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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6844890
(24)【登録日】2021年3月1日
(45)【発行日】2021年3月17日
(54)【発明の名称】採血管、試薬及びそれらを利用した血液性状分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/86 20060101AFI20210308BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20210308BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20210308BHJP
【ＦＩ】
G01N33/86
G01N33/48 K
G01N37/00 101
【請求項の数】17
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2017-560446(P2017-560446)
(86)(22)【出願日】2017年1月6日
(86)【国際出願番号】JP2017000335
(87)【国際公開番号】WO2017119508
(87)【国際公開日】20170713
【審査請求日】2019年10月25日
(31)【優先権主張番号】特願2016-2012(P2016-2012)
(32)【優先日】2016年1月7日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2016-39240(P2016-39240)
(32)【優先日】2016年3月1日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000224101
【氏名又は名称】藤森工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100126505
【弁理士】
【氏名又は名称】佐貫 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100131392
【弁理士】
【氏名又は名称】丹羽 武司
(72)【発明者】
【氏名】細川 和也
(72)【発明者】
【氏名】和田 朋子
(72)【発明者】
【氏名】金子 寿代
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 喬彬
(72)【発明者】
【氏名】永里 朋香
【審査官】
三好 貴大
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１５／１５６３２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２０１４／０２２０５５２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開２０００−０８３９３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１５−０５２０１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１５−５０９９２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／０６９６５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１０／０１８８３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００７／０４６４５０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブチルゴム製ゴム栓を有し、内部にクエン酸ナトリウムを含有する採血管で採血された血液を用い、該血液にカルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン
阻害剤ならびにへパリンまたはヘパラン硫酸を添加して血液凝固反応を開始させることを特徴とする、血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
阻害剤ならびにへパリンまたはヘパラン硫酸を添加して血液凝固反応を開始させることを特徴とする、血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項2】
FXII阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）である、請求項１に記載の血栓
形成能または血液凝固能の分析方法。
形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項3】
CTIの濃度が５〜２００μg／ｍＬである、請求項２に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項4】
カリクレイン阻害剤がアプロチニンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項5】
アプロチニンの濃度が１〜１００μｇ／ｍＬである、請求項４に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項6】
へパリンの濃度が０．０１〜０．２単位（Ｕ）／ｍＬである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項7】
ヘパリンが質量平均分子量４５００〜６５００の低分子へパリンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項8】
低分子へパリンの濃度が０．０１〜０．５単位（ＩＵ）／ｍＬである、請求項７に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項9】
ヘパラン硫酸がダナパロイドナトリウムである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項10】
ダナパロイドナトリウムの濃度が０．０１〜０．５単位（Ｕ）／ｍＬである、請求項９に
記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項11】
前記血液に、さらに、組織因子を添加することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の血栓形成能又は血液凝固能の分析方法。
【請求項12】
組織因子が、動物組織由来のトロンボプラスチン又は遺伝子組み換え可溶性組織因子である、請求項１１に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項13】
遺伝子組み換え可溶性組織因子の濃度が０．１ｎＭ〜１０ｎＭである、請求項１２に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項14】
内部に血管を模した流路が設けられたマイクロチップを用い、流路に血液を流入させて混合白色血栓形成能を分析する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
【請求項15】
ROTEMにより血液凝固能を分析する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の血栓形成能
または血液凝固能の分析方法。
または血液凝固能の分析方法。
【請求項16】
カルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤ならびにへパ
リンまたはヘパラン硫酸を含有する、ブチルゴム製ゴム栓を有し、内部にクエン酸ナトリウムを含有する採血管で採血された血液を用いた、血栓形成能または血液凝固能の分析のための試薬。
リンまたはヘパラン硫酸を含有する、ブチルゴム製ゴム栓を有し、内部にクエン酸ナトリウムを含有する採血管で採血された血液を用いた、血栓形成能または血液凝固能の分析のための試薬。
【請求項17】
さらに、組織因子を含有する、請求項１６に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能などの血液性状分析に好適に使用できる採血管、試薬及びそれらを用いた血液性状分析方法に関する。【背景技術】
【0002】
血液検査においては、採血後すぐに検査を行うことができない場合が多く、時間が経つと血液が凝固してしまうため、ヘパリンやクエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤をあらかじめ加えておいた採血管を用いて採血することが行われている。ヘパリンを抗凝固剤として利用した採血管としては特許文献１に開示されたものが例示される。【0003】
一方、生体内における血栓形成または止血反応は、コラーゲン上への血小板粘着と凝集反応よりなる一次止血と、それに続く血液凝固因子の活性化により産生されるフィブリンゲルの二次止血が同時に進行する。動脈条件下においては血小板凝集反応を主体とする一次止血が優位となり、静脈条件下においては血液凝固反応からなる二次止血が一次止血に対し優位となり、フィブリンをより多く含む血栓が形成される。これまでに、本発明者らは、微量血液を用いて血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能を評価するための血管を模した流路を有するマイクロチップを用いた血液性状分析装置を開発してきた（特許文献２〜５）。また、非血流下における血液凝固反応を詳細に解析する装置としては、トロンボエラストグラフ（ＴＥＧ）、ＲＯＴＥＭ（商標）等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平4‐9143号公報
【特許文献2】再表2010/018833号公報
【特許文献3】再表2011/99569号公報
【特許文献4】再表2009/69656号公報
【特許文献5】再表2007/46450号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記のように、ヘパリンなどの抗凝固剤を内部に含んだ採血管が知られていたが、血液が採血管のキャップに接触することで、凝固カスケードの接触因子の活性化反応が起こるなど、公知の採血管には改善の余地があった。また、採血した血液を上記のような血液性状分析装置を用いて評価するにあたり、よりカスタマイズされた採血管が望まれていた。また、従来の汎用されているクエン酸を含む採血管を用いる場合にも、より感度よく混合白色血栓形成能の分析、および血液凝固検査を行うことのできる試薬の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、一般に汎用されているヘパリンやクエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤を含んだ真空採血管であっても、接触因子を活性化し、全血における血液凝固を促進するということを発見し、その凝固促進は、少量の血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤やカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤を予め採血管に加えておくことで抑制することができることを見出した。さらに、そのようなヘパリン（好ましくは低分子へパリン）またはクエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤を内部に含んだ採血管によって採取された血液は血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能の分析、および従来の血液凝固検査（ROTEM、TEGなど）に好適に使用できることを見出した。また、従来の汎用されているクエン酸を含む採血管を用いる場合には、試薬にコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）等のFXII阻害剤及びカリクレイン阻害剤と、好ましくはさらに少量のへパリン及び／又はヘパラン硫酸を添加することで好適に混合白色血栓形成能の分析、および従来の血液凝固検査（ROTEM、TEGなど）に使用出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0007】
本発明は、へパリンまたはクエン酸ナトリウムと、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤を内部に含む採血管を提供する。ここで、用いるへパリンは、低分子へパリン、ペンタサッカライド（アンチトロンビンのXa阻害を促進するへパリン内の５糖構造）を用いることができるが、ヘパリンが質量平均分子量４５００〜６５００の低分子ヘパリンであることが好ましく、低分子へパリンは採血時に血液に対して０．１〜１０単位／ｍＬ(０．１〜１０ＩＵ（国際単位）／ｍＬ)となる量で採血管内部に塗布されていることが好ましい。また、へパリンの代替として、ヘパラン硫酸を用いてもよい。また、FXII阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）であることが好ましく、CTIが採血時に血液に対して５〜５０μg／ｍＬとなる量で採血管内部に塗布されていることが好ましい。
カリクレイン阻害剤は、アプロチニンであることが好ましく、アプロチニンが採血時に血液に対して１〜50μg／ｍＬとなる量で採血管に塗布されていることが好ましい。
FXII阻害剤およびカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤は、採血管内部へ塗布され乾燥状態であることが望ましい。
【0008】
また、本発明は、前記へパリンと接触因子阻害剤を内部に含む採血管を用いて採血された血液を用い、これにヘパリナーゼを添加した後に血栓形成能を測定する、フィブリンと活性化血小板を主成分とする混合白色血栓形成能の分析方法を提供する。ここで、へパリナーゼが１〜１０単位／ｍＬ（１〜１０ＩＵ（国際単位）／ｍＬ）の濃度で添加されることが好ましく、また、採血管の内部に25μg／ｍＬ以下のCTIおよび／または1〜50μg／ｍＬのアプロチニンが含まれており、へパリナーゼが１０μg／ｍＬ以上のCTIとともに添加される態様でもよい。より好ましい分析方法は、内部に血管を模した流路が設けられたマイクロチップを用い、流路に血液を流入させて分析する方法であり、マイクロチップは、流路上にコラーゲンと組織因子（tissue factor:組織トロンボプラスチン）をコートされた部位を有することが好ましい。ただし、ROTEM（商標：rotation thromboelastometry）、 TEG（商標：Thromboelastography）などのその他の血液凝固検査にも使用することができる。その場合は、へパリンと接触因子阻害剤を含む血液に、へパリナーゼと低濃度（例えば、０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）の組織因子を加えることにより凝固が開始される。【0009】
また、本発明は、前記採血管を用いて採血された血液を用い、これを、内部に血管を模した流路が設けられ、さらに、流路上に流路分割部を有するマイクロチップの流路に流して血栓形成を測定する、活性化血小板を主体とする血小板血栓形成能の分析方法を提供する。【0010】
また、本発明は、従来のゴム栓を有する採血管で採取された血液を用い、接触因子阻害剤（FXII阻害剤、カリクレイン阻害剤）とへパリン（またはヘパラン硫酸）を添加することで血流下における血栓形成を解析する方法、および、接触因子阻害剤とへパリンおよび組織因子を添加することでROTEMやTEGを用いて血液凝固の解析を行う方法を提供する。【発明の効果】
【0011】
へパリン（好ましくは低分子へパリン）と、FXII阻害剤（コーン由来トリプシンインヒビター（CTI）など）および／またはカリクレイン阻害剤（アプロチニンなど）などの接触因子阻害剤によって抗凝固処理され保存された血液は、血小板機能が良好に保持され、コラーゲンをコートされたマイクロチップ内で血小板血栓形成能を測定するのに適している。【0012】
さらにヘパリンと接触因子阻害剤によって抗凝固処理され保存された血液にヘパリナーゼを添加して、へパリンを分解した血液は、コラーゲンと組織因子がコートされたマイクロチップ内でのフィブリンと活性化血小板を主成分とする混合白色血栓形成能を測定するのに適している。また、例えば、へパリンとカリクレイン阻害剤で抗凝固処理され保存された血液に、測定時にへパリナーゼとCTIを添加して測定すると、測定時にはカリクレイン阻害剤とCTIの両方でより強力に接触因子の阻害が可能であり、混合白色血栓形成能測定およびROTEM、TEGなどの血液凝固測定に適している。
【0013】
アプロチニンに比べCTIは高価であるため、特に好ましい形態としては、採血管に低分子へパリンと、アプロチニンおよび／または少量のCTI（25μg/mL以下）をコートし、測定時にさらに、へパリナーゼとCTI(例えば、10〜50μg/mL)の混合物を添加して測定することが望ましい。【0014】
また、血液凝固を主体とする検査のみに用いる場合には、へパリンの代わりにクエン酸ナトリウムを用いることも可能である。その場合には、クエン酸ナトリウム（好ましくは約１１ｍM）とカリクレイン阻害剤を含む採血管で採血し、カルシウム（例えば、塩化カルシウム；以下、同じ）またはカルシウムとCTIを加えて測定することができる。【0015】
一方、一般に入手可能な3.2〜3.8％のクエン酸ナトリウムを含む真空採血管で採血された血液を用いて測定する場合には、CTI（例えば、10〜50μg/mL）とカリクレイン阻害剤（例えば、10〜50μg/mLのアプロチニン)及びカルシウムを測定時に加えることでも、測定時の接触因子の活性化及び血液凝固の促進を抑制し、正しく血栓形成能を測定することが可能である。その場合には、CTIとカリクレイン阻害剤とカルシウムに加え、低濃度（０．５単位（U）/mL以下）のへパリン、低分子へパリンやダナパロイドナトリウム（へパラン硫酸を主成分とする低分子へパリノイド）の添加によりさらに良好な血液凝固の抑制が可能となり、前記混合白色血栓形成能測定に適する。また、クエン酸ナトリウムを含む採血管に採血した血液検体に、CTI、カリクレイン阻害剤、カルシウムを添加すること、好ましくはさらに低濃度のへパリンまたはヘパラン硫酸を添加すること、より好ましくはさらに低濃度の組織因子を添加すること、によって血液凝固を開始した場合、ROTEM、TEG等の血液凝固検査においてより生理的な血液凝固反応の解析が可能である。
【0016】
一般に生体内の血液凝固は、外因系、内因系と単純化されておらず、細胞表面に発現された少量の組織因子によって開始され、少量生産されたトロンビンによる凝固XI,VIII,V因子の活性化によって増幅されるといわれている。（cell based coagulation model; Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 19(1) 2009, pp 3〜10）よって、上記のアッセイで、ゴム栓に由来する非生理的な血液凝固の活性化を抑制しつつ、少量の組織因子によって血液凝固を開始する測定は、生体内の血液凝固に近いと考えられる。さらに、近年、凝固VII因子（ノボセブン）や組織因子経路の阻害剤（TFPI:BAX499）等が止血用製剤として使用（又は開発中）されており、これら薬剤の効果を評価する上でも、有用と考えられる。【0017】
以上より、へパリンと接触因子阻害剤によって抗凝固処理された血液は、血小板血栓と混合白色血栓の両方の測定に使用でき、さらにはROTEM、TEGなどの血液凝固測定にも使用できる。【0018】
また、一般に入手可能なゴム栓をキャップに用いた3.2〜3.8% クエン酸を含む採血管で採血された場合には、カルシウム、FXII阻害剤及びカリクレイン阻害剤、好ましくはさらに少量のへパリン又はヘパラン硫酸を測定時に添加することで混合白色血栓の測定や血液凝固の測定が可能である。FXII因子阻害剤としてはCTIが好ましく、カリクレイン阻害剤としてはアプロチニンが好ましい。さらにCTI、アプロチニン、塩化カルシウムに加えて少量のへパリンまたはヘパラン硫酸が添加されていることがより好ましい。この混合物を用いることで、組織因子とコラーゲンが塗布された流路を用いた血流下における混合白色血栓の解析を好適に行うことが可能である。
【0019】
また、CTI、アプロチニン、へパリンに加えて、少量の組織因子を添加し、血液凝固を開始することで、ROTEM、TEG等を用いた血液凝固解析が良好に行うことが出来る。これら試薬を用いることで、CTIによって接触因子の活性化が阻害された環境下で、少量の組織因子によって、血液凝固が開始され、生成された少量のトロンビンによる凝固XI,VIII,V因子に対するフィードバック活性化で、凝固カスケードが増幅され、より生理的に近い凝固反応の解析が可能となる。
用いる組織因子は、動物組織より抽出した組織トロンボプラスチンまたは遺伝子組み換え技術によって作製された可溶性（細胞外ドメイン）の組織因子であってもよい。遺伝子組み換えの組織因子としては、リコンビナントＰＴ試薬として市販されているデイドイノビン（シーメンス）、ヒーモスアイエル（アイ・エル・ジャパン）等を用いることができる。
加える組織因子の量は、特に制限されない。添加するヘパリン又はヘパラン硫酸の量が多い場合には組織因子の量も多くなるが、血液凝固の解析の為には正常な血液において血液凝固の開始が、３分から３０分の間になることが望ましい。血液凝固が３分以内に開始される場合には、組織因子による外因系の血液凝固の影響が大きく、内因系の寄与がわずかとなり、血友病等の診断に適さないことがあり、血液凝固の開始が３０分を超えるような場合には、検査として時間がかかりすぎるからである。
遺伝子組み換えによって作成された組織因子を用いる場合は、０．１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲で加えることが望ましい。
【0020】
へパリンとCTIまたはカリクレイン阻害剤を用いて患者血液検体の血小板血栓形成を分析する場合には、患者がヘパリン又は低分子へパリンの投与を受けている場合には、分析される血小板血栓形成能は影響を受ける。そのような場合には、へパリナーゼ/トロンビン阻害剤（例えば、ヒルジン、アルガトロバンやBAPA（ベンジルスルホニル-D-Arg-Pro-4- アミジノベンジルアミド）など）の試薬を添加して、低分子へパリンを分解し、トロンビン阻害剤に置き換えることで、患者のへパリンによる治療の影響を受けず、血小板血栓形成能を分析することが可能である。【0021】
また、へパリナーゼ/トロンビン阻害剤混合試薬は、広く汎用されているヘパリンがコートされた採血管によって採取された血液の、血小板血栓形成能を分析するのにも有用である。【0022】
一般に、補助人工心肺を使用した心臓外科手術は、主として血液希釈による止血機能の低下および止血製剤（血漿分画製剤や血小板製剤などの輸血）による止血機能の回復をモニタリングすることが必要である。手術を受ける患者は、基本的に動脈からカテーテルによる採血経路が確保されており、このような患者においては真空採血管を用いる必要はない。特に補助人工心肺の使用中には、多量のへパリンが投与されており、このような患者の血液検体の血小板血栓（一次止血能）を分析する場合には、へパリナーゼとトロンビン阻害剤の混合試薬（好ましくは、混合試薬が予めコートされた容器）を、フィブリンと血小板血栓（一次止血二次止血総合）の分析には、へパリナーゼとCTIの混合試薬（好ましくは混合試薬が予めコートされた容器）を用いて分析することが好ましい。上記試薬が予めコートされた容器を用いる場合には、血液採取後、容器に添加し転倒混和するのみで測定に使用できるので簡便である。特に、感染症のある患者血液検体や失血や血液希釈によってヘマトクリットの低下が著しい患者の血液を分析する場合には、上記の試薬にDisodium4,4'-Dinitrostilbene-2,2'-disulfonate（DNDS）を添加することで血沈を抑制しつつ、血栓形成能や止血機能を分析することが可能である。その場合のDNDSの濃度は20〜200μg/mLであることが望ましい。【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の採血管によって採取された血液を用いて血栓形成能を評価するためのマイクロチップの第一の態様を示す図。
【図2】本発明の採血管によって採取された血液を用いて血栓形成能を評価するためのマイクロチップの第二の態様を示す図。
【図3】クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムまたは塩化カルシウムとCTIを添加して行ったROTEM測定の結果を示す図〜実施例１。
【図4】低分子へパリンを含む採血管を用いて採取された血液を用い、ヘパリナーゼまたはヘパリナーゼとCTIを添加して行ったROTEM測定の結果を示す図〜実施例２。
【図5】クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図〜実施例３。
【図6】クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果および低分子へパリンを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、ヘパリナーゼを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図〜参考例。
【図7】低分子へパリンとCTIを含む真空採血管、ヒルジン採血管及びBAPA採血管に採血した血液を用い、血小板血栓形成の測定を行った結果を示す図〜実施例４。
【図8】BD社へパリン採血管に採血した血液を用い、へパリナーゼ・BAPA混合試薬を添加して、血小板血栓形成の測定を行った結果を示す図〜実施例５。
【図9】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜実施例６。
【図10】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜実施例７。
【図11】採血管Bを用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果およびBD社採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとヘパリンナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図〜実施例８。
【図12】採血管Bを用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果およびBD社採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとヘパリンナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図。（ａ）は抗凝固薬無しの結果、（ｂ）はリバロキサバンを各濃度で添加したときの結果、（ｃ）はダビガトランを各濃度で添加したときの結果を示す〜実施例９。
【図13】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜実施例１０。
【図14】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜比較例。
【図15】BD社クエン酸ナトリウム採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図〜実施例１１。
【図16】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜実施例１２。
【図17】BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加してROTEMの測定を行った結果を示す図〜実施例１３。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明の採血管は、低分子ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤（例えば、FXII阻害剤またはカリクレイン阻害剤）を内部に含む。【0025】
ヘパリンは硫酸化Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸がポリマーを形成して構成される分子量約５，０００〜３０，０００のムコ多糖類である。本発明で使用されるヘパリンは質量平均分子量４５００〜６５００の低分子ヘパリンが好ましい。また、ヘパリンはヘパリンナトリウム又はヘパリンリチウムなどの金属塩でもよい。ヘパリンは、一般に牛由来のものが安全に使用されるが、その他、ブタ、犬等の動物あるいは人由来等も使用することができる。【0026】
FXII阻害剤としては、CTI、COU254、RD12などの合成阻害剤が挙げられるが、その中ではCTIが好ましい。CTIは例えば、以下の文献に開示されており、市販のものを使用してもよいし、自らコーンより調製して使用してもよい。【0027】
J Biol Chem. 1977 Nov 25;252(22):8105-7.Thromb Res. 1980 Oct 15;20(2):149-62.
Blood. 1996 Nov 1;88(9):3432-45.
【0028】
COU254, RD12は例えば、下記の文献に記載されている。Exp Transl Stroke Med. 2010; 2: 5. Published online 2010 Feb 15. doi: 10.1186/2040-7378-2-5
ACS Chem Biol. 2015 Aug 21;10(8):1861-70. doi: 10.1021/acschembio.5b00103. Epub 2015 May 19.
A Synthetic Factor XIIa Inhibitor Blocks Selectively Intrinsic Coagulation Initiation.
Baeriswyl V1, Calzavarini S2,3, Chen S1, Zorzi A1, Bologna L2,3, Angelillo-Scherrer A2,3, Heinis C1.
【0029】
カリクレイン阻害剤としてはアプロチニンがあげられるが、その他の低分子のカリクレイン阻害剤を用いてもよい。Expert Opin Investig Drugs. 2006 Sep;15(9):1077-90
【0030】
本発明の採血管の形状は特に制限されず、公知の採血管と同様の形状にすることができるが、本発明の一実施態様の採血管としては、有底筒状の採血管本体に、採血管本体の開口部を密封する栓体が取り付けられたものが挙げられる。【0031】
また、上記栓体が取り付けられる採血管本体内が減圧されていることが望ましい。採血管内を減圧しておくことにより、採血を速やかに行うことができる。なお、減圧の程度は、採血量に応じて適宜設定すればよい。【0032】
本発明の採血管における有底管としては、ガラス、ポリエチレンテレフタレート・ポリブチレンテレフタレート・ポリエチレンナフタレート・ポリエチレンイソフタレート等のホモポリマーあるいはコポリマー、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリウレタン等が好ましい。【0033】
本発明の採血管における有底管の開口部を密封する栓体としては、ゴム、エラストマーまたはアルミ蒸着フィルム等が好ましい。ゴムとしては、塩素化ブチルゴム、臭素化ブチルゴム、イソプレンゴム、天然ゴム等が挙げられ、エラストマーとしてはオレフィン系、ポリエステル系、ポリウレタン系等が挙げられる。またアルミ蒸着フィルムとしては、針が穿刺可能なようにアルミ蒸着フィルム上にイソプレン等のゴムボタンを設けて有底管と接着するような形態が挙げられる。【0034】
ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよびFXII阻害剤、カリクレイン阻害剤等の接触因子阻害剤の採血管内部への導入方法としては、ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤の溶液を採血管の内壁にスプレーし、乾燥させることで、内壁に付着させる方法が例示される。また、採血管内にヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤を封入し、栓体で有底管の開口端を密封した後、アルミ蒸着フィルムあるいはプラスチック包装材料で密封することにより、さらに長期間、熱、水分から保護され、ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤の安定性を増すことができる。また本発明の採血管にヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤を存在させる前に、有底管内面にシリコーンコーティングを施すことにより血液の異常凝固、付着などを防止することができる。【0035】
本発明において、抗凝固剤として採血管内に封入される低分子ヘパリンは、採血すべき血液１mLあたり、１〜１０単位（抗FXa単位:国際単位）（1〜10IU/mL）であることが好ましく、３〜８単位（3〜8IU/mL）であることがより好ましい。【0036】
本発明において、抗凝固剤として採血管内に封入されるクエン酸ナトリウムは、採血すべき血液に対し、1/10量の３．２〜３．８％のクエン酸ナトリウムであることが望ましい。【0037】
本発明において、採血管内に封入されるFXII阻害剤の量は血液凝固第XII因子を阻害できる量であればよいが、CTIの場合、採血すべき血液１mLあたり、5〜50μgであることが好ましい。なお、CTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみ加えてもよい。例えば、25μg/mL 以下、好ましくは5〜20μg/mLの量が挙げられる。【0038】
本発明において、採血管内に封入されるカリクレイン阻害剤の量はカリクレインを阻害できる量であればよいが、アプロチニンの場合、採血すべき血液１mLあたり、1〜50μgであることが好ましい。なお、アプロチニンとCTIの両方を採血管内に封入してもよく、その場合、CTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみでよく、例えば、1〜10μg/mLの量でもよい。【0039】
このような採血管を用いて採取された血液を用いて血栓形成能の分析を行う。血栓形成能の分析方法は、インビトロの方法であれば特に制限されないが、好ましくは、内部に血管を模した微小流路が設けられたマイクロチップを用いた血流下での血栓形成能の分析方法が挙げられる。なお、従来のROTEM、TEG等の凝固能解析に用いることも可能である。【0040】
このようなマイクロチップを使用した血栓形成能の分析方法として、本発明者らは、流路の途中に流路分割部を有する血小板血栓分析用のマイクロチップと、流路の途中にコラーゲンと組織因子が塗布された血栓観測部を有する混合白色血栓分析用のマイクロチップを報告している。【0041】
まずは、血小板血栓分析用のマイクロチップＡを用いた、血小板血栓形成能の分析方法について、図１を参照して説明する。なお、図１の例では流路が平行に２本設けられているが、あくまでも例示であり、当然ながら、流路は１本でもよいし、別の態様でもよい。【0042】
マイクロチップAの第一の流入口１０４および第二の流入口１１４には、リザーバー（血液収容容器）１０６，１１６がそれぞれ倒立して接続されており、リザーバー１０６、１１６には送液ポンプ１０７、１１７が接続されている。送液ポンプ１０７、１１７には圧力センサー１０８、１１８が接続されている。測定直前に、本発明の採血管により採血された血液を、リザーバー１０６、１１６に導入し、測定を行う。
【0043】
送液ポンプ１０７、１１７の液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプ１０７、１１７で当該液体を血液があらかじめ充填されたリザーバー１０６、１１６のそれぞれに導入し、該液体を血液の上に重層し、該液体をポンプ１０７、１１７で押し出すことで、血液が流路１０１、１１１へ導入される。該液体の流入圧を測定することで血液の流路への流入圧を間接的に測定することができる。【0044】
具体的には、送液ポンプ１０７、１１７から、ミネラルオイルがリザーバー１０６、１１６内に圧入され、血液の上に重層され、血液をマイクロチップ１の流路１０１、１１１内に押し出す。血液は流路１０１、１１１を通過し、反応部１０２、１１２に到達する。第一反応部および第二反応部にはコラーゲンが塗布されており、さらに、特許文献２，３に開示されたような血液の流れる方向に沿って延在し、流路の幅を複数に分割する複数の流路分割壁が設けられており、分割壁の部分で血栓形成による閉塞が、他の部分よりも早く進む。流路分割壁の間隔は200μｍ以下であることが望ましい。また、流路分割部において、流路の幅は流路分割壁によって５つ以上に分割されていることが望ましい。流路分割壁の形状は、流路の幅を複数に分割できさえすれば特に制限されない。また、特許文献３に記載されたように、流路分割壁は表面粗さ（Ra）が１０〜２００ｎｍになるような処理が施されていてもよい。反応部を通過する際に血小板による血栓形成が生じ、この血栓形成に基づく流入圧の上昇が観測される。これらの圧力上昇パターンを圧力センサーで検知し、比較することで、血液の性状、すなわち、血小板血栓形成能を評価することができる。
【0045】
検査に供した血液は、流路１０１、１１１の終端から廃液貯留部１０３、１１３に到達し、貯留され、廃液口１０５，１１５から排出される。なお、廃液貯留部内にEDTAなどを含浸させたスポンジなどの血液吸収材が配置されていると、血液廃液は血液吸収材に吸収されるが、凝固はしないので、圧力の測定に悪影響を与えることはない。【0046】
次に、混合白色血栓分析用のマイクロチップＢを用いた、混合白色血栓形成能の分析方法について、図２を参照して説明する。なお、図２の例では、流路通過後の血液に血液凝固防止剤を加える態様であるが、あくまでも例示であり、当然ながら、別の態様でもよい。【0047】
マイクロチップＢの流入口２０４には、リザーバー（血液収容容器）２０６が倒立して接続されており、リザーバー２０６には送液ポンプ２０７が接続されている。送液ポンプ２０７には圧力センサー２０８が接続されている。測定直前に、本発明の採血管により採血された血液に対し、ヘパリナーゼを添加してヘパリンを分解した後、リザーバー２０６に導入し、測定を行う。ヘパリナーゼは、採血された血液試料中のヘパリンの量にもよるが、血液１ｍＬあたり、０．１〜１０単位(０．１〜１０ＩＵ／ｍＬ)であることが好ましく、０．２〜５単位（０．２〜５ＩＵ／ｍＬ）であることがより好ましい。
【0048】
なお、採血管内部に存在させるCTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみとした場合、ヘパリナーゼとともに、追加でCTIを加えることが混合白色血栓分析にとっては好ましい。例えば、採血管の内部のCTIの量を２５μg／ｍＬ以下（例えば、５〜２０μg／ｍＬ）とし、測定直前に、へパリナーゼとともに、１０μg／ｍＬ以上のCTIを添加して混合白色血栓分析に供することが好ましい。【0049】
送液ポンプ２０７の液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプ２０７で当該液体を血液があらかじめ充填されたリザーバー２０６に導入し、該液体を血液の上に重層し、該液体をポンプ２０７で押し出すことで、血液が流路２０１へ導入される。該液体の流入圧を測定することで血液の流路への流入圧を間接的に測定することができる。【0050】
具体的には、送液ポンプ２０７から、ミネラルオイルがリザーバー２０６内に圧入され、血液の上に重層され、血液をマイクロチップＢの流路２０１内に押し出す。血液は流路の途中に設けられた狭窄部２０９を通過し、反応部２０２に到達する。狭窄部を設けておくことで高ずり応力惹起血小板凝集も観測することができ、アテローム血栓症の血栓生成を再現することもできるので好ましい。反応部にはコラーゲン及び組織因子（Tissue factor）が塗布されており、ここで血栓形成が生じる。コラーゲンと組織因子を含むことでコラーゲン上で血小板の粘着及び凝集ならびに組織因子による凝固系の活性化など総合的に血栓形成に関与する現象が誘発される。この血栓形成に基づく流入圧の上昇が観測される。これらの圧力上昇パターンを圧力センサーで検知し、比較することで、血液の性状、すなわち、混合白色血栓形成能を評価することができる。【0051】
検査に供した血液は、流路２０１の終端から廃液貯留部２０３に到達する。そして、血液凝固防止剤流入口２１１から血液凝固防止剤流路２１０を通じて注入される血液凝固防止剤と混合され、排出口２０５から排出される。血液凝固防止剤としては、廃液の血液凝固によるつまりや圧力上昇を防止する目的で用いられるもので、EDTA、クエン酸等のキレート剤、酸、アルカリ溶液、アルコール類またはグアニジン、尿素、SDS等の変性剤を用いることが可能である。【0052】
また、汎用されているクエン酸ナトリウムを含む採血管を用いて、混合白色血栓形成を解析する場合には、カルシウム（好ましくは塩化カルシウム）、接触因子阻害剤（ＦＸＩＩ因子阻害剤、カリクレイン阻害剤）を添加して凝固反応を開始することで良好な測定が可能である。【0053】
一般に汎用されている採血管に含まれるクエン酸ナトリウムは、血液に対し0.32〜0.38%になるように調整されている。添加する塩化カルシウムの濃度は、クエン酸ナトリウムによるキレート作用を解除できれば特に制限されないが１１〜１２ｍＭが望ましい。
【0054】
接触因子阻害剤はＦＸＩＩ阻害剤及びカリクレイン阻害剤が挙げられる。ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩ阻害活性を有する物質であれば特に制限されないが、ＣＴＩを使うことができる。ＣＴＩの場合は血液１ｍＬあたり、5〜200μｇが好ましく、10〜50μgがより好ましい。
カリクレイン阻害剤は、特に制限されないがアプロチニンが望ましい。アプロチニンの場合には、血液１ｍＬあたり、1〜100μgであることが好ましい。
ＦＸＩＩ阻害剤とカリクレイン阻害剤を併用することで、より完全な接触因子の活性化阻害が可能となるので望ましい。
特に、アプロチニンはカリクレインに加えてプラスミンも阻害する。また、プラスミンは、比較的基質特異性が低く、血液凝固因子を活性化する。
よって、カリクレインを阻害することで、接触因子の活性化を完全に抑制しつつ、同時にプラスミンを阻害することで、より完全な非特異的な経路による血液凝固因子の活性化を抑制可能である。また、プラスミンを抑制した場合には、線溶反応が抑制されるので、患者の血液凝固の状態、例えば血友病の診断や抗凝固薬の評価に適している。
【0055】
さらに、混合白色血栓の解析を行う場合には、混合血栓形成に影響を与えない少量のへパリン、低分子へパリン及び／又はヘパラン硫酸（例えば、ダナパロイドナトリウム）を添加することで、容器との接触による血液凝固が完全に抑制されるため望ましい。へパリンであれば０．０１〜０．２Ｕ／ｍＬ、低分子へパリンであれば０．０１〜０．５ＩＵ／ｍＬ、ダナパロイドナトリウムであれば０．０１〜０．５Ｕ（抗FXa単位）／ｍＬ程度が望ましい。
【0056】
上記の血液を、コラーゲンと組織因子がコートされたマイクロチップに流すと、血小板の活性化（粘着・凝集反応）と同時に、コ―ティングされている組織因子による外因系凝固の活性化が起こり、その後、マイクロ流路内でコラーゲン上の活性化血小板表面で、内因系凝固が促進され、血流下における混合白色血栓が形成される。【0057】
また、汎用されているクエン酸ナトリウムを含む採血管を用いて、血液凝固の解析をする場合には、塩化カルシウム、上記接触因子阻害剤、少量のへパリン（又は低分子へパリン又はヘパラン硫酸）に加えて、少量の組織因子を添加して血液凝固を開始することで、より生理的な血液凝固反応を解析することが可能である。この場合、塩化カルシウム、接触因子阻害剤、少量のへパリン（又は低分子へパリン又はヘパラン硫酸）によって、完全に採血管や測定容器による血液凝固が抑制された状態で、組織因子によって外因系の血液凝固が開始され、生じた微量のトロンビンが内因系の血液凝固を開始し、血液凝固反応が増幅される。
用いる組織因子の濃度は特に制限されないが、遺伝子組み換え可溶性組織因子の場合、100nM〜0.1nMであることが望ましい。添加するへパリンが多い場合は、組織因子も多めに添加する必要がある。健常人の血液を用いた場合に、血液凝固の開始が3〜30分の間であると測定がし易く望ましい。
用いる血液凝固解析装置は、特に制限されないが、ＲＯＴＥＭ、ＴＥＧ、ソノクロットなどの非血流下における血液凝固の解析装置が望ましい。
【0058】
したがって、本発明は、カルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤を含有する、血栓形成能または血液凝固能の分析試薬を提供する。当該分析試薬はさらにへパリンまたはヘパラン硫酸を含有することが好ましく、さらに組織因子を含有することがより好ましい。当該分析試薬はこれらの各成分を別々に含む試薬キットとして提供されうる。【実施例】
【0059】
実施例１採血管A（ブチルゴム製ゴム栓、3.2％クエン酸ナトリウム含有、Sunphoria社製品）及び採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血を行い、ROTEMの測定を実施した。
反応開始は、以下の異なる試薬を用いた。
（１）採血管Aの血液にSTARTEM（商標）試薬（塩化カルシウム；終濃度12mM）を添加
（２）採血管Aの血液にCTI(終濃度50μg/mL)と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
（３）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、CTI（終濃度50μg/mL）と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
（４）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、STARTEM試薬（塩化カルシウム；終濃度12ｍM）を添加
（５）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、CTI(終濃度50μg/mL)とSTARTEM試薬（塩化カルシウム；終濃度12mM)を添加
（６）採血管Bの血液にSTARTEM試薬（塩化カルシウム、終濃度12ｍM）を添加
（７）採血管Bの血液にCTI(終濃度50μg/mL)と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
【0060】
結果を図３に示す。ブチルゴムのゴム栓の採血管に採血した血液は、フィルムシールの採血管と比べて、塩化カルシウム添加時に、早く血液凝固が起こった。さらに、フィルムシールの採血管の血液は、CTIを添加することで塩化カルシウム誘発血液凝固が抑制されたのに対し、ブチルゴムのゴム栓の採血管では、CTIを添加することによる塩化カルシウム誘発血液凝固の抑制は限定的であった。しかし、ブチルゴムのゴム栓の採血管にアプロチニン及び比較的低濃度のCTIを添加して採血された血液に塩化カルシウムを添加した場合には、血液凝固が顕著に抑制され、さらに塩化カルシウムとCTIの混合物を添加して血液凝固を開始した場合には、より強く血液凝固が抑制された。アプロチニンと低濃度のCTIを事前に添加して採血し、測定時にCTIを再度添加するのが最もよく血液凝固を抑制する。
【0061】
実施例２採血管C（ブチルゴム製ゴム栓、低分子へパリン２IU/mL含有Sunphoria社製）に採血した血液（検体A）と、採血管Cに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液（検体B）と、採血管Cに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液（検体C）を用いてROTEMの解析を実施した。反応の開始は以下の試薬で行った。
（１）検体Aにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）を添加
（２）検体Bにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加
（３）検体Bにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加
【0062】
結果を図４に示す。低分子へパリンを含むゴム栓の採血管に採血し、へパリナーゼを添加した場合、血液凝固は早期に始まった。また、（１）のケースでへパリナーゼに加えてCTI 50μg/mLを測定開始時に添加した場合にも、血液凝固は抑制されなかった。
一方、低分子へパリンとアプロチニン及びCTIを事前に添加して採血し、測定開始時にへパリナーゼとCTIを添加した場合には、顕著に血液凝固が抑制された。
【0063】
実施例３採血管Aに採血した血液および採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液に塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加して、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
【0064】
結果を図５に示す。クエン酸に加えてアプロチニンを添加して採血した場合にも、血流下の血栓形成能の評価でデータに影響は無かった。しかし、実施例1の結果より、リザーバー内での非血流下における血液凝固(クロット形成)は抑制されると考えられ、アプロチニンを添加することで、リザーバー内で血液凝固を抑制しつつ非血流下の白色血栓形成の評価が可能であると考えられる。
【0065】
参考例採血管Bで採取された血液に塩化カルシウム(終濃度12mM)とCTI(終濃度50μg/mL) を添加、および採血管Cで採取された血液にへパリナーゼ(終濃度0.17IU/mL)を添加して、それぞれ図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。
【0066】
結果を図６に示す。クエン酸処理血液に塩化カルシウムとCTIを添加した場合と同様に、ゴム栓の採血管（低分子へパリンとCTIを含む）にへパリナーゼを添加して測定しても血栓形成能の解析が可能であった。
【0067】
実施例４低分子へパリン（終濃度2IU/mL）とCTI(終濃度50μg/mL)を含む真空採血管、ヒルジン採血管（Roche Diagnostic社製、ヒルジン終濃度 50μg/mL）及びBAPA採血管(BAPA終濃度100μM)に採血した血液を用い、図1に示される装置を用いて血小板血栓形成の測定を行った。
何れの真空採血管もブチルゴムのゴム栓を用いたものである。
【0068】
その結果、図７に示すように、各採血管の血液は、同様に血小板血栓形成を解析することが可能であった。また、低分子へパリンとCTIを含む採血管の血液に採血30分後にへパリナーゼ・BAPA試薬（終濃度；各0.17IU/ｍL, 100μM）を添加した場合においても、同様に血小板血栓形成の測定が可能であった。【0069】
実施例５BD社製へパリン採血管に採血し、その30分後に、当該血液に、へパリナーゼ・BAPA混合試薬を、それぞれ終濃度が0.17IU/mLと100μMになるように添加し、血液試料とした。
一方、比較として、ヒルジン採血管（Roche Diagnostic社）に採血した血液試料を用いた。
これらの血液試料を用い、図1に示される装置を用いて血小板血栓形成の測定流速を行った。血液は18μL/minで実施した。
何れの真空採血管もブチルゴムのゴム栓を用いたものである。
【0070】
結果を図８に示す。へパリン採血管に採血した血液にへパリナーゼ・BAPA混合試薬を添加することで、ヒルジン採血管で採血した場合と同様に血小板血栓形成の解析を行うことが可能であった。
一方、へパリン採血管に採血した血液をそのまま同様の測定を行った場合には、血小板血栓形成による圧力上昇は、ほとんど見られなかった。
【0071】
実施例６BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)
（４）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.25U/mL)
【0072】
結果を図９に示す。結果は、左より(凝固開始の早い方より)、（１）、（２）、（３）、（４）である。
塩化カルシウムとCTIに加えて、アプロチニンの添加で凝固開始が抑制され、さらに低濃度のダナパロイドナトリウムを添加することで血液凝固が完全に抑制された。
尚、（３）、（４）の添加によっても組織因子とコラーゲンを塗布したマイクロチップにおける混合白色血栓形成は、同様の結果が得られた。
【0073】
実施例７BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬(塩化カルシウム試薬)
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)
（４）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(持田製薬：終濃度0.15U/mL)
【0074】
結果を図１０に示す。結果は、左より(凝固開始の早い方より)、（１）、（２）、（３）、（４）である。
塩化カルシウムとCTIに加えて、アプロチニンの添加で血液凝固の開始が抑制され、さらに低濃度のへパリンナトリウムを添加することで血液凝固が完全に抑制された。
【0075】
実施例８採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）を添加した血液検体及びBD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)を添加した血液検体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
【0076】
結果を図１１に示す。テルモ社製フィルムシールの採血管と同様に、ＢＤ社製のブチルゴムのゴム栓を用いた採血管により白色血栓形成能の測定が可能であった。
【0077】
実施例９Ａ）採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）を添加した血液検体及びＢ）BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)を添加した血液検体体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した（図１２（ａ））。
【0078】
さらに、上記Ａ）、Ｂ）２種類の検体に、抗凝固薬であるリバロキサバン及びダビガトランをそれぞれ0nＭ、500nＭ及び1000nＭ添加して同様の測定を行った。リバロキサバン及びダビガトランの結果をそれぞれ図１２の（ｂ）および（ｃ）に示す。
その結果、検体Ｂ）は検体Ａ）と同様に、抗凝固薬の抗血栓効果を感度良く測定出来た。
【0079】
実施例１０BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル リコンビプラスチン（15μｇ/mL）を終濃度で約0.04％になるように添加）
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)とノボセブン（終濃度2μｇ/mL）とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル リコンビプラスチンを終濃度で0.04％になるように添加）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)と組織因子経路阻害剤（TFPI）（Ac-FQSKpNVHVDGYFERLXAKL-NH2；N末端アセチル化, C末端アミド化,5番目 p= D体Pro残基, 17番目X= Aib(α-methyl alanine）；J Biol Chem. 2014 Jan 17;289(3):1732-41；終濃度10μｇ/mL）とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル リコンビプラスチンを終濃度で0.04％になるように添加）
【0080】
結果を図１３に示す。左から（２）、（３）、（１）の順で凝固は早く起きた。【0081】
比較例BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬とEXTEM試薬（商標：組織因子を主体とする検査用試薬）
（２）STARTEM試薬とEXTEM試薬とノボセブン（ノボノルディスクファーマ：終濃度2μｇ/mL）
（３）STARTEM試薬とEXTEM試薬とＴＦＰＩ（終濃度10μｇ/mL）
【0082】
結果を図１４に示す。（１）、（２）、（３）が同じ波形を示した。【0083】
実施例と比較例より、塩化カルシウムとアプロチニンとへパリンに組織因子を添加した系でノボセブン、ＴＦＰＩなどの止血製剤の効果が評価出来たのに対し、EXTEM試薬の系では、評価することが出来なかった。【0084】
実施例１１BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加した血液検体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
上記血液に、さらにダビガトラン（1000ｎＭ）またはAbciximab（抗血小板剤：商品名レオプロ）（2μｇ/mL）を添加した血液を用い同様の実験を実施した。
結果を図１５に示す。ＢＤ社製のブチルゴムのゴム栓を用いた採血管により白色血栓形成能の測定及び抗凝固剤、抗血小板剤の評価が可能であった。
【0085】
実施例１２BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加してＲＯＴＥＭを測定した。
さらに、組換え第VIIa因子（商品名ノボセブン）(0.5μg/mL)、TFPI（50μg/mL）及びそれらの組み合わせを添加した血液の測定を行った。
結果を図１６に示す。図１６の（１）はノボセブン、TFPIともに添加せず、（２）はノボセブンのみ、（３）はTFPIのみ、（４）はノボセブン＋TFPIである。
その結果、BD社製クエン酸ナトリウム採血管によりＲＯＴＥＭの測定及び止血製剤の効果の判定が可能であった。
【0086】
実施例１３BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加してＲＯＴＥＭを測定した。
さらに、抗FVIIIポリクローナル抗体（FVIII阻害活性；96μｇ/mL;218 BU（FVIII阻害活性単位））ならびにノボセブン(0.5μg/mL)、TFPI（50μg/mL）及びそれらの組み合わせを添加した血液の測定を行った。
結果を図１７に示す。図１７の（１）は抗FVIIIポリクローナル抗体のみ、（２）は抗FVIIIポリクローナル抗体＋ノボセブン、（３）はFVIIIポリクローナル抗体＋TFPI、（４）はFVIIIポリクローナル抗体＋ノボセブン＋TFPIである。
BD社製クエン酸ナトリウム採血管によりＲＯＴＥＭの測定及び止血製剤の効果の判定が可能であった。
【符号の説明】
【0087】
A・・・マイクロチップ；１０１、１１１・・・流路；１０２，１１２・・・反応部；１０３、１１３・・・廃液貯留部；１０４、１１４・・・流入口；１０５、１１５・・・廃液口；１０６、１１６・・・リザーバー；１０７、１１７・・・送液ポンプ；１０８、１１８・・・圧力センサーB・・・マイクロチップ；２０１・・・流路；２０２・・・反応部；２０３・・・廃液貯留部；２０４・・・流入口；２０５・・・廃液口；２０６・・・リザーバー；２０７・・・送液ポンプ；２０８・・・圧力センサー；２０９・・・狭窄部；２１０・・・血液凝固防止剤流路；２１１・・・血液凝固防止剤流入口