特許 6857466 シート、その製造方法およびシート作製用鋳型

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6857466

(24)【登録日】2021年3月24日

(45)【発行日】2021年4月14日

(54)【発明の名称】シート、その製造方法およびシート作製用鋳型

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/78 20060101AFI20210405BHJP

   C12M 1/14 20060101ALI20210405BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20210405BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/78

   C12M1/14

   C12M3/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-172861(P2016-172861)

(22)【出願日】2016年9月5日

(65)【公開番号】特開2018-39738(P2018-39738A)

(43)【公開日】2018年3月15日

【審査請求日】2019年8月23日

(73)【特許権者】

【識別番号】000190943

【氏名又は名称】新田ゼラチン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】遠藤 達郎

(72)【発明者】

【氏名】塚本 啓司

(72)【発明者】

【氏名】伊田 寛之

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−２０２５７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０２８００６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１５０５２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 塚本啓志 ほか，三次元培養を支えるCellmatrix, beMatrix，月刊メディカル・サイエンス・ダイジェスト，２０１６年 ２月２５日，Vol. 42(2)，pp. 36(86)-39(89)

【文献】 加我公行 ほか，ナノインプリント法を利用したマイクロ・ナノパターン化ゼラチンシートへの細胞付着性，日本歯科理工学会誌，２０１４年，Vol. 33(5)，pp. 464

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／００

Ｂ２９Ｃ ５３／００−５９／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゼラチンまたはコラーゲンのシートであって、
前記シートは、いずれか一方の表面または両面に凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含み、
前記シートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示し、
前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下である、シート。

【請求項2】

前記凸状物および前記凹状物は、等間隔に配置されている、請求項１に記載のシート。

【請求項3】

前記凸状物および前記凹状物は、四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置される、請求項１または２に記載のシート。

【請求項4】

前記シートは、いずれか一方の前記表面または前記両面に第１領域と第２領域とを有し、
前記第１領域は、前記凸状物および前記凹状物のいずれか一方または両方を有し、
前記第２領域は、前記凸状物および前記凹状物を有さない、請求項１〜３のいずれかに記載のシート。

【請求項5】

前記シートは、細胞培養用シートである、請求項１〜４のいずれかに記載のシート。

【請求項6】

ゼラチンのシートの製造方法であって、
４０〜８０℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａで前記シートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、前記シートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含み、
前記シートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示し、
前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下未満であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下未満である、シートの製造方法。

【請求項7】

コラーゲンのシートの製造方法であって、
６０〜１００℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａで前記シートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、前記シートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含み、
前記シートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示し、
前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下未満であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下未満である、シートの製造方法。

【請求項8】

請求項６または７に記載のシートの製造方法に用いるシート作製用鋳型であって、
前記シート作製用鋳型は、刻印面を備え、
前記刻印面は、前記凸状物および前記凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含み、
前記シートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示し、
前記凸状物および前記凹状物は、前記刻印面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下未満であり、かつ前記刻印面に対して平行方向の長さで表される幅が２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下未満である、シート作製用鋳型。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シート、その製造方法およびシート作製用鋳型に関する。

【背景技術】

【0002】

最近、特殊な構造体を形成し、この構造体の作用に基づいて細胞などを接着させたり、細胞培養したり、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現させたりする技術の開発が進められている。たとえば、特許第４１５９１０３号公報（特許文献１）では、ポリスチレン、ポリイミド、ガラスなどの材料に凹凸構造からなる細胞接着面を形成した細胞培養構造体が提案されている。特開２０１５−１２８８１８号公報（特許文献２）では、絹フィブロインを材料とし、この材料に電子ビームリソグラフィを用いてナノパターンを形成することにより、フォトニック構造を作製する方法が提案されている。

【0003】

赤坂らの論文（非特許文献１）および加我らの論文（非特許文献２）では、ゼラチン溶液を鋳型に流し込むことにより、マイクロ・ナノ構造を有するシートを調製する方法が提案されている。K C. Hribarらの論文（非特許文献３）では、フェムト秒レーザーなどを用いて立体的なコラーゲンハイドロゲルの内部へ向けてレーザー発振することにより、該内部に３次元的な空間を形成し、該空間に細胞を吸着させたり、伸長させたり、整列させたりする手法が提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第４１５９１０３号公報

【特許文献2】特開２０１５−１２８８１８号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】赤坂ら、マイクロ・ナノ構造を持つパターン化バイオマテリアルの調製、日本歯科理工学会誌、Vol.32、No.2（2013）

【非特許文献2】加我ら、ナノインプリント法を利用したマイクロ・ナノパターン化ゼラチンシートへの細胞付着性、日本歯科理工学会誌、Vol.33、No.5（2014）

【非特許文献3】K C. Hribar et al, Three-dimensional direct cell patterning in collagen hydrogels with near-infrared femtosecond laser, Scientific Reports, Article number［5:17203］(2015)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１の細胞培養構造体は非生体由来材料を用いているため、生体適合性に懸念がある。凹凸構造のパターンもサブミクロンオーダーであるので、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現させることが困難である。特許文献２のフォトニック構造は、絹フィブロインが材料であるので細胞接着性を有していない。非特許文献１および非特許文献２のマイクロ・ナノ構造を有するシートは、ゼラチン溶液の高い粘度のために鋳型に流し込む手法によって作製することは困難である。さらに、鋳型に流し込むためにゼラチン溶液を希釈した場合、シートは非常に破損しやすいものとなる。非特許文献３の技術は、フェムト秒レーザーを用い、かつ非常に複雑な操作が必要とされるため、実用的ではない。したがって、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現する構造体を備えたシートは、未だ開発されていない。

【0007】

本発明は、上記実情に鑑みなされ、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるゼラチンまたはコラーゲンのシート、その製造方法およびシート作製用鋳型を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、ゼラチンまたはコラーゲンのシートに関し、前記シートは、いずれか一方の表面または両面に凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含み、前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。

【0009】

上記凸状物および上記凹状物は、等間隔に配置されていることが好ましい。さらに上記凸状物および上記凹状物は、四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置されることがより好ましい。

【0010】

上記シートは、いずれか一方の上記表面または上記両面に第１領域と第２領域とを有し、上記第１領域は、上記凸状物および上記凹状物のいずれか一方または両方を有し、上記第２領域は、上記凸状物および上記凹状物を有さないことが好ましい。

【0011】

上記シートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示すことが好ましい。さらに上記シートは、細胞培養用シートであることがより好ましい。

【0012】

本発明は、ゼラチンのシートの製造方法に関し、４０〜８０℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａで前記シートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、前記シートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含み、前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。

【0013】

本発明は、コラーゲンのシートの製造方法に関し、６０〜１００℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａで前記シートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、前記シートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含み、前記凸状物および前記凹状物は、前記表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつ前記表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。

【0014】

本発明は、上記のシートの製造方法に用いるシート作製用鋳型に関し、上記シート作製用鋳型は、刻印面を備え、上記刻印面は、上記凸状物および上記凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含み、上記凸状物および上記凹状物は、上記刻印面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつ上記刻印面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるゼラチンまたはコラーゲンのシート、その製造方法およびシート作製用鋳型を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本実施形態に係るコラーゲンシートの表面を撮影した電子顕微鏡（ＳＥＭ）像の一例を示す図面代用写真である。

【図2】実施例１に係るコラーゲンシートがフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することを示す図面代用写真である。

【図3】実施例１に係るコラーゲンシートにおいて凸状物または凹状物を有する領域と有さない領域との境界部を撮影した電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。

【図4】実施例１に係るコラーゲンシートにおいて凸状物または凹状物を有する領域と有さない領域とに、それぞれ細胞を接着させた様子を撮影した光学顕微鏡像を示す図面代用写真である。

【図5】比較例１に係るコラーゲンシートにおいて細胞を接着させた様子を撮影した光学顕微鏡像を示す図面代用写真である。

【図6】実施例１に係るコラーゲンシートにおいて凸状物または凹状物を有する領域での細胞培養の様子を撮影した光学顕微鏡像を示す図面代用写真である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明に係るゼラチンまたはコラーゲンのシート、その製造方法およびシート作製用鋳型について、それぞれ詳細に説明する。

【0018】

本明細書において「ゼラチン」、「コラーゲン」の用語は、それぞれゲル状態にあるとき、およびそれらが溶解している水溶液の状態にあるときを含めて用いる場合がある。さらに本明細書において、「Ｘ〜Ｙ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＸ以上Ｙ以下）を意味しており、Ｘにおいて単位の記載がなく、Ｙにおいてのみ単位が記載されている場合、Ｘの単位とＹの単位とは同じである。

【0019】

≪シート≫
本発明は、ゼラチンまたはコラーゲンのシートに係る。以下、本明細書においてコラーゲンのシートを「コラーゲンシート」とも記す。ゼラチンのシートを「ゼラチンシート」とも記す。

【0020】

「コラーゲン」とは、脊椎動物の真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などにおける細胞外基質を由来とするタンパク質をいう。コラーゲンは、３本のペプチド鎖からなる右巻きのらせん構造を有し、そのペプチド鎖を構成するアミノ酸残基は、グリシン残基が３残基ごとに繰り返される一次構造（所謂コラーゲン様配列）を有している。本発明に係るコラーゲンシートは、３本のペプチド鎖（α鎖）からなる分子量３０万以上であるコラーゲンの所定の濃度の水溶液を乾燥させることによりシート状化したものであることが好ましい。

【0021】

「ゼラチン」とは、上記コラーゲンのらせん構造を、熱を加えることにより解くとともに、各ペプチド鎖を抽出したもののうち、ＪＩＳ Ｋ ６５０３：２００１（にかわ及びゼラチン）に基づき水分率を１５質量％以下にした乾燥体をいう。本発明に係るゼラチンシートは、このようなゼラチンの所定の濃度の水溶液を乾燥させることによりシート状化したものであることが好ましい。

【0022】

ここで本発明に係るシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示す。本明細書において、フォトニック結晶に起因する光学現象とは、可視光域の波長を有する光と、後述する大きさ（高さまたは深さ、および幅）ならびに密度を有する凸状物および凹状物（以下、「ナノ構造体」とも記す）とが、相互作用することで発現する光学的な現象をいい、代表的には、屈折率が周期的に変化することによりオパール調の特有の構造色を呈する現象をいう。さらに、このフォトニック結晶に起因する光学現象が発現するために必要な構造を、フォトニック構造ともいう。

【0023】

シートは、細胞培養用シートであることが好ましい。本発明では、後述する大きさ（高さまたは深さ、および幅）を有する凸状物および凹状物が、後述する密度でシート上に存在することにより、通常の細胞培養において見られない挙動（たとえば、スフェロイドの形成）を細胞が呈することとなる。これにより本発明に係るシートは、たとえば細胞接着、増殖などを制御することができる基材として、医療機器などへの応用が見込める。

【0024】

シートは、いずれか一方の表面または両面に第１領域と第２領域とを有していてもよい。この場合、第１領域は、後述する凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を有することが好ましい。第２領域は、後述する凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を有さないことが好ましい。このような構成のシートにより、シート上の一部（第１領域）のみでフォトニック結晶に起因する光学現象を発現させることができる。細胞培養用シートとして適用した場合、シート上の一部（第１領域）のみでスフェロイドを形成し、その他の部分（第２領域）において通常の細胞培養を進めることができる。したがって本発明に係るシートは、バリエーションに富んだシートの活用が見込めるものとなる。

【0025】

＜凸状物および凹状物＞
シートは、いずれか一方の表面または両面に凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含む。凸状物および凹状物は、シート表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつシートの表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。本発明に係るゼラチンシートおよびコラーゲンシートは、凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を、上述の大きさ（高さまたは深さ、および幅）ならびに密度で有することにより、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができる。さらに、細胞培養用シートとして適用した場合、細胞接着性を変化させることができ、細胞をスフェロイド状に集合させることができる。

【0026】

ここで、凸状物および凹状物のシート表面に対する垂直方向の長さで表される高さまたは深さとは、その形状における最大高さまたは最大深さをいい、本発明において凸状物および凹状物は、この最大高さまたは最大深さが１μｍ未満となる。さらに凸状物および凹状物のシート表面に対する平行方向の長さで表される幅とは、その形状の平断面の外周上に存在する最も離れた２点を直線で結んだ距離（最大幅）をいう。本発明において凸状物および凹状物は、この最大幅が１μｍ未満となる。

【0027】

凸状物および凹状物は、上述の高さまたは深さ、および上述の幅を満たす限り、任意の形状を有することができる。凸状物は、たとえば円柱状、楕円柱状、三角柱状、四角柱状、その他の多角形の柱状形状、円錐状、三角錐状、四角錐状およびその他の多角形の錘状形状を有することができる。凸状物は、上述の高さおよび上述の幅を満たす不定形であってもよい。凹状物は、たとえば円柱状、楕円柱状、三角柱状、四角柱状、およびその他の多角形の柱形状に凹んだ形状、ならびに円錐状、楕円錐状、三角錐状、四角錐状およびその他の多角形の錐形状に凹んだ形状を有することができる。凹状物は、上述の深さおよび上述の幅を満たす不定形に凹んだ形状であってもよい。

【0028】

さらに、凸状物および凹状物は、上述の形状のうち１種のみがシートのいずれか一方の表面または両面に存在することに限定すべきではない。すなわち、これらの形状のうち複数種がシートのいずれか一方の表面または両面に混在していてもよい。

【0029】

凸状物および凹状物は、１００〜５００ｎｍの上述した高さまたは深さを有することが好ましい。さらに、２００〜８００ｎｍの上述した幅を有することが好ましい。凸状物および凹状物は、好ましくはシートのいずれか一方の表面または両面に１平方マイクロメートル当たり５〜３０個、さらに好ましくは５〜２５個有する領域を含む。凸状物および凹状物の上述した高さまたは深さの下限は１００ｎｍであり、上述した幅の下限は２００ｎｍである。凸状物および凹状物の密度が１平方マイクロメートル当たり１個未満となり、または１平方マイクロメートル当たり３０個を超えるようなコラーゲンまたはゼラチンのシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を可視領域中において発現させることが困難であり、さらに細胞培養用シートとして適用すると、細胞が通常のシャーレを用いて培養される場合と同様な経過をたどる傾向がある。コラーゲンまたはゼラチンのシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を可視領域中において発現させる観点から、２．５μｍ²を超える大きさ（面積）を有することが好ましい。コラーゲンまたはゼラチンのシートは、その大きさ（面積）に上限があるものではないが、細胞培養用シートなどとして使用される場面を考慮する限りにおいて、５００ｃｍ²を上限とすることができる。

【0030】

凸状物および凹状物は、上述した高さまたは深さが１μｍ以上となり、もしくは上述した幅が１μｍ以上となる場合、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現させることが困難となる。さらに、上述した高さまたは深さが１μｍを超え、もしくは上述した幅が１μｍを超える場合、細胞培養用シートとして適用すると、細胞は通常のシャーレを用いて培養される場合と同様な経過をたどることとなる。

【0031】

凸状物および凹状物は、等間隔に配置されていることが好ましい。すなわち、凸状物および凹状物は、ゼラチンシートおよびコラーゲンシートにおいて、いずれか一方の表面または両面に等間隔に配置されることが好ましい。これにより、これらのシートにおいてフォトニック結晶に起因する光学現象を強く発現させることができるとともに、細胞培養用シートとして適用した場合、細胞接着性を確実に変化させることができ、細胞を効率よくスフェロイド状に集合させることができる。

【0032】

凸状物および凹状物は、四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置されることがさらに好ましい。すなわち、凸状物および凹状物は、ゼラチンシートおよびコラーゲンシートにおいて、いずれか一方の表面または両面に四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置されることがさらに好ましい。特に、凸状物および凹状物は、ゼラチンシートおよびコラーゲンシートのいずれか一方の表面または両面に等間隔、かつ四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置されることが最も好ましい。これにより、これらのシートにフォトニック結晶に起因する光学現象を最も強く発現させることができるとともに、細胞培養用シートとして適用した場合、細胞接着性を劇的に変化させることができ、細胞を最も効率よくスフェロイド状に集合させることができる。

【0033】

ここで、三角配置とは、１の凸状物または凹状物を中心に据えたとき、その周りに６の凸状物または凹状物が、上記１の凸状物または凹状物から等距離に配置され、かつ隣り合う凸状物または凹状物同士も等距離に配置される配置状態をいう。四角配置とは、平面視において交点を有する２本の対角線を形成可能な相互に隣り合う４つの凸状物または凹状物を選択したとき、この対角線の交点から等距離に上記４つの凸状物または凹状物が配置される配置状態をいう。

【0034】

さらに、同心円状配置とは、１の凸状物または凹状物を中心に据えたとき、その周りに任意の数の凸状物または凹状物が、上記１の凸状物または凹状物から等距離かつ同心円状に配置される配置状態をいう。

【0035】

本発明に係るコラーゲンシートの一例を図１に示す。図１は、本実施形態に係るコラーゲンシートの表面を撮影した電子顕微鏡（ＳＥＭ）像の一例である。図１において、コラーゲンシートの表面には、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱形状である凸状物が、２３０ｎｍピッチの三角配置で、１平方マイクロメートル当たり５個存在している。このようなコラーゲンシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象を示し（たとえば、図２参照）、細胞培養用シートとして適用した場合、細胞接着性を変化させることができ、細胞をスフェロイド状に集合させることができる（たとえば、図６参照）。

【0036】

シートが有している凸状物または凹状物の形状、その大きさ（高さまたは深さ、および幅）ならびに密度は、いずれも電子顕微鏡（ＳＥＭ）により確認することができる。具体的には、シート上の凸状物または凹状物が形成されている任意の領域を１箇所（１視野）選択し、１０００〜５０００倍の倍率で観察することにより、凸状物または凹状物の形状、その大きさならびに密度を求めることができる。凸状物または凹状物の形状については、１視野に現れた凸状物または凹状物の中から複数を選んでその形状を確認する。凸状物または凹状物の大きさについては、１視野に現れた凸状物または凹状物のすべてを観察し、その平均値を算出して凸状物または凹状物の大きさとする。凸状物または凹状物の密度については、１視野に現れた凸状物または凹状物の数を確認し、これを１平方マイクロメートル当たりの個数に換算することにより、求めることができる。

【0037】

本実施形態において、凸状物または凹状物の形状、その大きさならびに密度は、シート上の任意の１箇所を観察し、その結果を求めることにより特定することができる。なぜならシート上の複数の箇所において凸状物または凹状物の形状、その大きさならびに密度を測定しても、個々の測定値と平均値とで有意な差を確認することができなかったためである。ここで、上記観察で明らかに異常値であると認識されたときは、その結果は除外されるべきである。

【0038】

≪シートの製造方法≫
本発明は、ゼラチンまたはコラーゲンのシートの製造方法に係る。このシートの製造方法において、凸状物および凹状物は、シートの表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつシートの表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。すなわち、シートの製造方法によりシートに形成される凸状物および凹状物は、上述の「＜凸状物および凹状物＞」の項で説明したとおりの形状、大きさおよび密度を有している。これにより、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるゼラチンまたはコラーゲンのシートを製造することができる。さらにシートの製造方法によりシートに形成される凸状物および凹状物は、四角配置、三角配置および同心円状配置から選ばれるいずれか１つの配置状態で配置されていることがさらに好ましい。

【0039】

＜ゼラチンシートの製造方法＞
本発明におけるゼラチンシートの製造方法は、４０〜８０℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａでゼラチンシートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、ゼラチンシートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含む。

【0040】

ここでゼラチンシートの製造方法において、鋳型を４０〜８０℃に加熱する理由は、シートの製造に用いるゼラチンの融点に基づく。本明細書において、融点（以下、単に「Ｔｍ」と記すこともある）とは、ゼラチンまたはコラーゲンのペプチド鎖が溶融する温度をいう。

【0041】

シートの製造に用いるゼラチンおよび後述するコラーゲンの融点は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ：Differential scanning calorimetry）を利用した以下の測定方法により決定することができる。すなわち、熱分析測定用パン（材質：アルミニウム）に１３ｍｇのコラーゲンシートまたはゼラチンシートの粉砕物を充填し、この熱分析測定用パンを１０℃／ｍｉｎで昇温することにより、熱量に対する温度の変化をＤＳＣ曲線（縦軸が熱流(Heat-Flow/mW)であり、横軸が温度である）として記録する。このとき標準物質は大気とする。その結果、得られるＤＳＣ曲線は、谷のピークを有する吸熱反応として現れ、そのピーク（最底点）の前後においてベースラインから変化のない温度領域が生じるため、この最底点が示す温度を融点と定める。これによりシートの製造に用いるゼラチンおよびコラーゲンの融点を決定することができる。

【0042】

ゼラチンシートの製造方法は、具体的には、まず鋳型がシートの製造に用いるゼラチンの融点に基づき、４０〜８０℃に加熱される。シートの製造に用いるゼラチンの融点は、その水溶液の濃度に依存するものの、標準的には９０℃前後である。したがって、ゼラチンシートを製造するときには、シートの製造に用いるゼラチンの融点よりわずかに低温の４０〜８０℃に鋳型を加熱する。鋳型の加熱温度が４０℃未満となれば、鋳型に形成されている凸状物および凹状物の刻印をシート上へ十分に転写することができない恐れがある。鋳型の加熱温度が８０℃を超えると、鋳型が接触することによりゼラチンシートそのものが溶出する恐れがある。鋳型の加熱温度は好ましくは、５０〜７０℃である。

【0043】

さらに、上記鋳型によりゼラチンシートのいずれか一方の表面または両面は、１０〜２０ＭＰａで刻印される。具体的には、シートの製造に用いるゼラチンが個別に有する強度（一般に「ゼリー強度」などと称される）に基づいて、刻印する圧力を１０〜２０ＭＰａの範囲内で適宜選択する。刻印する圧力が１０ＭＰａ未満となれば、鋳型に形成されている凸状物および凹状物の刻印をシート上へ十分に転写することができない恐れがある。刻印する圧力が２０ＭＰａを超えると、その圧力によってゼラチンシートそのものが破損する恐れがある。刻印する圧力は好ましくは１５〜２０ＭＰａである。

【0044】

鋳型の温度は、従来公知のホットプレス機またはナノインプリント装置を用い、これらの機器に搭載された温度計により測定することができる。刻印を転写する際の圧力は、これらの機器に搭載された圧力計により測定することができる。

【0045】

＜コラーゲンシートの製造方法＞
本発明におけるコラーゲンシートの製造方法は、６０〜１００℃に加熱された鋳型を用い、１０〜２０ＭＰａでコラーゲンシートのいずれか一方の表面または両面へ刻印することにより、コラーゲンシートに凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成する工程を含む。コラーゲンシートの製造方法において、鋳型を６０〜１００℃に加熱するのは、シートの製造に用いるコラーゲンの融点に基づく。

【0046】

コラーゲンシートの製造方法は、具体的には、まず鋳型がシートの製造に用いるコラーゲンの融点に基づき、６０〜１００℃に加熱される。シートの製造に用いるコラーゲンの融点は、その水溶液の濃度に依存するものの、標準的には１１０℃前後である。したがって、コラーゲンシートを製造するときには、シートの製造に用いるコラーゲンの融点よりわずかに低温の６０〜１００℃に鋳型を加熱する。鋳型の加熱温度が６０℃未満となれば、鋳型に形成されている凸状物および凹状物の刻印をシート上へ十分に転写することができない恐れがある。鋳型の加熱温度が１００℃を超えると、鋳型が接触することによりコラーゲンシートそのものが溶出する恐れがある。鋳型の加熱温度は好ましくは、７０〜９０℃である。

【0047】

さらに、上記鋳型によりコラーゲンシートのいずれか一方の表面または両面は、１０〜２０ＭＰａで刻印される。具体的には、シートの製造に用いるコラーゲンが個別に有する強度に基づいて、刻印する圧力を１０〜２０ＭＰａの範囲内で適宜選択する。刻印する圧力が１０ＭＰａ未満となれば、鋳型に形成されている凸状物および凹状物の刻印をシート上へ十分に転写することができない恐れがある。刻印する圧力が２０ＭＰａを超えると、その圧力によってコラーゲンシートそのものが破損する恐れがある。刻印する圧力は好ましくは１５〜２０ＭＰａである。

【0048】

コラーゲンシートを製造する際の鋳型の温度、および刻印を転写する際の圧力の測定は、それぞれゼラチンシートを製造する際の鋳型の温度、および刻印を転写する際の圧力の測定と同じ方法により測定することができる。

【0049】

以上により、本発明に係るシートの製造方法は、ゼラチンまたはコラーゲンのシートのいずれか一方の表面または両面に、シートの表面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつシートの表面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を、１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を形成することができる。これにより、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるゼラチンまたはコラーゲンのシートを製造することができる。

【0050】

≪シート作製用鋳型≫
本発明は、上述したシートの製造方法に用いるシート作製用鋳型に係る。シート作製用鋳型は、刻印面を備える。刻印面は、上記凸状物および凹状物のいずれか一方または両方を１平方マイクロメートル当たり１〜３０個有する領域を少なくとも含む。上記凸状物および凹状物は、刻印面に対して垂直方向の長さで表される高さまたは深さが１μｍ未満であり、かつ刻印面に対して平行方向の長さで表される幅が１μｍ未満である。このようなシート作製用鋳型により、その刻印面をゼラチンまたはコラーゲンのシートのいずれか一方の表面または両面へ容易に転写することができる。もって生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるゼラチンまたはコラーゲンのシートを提供することが可能となる。

【0051】

シート作製用鋳型の基材としては特に制限されるべきではなく、樹脂材料または金属材料を用いることができる。ただし、シート作製用鋳型は、ゼラチンまたはコラーゲンの融点まで加熱される可能性があるので、この温度に耐えられる程度の耐熱性を備えた材料である必要がある。さらに、従来公知の方法により、シート作製用鋳型に対し、凸状物および凹状物が上述の大きさおよび密度で存在する刻印面を形成することができる。すなわち、シート作製用鋳型の刻印面に形成される凸状物および凹状物は、上述の「＜凸状物および凹状物＞」の項で説明した凸状物および凹状物と同じ形状、大きさおよび密度を有している。

【実施例】

【0052】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0053】

＜実施例１＞
まず豚皮由来アテロコラーゲンの凍結乾燥物（商品名：「ｂｅＭａｔｒｉｘコラーゲンＦＤ」、新田ゼラチン株式会社製）を滅菌蒸留水に溶解させ、０．６質量％濃度、ｐＨ３．０の水溶液を調製し、この水溶液３００ｍＬをポリテトラフルオロエチレンでコートされたステンレス製トレー（縦２０７ｍｍ×横２４８ｍｍ×高さ３８ｍｍ）に流し込んだ。次に、このステンレス製トレー中の豚皮由来アテロコラーゲンへ向けて２０℃の風を送りながら、これを乾燥させることにより、縦２０７ｍｍ×横２４８ｍｍ×厚み１００μｍのコラーゲンシートを作製した。さらに、このコラーゲンシートの表面の一部（第１領域）にシクロオレフィンポリマーを基材とする鋳型を載置し、加えて市販のポリテトラフルオロエチレン製のシート（厚み０．２ｍｍ）で鋳型およびステンレストレーを挟み込んだ。この状態で、鋳型を９０℃に加熱し、かつ２０ＭＰａの圧力を与えて５分間維持することにより、鋳型の刻印面をコラーゲンシート上の第１領域に転写した。鋳型の刻印面には、深さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状に凹んだ凹状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されている。

【0054】

その結果、本実施例のコラーゲンシートは、鋳型の刻印面が転写された第１領域において、図２に示すようなフォトニック結晶に起因する光学現象が確認された。さらに図３に示すように、鋳型の刻印面が転写されたコラーゲンシートの表面の第１領域（図３の右上側）のみにおいて、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0055】

＜実施例２＞
本実施例では、鋳型の刻印面のコラーゲンシートへの転写に、加熱状態の酸が影響するか否かを検討した。このため本実施例では、実施例１と同じ方法により得たコラーゲンシートをｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液）により十分に洗浄し、そのｐＨを中和した。さらに、この中和されたコラーゲンシートへ、実施例１と同じ方法により鋳型の刻印面を転写した。

【0056】

その結果、本実施例のコラーゲンシートは、実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0057】

＜実施例３＞
まず酸処理豚皮由来ゼラチン（重量平均分子量１０００００、等電点９、ゼリー強度２８０）を５質量％濃度の水溶液となるように調製し、この水溶液３００ｍＬから実施例１と同じ方法によりゼラチンシート（縦２０７ｍｍ×横２４８ｍｍ×厚み１００μｍ）を作製した。さらに、このゼラチンシートの片面全面に実施例１で用いたのと同じ鋳型を載置し、実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン製のシートと同じもので鋳型およびステンレストレーを挟み込んだ。この状態で、鋳型を６０℃に加熱し、かつ２０ＭＰａの圧力を与えて１分間維持することにより、鋳型の刻印面をゼラチンシートに転写した。

【0058】

その結果、本実施例のゼラチンシートは、実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0059】

＜実施例４＞
まずアルカリ処理牛骨由来ゼラチン（重量平均分子量１７００００、等電点５、ゼリー強度２５０）を５質量％濃度の水溶液となるように調製し、それ以外については実施例３と同じ方法によりゼラチンシートを作製し、かつ実施例３と同じ方法により鋳型の刻印面をゼラチンシートに転写した。

【0060】

その結果、本実施例のゼラチンシートは、実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0061】

＜実施例５＞
まず酸処理豚皮由来ゼラチン（重量平均分子量１０００００、等電点９、ゼリー強度２８０）に１０質量％濃度のグリセリンを添加し、１５質量％濃度の水溶液となるように調製し、それ以外については実施例３と同じ方法によりゼラチンシートを作製し、かつ実施例３と同じ方法により鋳型の刻印面をゼラチンシートに転写した。

【0062】

その結果、本実施例のゼラチンシートは、実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。本実施例のゼラチンシートは、グリセリンを含むことにより、実施例１〜４のシートよりも柔軟であった。

【0063】

＜比較例１＞
実施例１と同じ方法によりコラーゲンシートを作製した。しかし本比較例では、実施例１で用いたのと同じ鋳型を２５℃に加熱し、２０ＭＰａの圧力を与えて５分間維持する条件により鋳型の刻印面をコラーゲンシートに転写した。

【0064】

その結果、本比較例のコラーゲンシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象が確認されず、かつ凸状物も確認することができなかった。

【0065】

＜比較例２＞
実施例１と同じ方法によりコラーゲンシートを作製した。しかし本比較例では、実施例１で用いたのと同じ鋳型を９０℃に加熱し、５ＭＰａの圧力を与えて５分間維持する条件により鋳型の刻印面をコラーゲンシートに転写した。

【0066】

その結果、本比較例のコラーゲンシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象が確認されず、かつ凸状物も確認することができなかった。

【0067】

＜比較例３＞
実施例３と同じ方法によりゼラチンシートを作製した。しかし本比較例では、実施例１で用いたのと同じ鋳型を９０℃に加熱し、２０ＭＰａの圧力を与えて１分間維持する条件により鋳型の刻印面をコラーゲンシートに転写した。

【0068】

その結果、本比較例のゼラチンシートは、フォトニック結晶に起因する光学現象が確認されず、かつ凸状物も確認することができなかった。

【0069】

上記実施例１〜５および比較例１〜３のシートに関し、これらの作製に用いたコラーゲンまたはゼラチンの組成、その濃度とともに、鋳型の刻印面を転写するための加熱温度、時間および圧力、ならびにフォトニック結晶に起因する光学現象が発現されたか否かについての一覧を表１に示す。

【0070】

【表1】

【0071】

＜考察＞
表１から、コラーゲンシートは、そのｐＨが酸性、中性であることを問わず、加熱温度、圧力および時間を適切に制御することにより、鋳型の刻印面を転写することができることが分かる。ゼラチンシートは、その等電点、原料種、ゼリー強度を問わず、加熱温度、圧力および時間を適切に制御することにより、鋳型の刻印面を転写することができることが分かる。コラーゲンシートは、鋳型の加熱温度が２５℃であると低温すぎ、さらに５ＭＰａの圧力でも低圧すぎることにより、鋳型の刻印面を転写することができなかった。ゼラチンシートは、鋳型の加熱温度が９０℃であると高温すぎることにより、鋳型の刻印面を転写することができなかった。

【0072】

＜比較例４＞
実施例１で用いたのと同じシクロオレフィンポリマーを基材とする鋳型上に、実施例１で用いたのと同じ豚皮由来アテロコラーゲンの水溶液を滴下し、室温の風を送りながら、これを乾燥させた。その結果、豚皮由来アテロコラーゲンの水溶液の粘度が高く、鋳型の刻印面へ該水溶液が浸透しなかったことから、刻印面のナノ構造が転写されたコラーゲンシートを調製することができなかった。

【0073】

＜実施例６＞
本実施例では、実施例１と同じ方法で作製したコラーゲンシートを５層積層し（以下、「多層コラーゲンシート」と記す）、この多層コラーゲンシートの最上層の全面に対し、実施例１と同じ条件により鋳型の刻印面を転写した。

【0074】

その結果、本実施例の多層コラーゲンシートは、実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。したがって、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるコラーゲンシートを厚みのあるものとして提供可能となることが分かった。

【0075】

＜実施例７＞
本実施例では、実施例１と同じ方法で作製したコラーゲンシートに、実施例１で用いたコラーゲン凍結乾燥物と同じものを重ねたもの（以下、「シート面含有コラーゲンスポンジ」と記す）を作製し、このシート面含有コラーゲンスポンジのシート面全面に実施例１と同じ条件により鋳型の刻印面を転写した。

【0076】

その結果、本実施例のシート面含有コラーゲンスポンジは、そのシート面において実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。したがって、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができるシート面を有するスポンジ状のコラーゲンを提供可能となる。これにより、コラーゲンシートに物理的強度を付与することができるため、細胞培養に用いた際には、細胞接着能の増強によってシートが収縮することなどを防ぐことができる。さらに細胞、組織の移植用基材として用いた際には、生体内のボリュームが必要な箇所への移植などに用いることができる。

【0077】

＜実施例８＞
本実施例では、実施例１と同じ方法で作製したコラーゲンシートの両面に、実施例１で用いたのと同じ鋳型を載置し、これらの鋳型およびステンレス製トレーを実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン製のシートと同じもので挟み込んだ。この状態で、鋳型を９０℃に加熱し、かつ２０ＭＰａの圧力を与えて５分間維持することにより、鋳型の刻印面をコラーゲンシートに転写した。

【0078】

その結果、本実施例のコラーゲンシートは、その両面において実施例１のコラーゲンシートと同様のフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、かつ高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されている様子が確認された。

【0079】

＜実施例９＞
本実施例では、実施例１で用いたのと同じ豚皮由来アテロコラーゲンの水溶液１３０ｍＬをアクリル板上に滴下し、室温で風を送りながら、これを乾燥させることにより、縦１５ｃｍ×横１５ｃｍ×厚み１００μｍのコラーゲンでコーティングされたアクリル板（以下、「複合シート」と記す）を作製した。次に、この複合シートのコラーゲンコーティングされた面の全面に、実施例１で用いたのと同じ鋳型を用い、実施例１と同じ条件で鋳型の刻印面を転写した。

【0080】

その結果、本実施例の複合シートは、そのコラーゲンコーティングされた面においてフォトニック結晶に起因する光学現象が確認され、かつ高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0081】

本実施例の複合シートは、アクリル板を含むことにより実施例１のコラーゲンシートよりも強度が付与されている。長期間の細胞培養では、細胞同士の引っ張る力が強くなることが知られるため、細胞が接着するシートに強度が不足していると、細胞によって該シートが収縮する傾向があった。このような場面に本実施例の複合シートを適用することにより、長期間の細胞培養に耐えるコラーゲンシートを提供することが可能となる。

【0082】

＜実施例１０＞
本実施例では、複数のゼラチン顆粒をゼリー強度の大きいものから順に、実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン製のシートと同じものの上に密に並べた（以下、「グラジエントゼラチンシート状物」という）。このグラジエントゼラチンシート状物に対し、実施例１で用いたのと同じ鋳型を載置し、加えて上記ポリテトラフルオロエチレン製のシートで鋳型およびグラジエントゼラチンシート状物を挟み込んだ。この状態で、実施例３の条件により鋳型の刻印面をグラジエントゼラチンシート状物に転写した。

【0083】

その結果、鋳型の温度でゼラチン顆粒が溶け出すとともに鋳型の刻印面が転写されることにより、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現するグラジエントゼラチンシートを得ることができた。このグラジエントゼラチンシートにおいて、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が、２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。

【0084】

さらに、このナノ構造が確認されたグラジエントゼラチンシート状物に対し、グルタルアルデヒドの雰囲気下にて化学架橋を導入した。このようなシートは、同一シート上に物性値の異なる領域が複数存在するモザイク状シートとなるため、たとえば同一シート上で硬さおよび等電点のいずれか一方または両方が異なる足場材料として細胞培養用途で提供することができる。近年、細胞の足場材料の硬さ、柔らかさが細胞の分化を決定する重要な要素の一つであるなどとして注目されている。さらに、同一シート上に分解性の異なる領域が複数存在するシートでもあるため、細胞培養用途において、シートの上面と下面との物質（情報伝達物質など）の移動を容易にするゼラチンシートを提供することも可能となる。

【0085】

＜実施例１１＞
本実施例では、ゼラチン顆粒を実施例１で用いたポリテトラフルオロエチレン製のシートと同じものの上に疎に並べた（以下、「疎グラジエントゼラチンシート状物」という）。この疎グラジエントゼラチンシート状物に対し、実施例１０と同じ方法により鋳型の刻印面を転写した。

【0086】

その結果、鋳型の温度でゼラチン顆粒が溶け出すとともに鋳型の刻印面が転写されることにより、シートに複数の穴が認められるゼラチンシート（以下、「穴開きゼラチンシート」と記す）を得ることができた。この穴開きゼラチンシートはフォトニック結晶に起因する光学現象を発現する領域において、高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物が２３０ｎｍピッチで三角配置されたナノ構造が確認された。この穴開きゼラチンシートに、複数の穴が認められた理由は、ゼラチン顆粒を疎に並べたためである。さらに、このナノ構造が確認された疎グラジエントゼラチンシート状物に対し、グルタルアルデヒドの雰囲気下にて化学架橋を導入することにより、通常の細胞培養に耐えうる強度を得た。

【0087】

本シートは、たとえば、上述のナノ構造に抗体をアンカーリングさせるといった操作をさらに施すことにより、以下のような用途のゼラチンシートの提供が可能となる。すなわち、ゼラチンシートのナノ構造の無い領域（表面）で細胞培養を行ない、細胞から生じる液性因子を、シートの穴を通じて裏面にあるナノ構造にアンカーリングさせた抗体で感知させることにより、ナノ構造内で抗原抗体反応を起こす。その結果、この反応に基づいて光の屈折率が変化することを利用することにより、液性因子に含まれる物質（情報伝達物質など）のバイオインジケーターとしての用途を期待することができる。

【0088】

さらに、マトリックスメタロプロテアーゼを含む各種の酵素は、基質特異的にコラーゲンまたはゼラチンを分解することが知られている。その一方で、ゼラチンシートおよびコラーゲンシートに使用する材料は、それぞれＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンあるいはＩＶ型コラーゲン、またはゼラチンを単独または複数混合して調製することができる。このため、酵素の基質特異性を利用することにより、シート上の局所的なナノ構造の分解を目視でまたはレーザーなどで分析することを通じ、酵素活性の定性または定量評価を行なうツールとしてゼラチンシートまたはコラーゲンシートを利用することが可能となる。ナノ構造の分解消失を目視確認できることにより、簡易的なインジケーターとしても使用することができる。

【0089】

＜実施例１２＞
本実施例では、実施例１のコラーゲンシートを用い、以下の方法を用いて細胞培養を行なった。すなわち、ウエルの数が６つのプレート（商品名：「組織培養用マイクロプレート ６ｗｅｌｌ」、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）の各ウエルに、正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＮＢ）（商品名：「凍結ＮＨＤＦ（ＮＢ）」、倉敷紡績株式会社製）を、１ウエルあたり２０万個／２．５ｍＬの割合で播種し、さらにＰＢＳにより中和洗浄後の実施例１のコラーゲンシート（ｐＨ７．４）を各ウエルに浸漬し、３７℃、５体積％ＣＯ₂の雰囲気で２日間、細胞培養を行なった。

【0090】

その結果、図４に示すように、実施例１のコラーゲンシートの鋳型の刻印面が転写された第１領域（図４中、矢印よりも右側）において細胞は接着せず、シートに対して忌避していた。一方、鋳型の刻印面が転写されていない第２領域（図４中、矢印よりも左側）で細胞は接着し、進展していた。比較例１のコラーゲンシートを用いて上述した細胞培養を行なったところ、図５に示すように細胞はその全面に接着し、進展していた。したがって、２３０ｎｍピッチで三角配置されている高さが２００ｎｍ、幅（径）が２３０ｎｍの円柱状の凸状物（ナノ構造）が、細胞の接着性を制限していることが分かった。

【0091】

ここで図５中の矢印は、上述のとおり比較例１のコラーゲンシートには刻印面が転写されなかったものの、その転写を試みた領域（第１領域）とそれ以外の領域（第２領域）との境界を示すために付したものである。

【0092】

＜実施例１３＞
本実施例では、実施例１のコラーゲンシートの第１領域を用い、以下の方法を用いて細胞培養を行なった。すなわち、ウエルの数が６つのプレート（商品名：「組織培養用マイクロプレート ６ｗｅｌｌ」、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）の各ウエルの底面をＰＢＳで洗浄した後、実施例１のコラーゲンシートの第１領域の部分を各ウエルに載置した。さらに正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＮＢ）（商品名：「凍結ＮＨＤＦ（ＮＢ）」、倉敷紡績株式会社製）が３０００個／ｍＬの濃度に調製された細胞懸濁液を準備した。この細胞懸濁液を各ウエルのコラーゲンシートへ向けて２０μＬずつ滴下し、３７℃、５体積％ＣＯ₂の雰囲気で２日間、細胞培養を行なった。

【0093】

その結果、図６に示すように、実施例１のコラーゲンシートの第１領域において細胞は接着することなく、通常の細胞培養でみられる進展、増殖などが認められなかった。特に、細胞が集合し、凝集することにより複数の小さな細胞塊（スフェロイド：図６において白色の塊状）となっていることが認められた。このような細胞忌避効果は通常のコラーゲンシートおよびゼラチンシートでは認められない効果である。したがって、本発明に係るコラーゲンシートまたはゼラチンシートは絆創膏の用途として、たとえば裂傷した皮膚組織において皮膚浸出液ならびに細胞を、シート上に吸着させることなく、目的の皮膚組織に届けることにより、治療を促進および進展させることが期待できる。

【0094】

以上より、本発明に係るゼラチンまたはコラーゲンのシートは、生体適合性を有し、フォトニック結晶に起因する光学現象を発現することができ、かつ細胞接着能を制御することができるシートとして提供可能であることが理解される。ゼラチンまたはコラーゲンのシートは、細胞接着を忌避する基材としてたとえば、手術後の細胞および組織の癒着を防止する医療機器としての活用を見込める。ゼラチンまたはコラーゲンのシートは、通常の細胞培養では実現されない立体的な細胞塊（組織）を形成するための基材となる可能性もある。さらに、生体適合性を有し、かつフォトニック結晶に起因する光学現象を利用した新たな光センサ、光デバイスへの展開を図ることも可能である。

【0095】

以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせたり、様々に変形したりすることも当初から予定している。

【0096】

今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】