、米国仮出願Ｎｏ．６２／１８７,８１６（出願日：２０１５年７月２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】