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特許6863380ムチン酸生産能を有する微生物並びにムチン酸、２，５−フランジカルボン酸及び２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6863380
(24)【登録日】2021年4月5日
(45)【発行日】2021年4月21日
(54)【発明の名称】ムチン酸生産能を有する微生物並びにムチン酸、２，５−フランジカルボン酸及び２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/15 20060101AFI20210412BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20210412BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20210412BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20210412BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20210412BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20210412BHJP
C12N 15/61 20060101ALI20210412BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20210412BHJP
C12P 7/44 20060101ALI20210412BHJP
C12P 17/04 20060101ALI20210412BHJP
【ＦＩ】
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/31
C12N15/54
C12N15/53
C12N15/61
C12N15/55
C12P7/44ZNA
C12P17/04
【請求項の数】10
【全頁数】37
(21)【出願番号】特願2018-527578(P2018-527578)
(86)(22)【出願日】2017年7月7日
(86)【国際出願番号】JP2017024963
(87)【国際公開番号】WO2018012426
(87)【国際公開日】20180118
【審査請求日】2018年12月25日
(31)【優先権主張番号】特願2016-138802(P2016-138802)
(32)【優先日】2016年7月13日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱ケミカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】湯村 秀一
(72)【発明者】
【氏名】谷口 岳志
【審査官】
藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】
欧州特許出願公開第０２５４６３３６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２０１４／０２０６０４７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２０１２／００４５８０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開２００８−１２７２８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
欧州特許出願公開第０２７２３９４５（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
欧州特許出願公開第０２７２３９４６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
特開２００７−３３２１４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１４／１８２１７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Metabolic Engineering (2013) Vol.18, pp.78-85
【文献】
Applied and Environmental Microbiology (2010) Vol.76, No.1, pp.169-175
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性と、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性と、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性が、
非改変株と比較して増強するように改変された、
大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つである、微生物。
非改変株と比較して増強するように改変された、
大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つである、微生物。
【請求項2】
さらに、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を水性媒体中で有機原料に作用させることを特徴とするムチン酸の製造方法であって、
前記有機原料が、グルコース、スクロース、およびラクトースからなる群より選ばれる１種類以上を含む、製造方法。
前記有機原料が、グルコース、スクロース、およびラクトースからなる群より選ばれる１種類以上を含む、製造方法。
【請求項5】
ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性と、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性とが非改変株と比較して増強するように改変された、
大腸菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つである、微生物。
大腸菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つである、微生物。
【請求項6】
さらに、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトースピロホスホリラーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項５に記載の微生物。
【請求項7】
さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された、請求項５または請求項６に記載の微生物。
【請求項8】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の微生物を水性媒体中で有機原料に作用させることを特徴とするムチン酸の製造方法であって、
前記有機原料が、グルコース、スクロース、ガラクトース、およびラクトースからなる群より選ばれる１種類以上を含む、製造方法。
前記有機原料が、グルコース、スクロース、ガラクトース、およびラクトースからなる群より選ばれる１種類以上を含む、製造方法。
【請求項9】
請求項４または８に記載の方法によりムチン酸を製造する工程、および前記工程で得られたムチン酸を２，５−フランジカルボン酸へ変換する工程を含む、２，５−フランジカルボン酸の製造方法。
【請求項10】
請求項４または８に記載の方法によりムチン酸を製造する工程、および前記工程で得られたムチン酸を２，５−フランジカルボン酸ジエステルへ変換する工程を含む、２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ムチン酸生産能を有する新規な微生物およびそれを用いたムチン酸の製造方法に関するものである。また、該製造方法で得られたムチン酸を原料とする２，５−フランジカルボン酸、２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法にも関する。【背景技術】
【0002】
ムチン酸は、ガラクトースの１位のホルミル基（−ＣＨＯ）と、主鎖の末端のヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）が共にカルボキシル基となったジカルボン酸であり、（ｍｅｓｏ）−ガラクタル酸とも呼ばれる。ムチン酸は、新規ポリマー原料として注目されている２，５−フランジカルボン酸や、２，５−フランジカルボン酸ジエステルの原料となるなど、様々な有用化学品へ誘導可能なバイオマス由来の基幹化合物として期待されている。【0003】
ムチン酸は、ガラクトースの硝酸酸化によって合成できることが知られているが、この方法は高温高圧条件での酸化反応であることや、環境汚染の原因となる窒素酸化物が副生することなどの問題があった。そのため、常温常圧下において高い選択率での合成が可能な酵素変換や発酵による生産が試みられてきた。【0004】
特許文献１には、ガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した真菌を用いることにより、ガラクツロン酸を原料としてムチン酸を製造する方法が開示されている。また、非特許文献１には、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ遺伝子を大腸菌に導入して発現させることにより、ＵＤＰ−ガラクツロン酸を基質としてガラクツロン酸−１−リン酸を生成する活性が検出されたことが記載されている。
【0005】
また、非特許文献２には、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ遺伝子を大腸菌に導入して発現させることにより、ＵＤＰ−グルクロン酸を基質としてＵＤＰ−ガラクツロン酸を生成する活性が検出されたことが記載されている。また、非特許文献３には、古細菌のＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ由来ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼにおいて、ＵＤＰ−グルコースだけでなくＵＤＰ−ガラクトースも基質として認識し、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性が検出されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１０／０７２９０２号パンフレット
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．２８５（２），ｐ８７８−８７
【非特許文献2】Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，Ｖｏｌ．３１（２），ｐ７０３−１３
【非特許文献3】Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．７５（４），ｐ１０４７−５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、ガラクツロン酸を原料として使用する必要があり、一般的な有機原料からはムチン酸を製造することができない。そのため、グルコースなどの安価で容易に入手可能な有機原料を使用してムチン酸を製造する方法が望まれていた。また、非特許文献１に記載の方法は、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ遺伝子を発現させ、その酵素活性を確認しただけで、ムチン酸を製造することに関しては何ら記載も示唆もない。
【0009】
また、非特許文献２に記載の方法は、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ遺伝子を発現させ、その酵素活性を確認しただけで、ムチン酸を製造することに関しては何ら記載も示唆もない。さらに、非特許文献３に記載の方法は、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性を有するＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼが開示されているが、ムチン酸を製造することに関しては何ら記載も示唆もない。
本発明の課題は、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料を使用して効率的にムチン酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、グルコースまたはガラクトースを出発物質として用い、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する新たな反応工程により、ムチン酸を製造できることを見出した。さらに、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性から選択される１種類以上の酵素活性とを増強するように微生物を改変することにより、グルコースまたはガラクトースからムチン酸を生合成する代謝経路を構築することができ、前記反応工程を含むムチン酸の製造方法に好適であることを見出し、本発明を完成させた。
【0011】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。［１］ムチン酸の製造方法であって、グルコースまたはガラクトースを出発物質または中間体として用い、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する、ムチン酸の製造方法。
［２］グルコースを出発物質または中間体として用い、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する、［１］に記載のムチン酸の製造方法。
［３］ＵＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクツロン酸との間にＵＤＰ−グルクロン酸を中間体として経由する、［２］に記載のムチン酸の製造方法。
［４］ＵＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクツロン酸との間にＵＤＰ−ガラクトースを中間体として経由する、［２］に記載のムチン酸の製造方法。
［５］ガラクトースを出発物質または中間体として用い、
ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する、［１］に記載のムチン酸の製造方法。
［６］ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性から選択される１種類以上の酵素活性とが、非改変株と比較して増強するように改変された微生物。
［７］ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［６］に記載の微生物。
［８］さらに、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［７］に記載の微生物。
［９］さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された、［７］また［８］に記載の微生物。
［１０］ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［６］に記載の微生物。
［１１］さらに、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトースピロホスホリラーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［１０］に記載の微生物。
［１２］さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された、［１０］または［１１］に記載の微生物。
［１３］前記微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［６］〜［１２］のいずれかに記載の微生物。
［１４］［６］〜［１３］のいずれかに記載の微生物またはその処理物を水性媒体中で有機原料に作用させることを特徴とするムチン酸の製造方法。
［１５］前記有機原料が、グルコース、スクロース、ガラクトース、およびラクトースからなる群より選ばれる１種類以上を含む、［１４］に記載のムチン酸の製造方法。
［１６］［１］〜［５］、［１４］または［１５］に記載の方法によりムチン酸を製造する工程、および前記工程で得られたムチン酸を２，５−フランジカルボン酸へ変換する工程を含む、２，５−フランジカルボン酸の製造方法。
［１７］［１］〜［５］、［１４］または［１５］に記載の方法によりムチン酸を製造する工程、および前記工程で得られたムチン酸を２，５−フランジカルボン酸ジエステルへ変換する工程を含む、２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料からムチン酸を製造することができる。また、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料からムチン酸の生合成が可能な微生物を作製することができ、このような本発明の微生物を用いることにより、ムチン酸を効率的に製造することができる。【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。【0015】
＜第一のムチン酸の製造方法＞本発明者らが見出したムチン酸の製造方法は、グルコースまたはガラクトースを出発物質または中間体として用い、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する反応工程を含む。このような反応工程を経ることで、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料を用いるムチン酸の製造が可能となる。
【0016】
グルコースを出発物質または中間体として用いる場合は、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する反応工程を含むことが好ましい。この場合、ＵＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクツロン酸との間にＵＤＰ−グルクロン酸を中間体として経由する反応工程、またはＵＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクツロン酸との間にＵＤＰ−ガラクトースを中間体として経由する反応工程を含むことがより好ましい。【0017】
グルコースを出発物質または中間体として用いる場合の反応経路について、図１を参照しながら説明するが、これに特に限定されない。反応は、グルコースを出発原料として開始してもよいし、他の出発原料から適当な反応で生成されたグルコースから開始してもよい。グルコースは、例えば、リン酸化反応によりグルコース−６−リン酸になり、さらにリン酸転移反応によりグルコース−１−リン酸を経て、脱リン酸及びＵＤＰ付加反応によりＵＤＰ−グルコースになる。ＵＤＰ−グルコースは、例えば、酸化反応によりＵＤＰ−グルクロン酸になり、さらに異性化反応によりＵＤＰ−ガラクツロン酸に至る。または、ＵＤＰ−グルコースは、例えば、先に異性化反応によりＵＤＰ−ガラクトースになり、さらに酸化反応によりＵＤＰ−ガラクツロン酸に至る。ＵＤＰ−ガラクツロン酸は、例えば、脱ＵＤＰ及びリン酸付加反応によりガラクツロン酸−１−リン酸を経て、さらに脱リン酸反応によりガラクツロン酸になる。ガラクツロン酸の酸化反応を受けることにより、目的とするムチン酸が生成する。
【0018】
ガラクトースを出発物質または中間体として用いる場合は、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクツロン酸、及びガラクツロン酸を順に中間体として経由する反応工程を含むことが好ましい。【0019】
ガラクトースを出発物質または中間体として用いる場合の反応経路について、図１を参照しながら説明するが、これに特に限定されない。反応は、ガラクトースを出発原料として開始してもよいし、他の出発原料から適当な反応で生成されたガラクトースから開始してもよい。ガラクトースは、例えば、リン酸化反応によりガラクトース−１−リン酸になり、さらに脱リン酸及びＵＤＰ付加反応によりＵＤＰ−ガラクトースを経て、さらに酸化反応によりＵＤＰ−ガラクツロン酸に至る。ＵＤＰ−ガラクツロン酸は、前述のように例えば、脱ＵＤＰ及びリン酸付加反応によりガラクツロン酸−１−リン酸を経て、さらに脱リン酸反応によりガラクツロン酸になる。ガラクツロン酸の酸化反応を受けることにより、目的とするムチン酸が生成する。
【0020】
本発明の第一のムチン酸の製造方法は、いずれの手法で行ってもよく、例えば、微生物の代謝経路を利用した生合成による方法、酵素反応を用いるインビトロでの合成方法、化学合成による方法などが挙げられる。これらのうち、微生物による生合成が特に好適なので、以降に詳述する。【0021】
＜本発明の微生物＞本発明の微生物は、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性から選択される１種類以上の酵素活性とが、非改変株と比較して増強するように改変された微生物である。
【0022】
これまで、多種多様な微生物において、ＵＤＰ−グルコースの生合成経路が見出されており、さらに、本代謝物からＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−ガラクトースを合成できることも一般的に知られている。そこで、本発明者らはＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性と、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性から選択される１種類以上の酵素活性とが、増強するように微生物を改変することによって、ＵＤＰ−グルクロン酸またはＵＤＰ−ガラクトースからムチン酸を合成する代謝経路を構築することができることを見出した。ここで、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強するように微生物を改変することが好ましく、この場合は、ＵＤＰ−グルクロン酸からムチン酸を合成する代謝経路が構築される。また、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強するように微生物を改変することも好ましく、この場合は、ＵＤＰ−ガラクトースからムチン酸を合成する代謝経路が構築される。
【0023】
なお、これらの代謝経路でムチン酸を合成するためには、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼによって生じるガラクツロン酸−１−リン酸が脱リン酸化され、ガラクツロン酸へ変換されなければならないが、一般的に、脱リン酸化反応を触媒するホスファターゼは基質特異性が低く、通常、宿主となる微生物が保有する同酵素はこのガラクツロン酸−１−リン酸を基質として認識し、ガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性を有する。【0024】
上述の通り、酵素活性を増強する改変を行うことによって、ムチン酸生産能を有する微生物を作製することができる。本発明において、「ムチン酸生産能」とは、微生物を培地中で培養したときに、該微生物が該培地中にムチン酸を生成蓄積することができることをいう。ムチン酸は、ガラクトースの１位のホルミル基（−ＣＨＯ）と、主鎖の末端のヒドロキシメチル基（−ＣＨ２ＯＨ）が共にカルボキシル基となったジカルボン酸であり、（ｍｅｓｏ）−ガラクタル酸とも呼ばれる。
【0025】
上述した酵素活性を増強する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、それぞれの酵素をコードする外来の遺伝子を導入する、または内在の遺伝子の発現を強化するなど、公知の方法を採用することができる。【0026】
本発明で用いる微生物は、特に限定されないが、ＵＤＰ−グルクロン酸、または、ＵＤＰ−ガラクトースを合成できる代謝経路を有する微生物が好ましい。具体的には、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選択される微生物であることが好ましい。その中でも、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、糸状菌、および酵母からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくは大腸菌、コリネ型細菌、酵母であり、特に好ましくは大腸菌、酵母である。
【0027】
本発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等が挙げられ、Ｋ１２株、Ｂ株、またはこれらの誘導体であるＢＷ２５１１３、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＨ２、ＴＯＰ１０などを用いることができる。【0028】
本発明で使用可能なコリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌である。【0029】
本発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９１， Ｖｏｌ．４１， ｐ２５５−２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株とする。【0030】
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。【0031】
本発明で使用可能なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等が挙げられる。本発明で使用可能なラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）等が挙げられる。
【0032】
本発明で使用可能なアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。本発明で使用可能なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌としては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・ベロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ）、シュードモナス・ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【0033】
本発明で使用可能な糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属等が挙げられる。上記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
上記ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）等が挙げられる。
上記リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属では、リゾパス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等が挙げられる。
上記ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属では、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａｊｅｃｏｒｉｎａ）等が挙げられる。なお、この菌の不完全世代はトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）である。
【0034】
本発明で使用可能な酵母としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等が挙げられる。
【0035】
上記サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）等が挙げられる。上記シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
上記キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属としては、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・ボイディニィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、キャンディダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。
上記ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）等が挙げられる。
【0036】
上記クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属としては、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。上記ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等が挙げられる。
上記チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属としては、チゴサッカロミセス・バイリィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
【0037】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。【0038】
本発明の微生物は、上述したようにＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変すること、または、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変することによって得ることができる。【0039】
本発明において、「ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧＬＥとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルクロン酸を異性化してＵＤＰ−ガラクツロン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．６）をいう。「ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強する」とは、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＵＤＰ−ＧＬＥ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＭｕｎｏｚらの方法（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，Ｖｏｌ．３１（２），ｐ７０３−１３）により、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性を測定することによって確認することができる。【0040】
ＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法としては、例えば、親株を変異剤によって処理する方法、ＵＤＰ−ＧＬＥをコードするｃａｐ１Ｊ遺伝子のコピー数を高める方法、ｃａｐ１Ｊ遺伝子やｃａｐ１Ｊ遺伝子のプロモーターを改変する方法などが挙げられる。さらに、これらＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法を複数組み合わせてもよい。【0041】
以下、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強するように改変された株の具体的な作製方法について説明する。ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強された株は、親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が上昇した株を選択することによって得ることができる。また、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強された株は、ｃａｐ１Ｊ遺伝子を用いて改変することによっても得ることができる。具体的には、ｃａｐ１Ｊ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、ｃａｐ１Ｊ遺伝子を含むベクターで形質転換すること、または相同組換え法等の手法によって染色体上に該遺伝子を導入し、染色体上で多コピー化させることなどによって達成できる。
【0042】
さらに、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上のｃａｐ１Ｊ遺伝子に変異を導入することによって、ｃａｐ１Ｊ遺伝子がコードするタンパク質１分子当たりのＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増加させることによっても達成できる。また、ｃａｐ１Ｊ遺伝子の発現が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上でｃａｐ１Ｊ遺伝子のプロモーターへ変異を導入すること、より強力なプロモーターへ置換することなどでｃａｐ１Ｊ遺伝子を高発現化させることによっても達成できる。
【0043】
ＵＤＰ−ＧＬＥ活性の増強に用いるｃａｐ１Ｊ遺伝子としては、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の遺伝子を挙げることができる。さらに、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｃａｐ１Ｊ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｃａｐ１Ｊ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＵＤＰ−ＧＬＥ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｃａｐ１Ｊ遺伝子を用いてもよい。
【0044】
上記のようにして単離されたＵＤＰ−ＧＬＥをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能なように挿入することにより、ＵＤＰ−ＧＬＥ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強するように改変された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＵＤＰ−ＧＬＥをコードするＤＮＡを発現可能なように組み込むことによってもＵＤＰ−ＧＬＥ活性が増強するように改変された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。【0045】
染色体上またはプラスミド上にｃａｐ１Ｊ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｃａｐ１Ｊ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。【0046】
本発明において、「ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−ガラクツロン酸からガラクツロン酸−１−リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．６４）をいう。「ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性が増強する」とは、ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＤａｍｅｒｏｗらの方法（Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．２８５（２），ｐ８７８−８７）により、ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性を測定することによって確認することができる。【0047】
ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性の増強に用いる遺伝子としては、ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）由来のＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子を挙げることができる。
さらに、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来の遺伝子を使用することもできる。ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子とのホモロジー等に基づいてＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＵＤＰ−ＧａｌＡＰＰａｓｅ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類の遺伝子を用いてもよい。
【0048】
本発明において、「ガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧａｌＡＤＨとも呼ぶ）活性」とは、ガラクツロン酸を酸化してムチン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２０３）をいう。「ＧａｌＡＤＨ活性が増強する」とは、ＧａｌＡＤＨ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＡＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＡＤＨ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＹｏｏｎらの方法（Ｊ. Ａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００９，Ｖｏｌ．１９１（５），ｐ１５６５−７３）により、ＧａｌＡＤＨ活性を測定することによって確認することができる。【0049】
ＧａｌＡＤＨ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＡＤＨ活性の増強に用いる遺伝子としては、ＧａｌＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のｕｄｈ遺伝子、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のｕｄｈ遺伝子を挙げることができる。
さらに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）やシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来の遺伝子を使用することもできる。ｕｄｈ遺伝子とのホモロジー等に基づいてＧａｌＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＡＤＨ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類の遺伝子を用いてもよい。
【0050】
本発明において、「ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＤＨとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−ガラクトースを酸化してＵＤＰ−ガラクツロン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性が増強する」とは、ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＹｕｒｉｓｔ−Ｄｏｕｔｓｃｈらの方法（Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．７５（４），ｐ１０４７−５８）により、ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性を測定することによって確認することができる。【0051】
ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性の増強に用いる遺伝子としては、ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）由来のａｇｌＭ遺伝子を挙げることができる。
さらに、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来の遺伝子を使用することもできる。ａｇｌＭ遺伝子とのホモロジー等に基づいてＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＵＤＰ−ＧａｌＤＨ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類の遺伝子を用いてもよい。
【0052】
ムチン酸の生産性を向上させるためには、ＵＤＰ−グルクロン酸からムチン酸の生合成経路を構築することに加えて、グルコースからＵＤＰ−グルクロン酸を経由してムチン酸を生合成する代謝経路において律速となる反応を触媒する酵素活性を増強することが有効である。【0053】
したがって、本発明の微生物は、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変する場合は、これらに加えて、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変されることが好ましい。ムチン酸の生産性をより向上させるためには、これら酵素活性のうち、好ましくは、２種類以上、より好ましくは、３種類以上、さらに好ましくは、４種類以上、特に好ましくは、５種類全ての活性を増強するような改変を行うことが望ましい。【0054】
また、ムチン酸の生産性を向上させるためには、ＵＤＰ−ガラクトースからムチン酸の生合成経路を構築することに加えて、グルコースまたはガラクトースからＵＤＰ−ガラクトースを経由してムチン酸を生合成する代謝経路において律速となる反応を触媒する酵素活性を増強することが有効である。【0055】
したがって、本発明の微生物は、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変する場合は、これらに加えて、グルコキナーゼ活性、ホスホグルコムターゼ活性、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ガラクトキナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトースピロホスホリラーゼ活性、およびガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して増強するように改変されることが好ましい。ムチン酸の生産性をより向上させるためには、これら酵素活性のうち、好ましくは、２種類もしくは３種類以上、より好ましくは、４種類もしくは５種類以上、さらに好ましくは、６種類もしくは７種類以上、特に好ましくは、８種類全ての活性を増強するような改変を行うことが望ましい。【0056】
本発明において、「グルコキナーゼ（以下、ＧＬＫとも呼ぶ）活性」とは、グルコースをリン酸化してグルコース−６−リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１、２．７．１．２）をいう。「ＧＬＫ活性が増強する」とは、ＧＬＫ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧＬＫ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧＬＫ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＷｕらの方法（ＰＬｏＳ. ＯＮＥ，２０１１，Ｖｏｌ．６（８），ｐ ｅ２３１７２））、ＦＥＲＮＡＮＤＥＺらの方法（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８５、Ｖｏｌ．１３１，ｐ２７０５−２７０９）、またはＭＥＹＥＲらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１７９（４），ｐ１２９８−３０６）により、ＧＬＫ活性を測定することによって確認することができる。【0057】
ＧＬＫ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧＬＫ活性の増強に用いるｇｌｋ遺伝子としては、ＧＬＫ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｇｌｋ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｇｌｋ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｇｌｋ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧＬＫ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧＬＫ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｇｌｋ遺伝子を用いてもよい。
【0058】
本発明において、「ホスホグルコムターゼ（以下、ＰＧＭとも呼ぶ）活性」とは、グルコース−６−リン酸の分子内転移によりグルコース−１−リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．４．２．２）をいう。「ＰＧＭ活性が増強する」とは、ＰＧＭ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＰＧＭ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＰＧＭ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，１９６９，Ｖｏｌ．２４４（４），ｐ９１０−６）またはＷａｌｔｈｅｒらの方法（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，２０１２、Ｖｏｌ．５８６（２３），４１１４−８）により、ＰＧＭ活性を測定することによって確認することができる。【0059】
ＰＧＭ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＰＧＭ活性の増強に用いるｐｇｍ遺伝子としては、ＰＧＭ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｐｇｍ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｐｇｍ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｐｇｍ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＰＧＭ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＰＧＭ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｐｇｍ遺伝子を用いてもよい。
【0060】
本発明において、「グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＵＦとも呼ぶ）活性」とは、ＵＴＰとグルコース−１−リン酸からＵＤＰ−グルコースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．９）をいう。「ＧａｌＵＦ活性が増強する」とは、ＧａｌＵＦ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＵＦ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＵＦ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＹｕらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０１２，Ｖｏｌ．４４２（２），ｐ２８３−９１）またはＷＥＩＳＳＯＢＲＮらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，Ｖｏｌ．１７６（９），ｐ２６１１−８）により、ＧａｌＵＦ活性を測定することによって確認することができる。【0061】
ＧａｌＵＦ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＵＦ活性の増強に用いるｇａｌＵ遺伝子及びｇａｌＦ遺伝子としては、ＧａｌＵＦ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｇａｌＵ遺伝子及びｇａｌＦ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｇａｌＵ遺伝子及びｇａｌＦ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｇａｌＵ遺伝子及びｇａｌＦ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧａｌＵＦ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＵＦ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｇａｌＵ遺伝子及びｇａｌＦ遺伝子を用いてもよい。
【0062】
本発明において、「ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＴとも呼ぶ）活性」とは、ガラクトース−１−リン酸とＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースとグルコース−１−リン酸を生成する反応を触媒する活性、または、その逆反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．１２）をいう。「ＧａｌＴ活性が増強する」とは、ＧａｌＴ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＴ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＴ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＬｉらの方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ．５６（５），ｐ７７２−８０）またはＧｅｅｇａｎａｇｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，Ｖｏｌ．３８（４０），ｐ１３３９８−４０６またはＢｉｏｃｈｅｍ．，２０００，３９（１８），ｐ５３９７−４０４）により、ＧａｌＴ活性を測定することによって確認することができる。【0063】
ＧａｌＴ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＴ活性の増強に用いるｇａｌＴ遺伝子としては、ＧａｌＴ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｇａｌＴ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｇａｌＴ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｇａｌＴ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧａｌＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＴ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｇａｌＴ遺伝子を用いてもよい。
【0064】
本発明において、「ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ（以下、ＵＧＤとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルコースを酸化してＵＤＰ−グルクロン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２２）をいう。「ＵＧＤ活性が増強する」とは、ＵＧＤ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＵＧＤ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＵＧＤ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｇｎｉらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，Ｖｏｌ．１４５，ｐ１０４９−５３）、Ｓｅｎｎｅｔらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１２，Ｖｏｌ．５１（４６），ｐ９３６４−７４）またはＫａｄｉｒｖｅｌｒａｊ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１３，Ｖｏｌ．５２（８），ｐ１４５６−６５）により、ＵＧＤ活性を測定することによって確認することができる。【0065】
ＵＧＤ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＵＧＤ活性の増強に用いるｕｇｄ遺伝子としては、ＵＧＤ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｕｇｄ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｕｇｄ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｕｇｄ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＵＧＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＵＧＤ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｕｇｄ遺伝子を用いてもよい。
【0066】
本発明において、「ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ（以下、ＧａｌＥとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルコースを異性化してＵＤＰ−ガラクトースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．２）をいう。「ＧａｌＥ活性が増強する」とは、ＧａｌＥ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＥ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＥ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＤａｅｎｚｅｒらの方法（ＰＬｏＳ. Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，Ｖｏｌ．８（５），ｐ ｅ１００２７２１）またはＫｉｍらの方法（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，Ｖｏｌ．１６３（３），ｐ４４４−５１）により、ＧａｌＥ活性を測定することによって確認することができる。【0067】
ＧａｌＥ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＥ活性の増強に用いるｇａｌＥ遺伝子としては、ＧａｌＥ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｇａｌＥ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｇａｌＥ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｇａｌＥ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧａｌＥ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＥ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｇａｌＥ遺伝子を用いてもよい。
【0068】
本発明において、「ガラクトキナーゼ（以下、ＧａｌＫとも呼ぶ）活性」とは、ガラクトースをリン酸化してガラクトース−１−リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．６）をいう。「ＧａｌＫ活性が増強する」とは、ＧａｌＫ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＫ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＫ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＴｅｄｅｓｃｏらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９６９，Ｖｏｌ．４８（１２），ｐ２３９０-７）またはＨｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒらの方法（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００４Ｖｏｌ．５（７），ｐ９８９−９２）により、ＧａｌＫ活性を測定することによって確認することができる。【0069】
ＧａｌＫ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＫ活性の増強に用いるｇａｌＫ遺伝子としては、ＧａｌＫ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のｇａｌＫ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のｇａｌＫ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｇａｌＫ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧａｌＫ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＫ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｇａｌＫ遺伝子を用いてもよい。
【0070】
本発明において、「ＵＤＰ−ガラクトースピロホスホリラーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅとも呼ぶ）活性」とは、ＵＴＰまたはＴＴＰとガラクトース−１−リン酸からＵＤＰ−ガラクトースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．１０、２．７．７．６４）をいう。「ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性が増強する」とは、ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＥｂｒｅｃｈｔらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，２０１５，Ｖｏｌ．１８５０（１），ｐ８８−９６）またはＤａｍｅｒｏｗらの方法（Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．，２０１０，Ｖｏｌ．２８５（２），ｐ８７８−８７）により、ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性を測定することによって確認することができる。【0071】
ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性の増強に用いるｕｇｐ遺伝子としては、ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）由来のｕｇｐ遺伝子を挙げることができる。
さらに、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）以外の原生動物、または他の微生物や動植物由来のｕｇｐ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｕｇｐ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＵＤＰ−ＧａｌＰＰａｓｅ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のｕｇｐ遺伝子を用いてもよい。
【0072】
本発明において、「ガラクツロン酸−１−リン酸ホスファターゼ（以下、ＧａｌＡ１Ｐとも呼ぶ）活性」とは、ガラクツロン酸−１−リン酸を脱リン酸化してガラクツロン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＧａｌＡ１Ｐ活性が増強する」とは、ＧａｌＡ１Ｐ活性が非改変株よりも高くなったことをいう。ＧａｌＡ１Ｐ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１．５倍以上に増加していることが好ましく、３倍以上に増加していることがより好ましい。ＧａｌＡ１Ｐ活性が増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｓｓａｒｉｅｌｌｏらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００６，Ｖｏｌ．１７６４，ｐ１３-９）またはＤａｓｓａらの方法（Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，１９８２，Ｖｏｌ．２５７（１２），ｐ６６６９−７６）により、ＧａｌＡ１Ｐ活性を測定することによって確認することができる。【0073】
ＧａｌＡ１Ｐ活性が増強するように改変された株は、上述のＵＤＰ−ＧＬＥ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。ＧａｌＡ１Ｐ活性の増強に用いるホスファターゼ遺伝子としては、ＧａｌＡ１Ｐ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のａｇｐ遺伝子、ａｐｈＡ遺伝子を挙げることができる。
さらに、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）以外の細菌、または他の微生物や動植物由来のホスファターゼ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のホスファターゼ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子や、ホモロジー等に基づいてＧａｌＡ１Ｐ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＧａｌＡ１Ｐ活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類のホスファターゼ遺伝子を用いてもよい。
なお、これらホスファターゼ遺伝子を使用する際には、変異を導入することによって基質特異性が改善されたものを用いることが望ましい。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のａｇｐ遺伝子の場合では、９４番目のアルギニンをヒスチジンに、１２３番目のメチオニンをバリンまたはアラニンに、１９６番目グルタミン酸をアスパラギン酸にアミノ酸残基を変更するような変異を導入することによって基質特異性を改善することができる。これらの変異導入は組み合わせて用いてもよい。
【0074】
ムチン酸の生産性を向上させるためには、ＵＤＰ−グルクロン酸からムチン酸の生合成経路を構築することに加えて、グルコースからＵＤＰ−グルクロン酸を経由してムチン酸を生合成する代謝経路と競合し、副生物を生成する反応を触媒する酵素活性を低減することが有効である。【0075】
したがって、本発明の微生物は、ＵＤＰ−グルクロン酸−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変することに加えて、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物が好ましい。ムチン酸の生産性をより向上させるためには、これら酵素活性のうち、好ましくは、２種類以上、もしくは３種類以上、より好ましくは、４種類以上、もしくは５種類以上であってよく、さらに好ましくは、６種類以上、もしくは７種類以上であってよく、特に好ましくは、８種類以上、もしくは９種類以上、であってもよく、最も好ましくは、１０種類全ての活性を低減するような改変を行うことが望ましい。【0076】
さらに、ムチン酸の生産性を向上させるためには、これらの改変と、上述のグルコースからＵＤＰ−グルクロン酸を経由してムチン酸を生合成する代謝経路において律速となる反応を触媒する酵素活性を増強する改変を組み合わせることが望ましい。なお、これら複数の改変を行う場合、その順番は問わない。【0077】
また、ムチン酸の生産性を向上させるためには、ＵＤＰ−ガラクトースからムチン酸の生合成経路を構築することに加えて、グルコースまたはガラクトースからＵＤＰ−ガラクトースを経由してムチン酸を生合成する代謝経路と競合し、副生物を生成する反応を触媒する酵素活性を低減することが有効である。【0078】
したがって、本発明の微生物は、ＵＤＰ−ガラクトース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性、及びガラクツロン酸デヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変することに加えて、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性、ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ活性、ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ活性、ガラクツロン酸イソメラーゼ活性、ガラクツロン酸レダクターゼ活性、およびガラクタル酸デヒドラターゼ活性からなる群より選ばれる少なくとも１種類以上の酵素活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物が好ましい。ムチン酸の生産性をより向上させるためには、これら酵素活性のうち、好ましくは、２種類以上、より好ましくは、３種類以上、もしくは４種類以上、さらに好ましくは、５種類以上、もしくは６種類以上であってよく、特に好ましくは、７種類以上、もしくは８種類以上であってよく、最も好ましくは、９種類全ての活性を低減するような改変を行うことが望ましい。
【0079】
さらに、ムチン酸の生産性を向上させるためには、これらの改変と、上述のグルコースまたはガラクトースからＵＤＰ−ガラクトースを経由してムチン酸を生合成する代謝経路において律速となる反応を触媒する酵素活性を増強する改変を組み合わせることが望ましい。なお、これら複数の改変を行う場合、その順番は問わない。【0080】
本発明において、「グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（以下、ＺＷＦとも呼ぶ）活性」とは、グルコース−６−リン酸を脱水素化して６−ホスホグルコノ−１，５−ラクトンを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．４９、１．１．１．３６３、１．１．１．３８８）をいう。「ＺＷＦ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＺＷＦ活性が低下していることをいう。ＺＷＦ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＺＷＦ活性は完全に消失していてもよい。ＺＷＦ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＭａらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，Ｖｏｌ．１８０（７），ｐ１７４１-９）またはＢａｎｅｒｊｅｅらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９７２，Ｖｏｌ．１１０（１），ｐ１５５−６０）によりＺＷＦ活性を測定することによって確認することができる。【0081】
ＺＷＦ活性が低減するように改変された株は、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＺＷＦ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、染色体上のｚｗｆ遺伝子を破壊したり、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによっても達成される。具体的には、染色体上のプロモーター配列を含むｚｗｆ遺伝子の領域において、その一部または全てを欠失させること、塩基配列を挿入して分断すること、変異を導入すること、より微弱なプロモーターへ置換することなどが挙げられる。なお、これらＺＷＦ活性を低減する方法を複数組み合わせてもよい。ＺＷＦ活性が低減するように改変された株の作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｇｅｎｅ，１９９４，Ｖｏｌ．１４５（１），ｐ６９−７３）等が挙げられる。
【0082】
本発明において、「グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（以下、ＰＧＩとも呼ぶ）活性」とは、グルコース−６−リン酸を異性化してフルクトース−６−リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．９）をいう。「ＰＧＩ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＰＧＩ活性が低下していることをいう。ＰＧＩ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰＧＩ活性は完全に消失していてもよい。ＰＧＩ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＨｏｒｒｏｃｋｓらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９６３，Ｖｏｌ．１６，ｐ２４８−５１）、またはＭｉｌｅｗｓｋｉらの方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２００６，Ｖｏｌ．４５０（１），ｐ３９-４９）によりＰＧＩ活性を測定することによって確認することができる。ＰＧＩ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0083】
本発明において、「グルコース−１−リン酸ホスファターゼ活性（以下、ＡＧＰとも呼ぶ）活性」とは、グルコース−１−リン酸を脱リン酸化してグルコースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：３．１．３．１０）をいう。「ＡＧＰ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＡＧＰ活性が低下していることをいう。ＡＧＰ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡＧＰ活性は完全に消失していてもよい。ＡＧＰ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＰｒａｄｅｌらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８，Ｖｏｌ．１７０（１０），ｐ４９１６−２３）によりＡＧＰ活性を測定することによって確認することができる。ＡＧＰ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0084】
本発明において、「ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ活性（以下、ＡＧＰａｓｅとも呼ぶ）活性」とは、グルコース−１−リン酸とＡＴＰからＡＤＰ−グルコースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．２７）をいう。「ＡＧＰａｓｅ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＡＧＰａｓｅ活性が低下していることをいう。ＡＧＰａｓｅ活性は非改変株と比較して、活性が単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡＧＰａｓｅ活性は完全に消失していてもよい。ＡＧＰａｓｅ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＳｅｉｂｏｌｄらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１５３（Ｐｔ４），ｐ１２７５−８５）によりＡＧＰａｓｅ活性を測定することによって確認することができる。ＡＧＰａｓｅ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0085】
本発明において、「ヘキソース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＴとも呼ぶ）活性」とは、ガラクトース−１−リン酸とＵＤＰ−グルコースからＵＤＰ−ガラクトースとグルコース−１−リン酸を生成する反応を触媒する活性、または、その逆反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．７．１２）をいう。「ＧａｌＴ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＧａｌＴ活性が低下していることをいう。ＧａｌＴ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＧａｌＴ活性は完全に消失していてもよい。ＧａｌＴ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＳａｉｔｏらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６７，Ｖｏｌ．２４２（１０），ｐ２３６２−８）またはＤａｖｉｔ−Ｓｐｒａｕｌらの方法（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９４，Ｖｏｌ．３５４，ｐ２３２−６）によりＧａｌＴ活性を測定することによって確認することができる。ＧａｌＴ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0086】
本発明において、「ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ（以下、ＧａｌＥとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルコースを異性化してＵＤＰ−ガラクトースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．２）をいう。「ＧａｌＥ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＧａｌＥ活性が低下していることをいう。ＧａｌＥ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＧａｌＥ活性は完全に消失していてもよい。ＧａｌＥ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＫｏｔａｋｅらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００９，Ｖｏｌ．４２４（２）ｐ１６９−７７）またはＳｃｈｕｌｚらの方法（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００５，Ｖｏｌ．２８０（１４），ｐ１３４９３−５０２）によりＧａｌＥ活性を測定することによって確認することができる。ＧａｌＥ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0087】
本発明において、「ＵＤＰ−グルコース−６−デヒドロゲナーゼ（以下、ＵＧＤとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルコースを酸化してＵＤＰ−グルクロン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２２）をいう。「ＵＧＤ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＵＧＤ活性が低下していることをいう。ＵＧＤ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＵＧＤ活性は完全に消失していてもよい。ＵＧＤ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＥａｓｌｅｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００７，Ｖｏｌ．４６（２），ｐ３６９-３７８）、Ｓｅｎｎｅｔらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１２，Ｖｏｌ．５１（４６），ｐ９３６４−７４）またはＫａｄｉｒｖｅｌｒａｊ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１３，Ｖｏｌ．５２（８），ｐ１４５６−６５）によりＵＧＤ活性を測定することによって確認することができる。ＵＧＤ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0088】
本発明において、「ＵＤＰ−グルクロン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＡｒｎＡとも呼ぶ）活性」とは、ＵＤＰ−グルクロン酸を酸化的に脱炭酸してＵＤＰ−４−ケト−アラビノースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．３０５、２．１．２．１３）をいう。「ＡｒｎＡ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＡｒｎＡ活性が低下していることをいう。ＡｒｎＡ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡｒｎＡ活性は完全に消失していてもよい。ＡｒｎＡ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＧａｔｚｅｖａ−Ｔｏｐａｌｏｖａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．４３（４２），ｐ１３３７０-９）によりＡｒｎＡ活性を測定することによって確認することができる。ＡｒｎＡ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0089】
本発明において、「ガラクツロン酸イソメラーゼ（以下、ＵｘａＣとも呼ぶ）活性」とは、ガラクツロン酸を異性化してタガツロン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．１２）をいう。「ＵｘａＣ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＵｘａＣ活性が低下していることをいう。ＵｘａＣ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＵｘａＣ活性は完全に消失していてもよい。ＵｘａＣ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＰｏｒｔａｌｉｅｒらの方法（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ.，１９７４，Ｖｏｌ．１２８（４），ｐ３０１-１９）によりＵｘａＣ活性を測定することによって確認することができる。ＵｘａＣ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0090】
本発明において、「ガラクツロン酸レダクターゼ（以下、ＧａｌＵＲとも呼ぶ）活性」とは、ガラクツロン酸を還元してガラクトン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．３６５）をいう。「ＧａｌＵＲ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＧａｌＵＲ活性が低下していることをいう。ＧａｌＵＲ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＧａｌＵＲ活性は完全に消失していてもよい。ＧａｌＵＲ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＭａｒｔｅｎｓ−Ｕｚｕｎｏｖａらの方法（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ. Ｂｉｏｌ.，２００８，Ｖｏｌ．４５（１１），ｐ１４４９-５７）またはＺｈａｎｇ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，２０１１，Ｖｏｌ．４８（１０），ｐ９９０−７）によりＧａｌＵＲ活性を測定することによって確認することができる。ＧａｌＵＲ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0091】
本発明において、「ガラクタル酸デヒドラターゼ（以下、ＧａｒＤとも呼ぶ）活性」とは、ムチン酸を脱水して（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−５−オキソヘキサン二酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：４．２．１．４２）をいう。「ＧａｒＤ活性が低減する」とは、非改変株と比較してＧａｒＤ活性が低下していることをいう。ＧａｒＤ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＧａｒＤ活性は完全に消失していてもよい。ＧａｒＤ活性が低下したことは、公知の方法、例えばＨｕｂｂａｒｄらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，Ｖｏｌ．３７（４１），ｐ１４３６９-７５）またはＷｅｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００７，４６（３３），ｐ９５６４−７７）によりＧａｒＤ活性を測定することによって確認することができる。ＧａｒＤ活性が低減するように改変された株は、上述のＺＷＦ活性を低減する方法と同様にして作製することができる。
【0092】
＜第二のムチン酸の製造方法＞本発明の第二のムチン酸の製造方法は、本発明の微生物またはその処理物を水性媒体中で、有機原料に作用させることにより、ムチン酸を生産させる工程（以下、「発酵工程」という）を含む。本発明の第二のムチン酸の製造方法は、本発明の第一のムチン酸の製造方法の実施に好適な態様である。
【0093】
本発明の第二のムチン酸の製造方法では、本発明の微生物の菌体の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。通常、これらの処理物には、本発明の微生物が有する、ムチン酸の生合成に関与する種々の酵素が含まれる。また、本発明の第二のムチン酸の製造方法は、前記発酵工程の後に、生産されたムチン酸を回収する工程（以下、「回収工程」という）を有することが好ましい。
【0094】
本発明の第二のムチン酸の製造方法に本発明の微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いてもよいが、発酵工程に先立ち、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。即ち、後述する種培養や本培養を行なうことで、本発明の微生物を予め増殖させた後に、発酵工程を行なうことができる。なお、後述する種培養や本培養と、後述する発酵工程は、区別することなく、同時に行なうこともできる。また、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、有機原料と反応させることによってムチン酸を生産させることもできる。
【0095】
（種培養）種培養は、本培養に供する本発明の微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物等が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
【0096】
種培養においては、必要に応じて、前記培地に炭素源を添加してもよい。種培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、ガラクトース、スクロースまたはラクトースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。【0097】
種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、ムチン酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。大腸菌の場合は、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３８℃がより好ましく、約３７℃が特に好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。酵母の場合は、通常２５℃〜４０℃であり、２８℃〜３５℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。【0098】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、ムチン酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ３〜１０であり、ｐＨ５〜８が好ましい。大腸菌の場合は、通常ｐＨ５〜８．５であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。酵母の場合は、通常ｐＨ３〜８であり、ｐＨ４．５〜７．５が好ましい。【0099】
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。【0100】
種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。【0101】
（本培養）本培養は、後述するムチン酸生産反応に供する本発明の微生物の菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。
【0102】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。【0103】
また、本培養においては、前記培地に炭素源を添加することが好ましい。本培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、ガラクトース、スクロースまたはラクトースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。【0104】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【0105】
前記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、微生物の増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記炭素源の減少にあわせ、炭素源を追加で添加してもよい。【0106】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。大腸菌の場合は、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３８℃がより好ましく、約３７℃が特に好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。酵母の場合は、通常２５℃〜４０℃であり、２８℃〜３５℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。【0107】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。大腸菌の場合は、通常ｐＨ５〜８．５であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。酵母の場合は、通常ｐＨ３〜８であり、ｐＨ４．５〜７．５が好ましい。【0108】
また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。【0109】
また、本培養においては、よりムチン酸の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。【0110】
本培養後の菌体は、後述するムチン酸生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。【0111】
（発酵工程）発酵工程では、上述のムチン酸生産能を有する微生物またはその処理物を水性媒体中で、有機原料に作用させることにより、ムチン酸を生産させる。この発酵工程で起こる反応を、以下、「ムチン酸生産反応」という。
【0112】
ここで、水性媒体とは、発酵工程におけるムチン酸生産反応を行う水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、本発明の微生物またはその処理物と有機原料とを反応させることによりムチン酸生産反応を行うことができる。本明細書において、水性媒体とは、反応容器に含まれる液体全てを意味する。【0113】
水性媒体としては、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化してムチン酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。【0114】
本発明の第二のムチン酸の製造方法で用いる有機原料としては、本発明の微生物が資化してムチン酸を生産し得るものであれば特に限定されず、いわゆる一般的な糖質を用いることができる。具体的には、グリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；、セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等が挙げられる。
【0115】
上述した糖質の中でも、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖質が好ましく、これらの中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類からなる群から選ばれる少なくとも一種がより好ましい。
ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコース、ガラクトースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。ヘキソースおよびペントースを構成成分とする二糖類としては、スクロース、ラクトースが好ましい。グルコース、ガラクトース、キシロース、スクロース、ラクトースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が容易なためである。
なお、本発明の第二のムチン酸の製造方法で用いる有機原料には、１種類の糖が単独で含有されていてもよいし、２種類以上の糖が含有されていてもよい。
【0116】
本発明の第二のムチン酸の製造方法で用いる有機原料は、前記糖質を含んでいれば特に制限されないが、例えば、１種類以上の前記糖質を水に溶解して水溶液としたもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部を糖質まで分解したもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部から糖質を抽出したもの等を用いることができる。具体的には、後述するようなリグノセルロース分解原料、スクロース含有原料、デンプン分解原料等が挙げられる。【0117】
本発明の第二のムチン酸の製造方法で用いる有機原料は、必要に応じて水等で希釈して糖質の濃度を下げて用いてもよいし、濃縮して糖質の濃度を高めて用いてもよい。本発明の第二のムチン酸の製造方法における有機原料中に含まれる糖質の濃度としては、有機原料の由来や、含有する糖質の種類等によって大きく変動するため、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮して、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上であり、また、通常８０質量％以下、好ましくは７０質量％以下である。ただし、糖質を２種類以上含む場合は、その合計の濃度を示す。
【0118】
好ましい有機原料として、リグノセルロース分解原料が挙げられる。リグノセルロースとは、構造性多糖のセルロース、ヘミセルロース、及び芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される有機物である。リグノセルロースは、通常、食用にはできず、通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定して供給でき、資源を有効利用できる点で好ましい。
リグノセルロース分解原料としては、バガス、コーンストーバー、麦わら、稲わら、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ササ、ススキ等の草本系バイオマスや、廃木材、オガ粉、樹皮、古紙等の木質系バイオマス等を好適に用いることができる。中でも、バガス、コーンストーバー、麦わらが好ましい。
【0119】
上述のリグノセルロース分解原料から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、リグノセルロースに対して必要に応じて前処理を施した後、酵素、酸、亜臨界水、超臨界水等による加水分解、または熱分解を行う方法等が挙げられる。【0120】
また、好ましい有機原料として、スクロース含有原料が挙げられる。また、スクロースは、細胞中にスクロースを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「スクロースを含む植物」という。スクロースを含む植物としては、サトウキビ、テンサイ、サトウカエデ、オウギヤシ、ソルガム等の砂糖の原料として使用されるもの等が挙げられ、中でも、サトウキビ、テンサイが好ましい。
【0121】
スクロースを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物を粉砕した後に圧搾または浸出を行なう方法等が挙げられる。本発明の第二のムチン酸の製造方法においては、このようにして得られたスクロースを含む植物の搾汁（例えば、サトウキビの場合はケーンジュース）、粗糖、廃糖蜜等も有機原料として用いることができる。【0122】
また、好ましい有機原料として、デンプン分解原料が挙げられる。また、デンプンは、細胞中にデンプンを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「デンプンを含む植物」という。デンプンを含む植物としては、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦、甘藷、サゴヤシ、米、クズ、カタクリ、緑豆、ワラビ、オオウバユリ等が挙げられ、中でも、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦が好ましい。
【0123】
デンプンを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物から抽出したデンプンを加水分解する方法等が挙げられる。【0124】
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、ムチン酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くすると生産性の点で有利であり、好ましい。水性媒体中に含まれる有機原料の濃度は、そこに含まれる糖質の濃度で、水性媒体に対して、通常５％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、一方、通常３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは２０％（Ｗ／Ｖ）以下である。また、ムチン酸の生産反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせて、有機原料の追加で添加してもよい。【0125】
ムチン酸生産反応中の水性媒体のｐＨは、用いる本発明の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、大腸菌を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常４．５以上、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらに好ましくは６．０以上であり、一方、通常９以下、好ましくは８．５以下、より好ましくは８．０以下とすることが好ましい。コリネ型細菌を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常５．０以上、好ましくは５．５以上、より好ましくは６．０以上、さらに好ましくは６．５以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。酵母を用いる場合には、反応液のｐＨを、通常２．５以上、好ましくは３．０以上、より好ましくは３．５以上、さらに好ましくは４．０以上であり、一方、通常８．５以下、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下とすることが好ましい。【0126】
水性媒体のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。ムチン酸生産反応中に生産される副生物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。【0127】
ムチン酸生産反応に用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。【0128】
ムチン酸生産反応の時間は、特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。【0129】
ムチン酸生産反応の温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常２℃〜２０℃、好ましくは７℃〜１５℃高い温度で行うことが好ましい。具体的には、大腸菌の場合には、通常３０℃以上、好ましくは３５℃以上、さらに好ましくは３７℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４０℃以下である。コリネ型細菌の場合には、通常３０℃以上、好ましくは３５℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。酵母の場合には、通常２７℃以上、好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４０℃以下である。ムチン酸生産反応の間、常に２７℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【0130】
ムチン酸生産反応は、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよいが、通気、攪拌を行なうことが好ましい。具体的には、酸素移動速度として、通常０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上であり、一方、通常２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下である。【0131】
本発明の第二のムチン酸の製造方法のムチン酸の製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。【0132】
（回収工程）本発明の第二のムチン酸の製造方法は、上記のムチン酸生産反応によりムチン酸が生成し、反応液中に蓄積させることができる。蓄積させたムチン酸は、常法に従って、水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去し、再結晶や酸析することによって、高純度のムチン酸を回収することができる。
また、ムチン酸エステルに変換した後、水溶性不純物を水で洗浄したり、有機溶媒に溶解させ、水で分液洗浄を行った後、加水分解工程を経たりして、更なる高純度のムチン酸を回収することもできる。
得られたムチン酸は、新規ポリマー原料として注目されている２，５−フランジカルボン酸や、２，５−フランジカルボン酸ジエステルの原料として用いることができ、その他様々な有用化学品へ誘導可能である。
【0133】
＜２，５−フランジカルボン酸の製造方法＞上述した方法によりムチン酸を製造した後に、得られたムチン酸を原料として、常法に従って、２，５−フランジカルボン酸を製造することができる。具体的には、例えば、酸触媒存在下で環化脱水する方法、後述する２，５−フランジカルボン酸ジエステルを加水分解する方法などが挙げられる。
使用する酸触媒は、本反応が進行すれば特に制限はないが、パラトルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、カンファ―スルホン酸などのスルホン酸化合物、硫酸、リン酸、臭化水素酸、塩化水素酸などの無機酸、リンタングステン酸、ケイタングステン酸などのヘテロポリ酸等が挙げられる。反応性の観点からパラトルエンスルホン酸、臭化水素酸が好ましい。
反応温度は通常１００℃以上が好ましく、１２０℃以上が更に好ましい。
フランジカルボン酸ジエステルからの加水分解によるフランジカルボン酸製造は公知の技術を用いることができる。
【0134】
２，５−フランジカルボン酸はポリエステル、ポリアミドの原料となるほか、カルボン酸の還元によりポリカーボネート、ポリエステルの原料となるジオールに変換可能であり、石油由来の既存合成樹脂をバイオマス由来に置き換えられる可能性があるため、その製造技術が注目されている。また、これら２，５−フランジカルボン酸を用いたポリマーはガスバリア性に優れている特長がある。【0135】
＜２，５−フランジカルボン酸ジエステルの製造方法＞上述した方法によりムチン酸を製造した後に、得られたムチン酸を原料として、常法に従って、２，５−フランジカルボン酸ジエステルを製造することができる。具体的には、例えば、溶媒と酸触媒存在下で環化脱水する方法、２，５−フランジカルボン酸とアルコールで脱水する方法、対応する酸クロライドに変換した後、アルコールと反応させる方法などが挙げられる。
【0136】
溶媒と酸触媒存在下で環化脱水する酸触媒は、本反応が進行すれば特に制限はないが、パラトルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、カンファ―スルホン酸などのスルホン酸化合物、硫酸、リン酸、臭化水素酸、塩化水素酸などの無機酸、リンタングステン酸、ケイタングステン酸などのヘテロポリ酸等が挙げられる。反応性の観点からパラトルエンスルホン酸、リン酸、硫酸が好ましい。また、直接エステルまで製造するためには、水を分離しながら反応させることが好ましい。油水分離が可能な溶媒として炭素数４以上のアルコールが好ましく、反応後処理の観点から炭素数８以下のアルコールが好ましい。溶媒回収の観点からは単一溶媒が好ましいが、２つ以上の溶媒を任意の割合で併用してもよい。
なお、２，５−フランジカルボン酸を合成した後、エステルに変換する場合は、ポリマー化の反応性の観点から、メチルエステル、エチルエステルが好ましい。２，５−フランジカルボン酸とアルコールで脱水する方法、対応する酸クロライドに変換した後、アルコールと反応させる方法によるフランジカルボン酸ジエステル製造は公知の技術を用いることができる。
【0137】
２，５−フランジカルボン酸ジエステルはポリエステル、ポリアミドの原料となるほか、エステル部位の還元によりポリカーボネート、ポリエステルの原料となるジオールに変換可能であり、石油由来の既存合成樹脂をバイオマス由来に置き換えられる可能性があるため、その製造技術が注目されている。また、これら２，５−フランジカルボン酸ジエステルを用いたポリマーはガスバリア性に優れている特長がある。
【実施例】
【0138】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。［実施例１］
大腸菌ＢＷ２５１１３株について、以下の通り、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，Ｖｏｌ．９７（１２），ｐ６６４０-５）により、ｇａｌＥ遺伝子、ｇａｌＴ遺伝子、ｕｘａＣ遺伝子、ｇａｒＤ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子、ａｒｎＡ遺伝子、およびａｇｐ遺伝子の破壊を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株を作製した。
【0139】
ｇａｌＥＴ遺伝子のフランキング領域と相同性を有する配列とＦＬＰ組換え酵素の認識部位であるＦＲＴ（ＦＬＰ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）を両端に持つカナマイシン耐性遺伝子を、ｐＫＤ１３を鋳型としてｇＥＴＦおよびｇＥＴＲプライマー（配列番号１および２）を用いたＰＣＲによって増幅した。アラビノースによるＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅの誘導発現が可能なプラスミドｐＫＤ４６を有するＢＷ２５１１３株をこのＰＣＲ産物で形質転換した。コロニーＰＣＲによりｇａｌＥＴ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子が置き換わったことが確認された形質転換体において、ｐＫＤ４６のキュアリングを行い、ＦＬＰ酵素の発現が可能なヘルパープラスミドｐＣＰ２０を導入した。さらに、ＦＬＰ酵素による組換えの結果、カナマイシン耐性遺伝子が脱落し、ｐＣＰ２０のキュアリングが確認された株をＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴとした。【0140】
上記と同様にして、ｐＫＤ４６を有するＢＷ２５１１３株を用いてｕｘａＣ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を置き換えた株を作製し、Ｐ１ドランスダクションによりＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴに形質を移した株を取得した。その後、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０を導入し、カナマイシン耐性遺伝子を脱落させることでｇａｌＥＴ遺伝子およびｕｘａＣ遺伝子を欠損させた株を構築、ＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣとした。上記の方法を繰り返すことによって、ｇａｒＤ遺伝子の欠損を組み合わせた株を構築し、ＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。
【0141】
［実施例２］実施例１と同様の方法により、ｇａｌＥ遺伝子、ｇａｌＴ遺伝子、ｕｘａＣ遺伝子、ｇａｒＤ遺伝子、およびｐｇｉ遺伝子の破壊を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ株を作製した。
【0142】
［実施例３］実施例１と同様の方法により、ｇａｌＥ遺伝子、ｇａｌＴ遺伝子、ｕｘａＣ遺伝子、ｇａｒＤ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子、ａｒｎＡ遺伝子、およびａｇｐ遺伝子の破壊を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株を作製した。
【0143】
［実施例４］実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、ａｇｐ遺伝子、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を作製した。
【0144】
ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型として、それぞれｕｇｄＦ／ｕｇｄＲ（配列番号３および４）、ｇａｌＵＦ／ｇａｌＵＲ（配列番号５および６）、ｇａｌＦＦ／ｇａｌＦＲ（配列番号７および８）、ｐｇｍＦ／ｐｇｍＲ（配列番号９および１０）のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲにより増幅した。大腸菌用発現ベクターｐＺＡ（ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ，２０１１，Ｖｏｌ．４（８），ｐ１０６８-７０）のプラスミド骨格はｐＺＡＲおよびｐＺＡＦプライマー（配列番号１１および１２）を用いたＰＣＲにより増幅した。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，Ｖｏｌ．６（５），ｐ３４３-５）にて、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子をｐＺＡベクターのＰＬｌａｃＯ１プロモーター下流に挿入した。構築したプラスミドはｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍと名付けた。【0145】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ａｇｐ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型としてａｇｐＦおよびａｇｐＲプライマー（配列番号１３および１４）を用いたＰＣＲによって増幅した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来ｕｄｈ遺伝子、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）由来のＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来ｃａｐ１Ｊ遺伝子を、それぞれ大腸菌での発現を改善させるため、コドンを最適化した配列で合成した（それぞれ配列番号１５、１６、１７）。これらの合成遺伝子を鋳型として、それぞれｕｄｈＦ／ｕｄｈＲ（配列番号１８および１９）、ＬｍｊＦ１７．１１６０Ｆ／ＬｍｊＦ１７．１１６０Ｒ（配列番号２０および２１）、ｃａｐ１ＪＦ／ｃａｐ１ＪＲ（配列番号２２および２３）のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲにより増幅した。大腸菌用発現ベクターｐＺＥ（ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ，２０１１，Ｖｏｌ．４（８），ｐ１０６８-７０）のプラスミド骨格は制限酵素Ａｃｃ６５ＩおよびＸｂａＩで処理することにより調製し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，Ｖｏｌ．６（５），ｐ３４３-５）にて、ｕｄｈ遺伝子、ａｇｐ遺伝子、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、ｃａｐ１Ｊ遺伝子をｐＺＥベクターのＰＬｌａｃＯ１プロモーター下流に挿入した。構築したプラスミドはｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと名付けた。【0146】
実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を上記の通り構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。【0147】
［実施例５］実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｒ９４Ｈ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ９４Ｈ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を作製した。
【0148】
９４番目のアルギニンをヒスチジンに変異させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ａｇｐ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型としてａｇｐＦおよびａｇｐＲ９４ＨＲ（配列番号１３および２４）、ａｇｐＲ９４ＨＦおよびａｇｐＲ（配列番号２５および１４）のプライマーの組み合わせを用いたオーバーラップＰＣＲ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，Ｖｏｌ．２２６，ｐ５１１-６）によって増幅した。その他は実施例４のｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと同様にしてプラスミドを構築し、ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ９４Ｈ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと名付けた。【0149】
実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を上記の通り構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ９４Ｈ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ９４Ｈ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。【0150】
［実施例６］実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｍ１２３Ｖ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を作製した。
【0151】
１２３番目のメチオニンをバリンに変異させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ａｇｐ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型としてａｇｐＦおよびａｇｐＭ１２３ＶＲ（配列番号１３および２６）、ａｇｐＭ１２３ＶＦおよびａｇｐＲ（配列番号２７および１４）のプライマーの組み合わせを用いたオーバーラップＰＣＲ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，Ｖｏｌ．２２６，ｐ５１１-６）によって増幅した。その他は実施例４のｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと同様にしてプラスミドを構築し、ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと名付けた。【0152】
実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を上記の通り構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。【0153】
［実施例７］実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｍ１２３Ａ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ａ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を作製した。
【0154】
１２３番目のメチオニンをアラニンに変異させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ａｇｐ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型としてａｇｐＦおよびａｇｐＭ１２３ＡＲ（配列番号１３および２８）、ａｇｐＭ１２３ＡＦおよびａｇｐＲ（配列番号２９および１４）のプライマーの組み合わせを用いたオーバーラップＰＣＲ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，Ｖｏｌ．２２６，ｐ５１１-６）によって増幅した。その他は実施例４のｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと同様にしてプラスミドを構築し、ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ａ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと名付けた。【0155】
実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を上記の通り構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ａ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ａ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。【0156】
［実施例８］実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｅ１９６Ｄ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１９６Ｄ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を作製した。
【0157】
１９６目のグルタミン酸をアスパラギン酸に変異させたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ａｇｐ遺伝子を、大腸菌ゲノムを鋳型としてａｇｐＦおよびａｇｐＥ１９６ＤＲ（配列番号１３および３０）、ａｇｐＥ１９６ＤＦおよびａｇｐＲ（配列番号３１および１４）のプライマーの組み合わせを用いたオーバーラップＰＣＲ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，Ｖｏｌ．２２６，ｐ５１１-６）によって増幅した。その他は実施例４のｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと同様にしてプラスミドを構築し、ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１９６Ｄ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊと名付けた。【0158】
実施例１にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を上記の通り構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１９６Ｄ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１９６Ｄ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤとした。【0159】
［実施例９］実施例２にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｍ１２３Ｖ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ株を作製した。
【0160】
実施例２にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ株を実施例４および６にて構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉとした。【0161】
［実施例１０］実施例３にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株について、以下の通り、ｕｇｄ遺伝子、ｇａｌＵ遺伝子、ｇａｌＦ遺伝子、ｐｇｍ遺伝子、ｕｄｈ遺伝子、変異ａｇｐ遺伝子（Ｍ１２３Ｖ）、ＬｍｊＦ１７．１１６０遺伝子、およびｃａｐ１Ｊ遺伝子の増強を行ない、大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株を作製した。
【0162】
実施例３にて作製したＢＷ２５１１３／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株を実施例４および６にて構築したプラスミドｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍおよびｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊで形質転換し、得られた株をＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐとした。【0163】
［実施例１１］実施例４にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を用いて、以下の通り、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。
【0164】
実施例４にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を２ＸＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）にて一晩培養した。１２５ｍＬフラスコに４％グルコース、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＭ９培地を５ｍＬ添加し、上記培養液を１／２５希釈となるよう植菌、３０℃で４８時間培養を行った。培養液をHPLCにて分析を行い、同条件にて3回行った平均値を算出した結果、１５．３ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【0165】
［実施例１２］実施例５にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ９４Ｈ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を用いて、実施例１１と同様に、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。その結果、１４．０ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【0166】
［実施例１３］実施例６にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を用いて、実施例１１と同様に、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。その結果、１９．８ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【0167】
［実施例１４］実施例７にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ａ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を用いて、実施例１１と同様に、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。その結果、１７．７ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【0168】
［実施例１５］実施例８にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１９６Ｄ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ株を用いて、実施例１１と同様に、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。その結果、１８．９ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【0169】
［実施例１６］実施例９にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ株を用いて、以下の通り、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。
【0170】
１２５ｍＬフラスコを用いた培養において、２％グルコース、２％グリセロール、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬ カナマイシン、５０μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＭ９培地を用いたこと以外は実施例１１と同様に行った。その結果、１３０ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。【0171】
［実施例１７］実施例１０にて作製したＢＷ２５１１３／ｐＺＡ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｇｄ＿ｇａｌＵ＿ｇａｌＦ＿ｐｇｍ／ｐＺＥ＿ＰＬｌａｃＯ１＿ｕｄｈ＿ａｇｐ１２３Ｖ＿ＬｍｊＦ１７．１１６０＿ｃａｐ１Ｊ／ΔｇａｌＥＴ／ΔｕｘａＣ／ΔｇａｒＤ／Δｐｇｉ／ΔａｒｎＡ／Δａｇｐ株を用いて、実施例１６と同様に、フラスコ培養によるムチン酸発酵評価を行った。その結果、２１４ｍｇ／Ｌのムチン酸が検出された。
【産業上の利用可能性】
【0172】
本発明によれば、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料からムチン酸を効率的に製造することが可能な方法及び微生物を提供することができる。このような本発明の微生物を用いることにより、ムチン酸を効率よく製造することができる。さらに、本発明の製造方法により得られたムチン酸を原料として２，５−フランジカルボン酸や、２，５−フランジカルボン酸ジエステルを効率よく製造することができる。したがって、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図1】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]