特許 6842655 粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6842655

(24)【登録日】2021年2月25日

(45)【発行日】2021年3月17日

(54)【発明の名称】粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/899 20060101AFI20210308BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20210308BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210308BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210308BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20210308BHJP

   A23L 33/10 20160101ALN20210308BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/899

   A61K36/48

   A61P43/00 105

   A61P37/08

   C12N5/078

   !A23L33/10

【請求項の数】2

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-227131(P2016-227131)

(22)【出願日】2016年11月22日

(65)【公開番号】特開2018-83775(P2018-83775A)

(43)【公開日】2018年5月31日

【審査請求日】2019年8月2日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004477

【氏名又は名称】キッコーマン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100149032

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 敏明

(72)【発明者】

【氏名】石川 友紀

(72)【発明者】

【氏名】足立 真樹

(72)【発明者】

【氏名】郭 子進

(72)【発明者】

【氏名】中井 久美子

(72)【発明者】

【氏名】大野 博司

【審査官】 大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０８４４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３２７５４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１９７３３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１３７８６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２００３−００８９９６７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 ○中野 信浩，本庄 明日香，西山 千春，大塚 宜一，清水 俊明，奥村 康，小川 秀興，４Ｅ０８５ Ｎｏｔｃｈシグナル阻害による食物アレルギーの症状の軽減，Annual Meeting of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, 2016 大会講演要旨集，公益社団法人日本農芸化学会 JSBBA，２０１６年 ３月 ５日

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ１２Ｎ、Ａ２３Ｌ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆからなる群から選ばれるしょうゆを有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。

【請求項2】

前記組成物は、インターロイキン−３及びインターロイキン−１０の存在下で、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用を有する組成物である、請求項１に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、粘膜型マスト細胞への分化を抑制するための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

マスト細胞（Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌｓ；ＭＣｓ；肥満細胞）は、造血系幹細胞に由来する血球系細胞の一種であり、マクロファージや樹状細胞などのその他の免疫細胞と同様に生体内の様々な組織に分布している。マスト細胞は、各組織において、マスト細胞前駆体（ＭＣＰ）から誘導されるが、各組織においてみられるマスト細胞の表現型は異なる。これは、マスト細胞が多様性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を有しているからである（例えば、非特許文献１を参照）。

【0003】

マスト細胞は、多様性を有していることにより、同一の組織又は培養容器内においてさえ、同一の刺激に対して相違する反応を示し得る。換言すれば、同一の表現型を有するマスト細胞を得ることは非常に難しい。かかる状況下において、非特許文献１には、Ｔ細胞由来のサイトカインの一種であるインターロイキン（ＩＬ）−３の存在下で、骨髄中のＭＣＰを培養することにより、骨髄由来型マスト細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＣ；ＢＭＭＣ）が得られることが記載されている。ＢＭＭＣは、異質性があり、かつ、未成熟であり、さらに表現型が様々な培養添加物により変化し得る細胞である。例えば、ＢＭＭＣを線維芽細胞と共培養することにより、成熟したマスト細胞の一種である結合組織型マスト細胞の表現型を示す。

【0004】

成熟したマスト細胞の一種として、粘膜型マスト細胞（ｍｕｃｏｓａｌ ＭＣｓ）がある。結合組織型マスト細胞が皮膚や血管内に局在化するのに対して、粘膜型マスト細胞は、生体内の粘膜組織に局在しており、ＩｇＥに対して高い親和性のあるＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩα）を細胞表面に発現している。マウスにおいては、粘膜型マスト細胞は、ＭＭＣＰ−１などのキマーゼを発現する。このＦｃεＲＩαに、アレルゲンとＩｇＥとが免疫複合体を形成して架橋することにより、様々な応答が引き起こされる。そのような応答の結果にもたらされるものとして、例えば、腸内組織における粘膜型マスト細胞が関与する食物アレルギーがある。食物アレルギーは、食物に由来する物質がアレルゲンとなり、ＩｇＥと免疫複合体を形成して、ＦｃεＲＩαと架橋することにより、腸内組織における粘膜型マスト細胞が活性化することにより発症する。

【0005】

粘膜型マスト細胞の活性化は、ヒスタミン、エフェクタープロテアーゼ、ヘパリンなどの炎症性メディエータを遊離する脱顆粒、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−３及びケモカインなどの炎症性サイトカインの産生、血小板活性化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエンなどの脂質メディエータの産生などをもたらし、生体におけるアレルギー反応を惹起する（非特許文献２を参照）。

【0006】

一方、発酵食品の代表的なものとして、しょうゆがある。大部分のしょうゆは、大豆や小麦などの麦を原料として麹菌などにより発酵及び熟成させて得られる。特許文献１には、しょうゆに含まれる高分子多糖類の中には、マクロファージの活性化作用及びＰＣＡ反応抑制作用を示すものがあることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１３−１２４２４７号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】TC Moon, et al., MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128

【非特許文献2】SJ Galli and M Tsai, Nature Medicine, Vol. 18, No. 5, (2012), p. 693-704

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記のとおり、粘膜型マスト細胞は、腸管などの粘膜組織に局在化し、アレルゲンが粘膜組織に到達することによるアレルギーの発症に関与し得る。そこで、粘膜組織を介したアレルギーを抑制するためには、異常に増加した粘膜型マスト細胞の割合を減少させることが肝要である。また、アレルギーを発症していなくとも、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することもまた肝要である。

【0010】

特に、粘膜組織を介したアレルギーとしては、食物を摂取することにより発症する食物アレルギーがある。そこで、食物アレルギーを誘起する食物性アレルゲンと同時的かつ日常的に摂取することにより、粘膜型マスト細胞の異常増加を抑制し、かつ、粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することにより、アレルギー疾患になりにくい体質作りに貢献できれば、食物アレルギーの罹患者の健康や福祉に資することができ、有益である。しかし、非特許文献１及び２並びに特許文献１を含めて、日常の食事の際に摂取することができ、かつ、粘膜型マスト細胞への分化を抑制して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させ得るものはこれまでに知られていない。

【0011】

そこで、本発明が解決しようとする課題は、食事の用に供することができ、かつ、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることができる組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

大豆の発酵物及び麦の発酵物において、大豆アレルゲン及び麦アレルゲンは発酵を通じて大幅に減少していることがＥＬＩＳＡ法などにより確認されている。したがって、大豆アレルゲンや麦アレルゲンに敏感に応答する個体において、発酵を通じて大豆アレルゲンや麦アレルゲンが分解した大豆の発酵物及び麦の発酵物を摂取したとしても、アレルギーの症状が見られる可能性が低いと考えられる。

【0013】

本発明者らは鋭意研究を積み重ねた結果、大豆の発酵物や麦の発酵物を含むしょうゆなどの発酵食品は、該発酵食品の後に摂取した小麦アレルゲンに対する免疫寛容がみられ、さらにアレルギーの発症を低めること、すなわち、アレルギーの発症に抑制的に作用し得ることを見出した。そして、さらに鋭意研究を進めていくうちに、粘膜型マスト細胞に着目するに至り、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を創作することを試みた。

【0014】

その結果、ＢＭＭＣと同様の性質を有する未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させることにより安定的に粘膜型マスト細胞の割合を高め得ることを見出した。この知見を基に製造された粘膜型マスト細胞を用いて検討を重ねた結果、発酵食品に含まれる大豆の発酵物及び麦の発酵物は、未成熟細胞から粘膜型マスト細胞への異常な分化を抑制することや粘膜型マスト細胞の割合を正常な値に維持することを通じて、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を減少させることにより、大豆アレルゲンや小麦アレルゲンなどの食物性アレルゲンが作用する細胞の数を減じることができ、アレルギーに対して抑制的に作用する可能性があることを見出した。

【0015】

そして、これらの知見を基に、本発明者らは、大豆の発酵物及び麦の発酵物を利用した、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。

【0016】

したがって、本発明の各一態様によれば、以下のものが提供される：
［１］大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［２］前記組成物は、しゅうゆ又はみそである、［１］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［３］前記しょうゆは、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆからなる群から選ばれるしょうゆである、［２］に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［４］前記組成物は、インターロイキン−３及びインターロイキン−１０の存在下で、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用を有する組成物である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物。
［５］［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物。
［６］前記抗アレルギー用組成物は、食物アレルギーを発症している者又は該食物アレルギーを発症する可能性がある者に摂取される抗アレルギー用組成物である、［５］に記載の抗アレルギー用組成物。
［７］前記抗アレルギー用組成物は、食物性アレルゲンを含有する食品と併用される抗アレルギー用組成物である、［５］又は［６］に記載の抗アレルギー用組成物。
［８］前記抗アレルギー用組成物は、粘膜組織を介するアレルギーを対象とする抗アレルギー用組成物である、［５］〜［７］のいずれか１項に記載の抗アレルギー用組成物。

【発明の効果】

【0017】

本発明の一態様である組成物は、有効成分による粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、粘膜性のアレルギーや該アレルギーと関連する炎症、例えば、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群、口内炎などによる症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療若しくは予防すること、又は免疫療法の用に供することが期待できる。

【0018】

特に、食物アレルギーの発症者にとって、アレルゲン除去食品の摂取は該発症者やその周囲の者にとって負担が甚大である。そこで、アレルギーを抑制する作用を示し得る本発明の一態様である組成物によれば、他の飲食品と併用することにより、食物アレルギーに関連する症状を減弱することが期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】図１Ａは、後述する実施例に記載があるとおり、ＩＬ−３添加及びＩＬ−１０添加による、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）の分化誘導の結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を示す図である。

【図1B】図１Ｂは、後述する実施例に記載があるとおり、ＩＬ−３添加及びＩＬ−１０添加による、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の分化誘導の結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の数を示す図である。

【図1C】図１Ｃは、後述する実施例に記載があるとおり、ＩＬ−３添加及びＩＬ−１０添加による、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の分化誘導の結果としてのＭＣ／９細胞及びＭＭＣＰ−１陽性細胞の総数を示す図である。

【図2A】図２Ａは、後述する実施例に記載があるとおり、抗ＩＬ−１０受容体抗体の添加による、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の分化誘導阻害の結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を示す図である。

【図2B】図２Ｂは、後述する実施例に記載があるとおり、抗ＩＬ−１０受容体抗体の添加による、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の分化誘導阻害の結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の数を示す図である。

【図2C】図２Ｃは、後述する実施例に記載があるとおり、抗ＩＬ−１０受容体抗体の添加による、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の分化誘導阻害の結果としてのＭＣ／９細胞及びＭＭＣＰ−１陽性細胞の総数を示す図である。

【図3A】図３Ａは、後述する実施例に記載があるとおり、脱塩しょうゆによる、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化抑制効果を検証した結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を示す図である。

【図3B】図３Ｂは、後述する実施例に記載があるとおり、脱塩しょうゆの添加による、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化抑制効果を検証した結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の数を示す図である。

【図3C】図３Ｃは、後述する実施例に記載があるとおり、脱塩しょうゆの添加による、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化抑制効果を検証した結果としてのＭＣ／９細胞及びＭＭＣＰ−１陽性細胞の総数を示す図である。

【図4】図４は、後述する実施例に記載があるとおり、しょうゆ５種及びモデルしょうゆ（成分合成しょうゆ）による、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化抑制効果を検証した結果としてのＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物及び抗アレルギー用組成物（以下、これらをまとめて本発明の一態様の組成物と総称する場合がある。）の詳細並びに本発明の一態様である粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

【0021】

本発明の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物である。

【0022】

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。

【0023】

例えば、分化とは、一般的に、特性をもたない細胞が様々な特性を持つ細胞に変化することをいうところ、本明細書における「分化」は、ある特性を有する細胞が別の特性を有する細胞に転じることを広く意味することに加え、一般に分化細胞として知られている２種の細胞の間での、可逆的又は不可逆的な相互の転換をも含む、より広範な概念として用いられ得る。本明細書における「分化を抑制する」とは、分化することを妨げることに加えて、分化前の状態に維持すること、分化後の状態を分化前の状態に戻すことなどを含み得る。また、本明細書における「分化を誘導する」とは、分化を引き起こすことに加えて、分化することを妨げないことなどを含み得る。

【0024】

例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形物又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。

【0025】

粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物は、含有する有効成分が機能することにより、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を示す。

【0026】

大豆の発酵物は、通常知られているとおりに、大豆に微生物を作用させて大豆中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。同様に、麦の発酵物は、通常知られているとおりに、小麦、大麦、裸麦、はと麦などの麦に微生物を作用させて麦中の物質を分解及び／又は変換することなどにより得られる発酵物であれば特に限定されない。

【0027】

本発明の一態様の組成物は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、しょうゆ、みそ及びこれらを含有する飲食品やこれらを用いて調理や加工された飲食品などが挙げられ、調理の際や他の食材や食品とともに用いられるしょうゆ及びみそであることが好ましい。

【0028】

しょうゆやみそは、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、農林水産省により示されている「しょうゆ品質表示基準」や「みそ品質表示基準」において定義付けされているものを挙げることができる。

【0029】

しょうゆの具体例としては、例えば、こいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ、しろしょうゆ、だししょうゆ、照りしょうゆ、生揚げしょうゆなどが挙げられ、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用の強度の観点からこいくちしょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、さいしこみしょうゆ及びしろしょうゆが好ましいが、これらに限定されない。しょうゆは、上記の例示したしょうゆなどをさらなる加工処理に供したものであってもよい。このような加工処理は特に限定されないが、例えば、脱塩処理や希釈処理などが挙げられる。また、しょうゆは、しょうゆ中の特定の成分を減少若しくは排除又はしょうゆに特定の成分を追加する意図をもって製造したしょうゆであってもよく、例えば、無塩下又は減塩下で製造したしょうゆ、トマトなどの野菜成分を追加するように製造したしょうゆなどが挙げられる。しょうゆは、これらのうちの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。

【0030】

大豆の発酵物、麦の発酵物及びこれらを含有する組成物は、その入手方法について特に限定されず、例えば、市販されているものや当業者により通常知られている手法により製造したものなどを利用することができる。例えば、しょうゆは、本願出願人であるキッコーマン社から市販されているものを挙げることができ、具体的には「キッコーマン しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆しょうゆ」、「キッコーマン 特選丸大豆減塩しょうゆ」、「キッコーマン 減塩しょうゆ」、「キッコーマン 特選有機しょうゆ」、「キッコーマン うすくちしょうゆ」などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を低め得る作用であれば、その作用機序、合わせて伴う他の作用、程度などについては特に限定されない。粘膜型マスト細胞への分化抑制作用としては特に限定されないが、例えば、非粘膜型マスト細胞の増殖に適した条件下や非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化に適した条件下における、非粘膜型マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用が挙げられる。

【0032】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、例えば、後述する本発明の粘膜型マスト細胞への分化誘導方法において、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用であることが好ましい。未成熟マスト細胞株の具体的な例としては、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株などが挙げられ、より具体的な例としてはマウスの肝臓に由来するマスト細胞を株化したＭＣ／９細胞などが挙げられる。

【0033】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。

【0034】

粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。

【0035】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第１の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びにＭＭＣＰ−１について標識化した粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。

【0036】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用を評価する具体的な第２の評価系は、ＩＬ−３及びＩＬ−１０の存在下で、ＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基にＭＭＣＰ−１遺伝子の発現量を測定することを含む方法である。

【0037】

第１及び第２の評価系におけるＭＣ／９細胞と本発明の一態様の組成物とを共培養させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−３及びＩＬ−１０が失活せず、かつ、ＭＣ／９細胞が死滅しないような条件を挙げることができ、マスト細胞の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ_２濃度、ｐＨなどを採用した培養条件であることが好ましい。この際、ＩＬ−３及びＩＬ−１０に加えて、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、マスト細胞が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、細胞培養に通常用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。

【0038】

粘膜型マスト細胞への分化抑制作用は、その程度について特に限定されないが、例えば、上記の第１の評価系により、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、ＭＭＣＰ−１が陽性である粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）の割合を低める作用であり、好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．９倍以下に低める作用であり、より好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．８倍以下に低める作用であり、さらに好ましくはＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合を０．７倍以下に低める作用である。

【0039】

本発明の別の一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は粘膜型マスト細胞への分化抑制用組成物を有効成分として含有する、抗アレルギー用組成物である。

【0040】

抗アレルギー用組成物は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されず、例えば、アレルギーの症状、アレルギーと関連した疾患の症状及び自己免疫症状などを改善、緩和、抑制、治療若しくは予防するための、又は免疫療法の用に供するための組成物であり得る。

【0041】

抗アレルギー用組成物は、消化器官系、例えば、腸、胃、鼻腔、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物アレルギー、花粉症、胃炎、腸炎、下痢、潰瘍性大腸炎、鼻炎、気管支炎、気管支喘息、レフレル症候群及び口内炎を対象とするものであることがより好ましい。しょうゆやみそなどの発酵食品は食物性アレルゲンを含む食材や食品とともに摂取する頻度が高いことから、食物アレルギーを対象とするものであることが好ましく、食物性アレルゲンが接触する可能性がある腸、胃、咽頭、口腔などの器官における粘膜組織を介するアレルギーを対象とするものであることがより好ましい。

【0042】

免疫応答のメカニズムは未解明な部分が多く、本発明の技術的範囲はいかなる理論や推測にも拘泥されるものではないが、抗アレルギー用組成物は、例えば、適用した被験体において、粘膜型マスト細胞の割合を低下させることにより、粘膜型マスト細胞が活性化することによる脱顆粒、炎症性サイトカインの産生、脂質メディエータの産生などのいずれかの生理的現象の程度を減弱することができ、これにより抗アレルギー作用を発揮し得る。

【0043】

抗アレルギー作用は、その評価方法について特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の方法を特に限定せずに挙げることができ、具体的には適用した被験体におけるアレルギーの症状の程度を測定すること、粘膜型マスト細胞から遊離した、又は産生された生理活性物質を測定すること、粘膜型マスト細胞の割合や数を測定することなどにより評価する方法が挙げられる。

【0044】

本発明の一態様の組成物の適用対象は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。適用対象は、健常な対象であってもよいが、アレルギーの治療又は予防が望まれる対象であることが好ましい。

【0045】

アレルギーの治療又は予防が望まれる対象としては、例えば、粘膜組織を介したアレルギーに罹患している者又はその可能性がある者が挙げられ、小麦アレルギーや大豆アレルギーなどの食物アレルギーを発症している者及び該食物アレルギーを発症する可能性がある者であることが好ましい。

【0046】

本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用を有することから、例えば、食物アレルギーを引き起こす可能性がある食物性アレルゲンを含有する食材や食品と併用することができる。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品としては特に限定されないが、例えば、大豆、小麦などの麦などの食物性アレルゲンを含有する食品が好ましい。本発明の一態様の組成物と併用される食材や食品は、本発明の一態様の組成物と同時的に、又はこれと前後して摂取され得る。

【0047】

本発明の一態様の組成物は、その適用方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞への分化抑制作用及び抗アレルギー作用が用量依存傾向にあることから、それらの適用量は年齢、体格、症状などの適用対象の特性；適用方法；適用部位などに合わせて適宜設定することができる。具体的には、本発明の一態様の組成物がしょうゆ又はしょうゆ含有食品である場合、本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、０．１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日であるが、これに限定されない。摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１〜３回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。

【0049】

本発明の一態様の組成物は、これを経口的に摂取することにより、経口免疫寛容が誘導又は増強される場合がある。その結果として、経口免疫寛容により、例えば、食物アレルギーなどのアレルギー症状や自己免疫症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが可能となる。

【0050】

また、本発明の一態様の組成物は、粘膜型マスト細胞により産生される炎症性サイトカインや炎症性メディエータなどの生理活性物質が関与する、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病などの症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。

【0051】

本発明の一態様の組成物は、それらを単独で、又はそれらを配合する飲食品組成物や医薬品組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、大豆の発酵物及び麦の発酵物を有効成分として含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品組成物、医薬品組成物、医薬部外品組成物、化粧品組成物、動物飼料組成物などである。

【0052】

本発明の一態様の組成物が飲食品組成物である場合は、本発明の目的を達成し得る限り、食経験のある、天然物及び非天然物並びにこれらの含有物を配合してもよい。例えば、飲食品組成物には、抗アレルギー効果や経口免疫寛容増強効果が知られている、フラボノイド、ゲニステイン、ゲニスチンなどを含む豆乳；醤油などに含まれる大豆発酵多糖類；ビタミンＣなどのビタミン類などを配合することが好ましい。

【0053】

飲食品組成物に含有してもよい他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物を挙げることができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。

【0054】

飲食品組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。

【0055】

飲食品組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。

【0056】

飲食品組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。

【0057】

本発明の一態様の組成物が医薬品組成物である場合は、適用後に少なくとも粘膜型マスト細胞への分化抑制作用が発揮し、それに伴いアレルギーの症状やアレルギーに関連のある疾患の症状を治療又は予防し得る限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。医薬品組成物には、本発明の目的を達成し得る限り、特許文献１に記載されている有効成分などの他の粘膜型マスト細胞への分化抑制作用又は抗アレルギー作用を有する生理活性物質を配合することができる。このような生理活性物質の他の具体例としては、抗ＩＬ−１０受容体抗体、ＩＬ−１０アナログ、ＩＬ−１０受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−１０との複合体形成物質、抗ＩＬ−３受容体抗体、ＩＬ−３アナログ、ＩＬ−３受容体拮抗阻害剤、ＩＬ−３との複合体形成物質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

医薬品組成物には、有効成分以外に様々な目的に対するその他の成分を含めてもよく、このようなその他の成分としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。

【0059】

医薬品組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品組成物は、食物アレルギーなどのアレルギー疾患を治療するためのワクチンとして調製することができる。医薬品組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。

【0060】

粘膜型マスト細胞を安定的かつ効率的に誘導して、細胞あたりの粘膜型マスト細胞の割合を増加させる方法についてはこれまでに知られていなかったが、本発明者らは方法を構築することに成功した。本明細書にて、本発明者らが見出した粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法を述べる。

【0061】

粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法である。粘膜型マスト細胞の製造方法は、未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０とを、又は未成熟マスト細胞株とインターロイキン−１０及びインターロイキン−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を含む製造方法である。

【0062】

いずれの方法においても、ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、それぞれ通常知られているとおりのサイトカインであれば特に限定されない。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その入手方法について特に限定されないが、例えば、市販されているものを利用することやＴ細胞やＢ細胞などのＩＬ−３やＩＬ−１０を分泌する細胞から得た培養上清などを常法に従って分離精製することなどによって入手することできる。ＩＬ−３及びＩＬ−１０は、その由来生物種については特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類が挙げられるが、高度な分化誘導活性が認められるために、マスト細胞と同一の由来生物種であることが好ましい。

【0063】

いずれの方法においても、未成熟マスト細胞株は、通常知られているとおりの骨髄その他の組織に由来するマスト細胞であれば特に限定されないが、例えば、異質性があり、かつ、表現型が粘膜型マスト細胞だけではなく、結合組織型マスト細胞にもなり得るマスト細胞株であることが好ましい。未成熟マスト細胞株は、マスト細胞が特異的に発現するタンパク質を発現するものがより好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔからなる群から選ばれるタンパク質を発現するものがさらに好ましく、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔの両方を発現するものがなおさらに好ましい。また、前記未成熟マスト細胞株は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現し、かつ、ＭＭＣＰ−１、ＭＭＣＰ−２、ＭＭＣＰ−３、ＭＭＣＰ−４、ＭＭＣＰ−５、ＭＭＣＰ−６及びカルボキシペプチダーゼＡを実質的に発現しない未成熟マスト細胞株であることが好ましい。

【0064】

未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現する少なくともいずれか１種のタンパク質の発現が陰性であると評価することによって、粘膜型マスト細胞と区別し得る。例えば、マウスにおいては、未成熟マスト細胞株は、粘膜型マスト細胞が発現するキマーゼの１種であるＭＭＣＰ（Ｍｏｕｓｅ Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）−１の発現については陰性と評価される。したがって、粘膜型マスト細胞への分化誘導方法は、例えば、マウスの系においては、ＭＭＣＰ−１陰性であると評価される未成熟マスト細胞株からＭＭＣＰ−１陽性であると評価される粘膜型マスト細胞への分化を誘導する工程を少なくとも含む方法と表すことができる。

【0065】

未成熟マスト細胞株は、その入手方法については特に限定されず、例えば、TC Moon, et al（MucosalImmunology, Vol. 3, No. 2, (2010), pp.111-128）に記載されているとおりに、ＩＬ−３の存在下又は非存在下で、骨髄中のマスト細胞前駆体やその他の組織に存在するマスト細胞を株化することにより、取得することができる。未成熟マスト細胞株の具体例としては、マウスの肝臓に由来するマスト細胞株であるＭＣ／９細胞などが挙げられるが、これに限定されない。

【0066】

粘膜型マスト細胞への分化誘導方法及び粘膜型マスト細胞の製造方法では、ＩＬ−１０と、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３と未成熟マスト細胞株とを接触させることを含む。いずれの方法においても、これらサイトカインと未成熟マスト細胞株とを接触させる条件は特に限定されず、例えば、ＩＬ−１０及びＩＬ−３が失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような条件を挙げることができ、未成熟マスト細胞株の維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ_２濃度、ｐＨなどの培養条件であることが好ましい。

【0067】

未成熟マスト細胞株の細胞数並びにＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は特に限定されない。未成熟マスト細胞株の細胞数は、例えば、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養する際に用いられる細胞数が挙げられ、培養容器の材質や形状によって適宜設定することができるが、より具体的には１０^３〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であり、１０^４〜１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌであることが好ましい。ＩＬ−１０及びＩＬ−３の添加量は、例えば、通常細胞に対して活性を示し得るとされている範囲の量が挙げられ、未成熟マスト細胞株の細胞数によって適宜設定することができるが、より具体的には０．１ｎｇ／ｍｌ〜５，０００ｎｇ／ｍｌであり、１〜１，０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、１０〜３００ｎｇ／ｍｌであることがより好ましく、２０〜２００ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。

【0068】

ＩＬ−３を用いる場合、ＩＬ−３の使用方法については特に限定されず、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを接触させるときと同時に、又はそのときに前後して、未成熟マスト細胞株と接触させる方法が挙げられるが、ＩＬ−３はＩＬ−１０と同時に未成熟マスト細胞株に接触させることが好ましい。

【0069】

未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとの接触時間は特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞の存在が確認できる時間などが挙げられるが、未成熟マスト細胞株の培養時間に相当する２〜４日間程度が好ましい。その他の接触条件は、通常の細胞培養に適した条件であれば特に限定されないが、静置培養であることが好ましい。

【0070】

未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させる際に、他の成分が系内に存在していてもよい。他の成分は、サイトカインが失活せず、かつ、未成熟マスト細胞株が死滅しないような成分であれば特に限定されないが、例えば、通常細胞培養に用いる成分が挙げられ、より具体的には２−メルカプトエタノールなどの還元剤、血清やＬ−グルタミンなどの細胞増殖に適した栄養成分、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＩＬ−２といったサイトカインなどの生理活性物質などが挙げられる。他の成分の使用量は、本発明の目的を達成し得る範囲内において、適宜設定することができる。

【0071】

未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０及びＩＬ−３といったサイトカインとを接触させることにより、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞を分化誘導できる。粘膜型マスト細胞への分化誘導作用は、未成熟マスト細胞株から粘膜型マスト細胞への分化を誘導する作用であって、結果として粘膜型マスト細胞の割合を高め得る作用であれば、その作用機序や合わせて伴う他の作用などについては特に限定されない。

【0072】

粘膜型マスト細胞への分化誘導は、その評価方法について特に限定されず、例えば、粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定すること、粘膜型マスト細胞が細胞内外に発現するマーカー分子（タンパク質）を測定すること、粘膜型マスト細胞の数や割合を測定することなどにより評価することができる。例えば、粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質について、標識化抗体を用いて細胞内標識をし、次いで標識した細胞の数及び割合を測定することにより評価することができる。

【0073】

粘膜型マスト細胞が細胞内に特異的に発現するタンパク質は、例えば、マウスの系ではＭＭＣＰ−１及びＭＭＣＰ−２などが挙げられる。

【0074】

粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養した細胞の量及び割合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）並びに細胞内標識又は細胞外標識した粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定することを含む方法である。粘膜型マスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、例えば、フローサイトメトリーなどの方法、ＥＬＩＳＡやラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの抗原抗体反応を利用する方法などにより測定することができるが、特に限定されない。

【0075】

粘膜型マスト細胞への分化誘導方法の別の具体的な一態様として、例えば、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを共培養し、次いで培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、次いで抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを得て、次いで得られたｃＤＮＡライブラリーを基に粘膜型マスト細胞が特異的に発現する遺伝子の発現量を測定することを含む方法が挙げられる。

【0076】

粘膜型マスト細胞への分化誘導方法を応用した方法の一つとしては、本発明の別の一態様である、未成熟マスト細胞株とＩＬ−１０とを、又はＩＬ−１０及びＩＬ−３とを接触させることにより、粘膜型マスト細胞を得る工程を少なくとも含む、粘膜型マスト細胞の製造方法が挙げられる。

【0077】

粘膜型マスト細胞の製造方法により製造される粘膜型マスト細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用が考えられる。例えば、製造された粘膜型マスト細胞を被験体の粘膜組織に適用することにより、被験体の寄生虫感染防御やその他の粘膜感染症の症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することが期待できる。

【0078】

本発明の一態様である方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。また、工程内及び工程間は、連続的又は断続的に実施することができる。

【0079】

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

【実施例】

【0080】

［実施例１］
マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞を用いて、粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）を以下のとおりに誘導した。

【0081】

マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９細胞を粘膜型へ分化させることを目的に、下記の実験を実施した。

【0082】

１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）

【0083】

２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。

【0084】

３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。

【0085】

４．抗ＩＬ−１０受容体抗体（αＩＬ−１０Ｒ抗体）溶液の調製
Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ２１０（ＩＬ−１０Ｒ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（５００μＭ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を、それぞれ１２、１２０及び１２００ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈することにより、αＩＬ−１０Ｒ抗体を調製した。

【0086】

５．培養方法
表１の例１〜１０が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。

【0087】

【表1】

【0088】

６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。

【0089】

次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳ^ＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。

【0090】

７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、例１〜７の結果をまとめたものを図１に示し、例２、例６及び例８〜１０の結果をまとめたものを図２に示す。

【0091】

（１）例１〜７の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図１Ａが示すとおり、ＩＬ−３添加条件と比較して、ＩＬ−１０添加条件では、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の顕著な増加が見られた。また、図１Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、これらの比較から、ＩＬ−１０を添加することにより増加傾向を示すことがわかった。

【0092】

総細胞数については、図１Ｃが示すとおり、サイトカイン非添加条件においては、十分な細胞の増殖が見られなかった。また、ＩＬ−３及びＩＬ−１０を独立して添加した際には、それぞれ細胞数が増加することが確認されたが、これらの間の増加の程度については、大きな差異はなかった。

【0093】

ＩＬ−３添加条件とＩＬ−１０添加条件との比較から、ＭＭＣＰ−１陽性細胞はＩＬ−１０依存的に分化誘導することが確認された。

【0094】

一方、ＩＬ−３とＩＬ−１０とを同時に添加した条件下においては、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が増加することが確認された（図１Ａを参照）。しかし、その増加の程度は、ＩＬ−１０を単独で添加した条件と比較して、顕著に大きいというものではなかった。一方、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数及び総細胞数については、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比べて、相乗的に顕著に増加することが確認された（図１Ｂ及び図１Ｃを参照）。

【0095】

図１の結果より、ＩＬ−１０は濃度依存的にＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認された。

【0096】

（２）例２、例６及び例８〜１０の結果（図２Ａ〜Ｃ）
抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することでマスト細胞が発現するＩＬ−１０受容体をブロックし、ＩＬ−１０シグナルを阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の誘導がどのような影響を受けるかについて評価した。

【0097】

図２Ａ及び図２Ｂに示すとおり、ＩＬ−３添加条件及びＩＬ−１０添加条件と比較して、抗ＩＬ−１０受容体（ａＩＬ−１０Ｒ）抗体を添加する条件では、濃度依存的なＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数の顕著な減少が確認された。しかし、図２Ｃが示すとおり、全細胞数は、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより若干減少したものの、その程度はＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少の程度と比較すると非常に小さかった。すなわち、抗ＩＬ−１０受容体抗体を添加することにより、総細胞数に与える影響は小さいながらも、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の数及び割合を格別顕著に減少した。

【0098】

図２の結果より、ＩＬ−１０はＭＣ／９細胞からＭＭＣＰ−１陽性細胞を分化誘導する作用があることが確認されたとともに、ＩＬ−１０とＩＬ−１０受容体との結合を阻害することにより、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合及び数を減じることができることがわかった。

【0099】

［実施例２］
しょうゆが粘膜型マスト細胞の分化を抑制する効果を有することについて、複数の市販しょうゆ及びモデルしょうゆを用いて、以下のとおりに評価した。

【0100】

マウスの粘膜型マスト細胞は、マスト細胞の表面マーカー分子であるＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現すると同時に、細胞内にＭＭＣＰ−１というプロテアーゼを発現する。マウスマスト細胞株であるＭＣ／９は、ＦｃεＲＩα及びｃ−Ｋｉｔを発現しているが、粘膜型のマーカーであるＭＭＣＰ−１を発現していない。そこで、ＭＣ／９から粘膜型マスト細胞（ＭＭＣＰ−１陽性細胞）への分化を利用して、しょうゆによる分化抑制効果について、下記の実験を実施した。

【0101】

１．細胞培養のための培地の調製
ＳＩＧＭＡ社製Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に、下記の終濃度になるように試薬を添加して、培地を調製した。
１０％（ｗ／ｖ） ＦＢＳ
１％（ｗ／ｖ） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
０．０５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１０％（ｗ／ｖ） Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）

【0102】

２．ＭＣ／９細胞懸濁液の調製
ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８３０６）凍結ストックを培地に添加し、週に２回程度培地を交換しながら培養した。５継代（Ｐ５）の時点で３×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのワーキングストックを作成した。ワーキングストックを培地に添加し、培養後週に２回程度で継代しながら培養することにより、Ｐ９以降の細胞を回収した。回収した細胞について、培地で１回洗浄した後、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し血球計算板を用いて細胞数を計測した。その後、２×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培地に懸濁することにより、ＭＣ／９細胞懸濁液を調製した。

【0103】

３．サイトカイン溶液の調製
ｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−３（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びｍｏｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＬ−１０（１００μＭ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、それぞれ１２０ｎｇ／ｍｌとなるように培地で希釈して、ＩＬ−３溶液及びＩＬ−１０溶液を調製した。

【0104】

４．被験しょうゆ試料の調製
被験しょうゆ試料として、下記の市販しょうゆ及びモデルしょうゆについて、しょうゆ原液の濃度を１として、培地を用いて６０倍、１２０倍、２４０倍、４８０倍又は９６０倍に希釈して試験に供した。
市販しょうゆ：こいくちしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ、うすくちしょうゆ、たまりしょうゆ、脱塩しょうゆ（特選丸大豆しょうゆを脱塩処理したもの）（以上、すべてキッコーマン社製）
モデルしょうゆ：たまりしょうゆ（キッコーマン社製）に含まれる成分のうち、酸、食塩、アルコール及びアミノ酸を、たまりしょうゆに含まれる濃度で配合して調製したもの

【0105】

５．培養方法
表１及び表２の例１〜２８が示すとおりに、９６ウェル平底プレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、内容物が所定の最終濃度になるように上記溶液及び培地を添加して、初発細胞数を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして３日間培養した。ただし、上記培地として、Ｒａｔ Ｔ−ＳＴＩＭを含有しない培地を用いた。

【0106】

【表2】

【0107】

【表3】

【0108】

６．細胞数計測のためのＦＡＣＳＡｒｉａ解析
培養後に回収した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した後、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＦｃεＲＩα（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）及びＰＥ／ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）と反応させた。次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させた。

【0109】

次いで、反応後の細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄した後、ＩＣバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。次いで、固定化した細胞を、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＭＭＣＰ−１抗体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＭＣＰＴ−１（ｍＭＣＰ−１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて標識したもの）と反応させ細胞内標識を行った。次いで、標識した細胞を、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、さらに同バッファー２００μＬに懸濁した後、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて解析した。解析の際、特定量のＢＤ ＦＡＣＳ^ＴＭ Ａｃｃｕｄｒｏｐ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を既知体積のサンプルに加え、細胞とともにビーズを計測した。ビーズ量とビーズの取り込み数、生細胞の取り込み数から全細胞数を算出した。さらに全細胞数とＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合とから、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数を算出した。

【0110】

７．細胞数解析結果
ＦＡＣＳＡｒｉａ解析の結果について、表１に示す例１〜８の結果をまとめたものを図１に示し、表２に示す例９〜２８の結果をまとめたものを図２に示す。

【0111】

（１）例１〜８の結果（図１Ａ〜Ｃ）
図３Ａが示すとおり、ＩＬ−１０のみを添加した場合やＩＬ−３及びＩＬ−１０を添加した場合と比較して、脱塩しょうゆを添加した場合では、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。同様に、図３Ｂが示すとおり、ＭＭＣＰ−１陽性細胞数についても、濃度依存的にＭＭＣＰ−１陽性細胞数が減少する傾向にあることを確認した。一方で、図３Ｃが示すとおり、総細胞数については、このような傾向は見られなかった。

【0112】

図３の結果より、しょうゆには、細胞の生存率については影響を与えずにして、濃度依存的にＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。

【0113】

（２）例９〜２８の結果（図２）
図４に示すとおり、サイトカインのみを添加した場合と比較して、サイトカインに加えて、脱塩しょうゆ、こいくちしょうゆ、たまりしょうゆ、特選丸大豆しょうゆ又はうすくちしょうゆを加えた場合は、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合が減少した。しかし、しょうゆを製造する際の発酵工程によって主として得られるペプチドやタンパク質を含まないモデルしょうゆでは、ＭＭＣＰ−１陽性細胞の割合の減少はみられなかった。

【0114】

図４の結果より、しょうゆのような発酵食品は、ＭＣ／９細胞からのＭＭＣＰ−１陽性細胞への分化を抑制する作用があることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0115】

本発明の一態様の組成物は、未成熟マスト細胞から粘膜型マスト細胞への分化を抑制する作用及び抗アレルギー作用を通じて、健常者に加えて、粘膜型マスト細胞の割合の増加に関連した疾患や症状を改善、緩和、抑制、治療又は予防することを期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資するものとして利用可能なものである。また、本明細書で開示される方法は、未成熟マスト細胞株を安定的に粘膜型マスト細胞へ誘導することができることから、粘膜型マスト細胞の割合を高める目的や、粘膜型マスト細胞の機序を評価する目的において利用可能である。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】