特許 6886402 生分解性インジェクタブルゲル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6886402

(24)【登録日】2021年5月18日

(45)【発行日】2021年6月16日

(54)【発明の名称】生分解性インジェクタブルゲル

(51)【国際特許分類】

   C08G 63/20 20060101AFI20210603BHJP

   A61L 27/18 20060101ALI20210603BHJP

   A61L 27/26 20060101ALI20210603BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20210603BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20210603BHJP

   A61L 27/58 20060101ALI20210603BHJP

   A61M 25/00 20060101ALN20210603BHJP

【ＦＩ】

   C08G63/20ZBP

   A61L27/18

   A61L27/26

   A61L27/20

   A61L27/22

   A61L27/58

   !A61M25/00 500

【請求項の数】3

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2017-536444(P2017-536444)

(86)(22)【出願日】2016年8月23日

(86)【国際出願番号】JP2016074558

(87)【国際公開番号】WO2017033941

(87)【国際公開日】20170302

【審査請求日】2018年11月27日

(31)【優先権主張番号】特願2015-165204(P2015-165204)

(32)【優先日】2015年8月24日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】505043041

【氏名又は名称】株式会社スリー・ディー・マトリックス

(73)【特許権者】

【識別番号】000125370

【氏名又は名称】学校法人東京理科大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】大塚 英典

(72)【発明者】

【氏名】松隈 大輔

(72)【発明者】

【氏名】松田 範昭

【審査官】 藤井 勲

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０９−１５７３６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５１３９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１３３６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１７６０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２００２−００２７７４７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１６７２２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０６３３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１２０９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−０１１０７７６（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−０１１０７７７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１４４１７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０５３３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／０４４７０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１３３０２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−１０８１６０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ ６３／００ − ６３／９１

Ａ６１Ｌ １５／００ − ３３／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化19】

（式中、
ｎは、１０〜１０００であり、
ｍは、１〜１００である）
で示される、トリブロック共重合体。

【請求項2】

請求項１記載のトリブロック共重合体を含む架橋剤であって、トリブロック共重合体が、スクシンイミド−ポリエチレングリコール−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）−ポリエチレングリコール−スクシンイミドである、架橋剤。

【請求項3】

下記：

【化20】

（式中、
ｎは、１０〜１０００である）
をＤ，Ｌ−ラクチドと反応させ、

【化21】

（式中、
ｍは、１〜１００である）
を得る工程、
得られた

【化22】

を

【化23】

と反応させ

【化24】

を得る工程、
得られた

【化25】

を脱保護し、

【化26】

を得る工程、
得られた

【化27】

を炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）と反応させ

【化28】

を得る工程
を含む、請求項２記載の架橋剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トリブロック共重合体ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ、自己組織化ペプチド及びキトサンから構成される生分解性インジェクタブルゲルに関する。

【背景技術】

【0002】

再生医療において、物理物性を高度に制御可能なハイドロゲルは、効果的な細胞の増殖、分化の場を提供する足場として注目されている。我々はこれまでに、疑似細胞外マトリックスとしての自己組織化ペプチドゲル（ＲＡＤＡ１６）と、力学的支持体としての共有結合ゲル（キトサン／ＰＥＧ）からなる相互侵入高分子網目（ＩＰＮ）型のインジェクタブルゲル（キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６）が、有用な軟骨組織再生足場となることを見出した。ゲル中に含まれるペプチドの繊維状網目が細胞の高機能化に寄与し、結果としてｉｎ ｖｉｖｏでの優れた軟骨組織再生を促すことを確認している。

【0003】

一方、生体組織の再生誘導後、足場は分解・消失し、正常組織と置換されることが望ましい。共有結合性のキトサン／ＰＥＧゲルは分解性に乏しく、生体組織再生後の足場分解を制御することが困難であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、生分解性インジェクタブルゲルを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明では、Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）を導入したトリブロック共重合体ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ（Ｆｉｇｕｒｅ １）を用いる、生分解性インジェクタブルゲル（キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６）を提供する。

【0006】

すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］ポリエチレングリコール−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）−ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体、
［２］式Ｉ：

【化1】

（式中、
ｎは、重合度を表し、好ましくは、１０〜１０００の範囲であり、
ｍは、重合度を表し、好ましくは、１〜１００の範囲である）
で示される繰り返し単位を含む、請求項１に記載のトリブロック共重合体、
［３］上記［１］又は［２］に記載のトリブロック共重合体、キトサン、自己組織化ペプチドを含む、生分解性インジェクタブルゲル、
［４］自己組織化ペプチドが、（ＲＡＤＡ）_４である、［３］に記載の生分解性インジェクタブルゲル、
［５］下記：

【化2】

（式中、
ｎは、重合度を表し１０〜１０００の範囲である）
をＤ，Ｌ−ラクチドと反応させ、

【化3】

（式中、
ｍは、重合度を表し１〜１００の範囲である）
を得る工程、
得られた

【化4】

を

【化5】

と反応させ

【化6】

を得る工程、
得られた

【化7】

を脱保護し、

【化8】

を得る工程、
得られた

【化9】

を炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）と反応させ

【化10】

を得る工程
を含む、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）−ポリエチレングリコール骨格を有する、トリブロック共重合体の製造方法、
［６］上記［１］のトリブロック共重合体を含む、架橋剤。

【0007】

用語「ポリマー」又は「重合体」は、互換的に使用することができ、分子量の小さいモノマーから得ることができる、モノマー単位の繰り返しで構成された構造を有する分子をいう。用語「高分子」は、ポリマーのほか、例えばタンパク質、核酸等のような多数の原子が共有結合してなる巨大分子をいう。

【0008】

ポリマーにおいて用語「平均重合度」は、１個のポリマー分子中に含まれるモノマー単位の平均数をいう。すなわち、ポリマー組成物中には、異なる長さのポリマー分子がある程度の範囲で分散して存在している。

【0009】

ポリマーの重合度に関して「数平均分子量」とは、ポリマー組成物中の分子１個あたりの分子量の平均をいい、「重量平均分子量」とは、重量に重みをつけて計算した分子量をいう。また、数平均分子量と重量平均分子量の比を分散度といい、ポリマー組成物の分子量分布の尺度となる。分散度が１に近いほど、ポリマー組成物中の平均重合度が近くなり、同じ程度の長さのポリマー鎖を多く含むことになる。

【0010】

本発明において、「生分解性」とは、加水分解、酵素分解、微生物分解等の作用により化学的に分解することが可能なものをいう。

【0011】

本発明のインジェクタブルゲルには、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、必要に応じて、例えば、ラジカル捕捉剤、過酸化物分解剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、熱安定剤、可塑剤、難燃剤、帯電防止剤等の添加剤を添加して使用することができる。また、本発明のポリマー以外のポリマーと混合させて使用することができる。このような、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む組成物もまた、本発明の目的である。

【0012】

本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、適宜の有機溶媒に溶解させて単独で使用することもできるし、使用の目的に応じて他の高分子化合物と混合して使用する等、各種の組成物として使用することができる。また、本発明の医療用機器は、生体内組織や血液と接して使用される表面の少なくとも一部分に本発明の生分解性インジェクタブルゲルを有していればよい。つまり、医療用機器を成す基材の表面に対して、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む組成物を表面処理剤として用いることができる。また、医療用機器の少なくとも一部の部材を本発明の生分解性インジェクタブルゲル、又は、その組成物で構成しても良い。

【0013】

本発明の一つの態様は、生体内組織や血液に接して使用されたときに、分解されるまでの間、血液や組織に対して異物反応を抑制するための、本発明の生分解性インジェクタブルゲルである。

【0014】

本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、医療用途に好ましく使用されることができる。本発明の生分解性インジェクタブルゲルを他の高分子化合物等と混合して組成物として使用する場合には、その使用の用途に応じて適宜の混合割合で使用することができる。特に、本発明の生分解性インジェクタブルゲルの割合を９０重量％以上とすることで、本発明の特徴を強く有する組成物とすることができる。その他、使用の用途によっては、本発明の生分解性インジェクタブルゲルの割合を５０〜７０重量％とすることで、本発明の特徴を活かしつつ、各種の特性を併せ持つ組成物とすることができる。

【0015】

本発明の一つの態様は、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを含む、医療用機器である。ここで、「医療用機器」とは、人工器官等の体内埋め込み型デバイス及びカテーテル等の一時的に生体組織と接触することがあるデバイスを含み、生体内で取り扱われるものに限定されない。また、本発明の医療用機器は、本発明のポリマー組成物を少なくとも表面の一部に有する医療用途に使用される機器である。本発明でいう医療用機器の表面とは、例えば、医療用機器が使用される際に血液等が接触する医療用機器を構成する材料の表面並びに材料内の孔の表面部分等をいう。

【0016】

本発明において、医療用機器を構成する基材の材質や形状は特に制限されることなく、例えば、多孔質体、繊維、不織布、粒子、フィルム、シート、チューブ、中空糸や粉末等いずれでも良い。その材質としては木錦、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ブタジエン−アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミクス及びそれらの複合材料等が例示でき、複数の基材より構成されていても構わず、その血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部に本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルが設けられることが望ましい。

【0017】

本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、生体内組織や血液と接して使用される医療用機器の全体をなす材料、又はその表面部をなす材料として用いることができ、体内埋め込み型の人工器官や治療器具、体外循環型の人工臓器類、手術縫合糸、さらにカテーテル類（血管造影用カテーテル、ガイドワイヤー、ＰＴＣＡ用カテーテル等の循環器用カテーテル、胃管カテーテル、胃腸カテーテル、食道チューブ等の消化器用カテーテル、チューブ、尿道カテーテル、尿菅カテーテル等の泌尿器科用カテーテル）等の医療用機器の血液と接する表面の少なくとも一部、好ましくは血液と接する表面のほぼ全部が本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルで構成されることが望ましい。また、本発明に係る生分解性インジェクタブルゲルが有する生分解性を利用して、治療の際に体内に留置される医療用機器に特に好ましく用いることができる。

【0018】

本発明の生分解性インジェクタブルゲルは、止血剤、生体組織の粘着材、組織再生用の補修材、薬物徐放システムの担体、人工すい臓や人工肝臓等のハイブリッド人工臓器、人工血管、塞栓材、細胞工学用の足場のためのマトリックス材料等に用いても良い。

【0019】

これらの医療用機器においては、血管や組織への挿入を容易にして組織を損傷しないため、さらに表面潤滑性を付与してもよい。表面潤滑性を付与する方法としては水溶性高分子を不溶化して材料表面に吸水性のゲル層を形成させる方法が優れている。この方法によれば、生体親和性と表面潤滑性を併せ持つ材料表面を提供できる。

【0020】

本発明の生分解性インジェクタブルゲルはそれ自体が生体親和性に優れた材料であるが、様々な生理活性物質をさらに担持させることもできるため、血液フィルターのみならず、血液保存容器、血液回路、留置針、カテーテル、ガイドワイヤー、ステント、人工肺装置、透析装置、内視鏡等の様々な医療用機器に用いることができる。

【0021】

具体的には、本発明の生分解性インジェクタブルゲルを、血液フィルターを構成する基材表面の少なくとも一部にコーティングしてもよい。また、血液バッグと前記血液バッグに連通するチューブの血液と接する表面の少なくとも一部に本発明の高分子化合物をコーティングしてもよい。また、チューブ、動脈フィルター、遠心ポンプ、ヘモコンセントレーター、カーディオプレギア等からなる器械側血液回路部、チューブ、カテーテル、サッカー等からなる術野側血液回路部から構成される体外循環血液回路の血液と接する表面の少なくとも一部を本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングしてもよい。

【0022】

また、先端に鋭利な針先を有する内針と、前記内針の基端側に設置された内針ハブと、前記内針が挿入可能な中空の外針と、前記外針の基端側に設置された外針ハブと、前記内針に装着され、かつ前記内針の軸方向に移動可能なプロテクタと、前記外針ハブと前記プロテクタとを連結する連結手段とを備えた留置針組立体の、血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。また、長尺チューブとその基端（手元側）に接続させたアダプターから構成されるカテーテルの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。

【0023】

また、ガイドワイヤーの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。また、金属材料や高分子材料よりなる中空管状体の側面に細孔を設けたものや金属材料のワイヤや高分子材料の繊維を編み上げて円筒形に成形したもの等、様々な形状のステントの血液と接触する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。

【0024】

また、多数のガス交換用多孔質中空糸膜をハウジングに収納し、中空糸膜の外面側に血液が流れ、中空糸膜の内部に酸素含有ガスが流れるタイプの中空糸膜外部血液灌流型人工肺の、中空糸膜の外面もしくは外面層に、本発明の生分解性インジェクタブルゲルが被覆されている人工肺としてもよい。

【0025】

また、透析液が充填された少なくとも一つの透析液容器と、透析液を回収する少なくとも一つの排液容器とを含む透析液回路と、前記透析液容器を起点とし、又は、前記排液容器を終点として、透析液を送液する送液手段とを有する透析装置であって、その血液と接する表面の少なくとも一部が本発明の生分解性インジェクタブルゲルでコーティングされてもよい。

【発明の効果】

【0026】

本発明は、優れた軟骨組織再生の足場であり、かつ、優れた生分解性を有するという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図2】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図3】生成物のＧＰＣ測定結果である。

【図4】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図5】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図6】ＰＥＧ ５ｋおよび、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合のゲル化相図である（左：キトサン／ＰＥＧ ５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ）。

【図7】ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合の周波数依存測定結果を示す（左：キトサン／ＰＥＧ ５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ）。

【図8】ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合のゲル化挙動を示す（左：キトサン／ＰＥＧ ５ｋ、右：キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ）。

【図9】ＲＡＤＡ混合系のゲル化挙動を示す（上：ＲＡＤＡ、左：キトサン／ＰＥＧ ５ｋ／ＲＡＤＡ、右：キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ）。

【図10】ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合のヤング率（点）、及びＲＡＤＡ混合系におけるヤング率（斜線）である。

【図11】ＰＥＧ５ｋおよび、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合の膨潤度（点）、及びＲＡＤＡ混合系における膨潤度（斜線）である。

【図12】ＲＡＤＡ混在化、非混在化における、ＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合の酸性条件下における分解挙動である。

【図13】ＲＡＤＡ混在化、非混在化における、ＰＥＧ５ｋ、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合の生理条件下における分解挙動である。

【図14】各ハイドロゲルにおけるＣＤ スペクトル測定結果である。

【図15】細胞存在下におけるキトサン／ＰＥＧ５ｋゲル、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルの分解挙動である。

【図16】各種ハイドロゲルのＭＴＴアッセイによるミトコンドリア活性である。

【図17】ＧＡＧ産生量（左：ｄａｙ当たりＧＡＧ産生量、右：積算ＧＡＧ産生量）である。

【図18】ゲル内ＧＡＧ産生量である。

【図19】ＧＡＧ総生産量（培地中＋ゲル内）である。

【図20】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【図21】生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

［実施例１］
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の例で用いた薬品は、とくに断りの無い場合は市販品をそのまま用いた。以下の例において、各実施例で得られた重合体の分子量分布の測定は以下のようにして行った。

【0029】

数平均分子量（［Ｍｎ］、単位：ｇ/mol）
ピーク分子量が既知の標準ポリスチレンを用い、該標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー社製「ＴＯＳＯ ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ」、カラム構成：ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＳｕｐｅｒＭＰ（ＨＺ）−Ｍ， ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＺ−Ｍ ４本直列）を使用して、重合体の数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。（溶媒：ＴＨＦ、温度：４０℃、流量：０．３５ｍＬ／min）。

【0030】

分子量分布（［Ｍｗ／Ｍｎ］）
上記の方法で求めた重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の値を用い、その比（Ｍｗ／Ｍｎ）として求めた。

【0031】

ＮＭＲ測定
ポリマーの構造解析については、ＮＭＲ測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ製、４００ＭＨｚ）を用い、^１Ｈ−ＮＭＲ測定及び^１３Ｃ−ＮＭＲ測定を行った。なお、ケミカルシフトはＣＤＣｌ_３（^１Ｈ：７．２６ppm、^１３Ｃ：７７．１ppm）を基準とした。

【0032】

両末端反応性ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ の合成
全体の合成スキームを示す。

【化11】

【0033】

ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｍｘ＝２，３５５）の合成

【化12】

【0034】

（２）の合成

【化13】

【0035】

Ａｒ雰囲気下で、エチレングリコール（１）１５．０ｇ（２２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（無水）２００ｍｌに溶解し、ＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ ４２４ｍｇ（２．２３ｍｍｏｌ， １ｍｏｌ％／ｖｓ．（１））を加え、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン ９．３３ｇ（１１１ｍｍｏｌ，０．５ｅｑｕｉｖ．／ｖｓ． （１））をゆっくり滴下し、常温で攪拌３０分後、微量のＴＥＡを添加した。反応溶液を濃縮し、カラム（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／１）にかけて片末端ＴＨＰ保護体（２）を得た（７．３６ｇ（２２％））。さらに減圧蒸留により精製を行った。^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ４．５８−４．５４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），３．９５−３．５１（ｍ，６Ｈ），２．９２−２．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．９１−１．７５（ｍ，６Ｈ）（図２０）。

【0036】

（３）の合成

【化14】

【0037】

（２）１４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）をＡｒ置換｛（真空１５分＋Ａｒ）×３｝し、Ａｒフロー下でＴＨＦ（無水）１５ｍｌを添加し、ＴＨＦ中のカリウムナフタレン１ｍｍｏｌ分を滴下し、メタル化した。メタル化後、Ａｒフロー下でエチレンオキシド ２．５ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を滴下し、常温で２日間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル４００ｍｌで再沈澱精製して、フリーズドライによりＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ（３）を得た（２．２ｇ（回収率１００％））。ＧＰＣ：数平均分子量（Ｍ_ｎ）＝２３５５，Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ＝１．０７．^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ４．６３−４．６（ｔ，１Ｈ），３．９０−３．３７（ｍ，２０８Ｈ），１．８９−１．４７（ｍ，６Ｈ）（図２１）。

【0038】

ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨの合成

【化15】

【0039】

Ｎ_２雰囲気下、トルエン９７．９２ｍＬ（ｄｌ−ラクチド：１０ｍｇ／ｍＬ）にＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｍｎ＝２，３５５、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０９４）２０００ｍｇ（０．８４９３ｍｍｏｌ）、ｄｌ−ラクチド（再結晶済み）９７９．２ｍｇ（６．７９４ｍｍｏｌ、８ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ）、Ｓｎ（Ｏｃｔ）_２３４．４０ｍｇ（０．０８４９ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ）を溶解させ、１２０℃で４８時間撹拌した。反応後、濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させた。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲにより解析した。（収量：２５３１ｍｇ、収率８５．０％、図１）

【0040】

図１より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来ピークａを基準として２１４．００とした。ＰＬＡ由来のピークｂの値から、ＰＬＡ連鎖数を５連鎖とした。

【0041】

ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＴＨＰ の合成

【化16】

【0042】

Ｎ_２雰囲気下、ＣＨ_２Ｃｌ_２３０ｍＬにＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ２０００ｍｇ（０．７３６６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ５３９．９ｍｇ（４．４１９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ）を溶解させ、ＴＥＡ４１１μＬ（２．９４６ｍｍｏｌ，２ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ）を添加し、氷冷下（０℃）１０分間撹拌した。ＣＨ_２Ｃｌ_２２０ｍＬに溶解させた塩化アジポイル６７．４１ｍｇ（０．３６８３ｍｍｏｌ、０．５ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ）を混ぜ合わせた後、室温で４８時間撹拌した。反応後、１Ｎ ＨＣｌ、ＭｉｌｌｉＱで洗浄し、この操作を２回繰り返した。さらに、ＭｇＳＯ_４を加え、濃縮後、ベンゼンによる凍結乾燥を行った。化合物の構造は^１Ｈ−ＮＭＲ、ＧＰＣにより解析した（収量１６１９ｍｇ、収率７９．３％、図２）。

【0043】

図２より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、塩化アジポイルの両末端にＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨが完全に結合していると仮定し、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＰＬＡ由来のピークｂの値から、ＰＬＡ連鎖数を１０連鎖とした。また、ＧＰＣ測定結果を図３に示す。

【0044】

ＧＰＣ測定の結果、単峰性の溶出ピークはＴＨＰ−ＰＥＧ−ＯＨ，ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＯＨ，ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＴＨＰの順に高分子量側へとシフトした。これらの結果より、ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＴＨＰの合成を確認した。

【0045】

ＯＨ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＨの合成

【化17】

【0046】

Ｎ_２雰囲気下、ＭｅＯＨ ２０ｍＬにＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＴＨＰ １５００ｍｇ（０．２７０７ｍｍｏｌ）、ピリジニウムパラトルエンスルホナート（ＰＰＴＳ） ６８．０３ｍｇ（０．２７０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．ｖｓ．ＴＨＰ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＴＨＰ）を溶解させ、室温で７時間撹拌した。反応後、濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させた。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造を^１Ｈ−ＮＭＲにより解析した（収量１３８５ｍｇ、収率９５．２％、図４）。

【0047】

図４より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＴＨＰ由来ピークが消失していることから、ＴＨＰの脱保護を確認した。

【0048】

ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳの合成

【化18】

【0049】

Ｎ_２雰囲気下、ＣＨ_２Ｃｌ_２ ５０ｍＬにＯＨ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＯＨ １２００ｍｇ（０．２２３２ｍｍｏｌ）を溶解させた。別途、ＣＨ_３ＣＮ ２０ｍＬに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（ＤＳＣ） ２８５．９ｍｇ（１．１１６ｍｍｏｌ）を５０℃で３０分間溶解させた。２０ｍＬのＤＳＣ溶液と５０ｍＬのＰＥＧ溶液を混ぜ合わせた後、ピリジン２００μＬを添加し、室温で４８時間攪拌した。反応後、ろ過・濃縮の後、ジエチルエーテルで再沈殿した。ベンゼンによる凍結乾燥後、化合物の構造を^１Ｈ−ＮＭＲにより解析した（収量１１４２ｍｇ、収率９０．１％、図５）。

【0050】

図５より、プロトンの帰属を行った。積算値の基準は、ＰＥＧのＥＯ鎖由来のピークａを基準として４２８．００とした。ＮＨＳ由来のピークから、９９．３％ＮＨＳ化されていることがわかった。

【0051】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルの作製と物性評価
キトサン／ＰＥＧ ２．０／１．０ｗｔ％ ３００μＬゲルの作製
ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％キトサン１００μＬにＰＢＳ １５０μＬを添加した。そこにＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％両末端ＮＨＳ−ＰＥＧ ５０μＬを添加した。

【0052】

キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ ２．０／１．０／０．２５ｗｔ％３００μＬゲルの作製
ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％キトサン１００μＬにＰＢＳ（３００ｍＭ，ｐＨ７．４）７５μＬを添加した。そこにＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）を用いて調製した６．０ｗｔ％両末端ＮＨＳ−ＰＥＧ５０μＬを添加した後、１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６水溶液７５μＬを素早く添加した。

【0053】

［ゲル化相図の作製］
・実験操作
溶液のゲル化を、２０分間静置させた後、ｔｉｌｔｉｎｇ ｔｅｓｔ により評価した。各々のゲル化挙動を観察した後、ゲル化相図を作成した。目的とする濃度のキトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルは、キトサン，ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ，ＰＢＳの混合比を適宜変化させることで作製した。すべてのゲルにおいて、イオン濃度の異なるＰＢＳを適宜用いることで、最終ＰＢＳ濃度が１５０ｍＭとなるように調整した。ゲル化相図を図５に示す。

【0054】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧは、ＰＥＧ ５ｋと比較して、より高濃度領域においてゲル化することを確認した。これは、ＰＬＡを含有することで溶媒和性が減少し、結果として反応性が減少したためであると考えられる。また、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧは、室温（２０℃）において、３０ｗｔ％のような高濃度領域において初めて、温度相転移（Ｓｏｌ−Ｇｅｌ転移）による物理架橋ゲルを形成することが知られている（T, Mukose et al., Macromol. Biosci. 2014, 4, 361-367）。本系のゲル化は極めて低濃度領域で生じていることから、分子鎖間の化学架橋形成に基づくゲル化が示唆された。

【0055】

周波数依存測定
体積３００μＬのゲルを、直径１５ｍｍのディスク型に成形した。ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で２４時間膨潤させた（４℃）後、装置台座にセットした。パラレルプレートを、０．５Ｎの荷重が掛かるようにゲルに接近させた。周波数測定において、せん断応力ひずみは１％（＝γ）とし、発振周波数を０．１−１００Ｈｚの範囲で測定した（図７）。双方において、貯蔵弾性率（Ｇ’）は損失弾性率（Ｇ”）よりも高く、典型的なゲル物性を確認した。

【0056】

ゲル化挙動観察
ゲル化挙動を、ゲルの典型的作製法と同様の手法でレオメーター台座上に体積２１０μＬのゲル前駆体溶液を調製した後、即座に粘弾性測定を開始することで評価した。測定周波数は１Ｈｚとし、測定荷重は１Ｐａで行った。なお、ＲＡＤＡのゲル化は、ＰＢＳ（２００ｍＭ，ｐＨ７．４）１５７．５μＬに対して１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６水溶液５２．５μＬを添加することで観察した（図８）。

【0057】

双方において、所定時間経過後にＧ’は急激に増加し、明確なゲル化点（Ｇ’＞Ｇ”）が観測された。また、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合、ゲル化速度の減少を確認した。これは、ＰＬＡを含有することで、溶媒和性が減少し、結果として反応速度が減少したためである。

【0058】

次に、ＲＡＤＡ混合系におけるゲル化挙動測定結果を示す（図９）。ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの場合、測定開始時のＧ’はＧ”より高く、ＰＢＳとの混和により即座にゲル化することが示唆された。また、ＲＡＤＡを混合することにより、Ｇ’の値は、それぞれ単独の場合と比べて顕著に増大した。さらに、Ｇ’は時間経過とともに多段階に変化し、その変曲点はキトサン／ＰＥＧ ５ｋ、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧのゲル化時間と高く相関していた。これらの結果から、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、ＲＡＤＡ１６のネットワークが形成された後に、その間をキトサン／ＰＥＧ、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧが架橋する相互侵入高分子網目（Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＩＰＮ）構造を形成していることが示唆された。

【0059】

力学強度測定
体積３００μＬのゲルを、直径１５ｍｍのディスク型に成形した。ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で２４時間膨潤させた（４℃）後、装置台座にセットした。
測定周波数を１Ｈｚに固定した後、各ゲルサンプルに１Ｐａから３０００Ｐａまでの圧力を印加することで力学強度を測定した。損失弾性率Ｇ”が貯蔵弾性率Ｇ’を上回る点をゲルの破断点と定義し、応力−ひずみ曲線を作成した。得られた応力−ひずみ曲線の初期の傾きを直線近似することで、ヤング率を算出した（図１０）。

【0060】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルよりも力学強度が低くなった。これは、ＰＬＡを導入したことによって反応性が低下し、力学強度が低くなったためと考えられる。また、双方において、ペプチドを内包した結果、力学強度が向上した。これは、ゲルの網目が複合したためであり、ＩＰＮ構造の形成を示唆している。

【0061】

膨潤度測定
体積３００μＬのゲルを作製し、ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）後、膨潤後のゲルの重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの重量を再度測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ０を算出した（図１１）。
Ｑ０＝（Ｗ_ｓ−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ
Ｗ_ｓ：膨潤ゲルの重量、Ｗ_ｄ：乾燥ゲルの重量

【0062】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルよりも膨潤度が高くなった。これは、ＰＬＡを導入したことによって反応性が低下し、膨潤度が高くなったと考えられる。また、双方において、ペプチドを内包した結果、膨潤度が有意に低下した。これは、ＩＰＮ構造の形成に基づく網目密度の増加を示唆している。

【0063】

分解挙動評価
分解試験を、以下：
・酸加速分解試験（酢酸、室温条件下）
・実験操作
について行った。
体積３００μＬのゲルをそれぞれ作製し、１ｍＬのＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）。ゲルを膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、ＣＨ_３ＣＯＯＨを１ｍＬ加え、室温条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、ゲルの膨潤重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ、重量損失を算出した。溶液は１日毎に取り換えた（図１２）。
Ｑ＝（Ｗ_ｓ−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ
Ｗ_Ｓ：膨潤ゲルの重量、Ｗ_ｄ：乾燥ゲルの重量

重量損失（％）＝（Ｗ_ｄ０−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ０×１００
Ｗ_ｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）

【0064】

ＰＥＧ５ｋを用いたゲルでは、分解挙動を示さなかった。一方、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いたゲルにおいては、ＲＡＤＡの有無に依らず、顕著な分解挙動が確認された。ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合、ＰＬＡの加水分解に基づく分解挙動を示すことが確認された。

【0065】

生理条件下分解試験（ＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）、３７℃）
体積３００μＬのゲルをそれぞれ作製し、１ｍＬのＰＢＳ（１５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で４８時間膨潤させた（４℃）。ゲルを膨潤させた後、ＰＢＳを取り除き、新たなＰＢＳを１ｍＬ加え、３７℃条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、ゲルの膨潤重量を測定した。各サンプルを２４時間凍結乾燥させた後、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、膨潤度Ｑ、重量損失を算出した。溶液は３日毎に取り換えた（図１３）。
Ｑ＝（Ｗ_ｓ−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ
Ｗ_Ｓ：膨潤ゲルの重量、Ｗ_ｄ：乾燥ゲルの重量

重量損失（％）＝（Ｗ_ｄ０−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ０×１００
Ｗ_ｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）

【0066】

ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ及びＲＡＤＡにおいて、初期の段階では未架橋鎖の流出に伴う重量損失上昇が確認された。ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合、ＲＡＤＡの有無によらず、緩やかな分解挙動が確認された。分解速度は、ＰＥＧ ５ｋを用いた場合と比較して加速しており、生理条件下においても同様に、ＰＬＡの加水分解に伴う分解挙動が確認された。

【0067】

円二色性（ＣＤ）スペクトル測定
体積９０μＬの各サンプルをそれぞれ作製し、光路長０．１ｍｍの石英セルに塗布した。測定条件は以下のとおりである。
測定波長：３００−２０５ｎｍ
データ間隔：０．５ｎｍ
走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ
積算回数：３回
レスポンス：２．０ｓ
バンド幅：１．０ｎｍ
測定温度：２０℃

【0068】

ＲＡＤＡは、ＣＤスペクトルの２２０ｎｍ付近にβシート構造に基づく負のコットン効果を示すことが知られている。ペプチドを内包したゲルにおいても同様に、負のコットン効果が得られたことから、ペプチドの繊維構造はゲル内部で安定に保持されていることがわかった。

【0069】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルの細胞培養
（１）２０分間のＵＶ滅菌処理を施したキトサン（カルボキシメチルキトサン、甲陽ケミカル）を用い、４ｗｔ％キトサン溶液（１５０ｍＭ ＰＢＳ）を調製した。
（２）予めインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で培養したサブコンフルのウシ由来軟骨細胞（Ｐ１）をトリプシン処理により基板から剥がし、遠心後（１，５００ｒｐｍ，５分間）、上澄みを除去した。
（３）ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ加え、細胞数を測定した。
（４）遠心（１，５００ｒｐｍ，５分間）し、上澄み除去後、４ｗｔ％キトサン溶液を用いて、細胞懸濁液を作製した。
（５）１．５ｍＬサンプリングチューブに細胞懸濁液を２５μＬ加えた。
（６）２０分間のＵＶ処理を施したＮＨＳ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳを用いて、４ｗｔ％ＰＥＧ溶液（３００ｍＭＰＢＳ中）を別途調製した。
（７）上記の（５）に（６）の４ｗｔ％ＰＥＧ溶液を１２．５μＬ加え、ピペッティングを行った後すぐに、１．０ｗｔ％ＲＡＤＡ１６溶液を１２．５μＬ加え混ぜ合わせた。なお、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ＝２．０／１．０ｗｔ％を足場とする場合には、ＲＡＤＡ１６溶液の代わりに同体積の１５０ｍＭ ＰＢＳを添加した。
（８）１０分間ゲル化させた後、ゲル上部にＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，２％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）を５００μＬ加え、インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）内で培養した。２−３日毎に培地サンプルを回収し、フレッシュなＤＭＥＭを５００μＬ添加した。回収した培地サンプルは−８０℃で保存した。

【0070】

ゲル組成：
１．キトサン／ＰＥＧ５ｋ＝２．０／１．０ｗｔ％
２．キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ＝２．０／１．０ｗｔ％
３．キトサン／ＰＥＧ５ｋ／ＲＡＤＡ１６＝２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
４．キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６＝２．０／１．０／０．２５ｗｔ％

【0071】

培養条件：
細胞数：５．０×１０^５細胞
細胞密度：１．０×１０^７細胞／ｍｌ
ゲル体積：５０μＬ
培地量：５００μＬ

【0072】

キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ ゲルの軟骨細胞機能評価
分解挙動評価（細胞存在下）
上記と同様の方法で、体積３００μＬのキトサン／ＰＥＧ ５ｋ ゲル及びキトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルをそれぞれ作製し、ＤＭＥＭを１ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で静置した。所定時間経過後、サンプルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、各サンプルを２４時間凍結乾燥させ、ゲルの乾燥重量を測定した。以下の式を用いて、重量損失を算出した。培地は２，３日毎に取り換えた。
重量損失（％）＝（Ｗ_ｄ０−Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ０×１００
Ｗ_ｄ０：初期乾燥重量（ｄａｙ０）

【0073】

培養条件：
細胞数：３．０×１０^６細胞
細胞密度：１．０×１０^７細胞／ｍｌ
ゲル体積：３００μＬ
培地量：１０００μＬ

【0074】

細胞存在下において、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルはｄａｙ４０まで顕著な分解挙動は示さず、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧゲルは経過時間に伴う緩やかな分解挙動を示した。従って、細胞存在下においても同様に、ＰＬＡに由来する分解挙動を示していることが示唆された。また、キトサン／ＰＥＧ５ｋゲルにおいて、ｄａｙ４０以降、細胞の伸展に伴い架橋鎖が切断され、顕著な分解挙動を示していると考えられる。

【0075】

ＭＴＴアッセイ
（１）サンプルの培地を交換する際に、ＤＭＥＭを４５０μＬ加え、５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ試薬を５０μＬ加えた。
（２）２４時間、インキュベーション（３７℃，５％ＣＯ_２）した。
（３）上澄みを除去し、ゲルを崩し、ＭＴＴ抽出用試薬（２−プロパノール：１Ｍ ＨＣｌ＝２４：１ｖｏｌ％）を５００μＬ加え、３７℃で２４時間振とうした。
（４）遠心（１，５００ｒｐｍ，５分間）後、９６ウェルプレートに上澄みを１００μＬ／ウェル加え、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１６）。

【0076】

ＭＴＴアッセイによるミトコンドリア活性は、培養初期において全てのハイドロゲルにおいて低下した。その後、ＲＡＤＡ非混合ゲルでは低い状態を維持していたが、ＲＡＤＡ混合ゲルでは顕著な活性の上昇が見られた。これは、ペプチドの繊維構造が生体環境を模倣した結果、細胞活性が向上したと考えられる。また、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合、細胞活性は有意に向上した。これは、分解性を付与した影響であると考えられる。また、培養後期において、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧを用いた場合、活性の低下を確認した。これは、ゲルが分解し細胞が放出されていることを示唆している。

【0077】

ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイ
（１）ＤＭＭＢ ４ｍｇをエタノール１．２５ｍＬに溶解させ、ギ酸０．７５ｍＬ，１．０Ｍ ＮａＯＨ溶液６．４ｍＬを添加し、計２５０ｍＬになるまでＭｉｌｌｉ Ｑ水でメスアップすることにより、ＤＭＭＢ溶液を調製した。
（２）９６ウェルプレートにＤＭＭＢ溶液を１２５μＬ／ウェル加えた。
（３）検量線用コンドロイチン硫酸溶液（ＰＢＳ中），サンプル（２倍希釈培地、ゲル融解液）を２０μＬ／ウェル加え、よくピペッティングした。
（４）５７０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１７〜１９）。

【0078】

作製したキトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、キトサン／ＰＥＧ５ｋ／ＲＡＤＡ１６ゲルと比較すると、培地中のＧＡＧ産生、及びゲル中のＧＡＧ産生量は、培養初期の段階では同程度のＧＡＧ産生量を示しているが、培養後期の段階では、キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルの方がＧＡＧ産生量が高くなっている。キトサン／ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、培養条件下において緩やかな分解挙動を示すことを確認しており、ゲルに分解性を付与した結果ＧＡＧ産生量が向上していると考えられる。

【0079】

重合官能基−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−重合官能基、または重合官能基−ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−重合官能基をゲル化の架橋材料として用いる場合は、重合開始剤、重合性の刺激（紫外線、ガンマ線、など）が必要となる。

【0080】

この場合、（１）光毒性、重合開始剤分解物等の毒性シグナルによって、ゲル化反応後の細胞生存率が大きく低下する、（２）光（主に紫外線）照射による細胞に対する遺伝子異常、癌化等のリスクが高まり、臨床ステージの安全性確保が困難である、などのデメリットが大きい（Wiliams et al, Biomaterials 2005, 26, 1211-1218; Liu et al, Adv. Mater. 2014, 26, 3912-3917; Cui et al, Biomacromolecules 2013, 14, 1904-1912）。

【0081】

一方、スクシンイミド−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ−スクシンイミドは、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ、またはＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡを用いる物理架橋ゲルと違い、極めて低濃度での架橋が可能である。したがって粘性の低い細胞混和物として扱うことが可能なため、生体内投与型のインジェクタブルゲルとしての利用が可能であり、臨床治療への適合性が高い。

【0082】

また、ゲル化反応の駆動力として、分解生成物（副生成物）の安全なスクシンイミドとタンパク分子アミノ酸残基との反応を用いており、しかも混合するだけでゲル化が進むため、他の第３刺激因子を必要としない。

【0083】

その結果、ゲル化反応後の細胞生存率は、架橋前に対して１００％を維持する極めて毒性の低い反応である。

【産業上の利用可能性】

【0084】

本発明のトリブロック共重合体は、生分解性相互侵入高分子網目（ＩＰＮ）の製造のために有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]