特許 6874276 分離材及びカラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6874276

(24)【登録日】2021年4月26日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】分離材及びカラム

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/285 20060101AFI20210510BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20210510BHJP

   B01J 20/28 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/285 N

   B01J20/285 M

   B01J20/281 X

   B01J20/281 G

   G01N30/88 J

   B01J20/26 L

   B01J20/28 Z

【請求項の数】11

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-83847(P2016-83847)

(22)【出願日】2016年4月19日

(65)【公開番号】特開2017-194318(P2017-194318A)

(43)【公開日】2017年10月26日

【審査請求日】2019年3月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004455

【氏名又は名称】昭和電工マテリアルズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100169454

【弁理士】

【氏名又は名称】平野 裕之

(74)【代理人】

【識別番号】100185591

【弁理士】

【氏名又は名称】中塚 岳

(72)【発明者】

【氏名】河内 史彦

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 優

(72)【発明者】

【氏名】川口 亜季子

(72)【発明者】

【氏名】後藤 昭人

(72)【発明者】

【氏名】宮澤 笑

(72)【発明者】

【氏名】安江 健

(72)【発明者】

【氏名】後藤 泰史

(72)【発明者】

【氏名】佛願 道男

【審査官】 高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６３−２３６５３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２６６５０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０１９１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２４４１２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０１９３９０９４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２８０８３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−２８１１０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−０７９０６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Qu, J.B., Wan, X. Z., Zhai, Y. Q., et al.，A novel stationary phase derivatized from hydrophilic gigaporous polystyrene-based microsphere for high-speed protein chromatography，Jounal of Chromatography A，２００９年，1216，P6511-6516

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／００−２０／３４

Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６

Ｂ０１Ｄ １５／００−１５／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、重量平均分子量が４００００以上の多糖類又はその変性体を含む被覆層と、を備え、
前記多糖類又はその変性体は、該多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する前記水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない、分離材。

【請求項2】

前記多孔質ポリマ粒子がスチレン系モノマをモノマ単位として含む、請求項１に記載の分離材。

【請求項3】

前記多糖類がデキストランである、請求項１又は２に記載の分離材。

【請求項4】

前記多糖類又はその変性体が架橋されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項5】

前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項6】

細孔径分布におけるモード径が０．０１〜０．５μｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項7】

空隙率が４０〜７０体積％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項8】

比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項9】

前記多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が５〜１５％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項10】

前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分離材及びカラムに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には合成高分子を母体とする多孔質型粒子、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする粒子が用いられている。上記の多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体は、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填しクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性が良いといった利点を持っている。しかし、このイオン交換体は、タンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起き、ピークの非対称化が発生したり、あるいは、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できない問題点があった。

【0003】

一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とする上記のイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤したり、溶液のイオン強度による体積変化及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。

【0004】

親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、いわば“骨格”となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている。

【0005】

例えば特許文献１では、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体を、ペプチド合成の分野で用いるという記載があり、それにより反応性物質の負荷係数を高め、高収率で合成できることが発明の効果として挙げられている。しかもこの特許文献１では、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという効果が挙げられている。

【0006】

特許文献２及び３では、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させ、このゲルに収着性能を付加するためにジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基等を付与したものをヘモグロビンの除去に使用している。その効果として、カラムでの通液性の良さが挙げられている。

【0007】

特許文献４では、いわゆるマクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が挙げられている。特許文献４では、架橋共重合体のゲルの架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善されることが記載されている。

【0008】

また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（特許文献５及び６参照）。非特許文献１では、ポリスチレン−ジビニルベンゼン多孔質粒子にデキストランをコーティングした粒子が合成されている。特許文献７では、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマにより構成される多孔質粒子が合成されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第４９６５２８９号明細書

【特許文献2】米国特許第４３３５０１７号明細書

【特許文献3】米国特許第４３３６１６１号明細書

【特許文献4】米国特許第３９６６４８９号明細書

【特許文献5】特開平１−２５４２４７号公報

【特許文献6】米国特許第５１１４５７７号明細書

【特許文献7】特開２００９−２４４０６７号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】C.Fournier, et al., JOURNAL OF COLLOID AND INTERFASE SCIENCE (1998), 198, 27-33

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

従来の分離材では、天然高分子の課題である通液性、耐久性や、ポリマ粒子の課題である耐アルカリ性、耐圧性、非特異吸着の低減、タンパク質吸着量が低い点等を充分なレベルで解決することは難しい。

【0012】

そこで、本発明は、イオン交換容量及び耐久性に優れ、かつタンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材及びカラムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、下記［１］〜［１１］に記載の分離材及び下記［１２］に記載のカラムを提供する。
［１］ 多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、重量平均分子量が４００００以上の多糖類又はその変性体を含む被覆層と、を備え、多糖類又はその変性体は、多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない、分離材。
［２］ 多孔質ポリマ粒子がスチレン系モノマをモノマ単位として含む、［１］に記載の分離材。
［３］ 多糖類がデキストランである、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］ 多糖類又はその変性体が架橋されている、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］ 多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］ 細孔径分布におけるモード径が０．０１〜０．５μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］ 空隙率が４０〜７０体積％である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］ 比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上である、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］ 多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が５〜１５％である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］ 多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜５００ｍｇの被覆層を備える、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］ カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、イオン交換容量及び耐久性に優れ、タンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減が可能な分離材及びカラムを提供することが可能となる。また、本発明に係る分離材及びカラムは、一態様において、通液性及び耐アルカリ性にも優れている。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】多糖類又はその変性体の水溶液の２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する粘度変化の一例を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明の詳細な説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。

【0017】

＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。

【0018】

（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、モノマと多孔質化剤とを含む組成物を反応させることにより得ることができる。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマをモノマ単位として含んでいてよい。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。

【0019】

多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性に更に優れる観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。

【0020】

単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性に優れる観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。

【0021】

多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0022】

上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。

【0023】

また、溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、多孔質化することが可能となる。

【0024】

多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。

【0025】

これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）；ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）；ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、最も好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）；ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル；及びこれらの混合物が好ましい。

【0026】

これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して、５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しやすくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。

【0027】

重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。

【0028】

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。

【0029】

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の四級アンモニウム塩が挙げられる。

【0030】

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。

【0031】

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。

【0032】

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。

【0033】

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。

【0034】

重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。

【0035】

多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。

【0036】

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。

【0037】

モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

【0038】

多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは５０μｍ以上である。

【0039】

多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることがさらに好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（例えば株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。

【0040】

多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）超音波分散装置を使用して粒子を水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。

【0041】

多孔質ポリマ粒子の空隙率（細孔容積）は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径分布におけるモード径（細孔径分布の最頻値、最大頻度径）が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径として、より好ましくは、０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入りやすくなる傾向にあり、細孔径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。

【0042】

多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。

【0043】

（被覆層）
本実施形態の被覆層は、多糖類を含む。多糖類で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を向上させることができる。さらに、多糖類が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。

【0044】

（多糖類又はその変性体）
被覆層は、多糖類又はその変性体を含む。多糖類としては、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられ、デキストランが好ましく用いられる。

【0045】

多糖類又はその変性体の重量平均分子量は、１００００以上であってよく、好ましくは４００００以上、より好ましくは１０００００以上、さらに好ましくは５０００００以上である。重量平均分子量が４００００以上の場合、少量の架橋剤によりデキストランを架橋させることができ、好適に非特異吸着を低減できる。また、この場合、イオン交換基の導入可能量も確保できるため、タンパク質の最大吸着量にも優れる。重量平均分子量は、８０℃に加温した高分子溶液をカラムオーブン温度５５℃、検出器温度５０℃にて、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で分析することによって測定される。

【0046】

被覆層は、界面吸着能を向上させる観点から、多糖類の変性体を含むことが好ましい。ここで、変性体とは、多糖類の分子中に疎水性基が導入されたものを指す。疎水性基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水性基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、多糖類と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。

【0047】

疎水性基を導入した多糖類の変性体における疎水性基の含有量は、多孔質ポリマ粒子表面に吸着するための疎水的相互作用力の保持と、タンパク質の非特異吸着の抑制とのバランスから、好ましくは５〜３０モル％、より好ましくは１０〜２０モル％、更に好ましくは１２〜１７モル％である。

【0048】

多糖類又はその変性体に多孔質ポリマ粒子を含浸させる際、多孔質ポリマ粒子の細孔内部における多糖類又はその変性体のつまりを抑制し、好適に被覆層を形成できる観点から、多糖類又はその変性体は、４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する当該水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さない多糖類又はその変性体である。多糖類又はその変性体が、当該水溶液の２０℃〜８０℃の範囲で温度変化させた際の粘度変化にヒステリシスを有さないことで、分子の運動性を高く保つことができ、タンパク質を立体的に吸着させやすくなる。なお、ここでの多糖類又はその変性体の４質量％水溶液は、実質的に水と多糖類又はその変性体とからなる水溶液を意味する。

【0049】

２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化は、以下の手順によって測定される。
１）多糖類又はその変性体を純水に溶解させて、４質量％の水溶液を調製する。
２）共軸二軸円筒型粘度計を用いて、２０〜８０℃を含む範囲で温度を変化させて上記水溶液の粘度変化を測定する。
３）具体的には、粘度変化の測定時、８０℃以上の温度（例えば８０〜１００℃のいずれかの温度。以下同様。）から開始して２℃／ｍｉｎの降温速度で２０℃以下の温度（例えば０〜２０℃のいずれかの温度。以下同様。）まで降温させ、その後、２℃／ｍｉｎの昇温速度で８０℃以上の温度まで昇温させる。縦軸に粘度、横軸に温度をとったグラフにおいて、８０℃以上の温度から２０℃以下の温度に降温させた際の粘度測定値から描かれる直線１又は曲線１と、２０℃以下の温度から８０℃以上の温度に昇温させた際の粘度測定値から描かれる直線２又は曲線２とが一致しない、すなわち、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時（直線１又は曲線１）の粘度と昇温時（直線２又は曲線２）の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ以上である場合をヒステリシスありと判断する。一方、直線１又は曲線１と直線２又は曲線２とが一致する、すなわち、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時（直線１又は曲線１）の粘度と昇温時（直線２又は曲線２）の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ未満である場合をヒステリシスなしと判断する。

【0050】

図１は、多糖類又はその変性体の水溶液の２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する粘度変化の一例を示すグラフである。図１の曲線Ｃ１は、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時の粘度と昇温時の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ以上であり、ヒステリシスありと判断される。図１の曲線Ｃ２，Ｃ３は、４０〜６０℃の任意の温度において、降温時の粘度と昇温時の粘度との差が０．０１Ｐａ・ｓ未満であり、ヒステリシスなしと判断される。

【0051】

（被覆層の形成方法）
多糖類又はその変性体（以下、これらをまとめて単に「多糖類」ともいう）を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、多糖類の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。多糖類の溶液の溶媒としては、多糖類を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
この溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、多糖類の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の多糖類を除去する。

【0052】

（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された多糖類を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。

【0053】

架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、多糖類としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライド化合物も架橋剤として使用できる。

【0054】

この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。

【0055】

架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、多糖類として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、多糖類との反応率が高い場合、原料の多糖類の特性が損なわれる傾向にある。

【0056】

また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、多糖類として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、さらに好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。

【0057】

例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。

【0058】

多糖類の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては、水、アルコール、トルエン、ジクロルベンゼン、ニトロメタン等が挙げられる。

【0059】

架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。

【0060】

架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いで、水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、多糖類を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、好ましくは３０〜５００ｍｇ、より好ましくは５０〜５００ｍｇ、更に好ましくは５０〜４８０ｍｇの被覆層を備える。被覆層の量は熱分解の質量減少等で測定することができる。

【0061】

（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。

【0062】

ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

【0063】

イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。

【0064】

通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。

【0065】

イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。

【0066】

イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。

【0067】

イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。

【0068】

イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。

【0069】

一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。

【0070】

本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、比表面積及び空隙率は、得られた細孔分布における細孔径が０．１〜３μｍである範囲に限定してそれぞれの値を算出する。

【0071】

本実施形態の分離材の細孔径分布におけるモード径は、０．０１〜０．５μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましい。細孔径分布におけるモード径がこの範囲にあると、粒子中に液が流れ易くなり、動的吸着量を多くすることができる。

【0072】

本実施形態の分離材の比表面積は、３０ｍ^２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ^２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ^２／ｇ以上であることがさらに好ましい。比表面積が３０ｍ^２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限は特に限定されないが、例えば３００ｍ^２／ｇ以下とすることができる。

【0073】

本実施形態の分離材の空隙率は、４０〜７０体積％であることが好ましい。空隙率がこの範囲にあると、蛋白質吸着量を多くすることができる。

【0074】

本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。すなわち、本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備え、例えば、本実施形態の分離材を充填してなっている。

【0075】

本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。

【0076】

本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。

【0077】

本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。

【0078】

本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることがより好ましく、５０〜１００μｍであることがさらに好ましい。

【0079】

分離材の細孔径分布におけるモード径、平均細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、多糖類等を適宜選択することによって、調整することができる。

【0080】

なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。

【実施例】

【0081】

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0082】

＜実施例１＞
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコ中で、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金株式会社製、商品名：ＤＶＢ９６０）１６ｇ、多孔質体としてヘキサノール１６ｇ及びジエチルベンゼン１６ｇ、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇをポリビニルアルコール（０．５質量％）水溶液に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化させた。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌をして粒子を得た。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値（変動係数）を算出した。また、多孔質ポリマ粒子１の細孔径分布におけるモード径、比表面積、空隙率を水銀圧入法にて測定した。結果を表１に示す。

【0083】

（被覆層の形成）
重量平均分子量（Ｍｗ）が４００００００であるデキストランの水溶液（２質量％）４８０ｍＬに水酸化ナトリウム０．９８ｇ、グリシジルフェニルエーテル９．８０ｇを投入して６０℃で６時間反応させ、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。変性デキストランの疎水性基含有量を下記方法により算出したところ、１４．２モル％であった。

【0084】

（デキストランの変性体における疎水性基含有量の評価）
乾燥状態の粉末デキストラン（変性されていないデキストラン）と揮発分０．１質量％未満まで乾燥させた疎水性基導入デキストランをそれぞれ７０℃の純水に溶解させ、０．０５質量％の水溶液サンプルを調製した。分光光度計により各水溶液の２６９ｎｍの吸光度を測定して濃度を求めることで、下記式より疎水性基含有量を算出した。
・疎水性基含有量（％）＝（Ｃ_ＡＧ／（Ｃ_ＨＡＧ＋Ｃ_ＡＧ））×１００
・Ｃ_ＡＧ：変性されているデキストラン構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）＝Ａ／ε_ＧＰＥ＊１０００
・Ａ：疎水性基導入デキストランの真の吸光度＝疎水性基を導入したデキストランの吸光度−変性されていないデキストランの吸収
・変性されていないデキストランの吸収＝変性されてないデキストランの吸光度×（疎水性基を導入したデキストランのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）／変性されてないデキストランのサンプル濃度（ｍｍｏｌ／ｌ））
・ε_ＧＰＥ：グリシジルフェニルエーテルの吸光係数＝１３７２（ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ））
・Ｃ_ＨＡＧ：変性されていないデキストラン構成単位の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）＝（変性されてないデキストラン構成単位の濃度（ｇ／ｌ）／デキストラン構成単位（３０６ｇ／ｍｏｌ））×１０００
・変性されてないデキストランス構成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝疎水性基を導入したデキストランのサンプル濃度（質量％）×１０−変性されているデキストラン構成単位の濃度（ｇ／ｌ）
・変性されているデキストラン成単位の濃度（ｇ／ｌ）＝（Ｃ_ＡＧ×変性されているデキストラン構成単位（４５６ｇ／ｍｏｌ））／１０００

【0085】

また、上記で得られた変性デキストランを純水に溶解させて４質量％水溶液を調製し、共軸二軸円筒型粘度計（商品名：ＡＲ−Ｇ２、ティー・エイ・インスツルメント社製）を用いて、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。
なお、粒子に吸着した変性デキストランの疎水性基含有量を測定する場合は、粒子０．２ｇを１Ｍ硫酸１０ｍｌ中にて、７０℃、５時間処理し、処理液を分光光度計にて２６９ｎｍの吸光度を測定して処理液濃度を求めることで、同様に算出できる。

【0086】

上記で得られた変性デキストランを２０ｍｇ／ｍＬの変性デキストラン水溶液とし、その水溶液に多孔質ポリマ粒子１を７０ｍＬ／粒子ｇの濃度で投入した後、５５℃で２４時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性デキストランを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。

【0087】

次いで、粒子に吸着したデキストランを次のようにして架橋させた。変性デキストランが吸着した粒子１０ｇを分散させた０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に０．４Ｍエピクロロヒドリンを添加し、室温にて８時間撹拌した。その後、加熱した２質量％のドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。得られた分離材を乾燥後、熱質量分析により被覆層の質量（多孔質ポリマ粒子１ｇに対する質量）を測定した。結果を表２に示す。

【0088】

（イオン交換基の導入）
分離材の分散液をろ過して得られた分離材（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。さらに、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩水溶液２００ｍＬ（ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩６０ｇ相当）を添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら８時間反応させた。反応終了後、水溶液をろ過し、水／エタノール（体積比５／１）で３回洗浄して、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材（ＤＥＡＥ変性分離材）を得た。得られた粒子の細孔径分布におけるモード径、空隙率及び比表面積を、水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。

【0089】

（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．２ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２４ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬに投入し、室温で２４時間撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計を用いたろ液の吸光度を測定し、２８０ｎｍの吸光度からＢＳＡ濃度を求めることにより、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。非特異吸着量が１ｍｇ／ｍＬ粒子以下の場合を○、１ｍｇ／ｍＬ粒子を超え１０ｍｇ／ｍＬ以下の場合を△、１０ｍｇ／ｍＬを超える場合を×とした。結果を表３に示す。

【0090】

（イオン交換容量の評価）
ＤＥＡＥ変性分離材のイオン交換容量を以下のように測定した。５ｍＬ容量の分離材を、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬに１時間浸漬し、室温で撹拌した。その後、洗浄液として用いた水のｐＨが７以下となるまで洗浄を行った。洗浄した分離材を０．１Ｎの塩酸２０ｍＬに浸漬し、１時間撹拌させた。分離材をろ過で取り除いた後、ろ液の塩酸水溶液を中和滴定することによって、分離材のイオン交換容量を測定した。結果を表３に示す。

【0091】

（カラム特性評価）
分離材をφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにスラリー（溶媒：メタノール）濃度３０質量％にて１５分間かけて充填した。その後、カラムに流速を変えて水を流し、流速とカラム圧との関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速を算出した。結果を表３に示す。
また、動的吸着量を以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで液を流し、５カラム容量分の１Ｍ ＮａＣｌのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量は以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ_１０＝ｃ_ｆＦ（ｔ_１０−ｔ_０）／Ｖ_Ｂ
ｑ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ ｗｅｔ ｒｅｓｉｎ）
ｃ_ｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｖ_Ｂ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ_１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間
ｔ_０：ＢＳＡ注入開始時間

【0092】

（耐アルカリ性評価）
分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌し、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が３％以下である場合を○、３％を超え２０％以下である場合を△、２０％を超える場合を×とした。結果を表３に示す。

【0093】

（耐久性評価）
８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１時間通液させた。再度８００ｃｍ／ｈにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上上昇した場合を×、１０％未満の上昇である場合を○とした。結果を表３に示す。

【0094】

＜実施例２＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が１００００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、図１の曲線Ｃ２で示されるように、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．０モル％であった。

【0095】

＜実施例３＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が５０００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、図１の曲線Ｃ３で示されるように、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．３モル％であった。

【0096】

＜比較例１＞
重量平均分子量（Ｍｗ）が１００００であるデキストランを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。また、変性デキストランの疎水性基含有量は、１４．１モル％であった。

【0097】

＜比較例２＞
変性デキストランに代えて重量平均分子量が１００００であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。ポリビニルアルコールの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスは見られなかった。

【0098】

（比較例３）
変性デキストランに代えて重量平均分子量が１００００である変性アガロースを使用した以外は、実施例１と同様にして分離材の作製及び評価を行った。変性デキストランの４質量％水溶液について、温度を２０〜８０℃の範囲で変化させたときの水溶液の粘度変化を測定したところ、粘度変化にヒステリシスが見られた。

【0099】

（比較例４）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、ＧＥヘルスケア、「多孔質ポリマ粒子２」という）を分離材として使用して、実施例１と同様にして分離材の評価を行った。

【0100】

【表1】

【0101】

【表2】

【0102】

【表3】

【0103】

表２，３の結果より、多糖類又はその変性体の４質量％水溶液を調製したときに、２０〜８０℃の範囲での温度変化に対する水溶液の粘度変化においてヒステリシスを有さないような多糖類又はその変性体を被覆層に用いることで、イオン交換容量及び耐久性に優れ、かつタンパク質の吸着量の向上及び非特異吸着の低減できることが分かる。

【図1】