特許 6828219 核酸分子の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6828219

(24)【登録日】2021年1月22日

(45)【発行日】2021年2月10日

(54)【発明の名称】核酸分子の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20210128BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20210128BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20210128BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20210128BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/10 112Z

   C12N15/11 ZZNA

   C12P19/34 A

   C12N15/113 Z

【請求項の数】14

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2020-518565(P2020-518565)

(86)(22)【出願日】2019年8月8日

(86)【国際出願番号】JP2019031421

【審査請求日】2020年3月30日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】阪田 彬裕

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１７−０４６５９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１７／０１２１７１６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Rapid Communications in Mass Spectrometry，２０１４年，Vol.28，p.339-350

【文献】 Rapid Communications in Mass Spectrometry，２０１５年，Vol.29，p.2402-2410, Supporting information

【文献】 The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(49), pp.50654-50661

【文献】 Virology, 2004, 319(1), pp.141-151

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ｉ）５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および
（ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに完全に相補的な、５以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに完全に相補的な、２以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｅ）前記Ｚ領域が、ヌクレオチド数が０〜３のヌクレオチド配列を含む領域であり；
ｆ）前記Ｌｙリンカー領域が、４〜３０量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
一本鎖ＲＮＡの製造方法。

【請求項2】

前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、
前記Ｌｚリンカー領域が、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域および前記Ｚ２領域からなる一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項１または２に記載の製造方法。

【化1】

（式中、Ｙ_１１及びＹ_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ_１２及びＹ_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ_１２とＹ_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【請求項4】

前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項２または３に記載の製造方法。

【化2】

（式中、Ｙ_１１及びＹ_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ_１２及びＹ_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ_１２とＹ_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【化3】

（式中、Ｙ’_１１及びＹ’_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’_１２及びＹ’_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’_１２とＹ’_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【請求項5】

前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）で表される構造の二価の基である、請求項２、３または４に記載の製造方法。

【化4】

（式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）

【請求項6】

Ｌｙリンカー領域が、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｙ１領域およびＸ１領域のヌクレオチド数の総和より少ない数のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項１または２に記載の製造方法。

【請求項7】

Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、互いにワトソンクリック塩基対を形成しない２塩基のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項１、２または６に記載の製造方法。

【請求項8】

Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙｂ領域は０から２０量体のヌクレオチド配列からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、それぞれ２塩基のヌクレオチド配列のリンカー領域であり、その組合せである（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）は、以下の組み合わせから選ばれる、請求項１、２、６または７に記載の製造方法。
（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）＝（ＡＡ、ＡＡ）、（ＡＡ、ＡＣ）、（ＡＡ、ＡＧ）、（ＡＡ、ＣＡ）、（ＡＡ、ＣＣ）、（ＡＡ、ＣＧ）、（ＡＡ、ＧＡ）、（ＡＡ、ＧＣ）、（ＡＡ、ＧＧ）、（ＡＣ、ＡＡ）、（ＡＣ、ＡＣ）、（ＡＣ、ＡＧ）、（ＡＣ、ＣＡ）、（ＡＣ、ＣＣ）、（ＡＣ、ＣＧ）、（ＡＣ、ＵＡ）、（ＡＣ、ＵＣ）、（ＡＣ、ＵＧ）、（ＡＧ、ＡＡ）、（ＡＧ、ＡＣ）、（ＡＧ、ＡＧ）（ＡＧ、ＧＡ）、（ＡＧ、ＧＧ）、（ＡＧ、ＵＡ）、（ＡＧ、ＵＣ）、（ＡＧ、ＵＵ）、（ＡＵ、ＣＡ）、（ＡＵ、ＣＣ）、（ＡＵ、ＣＧ）、（ＡＵ、ＧＡ）、（ＡＵ、ＧＣ）、（ＡＵ、ＧＧ）、（ＡＵ、ＵＡ）、（ＡＵ、ＵＣ）、（ＡＵ、ＵＧ）、（ＡＵ、ＵＵ）、（ＣＡ、ＡＡ）、（ＣＡ、ＡＣ）、（ＣＡ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＡＡ）、（ＣＣ、ＡＣ）、（ＣＣ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＣＣ）、（ＣＣ、ＣＵ）、（ＣＣ、ＵＡ）、（ＣＣ、ＵＣ）、（ＣＣ、ＵＵ）、（ＣＧ、ＡＡ）、（ＣＧ、ＡＣ）、（ＣＧ、ＡＵ）、（ＣＧ、ＧＡ）、（ＣＧ、ＧＣ）、（ＣＧ、ＧＵ）、（ＧＡ、ＡＡ）、（ＧＡ、ＡＧ）、（ＧＡ、ＧＧ）、（ＧＡ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＡＡ）、（ＧＣ、ＡＧ）、（ＧＣ、ＡＵ）、（ＧＣ、ＣＡ）、（ＧＣ、ＣＧ）、（ＧＣ、ＣＵ）、（ＧＣ、ＧＡ）、（ＧＣ、ＧＧ）、（ＧＣ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＵＡ）、（ＧＣ、ＵＧ）、（ＧＣ、ＵＵ）、（ＧＧ、ＡＡ）、（ＧＧ、ＡＧ）、（ＧＧ、ＡＵ）、（ＧＧ、ＧＡ）、（ＧＧ、ＧＧ）、（ＧＧ、ＧＵ）、（ＧＧ、ＵＵ）、（ＧＵ、ＣＡ）、（ＧＵ、ＣＧ）、（ＧＵ、ＧＵ）、（ＧＵ、ＵＡ）、（ＧＵ、ＵＧ）、（ＧＵ、ＵＵ）、（ＵＡ、ＡＣ）、（ＵＡ、ＡＧ）、（ＵＡ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＡＣ）、（ＵＣ、ＡＧ）、（ＵＣ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＣＣ）、（ＵＣ、ＣＧ）、（ＵＣ、ＣＵ）、（ＵＣ、ＵＣ）、（ＵＣ、ＵＧ）、（ＵＣ、ＵＵ）、（ＵＧ、ＡＡ）、（ＵＧ、ＡＣ）、（ＵＧ、ＡＧ）、（ＵＧ、ＡＵ）、（ＵＧ、ＧＣ）、（ＵＧ、ＧＧ）、（ＵＧ、ＧＵ）、（ＵＧ、ＵＣ）、（ＵＧ、ＵＧ）、（ＵＧ、ＵＵ）、（ＵＵ、ＣＣ）、（ＵＵ、ＣＧ）、（ＵＵ、ＣＵ）、（ＵＵ、ＧＣ）、（ＵＵ、ＧＧ）、（ＵＵ、ＧＵ）、（ＵＵ、ＵＣ）、（ＵＵ、ＵＧ）、（ＵＵ、ＵＵ）

【請求項9】

前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の製造方法。

【請求項10】

前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼである、請求項１から９の何れか一項に記載の製造方法。

【請求項11】

前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号９、１０、または１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、請求項１から１０の何れか一項に記載の製造方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、請求項１から１１の何れか一項に記載の製造方法。

【請求項13】

前記アンモニウム塩が、ヘキシルアンモニウム塩、ジプロピルアンモニウム塩、ジブチルアンモニウム塩、およびジアミルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩である請求項１から１２の何れか一項に記載の製造方法。

【請求項14】

前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤が、フェニル基、炭素数１〜２０のアルキル基、またはシアノプロピル基のいずれか１つ以上が固定されたシリカまたはポリマーである請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸分子の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１及び２には、ＲＮＡ干渉法に用いられる一本鎖ＲＮＡが開示されており、かかる化合物の製造方法としては、核酸合成装置を用いて多段階の化学反応により製造する方法が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第２０１２／０１７９１９号

【特許文献2】国際公開第２０１３／１０３１４６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、以下の態様を包含する。
本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、
（Ｉ）５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および
（ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、５以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｅ）前記Ｚ領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり；
ｆ）前記Ｌｙリンカー領域が、４〜３０量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、一本鎖ＲＮＡの製造方法。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、前記Ｌｚリンカー領域がアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域および前記Ｚ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、製造方法である。

【0006】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、製造方法である。

【0007】

【化1】

（式中、Ｙ_１１及びＹ_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ_１２及びＹ_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ_１２とＹ_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【0008】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、製造方法である。

【0009】

【化2】

（式中、Ｙ_１１及びＹ_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ_１２及びＹ_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ_１２とＹ_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【0010】

【化3】

（式中、Ｙ’_１１及びＹ’_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’_１２及びＹ’_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’_１２とＹ’_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ’_１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’_２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【0011】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）で表される構造の二価の基である、製造方法である。

【0012】

【化4】

（式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）

【0013】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、製造方法である。

【0014】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼである、製造方法である。

【0015】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号９、１０、または１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、製造方法である。

【0016】

また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、製造方法である。

【発明の効果】

【0017】

本発明の製造方法によれば、一本鎖ＲＮＡを簡便に製造できる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。

【図2】連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。

【図3】第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。

【図4】連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。

【図5】移動相Ａとしてトリエチルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図6】実施例１において移動相Ａとしてヘキシルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図7】実施例１において移動相Ａとしてジプロピルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図8】実施例１において移動相Ａとしてジブチルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図9】実施例１において移動相Ａとしてジアミルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図10】実施例１において移動相Ａとしてテトラブチルアンモニウムホスファート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。

【図11】実施例１ないし３および比較例１ないし３で用いた第１および第２のＲＮＡと生成する連結一本鎖ＲＮＡの配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の一実施形態にかかる製造方法においては、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結して一本鎖ＲＮＡを製造する工程を含む。本実施形態の製造方法により得られる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端側から、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡである。前記Ｚ領域は、５’末端側から、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域およびＺ２領域からなっていてもよく、前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域およびＺ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであってもよい。前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域、および、Ｘ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を含んでいてもよい。

【0020】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡ及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、その結果タンパク質への翻訳阻害を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象をいう。ＲＮＡ干渉の機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、ＤＩＣＥＲといわれる酵素（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖ＲＮＡと接触し、二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡと呼ばれる小さな断片に分解されるのが主な機構と考えられている。

【0021】

標的となる遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を適宜選択することができる。標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列は、遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなど）等に登録されている標的遺伝子の配列情報を基に常法により設計することが可能である。当該ヌクレオチド配列は、標的となる遺伝子の所定の領域に対して、８０％または８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を有する。

【0022】

ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列としては、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡを用いることができる。ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列の塩基数は、特に制限されず、例えば１９〜３０塩基であり、好ましくは１９〜２１塩基である。

【0023】

Ｗ１領域およびＷ２領域のいずれか一方または両者は、同じ標的遺伝子に対する同一の発現抑制配列を２つ以上有していてもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有していてもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有していてもよい。Ｗ１領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、Ｘ１領域およびＹ１領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。Ｗ２領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、Ｘ２領域およびＹ２領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。発現抑制配列は、標的遺伝子の所定領域に対して、通常８０％または８５％以上の相補性を有しており、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。

【0024】

かかる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡとにリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖とを連結する工程で製造される（図１乃至４参照）。

【0025】

連結一本鎖ＲＮＡは、分子内において相補性のある配列部分が並び、分子内で部分的に二重鎖を形成しうる。連結一本鎖ＲＮＡ分子は、図２及び図４に示すように、Ｘ１領域とＸ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＹ１領域とＹ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これらの相補性を有する配列との間で、二重鎖が形成され、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２及び図４は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖部を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域（ＬｙおよびＬｚ）の形状等は、これらに限定されない。

【0026】

Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域およびＸ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方が、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を少なくとも１つ含んでいてもよい。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、Ｗ１領域とＷ２領域とは、完全に相補的でもよいし、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１若しくは数個のヌクレオチドは、例えば、１〜７個のヌクレオチド、好ましくは１〜５個のヌクレオチドである。Ｙ１領域は、Ｙ２領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｙ１領域とＹ２領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、２つ以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。Ｘ１領域とＸ２領域とは、完全に相補的でもよいし、１〜５個のヌクレオチドが非相補的であってもよく、２つ以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。本実施形態の製造方法では、Ｚ領域は、任意の数のヌクレオチド配列を含む領域であり、必須の配列ではなく、ヌクレオチドの数が０の態様であってもよく、１つ以上のヌクレオチドを含む態様であってもよい。Ｚ領域は、５’末端からＺ１、ＬｚおよびＺ２の各領域を連結したものであってもよい。

【0027】

以下に各領域の長さを例示するが、これに限定されない。本明細書において、ヌクレオチド数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４ヌクレオチド」との記載は、「１ヌクレオチド」、「２ヌクレオチド」、「３ヌクレオチド」、および「４ヌクレオチド」の全ての開示を意味する（以下、同様）。

【0028】

連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｗ２領域のヌクレオチド数（Ｗ２ｎ）と、Ｘ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係は、例えば、下記式（１）の条件を満たす。Ｗ１領域のヌクレオチド数（Ｗ１ｎ）と、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）およびＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、例えば、下記式（２）の条件を満たす。
Ｗ２ｎ＝Ｘ２ｎ＋Ｙ２ｎ ・・・（１）
Ｗ１ｎ≧Ｘ１ｎ＋Ｙ１ｎ ・・・（２）

【0029】

連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれかの条件を満たす。
Ｘ１ｎ＝Ｙ１ｎ ・・・（３）
Ｘ１ｎ＜Ｙ１ｎ ・・・（４）
Ｘ１ｎ＞Ｙ１ｎ ・・・（５）

【0030】

本実施形態の方法において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）、およびＸ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは４以上であり、より好ましくは１０以上である。
Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）、およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。

【0031】

Ｚ１領域は、好ましくは、Ｚ２領域の全領域またはＺ２領域の部分領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。Ｚ１領域とＺ２領域とは、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。

【0032】

より詳しくは、Ｚ２領域は、Ｚ１領域よりも、１ヌクレオチド以上短いヌクレオチド配列からなることが好ましい。この場合、Ｚ２領域のヌクレオチド配列全体が、Ｚ１領域の任意の部分領域の全てのヌクレオチドと相補的となる。Ｚ２領域の５’末端から３’末端までのヌクレオチド配列は、Ｚ１領域の３’末端のヌクレオチドから始まり５’末端に向かってのヌクレオチド配列と相補性のある配列であることがより好ましい。

【0033】

連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＸ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）との関係、Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）とＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係、並びにＺ１領域のヌクレオチド数（Ｚ１ｎ）とＺ２領域のヌクレオチド数（Ｚ２ｎ）との関係は、下記式（６）、（７）および（８）の条件をそれぞれ満たす。
Ｘ１ｎ≧Ｘ２ｎ ・・・（６）
Ｙ１ｎ＝Ｙ２ｎ ・・・（７）
Ｚ１ｎ≧Ｚ２ｎ ・・・（８）

【0034】

連結一本鎖ＲＮＡの全長（ヌクレオチドの総数）は、特に制限されない。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ヌクレオチド数の合計（全長のヌクレオチド数）は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、その上限は、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、リンカー領域（Ｌｙ、Ｌｚ）を除くヌクレオチド数の合計は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、上限が、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。

【0035】

連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域の長さは、特に制限されない。これらのリンカー領域は、例えば、Ｘ１領域とＸ２領域とが二重鎖を形成可能な長さ、あるいはＹ１領域とＹ２領域とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。

【0036】

リンカー領域の主鎖を形成する原子の数は、その上限は、典型的には、１００であり、好ましくは８０であり、より好ましくは５０である。

【0037】

Ｌｙリンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、Ｌｚリンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である。

【0038】

【化5】

（式中、Ｙ_１１及びＹ_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ_１２及びＹ_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ_１２とＹ_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ_１１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ_２１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のＹ_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【0039】

【化6】

（式中、Ｙ’_１１及びＹ’_２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’_１２及びＹ’_２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’_１２とＹ’_２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ’_１１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’_２１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のＹ’_１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）

【0040】

前記Ｙ_１１及びＹ_２１、並びに、Ｙ’_１１及びＹ’_２１における炭素数１〜２０のアルキレン基は、炭素数１〜１０が好ましく、炭素数１〜５がより好ましい。アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、
前記Ｙ_１２及びＹ_２２、並びに、Ｙ’_１２及びＹ’_２２におけるアミノ基で置換されていてもよいアルキル基は、炭素数１〜１０が好ましく、炭素数１〜５がより好ましい。アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、

【0041】

Ｌｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域の好適な例としては、下記式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）で表される構造の二価の基が挙げられる。

【0042】

【化7】

（式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）

【0043】

ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１〜１０のいずれかの整数であることが好ましく、１〜５のいずれかの整数であることがより好ましい。

【0044】

好ましい態様において、Ｌｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域は、それぞれ独立して、式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）の何れかの二価の基を表す。

【0045】

第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの例としては、具体的には、図１１の鎖Ｉおよび鎖ＩＩが例示される。

【0046】

本明細書及び図面において示す配列においては、「ｐ」の略号は、５’末端の水酸基がリン酸基で修飾されていることを示す。また、配列中の「Ｐ」の略号は、下記構造式（ＩＩＩ−Ａ）で表されるアミダイトを用いて導入される構造である。

【0047】

【化8】

【0048】

本発明の方法においては、Ｌｙリンカー領域が、４〜３０量体のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。かかる例としては、例えば、Ｌｙリンカー領域が、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｙ１領域およびＸ１領域のヌクレオチド数の総和より少ない数のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。

【0049】

前記Ｌｙリンカー領域は、より詳しくは、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、互いにワトソンクリック塩基対を形成しない２塩基のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。

【0050】

Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙｂ領域は０から２０量体のヌクレオチド配列からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、それぞれ２塩基のヌクレオチド配列のリンカー領域であり、その組合せである（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）は、以下の組み合わせから選ばれるものであってもよい。
（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）＝（ＡＡ、ＡＡ）、（ＡＡ、ＡＣ）、（ＡＡ、ＡＧ）、（ＡＡ、ＣＡ）、（ＡＡ、ＣＣ）、（ＡＡ、ＣＧ）、（ＡＡ、ＧＡ）、（ＡＡ、ＧＣ）、（ＡＡ、ＧＧ）、（ＡＣ、ＡＡ）、（ＡＣ、ＡＣ）、（ＡＣ、ＡＧ）、（ＡＣ、ＣＡ）、（ＡＣ、ＣＣ）、（ＡＣ、ＣＧ）、（ＡＣ、ＵＡ）、（ＡＣ、ＵＣ）、（ＡＣ、ＵＧ）、（ＡＧ、ＡＡ）、（ＡＧ、ＡＣ）、（ＡＧ、ＡＧ）（ＡＧ、ＧＡ）、（ＡＧ、ＧＧ）、（ＡＧ、ＵＡ）、（ＡＧ、ＵＣ）、（ＡＧ、ＵＵ）、（ＡＵ、ＣＡ）、（ＡＵ、ＣＣ）、（ＡＵ、ＣＧ）、（ＡＵ、ＧＡ）、（ＡＵ、ＧＣ）、（ＡＵ、ＧＧ）、（ＡＵ、ＵＡ）、（ＡＵ、ＵＣ）、（ＡＵ、ＵＧ）、（ＡＵ、ＵＵ）、（ＣＡ、ＡＡ）、（ＣＡ、ＡＣ）、（ＣＡ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＡＡ）、（ＣＣ、ＡＣ）、（ＣＣ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＣＣ）、（ＣＣ、ＣＵ）、（ＣＣ、ＵＡ）、（ＣＣ、ＵＣ）、（ＣＣ、ＵＵ）、（ＣＧ、ＡＡ）、（ＣＧ、ＡＣ）、（ＣＧ、ＡＵ）、（ＣＧ、ＧＡ）、（ＣＧ、ＧＣ）、（ＣＧ、ＧＵ）、（ＧＡ、ＡＡ）、（ＧＡ、ＡＧ）、（ＧＡ、ＧＧ）、（ＧＡ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＡＡ）、（ＧＣ、ＡＧ）、（ＧＣ、ＡＵ）、（ＧＣ、ＣＡ）、（ＧＣ、ＣＧ）、（ＧＣ、ＣＵ）、（ＧＣ、ＧＡ）、（ＧＣ、ＧＧ）、（ＧＣ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＵＡ）、（ＧＣ、ＵＧ）、（ＧＣ、ＵＵ）、（ＧＧ、ＡＡ）、（ＧＧ、ＡＧ）、（ＧＧ、ＡＵ）、（ＧＧ、ＧＡ）、（ＧＧ、ＧＧ）、（ＧＧ、ＧＵ）、（ＧＧ、ＵＵ）、（ＧＵ、ＣＡ）、（ＧＵ、ＣＧ）、（ＧＵ、ＧＵ）、（ＧＵ、ＵＡ）、（ＧＵ、ＵＧ）、（ＧＵ、ＵＵ）、（ＵＡ、ＡＣ）、（ＵＡ、ＡＧ）、（ＵＡ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＡＣ）、（ＵＣ、ＡＧ）、（ＵＣ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＣＣ）、（ＵＣ、ＣＧ）、（ＵＣ、ＣＵ）、（ＵＣ、ＵＣ）、（ＵＣ、ＵＧ）、（ＵＣ、ＵＵ）、（ＵＧ、ＡＡ）、（ＵＧ、ＡＣ）、（ＵＧ、ＡＧ）、（ＵＧ、ＡＵ）、（ＵＧ、ＧＣ）、（ＵＧ、ＧＧ）、（ＵＧ、ＧＵ）、（ＵＧ、ＵＣ）、（ＵＧ、ＵＧ）、（ＵＧ、ＵＵ）、（ＵＵ、ＣＣ）、（ＵＵ、ＣＧ）、（ＵＵ、ＣＵ）、（ＵＵ、ＧＣ）、（ＵＵ、ＧＧ）、（ＵＵ、ＧＵ）、（ＵＵ、ＵＣ）、（ＵＵ、ＵＧ）、（ＵＵ、ＵＵ）

【0051】

本実施形態の製造方法で実施する連結反応においては、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類されるＲＮＡリガーゼであって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼ（以下、「本ＲＮＡリガーゼ」と記すこともある）が使用される。かかるＲＮＡリガーゼとしては、たとえば、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２が例示される。このＲＮＡリガーゼ２は、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入できる。さらに、ＲＮＡリガーゼとしては、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼが例示される。かかるＲＮＡリガーゼは、たとえば、非特許文献（Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.）に記載の方法で各生物から抽出および精製することで得られたものを用いることもできる。

【0052】

Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼも使用可能である。かかるＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列の酵素のほかに、その変異体であるＴ３９Ａ、Ｆ６５Ａ、またはＦ６６Ａ（RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward, Cell. Vol.127, pp.71-84.参照）などを例示することができる。かかるＲＮＡリガーゼ２は、例えば、前記文献の記載に基づき、ＡＴＣＣ（登録商標） １１３０３としてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４を用いる方法やＰＣＲ等の方法で得ることが可能である。

【0053】

ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２は、非特許文献（Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol. 319, PP.141-151.）に記載の方法で取得することができる。具体的には、例えば、以下のような方法で取得できる。すなわち、バクテリオファージＫＶＰ４０（例えば、寄託番号Ｇｏ００８１９９としてＪＧＩに寄託されている）から抽出したＤＮＡのうち、オープンリーディングフレーム２９３を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって制限酵素消化したのちに、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる。得られたＤＮＡをプラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込む。または、当該のＤＮＡ配列をＰＣＲによって人工合成することもできる。ここで、ＤＮＡ配列解析により、所望の変異体を得ることができる。続いて、得られたベクターＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に組み込み、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中にて培養する。イソプロピル−β−チオガラクトシドを０．５ｍＭになるように添加し、３７℃で３時間培養する。その後の操作はすべて４℃で行うことが好ましい。まず、遠心操作により菌体を沈殿させ、沈殿物を−８０℃にて保管する。凍った菌体にバッファーＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０％スクロース］を加える。そして、リゾチームとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、超音波によって菌体を破砕し、目的物を溶出させる。その後、アフィニティクロマトグラフィやサイズ排除クロマトグラフィーなどを利用して目的物を単離する。そして、得られた水溶液を遠心ろ過し、溶離液をバッファーに置換することによりリガーゼとして使用することができる。
このようにして、ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２を得ることができる。ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼが使用可能である。

【0054】

Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）に記載の方法で取得することができる。例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−８１６としてＡＴＣＣに寄託されている生物学的な材料から、前記リガーゼを得ることも可能である。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼとしては、配列番号１１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを使用可能である。かかるリガーゼとしては、具体的には、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼに加えて、配列番号１１のＲＮＡリガーゼにおいて、Ｋ１６５ＡあるいはＥ２７８Ａの変異を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼが例示される（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）。

【0055】

Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.）に記載の方法で取得することができる。

【0056】

Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA, Vol. 274, No.34, PP.24289-24296）に記載の方法で取得することができる。

【0057】

本ＲＮＡリガーゼを用いる本実施形態の製造方法の反応条件は、本ＲＮＡリガーゼが機能する条件であれば、特に限定されないが、一つの典型的な例としては、第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖と、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、およびＤＴＴを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と、純水と、を混合し、その混合液に本ＲＮＡリガーゼを加え、その後当該リガーゼが機能する温度（例えば３７℃）で所定時間（例えば１時間）反応させる条件が挙げられる。
あるいは、本実施形態の製造方法は、非特許文献（Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No.20, PP.12709-12714.）に記載の条件に準じて行うこともできる。

【0058】

前記ＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程について以下説明する。

【0059】

本ＲＮＡリガーゼを用いた第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの連結反応で得られた粗生成物は、例えば、まず、ＲＮＡを沈殿、抽出する方法で単離してもよい。具体的には、連結反応後の溶液にエタノールやイソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１）の混合溶液を連結反応後の溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出する方法を採用してもよい。

【0060】

生成した一本鎖ＲＮＡを逆相カラムクロマトグラフィーで精製する工程においては、モノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相が使用される。かかるアンモニウム塩としては、典型的には、有機または無機の酸とモノアルキルアミンまたはジアルキルアミンからなるアンモニウム塩が例示される。
逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、移動相（溶離液）となるのは、非疎水性の移動相であり、具体的には、前記のようなアンモニウム塩を含むものが例示される。かかる移動相としては、Ｃ１−Ｃ３アルコール（例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノールもしくはｎ−プロパノール）、ニトリル（例えば、アセトニトリル）および場合によっては、水を含む溶媒が、例示される。前記アンモニウム塩を形成する酸としては、例えば、炭酸、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が例示される。かかる移動相としては、典型的には、モノアルキルアミンまたはジアルキルアミン／酢酸／水／アセトニトリルからなる溶離液が例示される。

【0061】

前記アンモニウム塩の濃度としては、例えば、１−２００ｍＭ、５−１５０ｍＭまたは２０−１００ｍＭの濃度が例示される。移動相のｐＨ範囲としては、例えば、ｐＨ：６−８、あるいは６．５−７．５の範囲が例示される。

【0062】

移動相は、前記アンモニウム塩以外のトリエチルアンモニウム塩等を含んでいてもよいが、モノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩の割合は、全アンモニウム塩に対して、例えば、３０ｍｏｌ％以上、４０ｍｏｌ％以上、５０ｍｏｌ％以上、６０ｍｏｌ％以上、７０ｍｏｌ％以上、８０ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以上あるいはモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩のみからなる。選択される少なくとも１つのアンモニウム塩としては、具体的には、例えば、ヘキシルアンモニウム塩、ジプロピルアンモニウム塩、ジブチルアンモニウム塩、およびジアミルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩が例示され、これらから選ばれるアンモニウム塩を使用することが好ましい。

【0063】

前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、疎水性の固定相となる、例えば、フェニル基、炭素数１〜２０のアルキル基、またはシアノプロピル基のいずれか１つ以上が固定されたシリカまたはポリマーが例示される。かかる充填剤であるシリカまたはポリマーとしては、例えば、粒子径が、２μｍ以上、あるいは、５μｍ以上のものが例示される。

【0064】

逆相カラムクロマトグラフィーによる分離は、前記充填剤を含むカラムに前記のアンモニウム塩を含む移動相を通液し、次いで同移動相にリガーゼにより連結された一本鎖ＲＮＡを溶解した溶液を通液し、前記ＲＮＡをカラム内に結合させ、次いで、通液する移動相中の有機溶媒濃度を順次増大させる勾配（グラジエント）により前記ＲＮＡに含まれる不純物（未反応の第１および／または第２のＲＮＡ鎖など）と目的とするＲＮＡ分子とを分離して溶出させることにより実施される。
逆相カラムクロマトグラフィーの温度は、例えば、２０−１００℃、２５−８０℃、あるいは３０−６０℃である。
逆相カラムクロマトグラフィーにより得られる画分は、一般的に核酸の分離分析に用いるクロマトグラフィーの条件下で、波長２６０ｎｍのＵＶ吸収で、組成を分析して、選択された画分が集められ、精製された目的物が得られ、たとえば、非特許文献（Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press）に記載の方法を用いることができる。

【0065】

第１の一本鎖ＲＮＡは、例えば、固相合成法により調製することができる。より具体的には、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ（日本テクノサービス株式会社製））を用いて調製することができる。ホスホロアミダイト法は、デブロッキング、カップリング、および酸化の３段階を１サイクルとして、望みの塩基配列が得られるまでこのサイクルを繰り返す方法である。各試薬に関して、たとえば、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、カップリング剤として５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液として無水酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液を使用して行うことができる。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、たとえば、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従って行うことができる。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールを加えて塩基部およびリン酸基の脱保護と固相担体からの切り出しを行なったのち、固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて２’−水酸基の脱保護を行なってＲＮＡを調製することができる。

【0066】

かかる固相合成法で使用するアミダイトとしては、特に制限されず、たとえば、下記構造式（ＩＩＩ−ａ）中の、Ｒ_１がターシャリブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２−アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２−シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ―トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２−シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ ＲＮＡ Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等を使用することもできる。

【0067】

またＬｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域については、下記構造式（ＩＩＩ―ｂ）に示されるプロリン骨格を有するアミダイトを国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法にて使用することができる。また、下記構造式（ＩＩＩ―ｃ）、（ＩＩＩ―ｄ）および（ＩＩＩ−ｅ）のいずれかで表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１〜Ａ３参照）を使用することにより、同様に核酸合成機にて調製することができる。

【0068】

５’末端の５’位のリン酸化には、５’末端のリン酸化用のアミダイトを固相合成にて使用してもよい。５’末端のリン酸化用のアミダイトは市販のアミダイトを使用することができる。また固相合成にて、５’末端の５’位が水酸基若しくは保護された水酸基であるＲＮＡ分子を合成しておき、適宜脱保護を行った後に、市販のリン酸化剤にてリン酸化することで５’末端にリン酸基を有する一本鎖ＲＮＡを調製することができる。リン酸化剤としては下記構造式（ＩＩＩ−ｆ）で示される市販のＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が知られている（特許文献ＥＰ０８１６３６８）。

【0069】

【化9】

【0070】

式（ＩＩＩ−ａ）において、Ｒ_２は保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、Ｒ_１は保護基を示す。

【0071】

【化10】

【0072】

【化11】

【0073】

【化12】

【0074】

【化13】

【0075】

【化14】

【0076】

第２の一本鎖ＲＮＡは、固相合成法、即ちホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機を用いて、同様に製造することができる。

【0077】

ヌクレオチドを構成する塩基は、通常は、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては、使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然あるいは非天然の塩基の修飾アナログが例示される。

【0078】

塩基の例としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。塩基は、この他に、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等が挙げられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等が挙げられる。また、プリン塩基およびピリミジン塩基には、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。

【0079】

本実施形態の方法で得られる、５’末端側から、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。かかる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用でき、ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現抑制のために使用することができる。「標的遺伝子の発現抑制」とは、例えば、標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。
標的遺伝子の発現抑制は、例えば、標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、転写産物の活性の減少、標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。翻訳産物としてのタンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等が挙げられる。

【実施例】

【0080】

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等限定されるものではない。

【0081】

［実施例１］
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖Ｉ）を合成した。当該鎖は２６塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0082】

鎖Ｉ：pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG (5'-3') （配列番号１）
配列表中の配列番号１の記載は、５’末端から「Ｐ」の前までの塩基配列を示す。当該一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。

【0083】

当該合成には、ＲＮＡアミダイトとして、それぞれ下記の式のウリジンＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同実施例３に記載）、アデノシンＥＭＭアミダイト（同実施例４に記載）、グアノシンＥＭＭアミダイト（同実施例５に記載）、及びプロリンアミダイト（ＩＩＩｂ）（国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ３に記載）を使用し、５’リン酸化には前記構造式（ＩＩＩ-ｆ）で示されるＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてトリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液として無水フェノキシ酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。

【0084】

ウリジンＥＭＭアミダイト

【化15】

【0085】

シチジンＥＭＭアミダイト

【化16】

【0086】

アデノシンＥＭＭアミダイト

【化17】

【0087】

グアノシンＥＭＭアミダイト

【化18】

【0088】

プロリンアミダイト（ＩＩＩｂ）

【化19】

【0089】

固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールとを加え、しばらく静置した後に固相担体をろ過し、溶媒を留去した。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。

【0090】

２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＩＩ）を合成した。当該鎖は２７塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0091】

鎖ＩＩ：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGG (5'-3') （配列番号２）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。

【0092】

配列表中の配列番号２の記載は、５’末端から「Ｐ」の前までの塩基配列を示す。前記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記鎖ＩＩＩ及び図１１に示す。
鎖ＩＩＩ：
AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG (5'-3') （配列番号１，２）
上記配列中、５’末端の塩基から２７番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号２の配列に相当し、また、２８番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号１の配列に相当する。

【0093】

３．ライゲーション反応目的物の一本鎖ＲＮＡ標品の固相合成
上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡの標品を、前記第１および第２のＲＮＡと同様に、固相合成法で合成した。

【0094】

４．ＨＰＬＣを用いた精製条件の検討
上記３種類の合成ＲＮＡを標品として用い、表１に示す条件によって分離分析を行い、精製条件を検討した。

【表1】

【0095】

移動相Ａとして１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図５に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび生成物である鎖ＩＩＩの分離は不可能であった。

【0096】

移動相Ａとして１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図６に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。

【0097】

移動相Ａとして１００ｍＭ ジプロピルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図７に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。

【0098】

移動相Ａとして１００ｍＭ ジブチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図８に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。

【0099】

移動相Ａとして１００ｍＭ ジアミルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図９に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。

【0100】

移動相Ａとして１０ｍＭ テトラブチルアンモニウムホスファート（ｐＨ．７．５）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図１０に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取は、不可能であった。

【0101】

５．ライゲーション
次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を２２．３ｍＬ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２．８ｍＬ、０．８７ｍＭの鎖ＩのＲＮＡを７８．１μＬ、０．７４ｍＭの鎖ＩＩのＲＮＡを１０１．３μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１６２５ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および４ｍＭ ＡＴＰ混合液２．８ｍＬの組成で、反応スケール２８．２ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。

【0102】

得られた反応液から一部を取り出し、ＨＰＬＣによって分析したところ、粗生成物中の目的物の純度は６１％、鎖Ｉおよび鎖ＩＩの残存割合はそれぞれ６．４％、８．３％であった。なお、ＨＰＬＣにおいて波長２６０ｎｍのＵＶスペクトルによって検出し、得られたクロマトグラムの総面積値に対する目的物の面積値を純度として算出し、総面積値に対する原料の面積値を残存割合として算出した。

【0103】

続いて、前記反応液を１４ｍＬ取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0104】

６．精製
下記表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析した。なお、ＨＰＬＣにおいて波長２６０ｎｍのＵＶスペクトルによって検出し、得られたクロマトグラムの総面積値に対する目的物の面積値を純度として算出した。
その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分は、純度９６．４％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、表３に示すとおり、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩは検出されなかった。

【表2】

【表3】

【0105】

［比較例１］
実施例１におけるライゲーションで得られた反応液から１４ｍＬを取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0106】

下記表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をＨＰＬＣにて分析した。なお、実施例１に記載の方法と同様に純度を算出した。
その結果、目的物が最も高純度になった画分は、純度７７％であった。得られた試料を質量分析測定した結果を表３に示す。

【表4】

【0107】

［参考例１］
５．ライゲーション
次に、２５０ｍＬポリプロピレン反応器の中に蒸留水（大塚製薬社製）を６８ｍＭ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）８．６ｍＬ、０．８７ｍＭの鎖ＩのＲＮＡを２０３μＬ、０．７４ｍＭの鎖ＩＩのＲＮＡを２３０μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、２５００ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および４ｍＭ ＡＴＰ混合液２．８ｍＬの組成で、反応スケール２８．２ｍＬで行った。その後、３５℃で２４時間インキュベートし、０．２Ｍ エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。

【0108】

続いて、得られた反応液を１ｍＬ取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、蒸留水（大塚製薬社製）１ｍＬで洗いこんだ。

【0109】

６．精製
下記表５に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。
その結果、得られた画分のうち、目的物が最も高い純度を示した画分の純度は７９％、鎖Ｉおよび鎖ＩＩの残存割合についてはそれぞれ５．０％、７．１％となった。

【表5】

【0110】

これらの結果を表６にまとめた。イオン交換クロマトグラフィー（以下、イオン交換と略記することもある）やトリエチルアンモニウムアセテートを用いた逆相クロマトグラフィー（以下、ＴＥＡＡ精製と略記することもある）では目的物と未反応原料が同時に溶出する一方、ヘキシルアンモニウムアセテートを用いた逆相クロマトグラフィー（以下、ＨＡＡ精製と略記することもある。）では目的物と未反応原料を分離できることが判明した。

【表6】

【0111】

［実施例２］
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
第１の一本鎖ＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＩＶ）を使用した。当該鎖は２３基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0112】

鎖ＩＶ：pUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3') （配列番号３）
当該一本鎖ＲＮＡは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。

【0113】

２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
第２の一本鎖ＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖Ｖ）を使用した。当該鎖は３６塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0114】

鎖Ｖ：ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCA (5'-3') （配列番号４）
当該一本鎖ＲＮＡは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。

【0115】

上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記および図１１に示す。
鎖ＶＩ：
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3') （配列番号５）
上記配列中、５’末端の塩基から３６番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号４の配列に相当し、また、３７番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号３の配列に相当する。

【0116】

３．ライゲーション
次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を１．７４ｍＬ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２３４μＬ、０．１０ｍＭの鎖ＩＶのＲＮＡを６４．１μＬ、０．１０ｍＭの鎖ＶのＲＮＡを７０．５μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１７５０ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および４ｍＭ ＡＴＰ混合液２３４μＬの組成で、反応スケール２．４ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ エチレンジアミン四酢酸水溶液０．１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。

【0117】

得られた反応液から一部を取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、実施例１と同様に純度および残存割合を算出した。その結果、粗生成物中の目的物の純度は２９．３％、鎖ＩＶおよび鎖Ｖの残存割合はそれぞれ１３．８％、１１．８％であった。

【0118】

続いて、前記反応液を１．２ｍＬ取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0119】

４．精製
表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度を算出した。その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分の目的物の純度は８０．５％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表７に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、質量分析では原料である鎖ＩＶおよび鎖Ｖは検出されなかった。

【表7】

【0120】

［比較例２］
実施例２において、ライゲーションを停止して得られた反応液から１．２ｍＬを取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0121】

表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、最も目的物が高純度となった画分について、純度は４７．１％、鎖ＩＶおよび鎖Ｖの残存割合はそれぞれ１．９％、１３．７％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られることが確認できた。得られた試料を質量分析測定した結果を表７に示す。

【0122】

比較例２および実施例２について、目的物が最も高純度となった画分の純度および原料の残存割合を表８にまとめた。

【表8】

【0123】

［実施例３］
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＶＩＩ）を合成した。当該鎖は２３塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0124】

鎖ＶＩＩ：pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU (5'-3') （配列番号６）
当該一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって、実施例１における一本鎖ＲＮＡ（鎖Ｉ）の合成と同様のやりかたで合成し、さらに、同様の方法で固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護を行った。

【0125】

２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＶＩＩＩ）を前記第一の一本鎖ＲＮＡと同様の方法で合成した。当該鎖は２９塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。

【0126】

鎖ＶＩＩＩ：GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGG (5'-3') （配列番号７）

【0127】

上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記に示す。
鎖ＩＸ：
GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU (5'-3') （配列番号８）
上記配列中、５’末端の塩基から２９番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号７の配列に相当し、また、３０番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号６の配列に相当する。

【0128】

３．ライゲーション
次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を１９．６ｍＬ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２．５ｍＬ、０．６２ｍＭの鎖ＶＩＩのＲＮＡを１１１．２μＬ、０．４９ｍＭの鎖ＶＩＩＩのＲＮＡを１５４．９μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１７５０ｕｎｉｔｓ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および４ｍＭ ＡＴＰ混合液２．５ｍＬの組成で、反応スケール２５ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。

【0129】

得られた反応液から一部を取り出し、実施例１と同様に純度および残存割合を算出した。その結果、粗生成物中の目的物の純度は３３．０％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合はそれぞれ１５．７％、２８．１％であった。

【0130】

続いて、前記反応液を１２．５ｍＬ取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0131】

４．精製
表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、目的物が最も高純度となった画分の純度は９４．２％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合についてはそれぞれ０．４％、０．５％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表９に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。

【表9】

【0132】

［比較例３］
実施例３のライゲーション反応で得られた一本鎖ＲＮＡを含む反応液から１２．５ｍＬを取り出し、マイレクス−ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。

【0133】

表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、目的物が最も高純度となった画分の純度は３５．５％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合はそれぞれ１７．０％、３０．１％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られることが確認できた。得られた試料を質量分析測定した結果を表９に示す。

【0134】

比較例３および実施例３について、目的物が最も高純度となった画分の純度および原料の残存割合を表１０にまとめた。

【表10】

【表11】

【産業上の利用可能性】

【0135】

本発明の製造方法によれば、一本鎖ＲＮＡを簡便に製造できる。

【配列表フリーテキスト】

【0136】

配列番号１〜８は、ＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号９〜１１は、アミノ酸配列を示す。

【要約】

本発明は、（Ｉ）５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および（ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法、を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]