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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6892721
(24)【登録日】2021年6月1日
(45)【発行日】2021年6月23日
(54)【発明の名称】新規ヌクレアーゼドメインおよびその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20210614BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20210614BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20210614BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20210614BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20210614BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20210614BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20210614BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N15/62 Z
C12N15/55ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C07K19/00
C12N9/16 Z
【請求項の数】8
【全頁数】38
(21)【出願番号】特願2020-539416(P2020-539416)
(86)(22)【出願日】2019年8月23日
(86)【国際出願番号】JP2019033045
(87)【国際公開番号】WO2020045281
(87)【国際公開日】20200305
【審査請求日】2020年12月10日
(31)【優先権主張番号】特願2018-158710(P2018-158710)
(32)【優先日】2018年8月27日
(33)【優先権主張国】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度〜平成３０年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発／植物の生産性制御に係る共通基盤技術開発ゲノム編集の国産技術基盤プラットフォームの確立」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山本 卓
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 哲史
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 勝和
【審査官】
藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１４／１７５２８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１２／１６８３０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Database GenBank [online], Accession No.KSU87972.1，04-Dec-2015,[retrieved on 30.09.2019]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/KSU87972
【文献】
Database GenBank [online], Accession No.LNQP01000031.1，04-DEC-2015, [retrieved on 30.09.2019]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LNQP01000031.1
【文献】
Database GenBank [online], Accession No.MZGW01000003.1，15-MAR-2017, [retrieved on 30.09.2019]，ＵＲＬ，http://ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MZGW01000003.1
【文献】
Molecular Therapy (2009) Vol.17, No.1, pp.104-111
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドであるヌクレアーゼドメインおよび核酸結合ドメインを含む人工核酸切断酵素であって、
前記変異体ポリペプチドが、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであり、
前記核酸結合ドメインが、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＰＰＲを含む、人工核酸切断酵素。
前記変異体ポリペプチドが、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであり、
前記核酸結合ドメインが、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＰＰＲを含む、人工核酸切断酵素。
【請求項2】
前記ヌクレアーゼドメインと前記核酸結合ドメインとの間に位置するリンカーをさらに含む、請求項１記載の人工核酸切断酵素。
【請求項3】
請求項１または２に記載の人工核酸切断酵素をコードする核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸またはその転写産物もしくは翻訳産物を含むベクター。
【請求項5】
請求項１または２に記載の人工核酸切断酵素、請求項３に記載の核酸、または請求項４に記載のベクターを細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）に導入することを含む、標的核酸を改変する方法。
【請求項6】
前記人工核酸切断酵素、核酸、またはベクターが、２種以上の人工核酸切断酵素、該２種以上の人工核酸切断酵素をコードする核酸、または該核酸、その転写産物、もしくはその翻訳産物を含むベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
請求項１または２に記載の人工核酸切断酵素、請求項３に記載の核酸、または請求項４に記載のベクターを含む、標的核酸の改変のためのキット。
【請求項8】
前記人工核酸切断酵素、核酸、またはベクターが、２種以上の人工核酸切断酵素、該２種以上の人工核酸切断酵素をコードする核酸、または該核酸、その転写産物、もしくはその翻訳産物を含むベクターである、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規ヌクレアーゼドメイン、および当該ヌクレアーゼドメインを含む人工核酸切断酵素に関する。【背景技術】
【0002】
近年、ゲノム編集ツールとして、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-finger nuclease；ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription activator-like effector nuclease；ＴＡＬＥＮ）やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated）システムといった、標的配列を特異的に認識し、その近傍で切断可能なヌクレアーゼが利用できるようになった。これらのヌクレアーゼは、核酸結合ドメインと核酸切断ドメインを含み、ゲノムＤＮＡの特定の塩基配列でＤＮＡ二本鎖の切断（DNA double-strand break；ＤＳＢ）をもたらすことができる。これらのヌクレアーゼによりもたらされたＤＳＢの修復としては、修復エラーを生じやすい非相同末端連結修復（nonhomologous end joining；ＮＨＥＪ）と相同組換え修復（homologous recombination；ＨＲ）等が知られている。細胞がＤＳＢを修復する際にはＮＨＥＪ経路を主に用いて修復を行うため、修復エラーが生じやすく、フレームシフトが起き、その結果、遺伝子機能を喪失することとなる。このように、細胞が持っている機構を利用して遺伝子破壊等を行うことができるゲノム編集技術は、疾病研究や農作物への応用等、生命科学において幅広く利用されつつある。【0003】
ＺＦＮやＴＡＬＥＮでは、通常、核酸切断ドメインとしてＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（以下、「ＦｏｋＩ−ＮＤ」ともいう）が用いられている。ＦｏｋＩ−ＮＤは、核酸への結合能を有するが、塩基配列を認識せず、また二量体を形成することで標的とする核酸を切断することが明らかにされている。そのため、ＺＦＮやＴＡＬＥＮでは、核酸結合ドメインの標的配列が２つ必要となり、この２つの標的配列に挟まれたスペーサー配列内でＦｏｋＩ−ＮＤが作用し、ＤＳＢをもたらす。ＺＦＮでは、２つの標的配列をそれぞれ、ターゲットハーフサイトＬ（Target half-site L）およびターゲットハーフサイトＲ（Target half-site R）と呼ぶ。【0004】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ−ＮＤ、ジンクフィンガータンパク質（Zinc-finger protein；ＺＦＰ）からなる核酸結合ドメイン、およびそれらをつなぐリンカー（intermolecular linker）からなる。ＺＦＮでは、スペーサー配列の長さやリンカーの性質からの制約が強く、その設計において工夫が必要である。そこで、ＺＦＮに関する技術として、スペーサー配列の長さやリンカーの改変が報告されている（非特許文献１）。【0005】
また、ＴＡＬＥ等の核酸結合ドメインと、Clostridium spec. 7_2_43 FAA株由来のヌクレアーゼドメインとの融合タンパク質が報告されている（特許文献１）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第９４１０１３４号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Handel, E.M., Alwin, S. and Cathomen, T. (2009) Expanding or restricting the target site repertoire of zinc-finger nucleases: the inter-domain linker as a major determinant of target site selectivity. Mol Ther, 17, 104-111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
切断活性、切断効率が高く、かつ、標的配列、スペーサー配列、またはリンカー配列等による制約の少ない、新規ヌクレアーゼドメイン、および当該ヌクレアーゼドメインを含む人工核酸切断酵素を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ゲノム編集酵素の核酸切断ドメインとして現在標準的に用いられているＦｏｋＩ−ＮＤとは異なるヌクレアーゼドメインを探索した結果、切断活性や特異性、細胞毒性、標的配列の選択性等の機能性において既存のＦｏｋＩ−ＮＤをしのぐ新規ヌクレアーゼドメインを見出し、本発明を完成するに至った。【0010】
すなわち、本発明は、以下の態様を提供する。（１）配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドである、ヌクレアーゼドメイン、および
核酸結合ドメイン
を含む人工核酸切断酵素。
（２）前記ヌクレアーゼドメインと前記核酸結合ドメインとの間に位置するリンカーをさらに含む、前記（１）記載の人工核酸切断酵素。
（３）前記核酸結合ドメインが、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＰＰＲを含む、前記（１）または（２）に記載の人工核酸切断酵素。
（４）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の人工核酸切断酵素をコードする核酸配列を含む単離された核酸。
（５）前記（４）に記載の核酸またはその転写産物もしくは翻訳産物を含むベクター。
（６）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の人工核酸切断酵素、前記（４）に記載の核酸、または前記（５）に記載のベクターを細胞に導入することを含む、標的核酸を改変する方法。
（７）前記人工核酸切断酵素、核酸、またはベクターが、２種以上の人工核酸切断酵素、該２種以上の人工核酸切断酵素をコードする核酸、または該核酸、その転写産物、もしくはその翻訳産物を含むベクターである、前記（６）に記載の方法。
（８）前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の人工核酸切断酵素、前記（４）に記載の核酸、または前記（５）に記載のベクターを含む、標的核酸の改変のためのキット。
（９）前記人工核酸切断酵素、核酸、またはベクターが、２種以上の人工核酸切断酵素、該２種以上の人工核酸切断酵素をコードする核酸、または該核酸、その転写産物、もしくはその翻訳産物を含むベクターである、前記（８）に記載のキット。
（１０）配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチド。
（１１）
前記（１０）に記載のポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸。
（１２）
前記（１１）に記載の核酸またはその転写産物もしくは翻訳産物を含むベクター。
【発明の効果】
【0011】
本発明によるヌクレアーゼドメインは、従来のＦｏｋＩ−ＮＤよりも、切断活性や特異性、標的配列の選択性等の機能性において優れた核酸切断作用を提供する。本発明のヌクレアーゼドメインを核酸結合ドメインと結合させることにより、活性が高く、標的配列柔軟性のある、標的配列を特異的に切断する核酸切断酵素が提供される。かかる核酸切断酵素は、ゲノム編集ツールとして非常に有用である。【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】ＺＦＡ３６−ＮＤの模式図である。上段は、２つのＺＦＮ標的部位がスペーサー配列で分けられていることを示す。下段は、ＺＦＮが３つのジンクフィンガー分子、短い７アミノ酸のＴＧＡＡＡＲＡリンカーおよびＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインを含むことを示す。所定の長さのスペーサー配列によって隔てられたターゲットハーフサイトに一対のＺＦＮが結合すると、ヌクレアーゼドメインが二量体化し、核酸を切断することができる。
【図1B】ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインホモログのアミノ酸配列アラインメントを示す。ＭＡＦＦＴを用いてアミノ酸配列をアラインメントした。へテロ二量体ヌクレアーゼドメインを定めるアミノ酸および対応する点変異を矢印、星印およびコロンで示す。図中、「Ｆｏｋ１」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図1C】実施例２で実施した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ベースのＳＳＡアッセイによる細胞活性の結果を示す。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。＋および−は、ジンクフィンガー標的配列レポータープラスミドの有無を示す。
【図2A】ヌクレアーゼドメインの標的ゲノムに対する切断活性を示す。ＺＦＡ３６−ＮＤをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を３７℃でインキュベートし、７２時間後に回収し、ついでゲノムＤＮＡ鋳型を調製した。ＺＦＡ３６標的部位を含むＰＣＲ産物をＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより切断した。切断断片を電気泳動（ＭｕｌｔｉＮＡシステム）により解析した。切断効率を、非切断バンドおよびより大きい切断断片のモル濃度から計算した。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図2B】実施例３で実施した、ヌクレアーゼドメインの標的ゲノムに対する切断活性試験の結果を切断効率で示す。
【図3】ＺＦＡ３６−ＮＤの発現レベルを示すウェスタンブロット解析結果を示す。ＡｃＶ５タグ−ＺＦＡ３６−ＮＤをＨＥＫ２９３Ｔ細胞により発現させた。トランスフェクションした細胞を７２時間後に回収し、細胞溶解物をＡｃＶ５タグおよびα−チューブリンの両者に対する抗体でプローブした。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図4】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＺＦＡ３６−ＮＤ−ＥＧＦＰのＬＳＭ画像を示す。ＺＦＡ３６−ＮＤ−ＥＧＦＰ過剰発現細胞の顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ染色により、ＤＮＡを可視化した。スケールバー：４０μｍ。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図5】異なるスペーサー長でのＺＦＡ３６−ＮＤリンカー変異体のレポーター活性プロファイルを示す。実施例５で実施したＳＳＡレポーターアッセイの結果を示す。ＺＦＮリンカー変異体およびスペーサー長を６ｂｐ（Ａ）、５ｂｐ（Ｂ）および７ｂｐ（Ｃ）として示す。データは、６ｂｐスペーサー長のＦｏｋＩのＴＧＡＡＡＲＡ−リンカーのルシフェラーゼ活性に対して正規化したものである。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図6】ＺＦＡ３６−ＮＤ−Ｓｈａｒｋｅｙ変異体のレポーター活性プロファイルを示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。（Ａ）ＺＦＮの模式図。ＦｏｋＩ−ＮＤの４１４−４４５位のアミノ酸配列に相当するＮＤ１、ＮＤ２および各ｓｈａｒｋｅｙ変異体の配列について示す。図中、アミノ酸ナンバーは、各ヌクレアーゼドメインの全長アミノ酸に基づく。（Ｂ）実施例６で実施したＳＳＡレポーターアッセイの結果を示す。−は、ＺＦＮプラスミドが存在しないことを示す。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。
【図7】細胞ベースのＳＳＡアッセイにより測定したヘテロ二量体型変異を有するＺＦＮの単独使用におけるヌクレアーゼ活性を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各ＺＦＮ発現プラスミド、レポータープラスミドおよび参照プラスミドで同時トランスフェクションしてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション後、細胞を２４時間インキュベートし、溶解し、ルシフェラーゼ活性を分析した。（Ａ）ｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１−６ｂｐ−ｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１レポーター。（Ｂ）ＺＦＡ３６−６ｂｐ−ＺＦＡ３６レポーター。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図8A】ＳＳＡレポーターアッセイによる、ホモ二量体およびヘテロ二量体の切断反応の分析を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各対のＺＦＮ発現プラスミド、レポータープラスミドおよび参照プラスミドで同時トランスフェクションしてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション後、細胞を２４時間インキュベートし、溶解し、ルシフェラーゼ活性を分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図8B】Ｃｅｌ−Ｉアッセイによる、ホモ二量体およびヘテロ二量体の切断反応の分析を示す。各ＺＦＮプラスミドをトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。ついで、トランスフェクションした細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ＺＦＡ３６−ＺＦＬ１標的部位を含むフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより切断した。切断したフラグメントをアガロースゲル電気泳動により解析した。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図9】細胞ベースのＳＳＡアッセイにより測定したハイブリッドＺＦＮのヌクレアーゼ活性を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ベースのＳＳＡアッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各対のＺＦＮ発現プラスミド、レポータープラスミドおよび参照プラスミドで同時トランスフェクションしてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション後、細胞を２４時間インキュベートし、溶解し、ルシフェラーゼ活性を分析した。白色および灰色のバーは、それぞれＺＦＡ３６−ＦｏｋＩおよびＺＦＮが存在しないことを示す。（Ａ）ＺＦＬ１−ＦｏｋＩ−ＤＤＤおよび適当なヌクレアーゼドメイン。（Ｂ）ＺＦＬ１−ＮＤ１−ＤＤＤおよび適当なヌクレアーゼドメイン。（Ｃ）ＺＦＬ１−ＮＤ２−ＤＤＤおよび適当なヌクレアーゼドメイン。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図10】実施例９で実施した標的部位の配列分析結果を示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図11A】実施例１０で実施した、本発明の新規ヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥを含む人工核酸切断酵素の切断試験の結果を示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図11B】実施例１０で実施した、本発明の新規ヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥを含む人工核酸切断酵素の切断試験の結果を示す。図中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。
【図12A】エレクトロポレーション法により植物細胞に導入したＺＦ−ＮＤ１およびＺＦ−ＦｏｋＩのヌクレアーゼ活性をＳＳＡレポーターアッセイにより検出した結果を示す。
【図13】プロテイントランスダクション法により植物細胞に導入したＺＦ−ＮＤ１およびＺＦ−ＦｏｋＩのヌクレアーゼ活性をＳＳＡレポーターアッセイにより検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．新規ヌクレアーゼドメインＦｏｋＩ−ＮＤよりも高性能の新規ヌクレアーゼドメインを開発するため、ＦｏｋＩ−ＮＤのアミノ酸配列を元にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴにより相同性のある天然素材の検索を行った。ＦｏｋＩ−ＮＤとの相同性が３５％〜７０％の範囲に存在する相同配列から数種類を選択し、さらに解析を進め、ＦｏｋＩ−ＮＤより優れたヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼドメイン１（以下、「ＮＤ１」という）およびヌクレアーゼドメイン２（以下、「ＮＤ２」という）を見出した。
【0014】
ＮＤ１を含む全長タンパク質（バチルス属ＳＧＤ−Ｖ−７６由来）のアミノ酸配列を配列番号１に、その塩基配列を配列番号２に示す。ＮＤ２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列を配列番号３に、その塩基配列を配列番号４に示す。ＮＤ１は、典型的には、配列番号１の３９１〜５８５位に相当する部分ペプチドであり、ＮＤ２は、典型的には、配列番号３の３８９〜５７９位に相当する部分ペプチドである。【0015】
ＮＤ１は、ＦｏｋＩ−ＮＤとのアミノ酸配列同一性７０％を有し、ＮＤ２は、ＦｏｋＩ−ＮＤとのアミノ酸配列同一性５７％を有するが、本発明において初めて単離された、新規ポリペプチドである。【0016】
したがって、本発明は、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドであるヌクレアーゼドメイン（以下、「本発明のヌクレアーゼドメイン」ともいう）を提供する。本発明のヌクレアーゼドメインは、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドであるヌクレアーゼドメインを包含する。言い換えれば、本発明は、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体ポリペプチド、例えば、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドのヌクレアーゼドメインとしての使用を提供する。【0017】
本明細書において、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体ポリペプチドとは、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有し、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドである。該変異体ポリペプチドの例として、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、および配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列からなり、かつヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、「１ないし数個」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個であり、例えば、１個、２個、３個、４個または５個である。【0018】
また別の例として、該変異体ポリペプチドは、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであってもよく、例えば、配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。また、該変異体ポリペプチドのさらなる例として、配列番号２の１１７１〜１７５５位または配列番号４の１１６５〜１７３７位に示される塩基配列に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、および配列番号２の１１７１〜１７５５位または配列番号４の１１６５〜１７３７位に示される塩基配列に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。【0019】
本発明において、アミノ酸配列の「配列同一性」とは、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等）を利用すればよい。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等の配列解析ソフトウェアを用いて決定される。【0020】
さらに、上記の変異体ポリペプチドは、好ましくは、ＦｏｋＩのアミノ酸配列における４８３位に相当する位置にアスパラギン酸（以下、「Ｄ４８３」という）、および／またはＦｏｋＩのアミノ酸配列における４８７位に相当する位置にアルギニン（以下、「Ｒ４８７」という）を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。また、上記の変異体ポリペプチドは、好ましくは、ＦｏｋＩのアミノ酸配列における４５０位、４６７位および４６９位に相当する位置にそれぞれ、アスパラギン酸、アスパラギン酸およびリジン（以下、それぞれ、「Ｄ４５０」、「Ｄ４６７」および「Ｋ４６９」という）を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらに好ましくは、上記変異体ポリペプチドは、Ｄ４８３および／またはＲ４８７を有し、かつ、Ｄ４５０、Ｄ４６７およびＫ４６９を有するアミノ酸配列を含む。Ｄ４８３およびＲ４８７は、ＦｏｋＩ−ＮＤが切断活性を持つ二量体を形成する際に必須となると考えられているアミノ酸残基であり、ＮＤ１およびＮＤ２のアミノ酸配列において保持されている。さらにＦｏｋＩ−ＮＤの触媒部位については、アミノ酸置換を用いた解析により、Ｄ４５０とＤ４６７が核酸の切断に関わることが明らかにされている。さらにこれらのアミノ酸近傍のＫ４６９も含めた配列が、ＥｃｏＲＩやＥｃｏＲＶで見られるモチーフであり、これらのアミノ酸がリン酸ジエステル結合の切断活性に係ることが明らかにされている。Ｄ４５０、Ｄ４６７およびＫ４６９は、ＮＤ１およびＮＤ２のアミノ酸配列において保持されている。【0021】
また、上記の変異体ポリペプチドは、本発明のヌクレアーゼドメインが核酸切断時にヘテロ二量体を形成するように、ＦｏｋＩのアミノ酸配列における４８３位、４８７位および４９６位に相当する位置にアスパラギン酸（以下、「Ｄ４８３、Ｄ４８７およびＤ４９６」という）を含んでいてもよく（以下、「ＤＤＤ型変異体」ともいう）、またはＦｏｋＩのアミノ酸配列における４８３位、４８７位および５３７位に相当する位置にアルギニン（以下、「Ｒ４８３、Ｒ４８７およびＲ５３７」という）を含んでいてもよい（以下、「ＲＲＲ型変異体」ともいう）。【0022】
本発明の配列番号１の３９１〜５８５位または配列番号３の３８９〜５７９位に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドやその変異体ポリペプチドの鎖長は、通常、５００アミノ酸以下であり、例えば、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、または２００アミノ酸以下である。【0023】
さらに、本明細書において、上記の変異体ポリペプチドには、修飾アミノ酸および／または非天然アミノ酸を含むポリペプチドも包含される。修飾アミノ酸としては、限定するものではないが、例えば、メチル化、エステル化、アミド化、アセチル化、アルキル化、ハロゲン化等が挙げられる。該修飾アミノ酸および非天然アミノ酸は、公知の方法によって導入することができる。【0024】
本発明のヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ−ＮＤと同等以上のヌクレアーゼ活性を有する。例えば、本発明のヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ−ＮＤと比べて、少なくとも０．８倍、少なくとも０．９倍、少なくとも１倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．８倍、少なくとも３倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３．８倍、または少なくとも４倍のヌクレアーゼ活性を有する。ヌクレアーゼ活性は、当該分野で既知の方法で確認することができる。例えば、ヌクレアーゼドメインをＺＦＮシステムに組み入れて、ＳＳＡ（single-strand annealing）法およびＣｅｌ−Ｉ法により核酸切断活性、例えばＤＮＡ切断活性を測定することによって確認してもよい。【0025】
本発明のヌクレアーゼドメインは、後記するように、人工核酸切断酵素におけるリンカーの選択における柔軟性および標的切断部位となるスペーサーの選択における柔軟性において、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なる性質を有する（実施例５）。また、本発明のヌクレアーゼドメインに、ＦｏｋＩ−ＮＤにおいて活性上昇をもたらすことが知られたＳｈａｒｋｅｙ変異を導入しても、活性の上昇は見られなかった（実施例６）。また、本発明のＮＤ１は、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なり、ヘテロ二量体を形成してもヌクレアーゼ活性が低下しなかった（実施例７）。かくして、本発明のヌクレアーゼドメインは、従来のＦｏｋＩ−ＮＤよりも優れた性質および／または異なる性質を有するヌクレアーゼドメインである。【0026】
本発明のヌクレアーゼドメインは、単離ヌクレアーゼドメインであってもよい。本発明はまた、本発明のヌクレアーゼドメインをコードする単離核酸も提供する。本明細書において、「単離」とは、自然界または生体から分離した状態をいう。【0027】
２．人工核酸切断酵素本発明の人工核酸切断酵素は、本発明のヌクレアーゼドメインおよび核酸結合ドメインを含む。該人工核酸切断酵素は、核酸結合ドメインを介して核酸上の標的配列に結合し、ヌクレアーゼドメインによって標的切断部位で核酸を切断する。したがって、該人工核酸切断酵素は、核酸中の標的部位を特異的に切断することができる、配列特異的核酸切断酵素である。
【0028】
本明細書において、「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれもが包含される。本発明の人工核酸切断酵素が切断する核酸としては、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡが挙げられる。該ＤＮＡとしては、例えば、限定するものではないが、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。好ましくは、本発明の人工核酸切断酵素は、ゲノム上の二本鎖ＤＮＡを切断する。該ＲＮＡとしては、例えば、限定するものではないが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＲＮＡからなるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖等が挙げられる。【0029】
核酸結合ドメインは、任意の核酸配列（標的配列）へ特異的に結合するタンパク質ドメインであればよく、例えば、限定するものではないが、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡの複合体）、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ（ＰＰＲ）等またはこれらの組み合わせを含むＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ｂ、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３などが挙げられる。ジンクフィンガーを含む核酸結合ドメインは、好ましくは２個以上のジンクフィンガーを含んでいてもよく、限定するものではないが、例えば、３〜９個のジンクフィンガーからなるジンクフィンガーアレイ（以下、「ＺＦＡ」ともいう）を含んでいてもよい。１つのジンクフィンガーは、３塩基配列を認識することが知られており、例えば、ＧＮＮ、ＡＮＮ、またはＣＮＮ等を認識するジンクフィンガーが知られている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓとしては、好ましくは、ヌクレアーゼ活性を不活性化したＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ（ヌクレアーゼ活性を不活化させたＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９）等が挙げられる。核酸結合ドメインは、所望の標的配列に結合するよう当業者によって適宜設計される。なお、本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」とは、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の複合体を意味し、該ガイドＲＮＡは、標的配列を認識し、結合する。【0030】
本発明の人工核酸切断酵素において、ヌクレアーゼドメインと核酸結合ドメインは、直接連結されていてもよく、またはリンカーを介して連結されていてもよい。リンカーは、例えば、２以上のアミノ酸残基からなり、長さは特に限定されないが、例えば、２〜２０アミノ酸長、例えば、２個、４個、６個、８個、９個、１２個、１６個、または２０個のアミノ酸長であってよい。リンカーの種類もまた特に限定されないが、例えば、ＴＧＡＡＡＲＡ、ＧＳ、ＲＰＧＥＫＰ、ＴＧＰＧＡＡＡＲＡ等が挙げられる。リンカーの有無およびリンカーの長さおよび種類は、核酸結合ドメインの種類等を考慮して当業者によって適宜選択される。従来のＦｏｋＩ−ＮＤを含むＺＦＮのヌクレアーゼ活性は、ＺＦとＦｏｋＩ−ＮＤをつなぐリンカー配列により大きく影響を受けることが知られているが、本発明の人工核酸切断酵素の場合、従来のＺＦＮと比べて、そのヌクレアーゼ活性のリンカー配列への依存性が低い。特にＮＤ１では、リンカー配列を変化させることによるヌクレアーゼ活性の低下がほとんどみられなかった（実施例５）。したがって、本発明の人工核酸切断酵素は、リンカー配列の柔軟性が高い。【0031】
本発明の人工核酸切断酵素の標的配列は、核酸上の任意の配列である。該標的配列は、好ましくは、スペーサー配列を挟んだ２つの配列である。スペーサー配列の長さや標的配列の長さおよび塩基配列は特に限定されない。当業者は、所望の長さおよび塩基配列からなる標的配列を適宜設定することができる。該２つの標的配列は、互いに回文配列であってもよく、または非回文配列であってもよい。該２つの標的配列が非回文配列である場合、各配列を標的とする２種の人工核酸切断酵素を調製する。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを含む核酸結合ドメインを用いる場合は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列の近傍に位置する配列を標的配列として選択する。すなわち、ＰＡＭが両標的配列の外側またはスペーサー配列中に存在するように、標的配列を設定する。標的配列は、二本鎖配列、または一本鎖配列のいずれであってもよい。なお、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。【0032】
本発明の人工核酸切断酵素において、核酸結合ドメインが核酸上の標的配列に結合すると、ヌクレアーゼドメインが標的切断部位で該核酸を切断する。標的切断部位は、標的配列に隣接するスペーサー配列中またはその近傍に存在する。スペーサー配列の長さは特に限定されないが、例えば、１〜２０ｂｐ、好ましくは３〜８ｂｐ、さらに好ましくは５〜７ｂｐが挙げられる。従来のＦｏｋＩ−ＮＤを含むＺＦＮの場合、至適なスペーサー長が６ｂｐであり、そのヌクレアーゼ活性はスペーサー長により大きな影響を受けることが知られているが、本発明の人工核酸切断酵素の場合、従来のＺＦＮと比べて、スペーサー長の柔軟性が高い。本発明の人工核酸切断酵素は、例えば、リンカー長を変えることにより、短いスペーサーや長いスペーサーに対しても高い切断活性を示す（実施例５）。一方、従来のＦｏｋＩ−ＮＤを含むＺＦＮでは、リンカー長を変えても、至適スペーサー長より短いスペーサーや長いスペーサーに対して、切断活性が著しく低下する。スペーサー長は認識配列間の距離を規定することから、本発明の人工核酸切断酵素は、スペーサー長の柔軟性の高さにより、標的切断部位および認識配列の選択肢が広がる。【0033】
本発明の人工核酸切断酵素は、当該分野で既知の方法によってイン・ビトロまたはイン・ビボで製造することができる。例えば、アミノ酸配列情報を基に人工合成する方法や、本発明の人工核酸切断酵素をコードする核酸、または本発明のヌクレアーゼドメインおよび核酸結合ドメインをコードする各核酸を人工合成し、適当な発現ベクター中に挿入し、次いで適当な宿主細胞中に導入して、該細胞内で該人工核酸切断酵素を発現させる方法が挙げられる。もしくは、本発明の人工核酸切断酵素をコードする核酸をイン・ビトロまたはイン・ビボ翻訳によりタンパク質を合成し、これを適当な細胞に導入し、該細胞内で該人工核酸切断酵素を作用させる、もしくは本発明の人工核酸切断酵素をコードするＲＮＡをイン・ビトロ転写により合成し、適当な宿主細胞中に導入して、該細胞内で該人工核酸切断酵素を作用させる方法があげられる。発現ベクターとしては、特に限定されず、当該分野で使用されるベクターから選択すればよい。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクター等が挙げられる。【0034】
宿主細胞としては特に限定されず、大腸菌、放線菌、古細菌等の原核生物や、酵母、ウニ、カイコ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、カエル、タバコ、シロイヌナズナ、イネ等の真核生物、および培養細胞等が挙げられる。【0035】
本発明のさらなる態様において、本発明の人工核酸切断酵素をコードする核酸配列を含む単離された核酸、ならびに該核酸の転写産物および翻訳産物も提供される。上記核酸は、本発明の人工核酸切断酵素をコードする核酸配列からなる単離核酸であってもよい。また、コドン最適化を行っていてもよい。本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも包含する。【0036】
３．標的核酸を改変する方法本発明の人工核酸切断酵素を細胞に導入すると、該酵素により該細胞内の核酸上の標的部位が切断され、該切断は次いで、非相同末端連結修復（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＲ）等によって修復される。この際、主な修復経路となるＮＨＥＪによる修復において、該切断部位に１以上の変異が挿入され、該核酸が改変される。したがって、本発明のさらなる態様において、本発明の人工核酸切断酵素、または該人工核酸切断酵素をコードする核酸を細胞に導入することを含む、標的核酸を改変する方法が提供される。上記の酵素または核酸は、該核酸の転写産物またはその翻訳産物であってもよい。上記核酸はまた、上記細胞中で高発現するように、コドン最適化を行っていてもよい。なお、本明細書において、「改変」には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。また、本明細書において、核酸に関して「変異」なる用語を用いる場合、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を意味する。
【0037】
上記の酵素または核酸の細胞への導入は、物理的な導入、またはウイルスまたは生物の感染等を介する導入であってもよく、当該分野で既知の様々な方法を用いることができる。物理的な導入方法としては、限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、パーティンクルガン法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、プロテイントランスダクション法等が挙げられる。ウイルスまたは生物の感染等を介する導入方法としては、限定するものではないが、例えば、ウイルス形質導入、アグロバクテリウム法、ファージ感染、接合等が挙げられる。上記導入には、適宜、ベクターが用いられる。ベクターとしては、導入する細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクター等が挙げられる。また、翻訳産物（タンパク質）や転写産物（ｍＲＮＡ）を運搬することのできるリポソームやレンチウイルスなどのベクター、および融合または結合させた分子を細胞内に導入することのできる細胞透過性ペプチドなどのペプチドベクターが挙げられる。【0038】
したがって、本発明のさらなる態様において、本発明の人工核酸切断酵素をコードする核酸を含むベクター、あるいは該核酸の転写産物またはその翻訳産物を含むベクターが提供される。該核酸の転写産物またはその翻訳産物を含むベクターには、該核酸を含むベクター内で該核酸が転写したもの、さらに翻訳産物が生じたものも包含される。【0039】
上記の細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。該細胞はまた、生体内の細胞であってもよく、または単離された細胞であってもよく、また、初代細胞であっても、培養細胞であってもよい。該細胞はまた、体細胞、生殖細胞、または幹細胞であってもよい。【0040】
具体的には、上記細胞の由来する原核生物としては、例えば、大腸菌、放線菌、古細菌等が挙げられる。また、上記細胞の由来する真核生物としては、例えば、酵母、キノコ、カビ等の真菌類、ウニ、ヒトで、ナマコなどの棘皮動物、カイコ、ハエなどの昆虫類、マグロ、タイ、フグ、ゼブラフィッシュなどの魚類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、トカゲ等の爬虫類、カエル等の両生類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどのネコ目、ニワトリ、ダチョウ、ウズラ等の鳥類、タバコ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーション等の植物が挙げられる。「動物細胞」としては、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞；受精卵などが挙げられる。【0041】
標的核酸は、上記細胞中のゲノムＤＮＡ中の任意の遺伝子または遺伝子外領域のＤＮＡであってもよい。標的核酸中の目的配列を切断するためには、本発明の人工核酸切断酵素に含まれる核酸結合ドメインが該目的配列の近傍の配列（該核酸結合ドメインの標的配列として選択される）に結合するように、本発明の人工核酸切断酵素を設計する。その結果、該標的核酸中の所望の配列が切断され、例えば、該遺伝子の発現が低下または消失し、あるいは該遺伝子の機能が低下または機能が発現しなくなる。【0042】
本発明の標的核酸改変方法においては、上記の人工核酸切断酵素に加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的切断部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。本発明の標的核酸改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、標的切断部位で相同組換え修復が起こり、ドナーポリヌクレオチドが該部位に挿入されるか、または該部位がドナー配列に置換される。その結果、標的切断部位に所望の改変が導入される。【0043】
本発明の標的核酸改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的切断部位は、主に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該核酸は、標的切断部位において改変される。【0044】
本発明の標的核酸改変方法においては、２種以上の上記人工核酸切断酵素を細胞に導入してもよい。該２種以上の人工核酸切断酵素としては、例えば、核酸結合ドメインが異なる２種以上の人工核酸切断酵素、ヌクレアーゼドメインが異なる２種以上の人工核酸切断酵素、ヌクレアーゼドメインおよび核酸結合ドメインの両方が異なる２種以上の人工核酸切断酵素、またはリンカー配列が異なる２種以上の人工核酸切断酵素等が挙げられる。核酸結合ドメインが異なる２種以上の人工核酸切断酵素には、核酸結合ドメインが結合する標的配列が異なる２種以上の人工核酸切断酵素、および核酸結合ドメインの種類が異なる２種以上の人工核酸切断酵素が包含され、一例として、ヌクレアーゼドメインが異なり、かつ、核酸結合ドメインが結合する標的配列が異なる２種以上の人工核酸切断酵素が挙げられる。例えば、核酸上の改変したい領域に回文配列が存在しない場合は、それぞれ異なる配列を標的とする２種の人工核酸切断酵素を用いてもよい。この場合、さらに、該２種の人工核酸切断酵素のヌクレアーゼドメインに、該ヌクレアーゼドメインのヘテロ二量体形成を促進するような変異を導入してもよい。これにより、該人工核酸切断酵素の認識配列を増やすとともに、オフターゲットの確率を低くすることができる。このような変異は、例えば、Ｄ４８３、Ｄ４８７およびＤ４９６への置換（以下、「ＤＤＤ型変異」ともいう）、およびＲ４８３、Ｒ４８７およびＲ５３７への置換（以下、「ＲＲＲ型変異」ともいう）であり、一方の人工核酸切断酵素のヌクレアーゼドメインにＤＤＤ型変異を導入し、もう一方の人工核酸切断酵素のヌクレアーゼドメインにＲＲＲ型変異を導入する。なお、変異導入前のヌクレアーゼドメイン配列がすでに上記に示すＤＤＤ型変異およびＲＲＲ型変異のいずれかのアミノ酸残基を有する場合は、それ以外のアミノ酸置換のみを施せばよい。このようなヘテロ二量体の形成を促進する一対の変異（例えば、ＤＤＤ型変異およびＲＲＲ型変異）がそれぞれ導入された２種のヌクレアーゼドメインは、上記変異以外は同一のヌクレアーゼドメインであってもよいし、または上記変異導入前から元々異なるヌクレアーゼドメインであってもよい。例えば、ＮＤ１のＤＤＤ型変異体を含む人工核酸切断酵素とＮＤ１のＲＲＲ型変異体を含む人工核酸切断酵素を本発明の方法に用いてもよい。また、例えば、ＮＤ２のＤＤＤ型変異体を含む人工核酸切断酵素とＮＤ１のＲＲＲ型変異体を含む人工核酸切断酵素を本発明の方法に用いてもよい。本発明によれば、ＮＤ１のＤＤＤ型変異体およびＮＤ１のＲＲＲ型変異体の組み合わせ、またはＮＤ２のＤＤＤ型変異体およびＮＤ１のＲＲＲ型変異体の組み合わせが、特に高い特異性およびヌクレアーゼ活性を示した（実施例８）。【0045】
４．キット本発明のさらなる態様において、本発明の人工核酸切断酵素、該人工核酸切断酵素をコードする核酸、あるいは該核酸、該核酸の転写産物またはその翻訳産物を含むベクターを含む、標的核酸改変のためのキットが提供される。さらに、該キットは、上記したような２種以上の人工核酸切断酵素を含んでいてもよい。さらに、該キットは、該２種以上の人工核酸切断酵素をコードする核酸、あるいは該核酸、該核酸の転写産物またはその翻訳産物を含むベクターを含んでいてもよい。好ましくは、本発明のキットは、１種または２種の人工核酸切断酵素、該１種または２種の人工核酸切断酵素をコードする核酸、あるいは該核酸、該核酸の転写産物またはその翻訳産物を含むベクターを含む。上記２種以上の人工核酸切断酵素は、例えば、ＮＤ１のＤＤＤ型変異体を含む人工核酸切断酵素とＮＤ１のＲＲＲ型変異体を含む人工核酸切断酵素であってもよい。さらに、上記２種以上の人工核酸切断酵素は、例えば、ＮＤ２のＤＤＤ型変異体を含む人工核酸切断酵素とＮＤ１のＲＲＲ型変異体を含む人工核酸切断酵素であってもよい。該キットは、一つまたは複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬が挙げられるが、これらに制限されない。通常、キットには取扱説明書が添付される。
【0046】
本明細書中の用語の意味は、特に断らない限り、生物学、分子生物学、生化学、遺伝学等の分野において通常認識されている意味に解される。【実施例】
【0047】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。【0048】
なお、実施例で用いた細胞は、以下のようにして培養した。【0049】
＜細胞培養＞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ（Difco）、１％ストレプトマイシン−ペニシンリン（和光純薬工業）、１％ＮＥＡＡ（Difco）を含むＤ−ＭＥＭ培地（和光純薬工業）で維持した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ストレプトマイシン−ペニシリン、５％カナマイシン（和光純薬工業）を含むＨａｍ’ｓ−Ｆ１２（Difco）で維持した。以下、培養温度について特に記載がない場合、培養細胞は、３７℃、二酸化炭素濃度５％で維持し、記載がある場合にはその温度に従った。また、培養液についても、記載がない場合は上記のそれぞれの培地を使用した。
【0050】
実施例１：新規ヌクレアーゼドメインの探索ＦｏｋＩのＣ末端側のアミノ酸配列を元にして、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴにより相同性のある天然素材の検索を行った。得られた検索結果において、ＦｏｋＩ−ＮＤとの相同性が３５％〜７０％のものの中から任意に４種類の候補を選んだ。それらを相同性の高い配列からＮＤ１（アミノ酸配列同一性７０％；全長アミノ酸配列：配列番号１；対応塩基配列：配列番号２）、ＮＤ２（アミノ酸配列同一性５７％；全長アミノ酸配列：配列番号３；対応塩基配列：配列番号４）、ＮＤ３（アミノ酸配列同一性４９％；全長アミノ酸配列：配列番号５；対応塩基配列：配列番号６）、ＮＤ４（アミノ酸配列同一性４５％；全長アミノ酸配列：配列番号７；対応塩基配列：配列番号８）と称する。
【0051】
ＮＤ１〜ＮＤ４のアミノ酸配列をＦｏｋＩ−ＮＤのアミノ酸配列と比較したところ、アミノ酸の欠失や置換が生じているものの、ＦｏｋＩ−ＮＤとヌクレアーゼドメインの長さは、ほぼ同じであることが明らかになった。また、ＮＤ１〜ＮＤ４は、ＦｏｋＩ−ＮＤが切断活性を持つ二量体を形成する際に必須となると考えられているアミノ酸（Ｄ４８３、Ｒ４８７）、およびＤＮＡのリン酸ジエステル結合の加水分解による切断に関与すると推定されているアミノ酸（Ｄ４５０、Ｄ４６７およびＫ４６９）を保持していた（図１Ｂ）。したがって、ＮＤ１〜ＮＤ４はヌクレアーゼ活性を有していると考えられた。【0052】
実施例２：新規ヌクレアーゼドメインの切断活性（ＳＳＡ法）ＮＤ１〜ＮＤ４のヌクレアーゼ活性を評価するため、ＮＤ１〜ＮＤ４の各々を含むＺＦＮプラスミド（ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤ）を作製し、ＳＳＡレポーターアッセイにより各新規ヌクレアーゼドメインの切断活性を測定した。
【0053】
（１）ＺＦＮプラスミド構築ＮＤ１〜ＮＤ４の塩基配列はコドン最適化を行い、ＩＤＴ社により人工合成を行った。ＺＦＮプラスミド（ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６）は、落合らが作製したコンストラクトを使用した（Ochiai et al.(2010) Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using zinc-finger nucleases. Genes to Cells 15:875-885）。ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６のＦｏｋＩ−ＮＤを新たに同定したＮＤ１〜ＮＤ４と置換するため、各ヌクレアーゼドメイン置換用プライマーペアーでＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Takara）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲは９８℃で２分処理後、９８℃で１０秒、６０℃で５秒、６８℃で４０秒という反応を４０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物および、人工合成したＮＤ１〜ＮＤ４をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Clontech）を用いて反応させ、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することで、目的とする各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤプラスミドを得た。得られたＺＦＡ（ジンクフィンガーアレイ）３６−ＮＤの模式図を図１Ａに示す。該ＺＦＡ３６−ＮＤは、ＴＧＡＡＡＲＡリンカーを有する。
【0054】
（２）ＳＳＡレポーターアッセイＳＳＡレポータープラスミド１２０ｎｇ、上記の各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤプラスミド２４０ｎｇ、参照プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega）（形質導入効率を標準化するためのプラスミド）２４ｎｇを含む７．２μＬのプラスミド溶液を調製した。該ＳＳＡレポータープラスミドは、Ｌｕｃ配列のオーバーラップ領域に挟まれるように、６ｂｐのスペーサー配列を含むＺＦアレイ（ＺＦＡ３６）の標的配列が挿入されるように、既知の方法にしたがって調製した（Ochiai et al.(2010) Targeted mutagenesis in the sea urchin embryo using zinc-finger nucleases. Genes to Cells 15:875-885）。ポリリジンコート処理済みの９６穴マルチウェルプレート（Iwaki）に、２５μＬの無血清Ｄ−ＭＥＭ培養液を加え、６μＬのプラスミド溶液を混合した。ここに無血清のＤ−ＭＥＭ培養液２５μＬ当たり０．７μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Life Technologies）を加えた溶液を２５．７μＬ加え、３０分室温で放置した。この間に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００ｍｍの組織培養皿（Iwaki）からトリプシン処理により解離させ、１０００ｒｐｍで３分遠心後、上清を取り除き、再度５ｍＬの培養液で懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液を分取し、細胞数を計測した。得られた細胞数から、細胞懸濁液中の細胞数が６×１０５細胞／ｍＬとなるように、培養液を加えて調整した。該細胞懸濁液１００μＬを、上記の３０分間室温で放置した９６穴プレートに加えた。その後、該９６穴プレートを３７℃、二酸化炭素濃度５％に移して培養することにより、形質導入を行った。
【0055】
形質導入を行い２４時間培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液を７５μＬ取り除き、Ｄｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）に付属するＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を各ウェルに７５μＬ加え、暗所、室温で１０分処理した。その後、マルチウェルプレートリーダーのＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１により、ルシフェラーゼ活性を測定した。測定後、各サンプルに１００倍希釈したＤｕａｌ Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを含むＤｕａｌ Ｇｌｏ Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ Ｂｕｆｆｅｒを７５μＬ加え、暗所、室温で１０分処理をし、先程と同様にプレートリーダーで、参照プラスミドのルシフェラーゼ活性を測定した。対照として、ＦｏｋＩ−ＮＤを含むＺＦＡ３６−ＦｏｋＩを用いて同様に測定した。測定結果は、ＳＳＡレポーターのルシフェラーゼ活性を参照プラスミドのルシフェラーゼ活性で割った値の変化を算出し、ＺＦＡ３６−ＦｏｋＩの値を１とした時の各サンプルでの相対値を求めた。【0056】
（３）結果結果を図１Ｃに示す。図１Ｃから明らかなように、ＮＤ１およびＮＤ２は、従来使用されてきたＦｏｋＩ−ＮＤに比べ、切断活性が２０％以上も高かった。一方、ＮＤ３およびＮＤ４では切断活性が低く、ＦｏｋＩ−ＮＤの約２割程度しか持っていないことが明らかとなった。
【0057】
さらに、ヌクレアーゼドメインを細胞内で発現させず、該細胞内に元々存在するヌクレアーゼがルシフェラーゼレポーターを標的とするかを確認した。その結果、ＦｏｋＩ−ＮＤに対する相対活性が著しく低かったことから、ルシフェラーゼレポーターはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に存在する様々なヌクレアーゼの標的になり得ないことがわかった。この解析により、ＮＤ１およびＮＤ２が、ＺＦＮで従来使用されてきたＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性をしのぐ、天然素材に由来する新規ヌクレアーゼドメインであることが明らかとなった。【0058】
実施例３：新規ヌクレアーゼドメインの標的ゲノムに対する切断活性（Ｃｅｌ−Ｉ法）実施例２でヌクレアーゼ活性を有することを確認した新規ヌクレアーゼドメインＮＤ１およびＮＤ２が生体において、ゲノムＤＮＡにどの程度変異導入をもたらすのか確認するため、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより、新規ヌクレアーゼドメインの培養細胞におけるゲノムＤＮＡへの変異導入率の解析を行った。比較対照として、ＦｏｋＩ−ＮＤ、ＮＤ３およびＮＤ４も同様に解析した。
【0059】
（１）Ｃｅｌ−ＩアッセイＴＡＬＥＮやＺＦＮなどのゲノム編集ツールを形質導入した細胞では、それらが持つヌクレアーゼドメインによる標的ＤＮＡの切断と細胞内に存在する修復機構による切断部位の修復が行われるが、この過程で修復エラーが生じる。このゲノムＤＮＡの標的配列を含む領域をＰＣＲで増幅すると、野生型アレルのＰＣＲ断片と変異を含むＰＣＲ断片の混合産物が得られる。これら産物を乖離後再会合させると野生型アレルと変異を含むアレルのＰＣＲ断片からなるミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡが生じ、これがミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ（Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ）で切断される。該切断パターンを検出することで、変異導入を評価できる。
【0060】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトリプシン処理により解離させ、１０００ｒｐｍ、３分遠心後、上清を取り除いた後、１０ｍＬの培養液で懸濁した。１０μＬの細胞懸濁液を用いて細胞数を測定し、細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養液を加え、３７℃、二酸化炭素濃度５％で一晩培養した。【0061】
５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Difco）に８００ｎｇとなるよう、実施例２で作製した各ＺＦＮプラスミドを加え、室温で５分放置した。５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに３２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを加え、その全量を、上記のプラスミドを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と混合し、室温で３０分放置した。この間に、一晩生育させたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養液を４ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに交換した。該細胞培養液に、上記の室温で３０分放置したプラスミド溶液全量を加え、３７℃、二酸化炭素濃度５％で一晩培養した。翌日の午前中に、培養液をＯｐｔｉ−ＭＥＭから１０ｍＬの培養液に交換し、さらに、３７℃、二酸化炭素濃度５％で培養を続けた。また、２４時間後から終濃度５００μｇ／ｍＬとなるように、ピューロマイシン（和光純薬工業）を添加した。以降毎日、培養液交換およびピューロマイシン添加を行いながら、３日間培養を行った。【0062】
上記のようにしてＺＦＮプラスミドを形質導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、トリプシン処理によって培養皿から回収した。回収した細胞は、ＰＢＳ（−）で一度洗浄を行った。得られた細胞は、ＤＮＡ精製キット（Qiagen）またはＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Life Technologies）に含まれる細胞溶解バッファーおよびタンパク質分解剤（Protein degrader）による処理のいずれかにより、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ（ToYoBo）もしくは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Life Technologies）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏの場合は、９５℃で２分加熱後、９５℃を３０秒、６０℃を３０秒、６８℃を３０秒というサイクルを４０サイクル行い、ターゲットを増幅した。ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄの場合は、９５℃で１０分処理した後、９５℃を１０秒、６０℃を３０秒、７２℃を４０秒というサイクルを４０サイクル行った後、最後に７２℃で７分処理しターゲットを増幅した。得られた各ＰＣＲ産物は等量を、ＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、マニュアルに従い、検出酵素による切断反応を行った。反応後の溶液は、アガロース電気泳動または、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）により切断断片を検出した。非切断バンドおよびより大きい切断断片のモル濃度から、切断効率を計算した。【0063】
（２）結果ＭｕｌｔｉＮＡによる泳動の結果を図２に示す。解析に用いたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＺＦＮのゲノム標的（ＺＦＡ３６−ＺＦＡ３６）候補配列を表１に示す。また、後記する実施例７で使用するＺＦＮのゲノム標的（ＺＦＬ１−ＺＦＡ３６）候補配列も表１に示す。
【0064】
【表1】
【0065】
解析した標的配列すべてにおいて、ターゲットハーフサイト（Ｌ）は、ＺＦアレイの標的配列と完全に一致していた。一方、ターゲットハーフサイト（Ｒ）は、ＺＦアレイの標的配列と完全に一致はせず、３’側にミスマッチが存在していた。これらの標的候補配列をＣｅｌ−Ｉにより切断すると、ルシフェラーゼレポーター解析の結果と同様に、新規ヌクレアーゼドメインであるＮＤ１およびＮＤ２の切断効率はＦｏｋＩ−ＮＤよりも約１．５倍以上高いことが明らかになった（図２ＡおよびＢ）。特に、ＮＤ１の変異導入活性は、解析したすべての標的候補配列において、ＮＤ２よりも安定した高い切断活性を有していた。これらの結果から、ＮＤ１およびＮＤ２は、実施例２のルシフェラーゼの発光を利用したレポーター解析での結果と同様に、生体内における標的ゲノム配列に対しても、従来型のＦｏｋＩ−ＮＤよりも高活性である天然素材由来の新規ヌクレアーゼドメインであることが明らかとなった。【0066】
一方、ＮＤ３においては、標的候補配列により変異導入活性が変化するものの、ＦｏｋＩ−ＮＤの活性の２５〜４５％程度であった。また、ＮＤ４においては、解析した標的候補配列すべてにおいて、検出可能な標的候補配列への変異導入が認められなかった。【0067】
実施例４：新規ヌクレアーゼドメインの細胞内蓄積量解析新規ヌクレアーゼドメインの変異導入率がＦｏｋＩ−ＮＤよりも高いのは、細胞内に蓄積されている量がＦｏｋＩ−ＮＤよりも多いことにより、見かけの変異導入率が高くなっているのかを明らかにするため、ＺＦＮにタグを付加し、それを認識する抗体を用いることで、各ヌクレアーゼドメインの蓄積量を解析した。この解析を行うため、ＺＦＮのＮ末端に新たにＡｃＶ５タグを付加したコンストラクトを作製し、解析に用いた。
【0068】
（１）細胞内蓄積量の解析（ウェスタンブロット解析）細胞内におけるＺＦＮの蓄積量を解析するため、実施例２で作製した各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型にＰＣＲを行い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応後、大腸菌へ形質転換し、ＺＦアレイのＮ末端側にＡｃＶ５タグが付加された各ＺＦＮプラスミドを得た。該ＺＦＮプラスミド２４０ｎｇを含有する７．２μＬのプラスミド溶液を調製した。該プラスミド溶液は、実施例２に記載のＳＳＡアッセイと同様にしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ形質導入し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で３日間培養した。培養液は、毎日交換した。
【0069】
培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン処理し、遠心後、上清を除いた。得られた沈殿をＰＢＳで懸濁し、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ＢＰＢおよび６２．５ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ６．８）からなるサンプル処理液を加え、９５℃で５分煮沸した。その後、超音波処理によって核酸などを裁断した。得られたタンパク質サンプルは、ＢＳＡを外部標準とし、タンパク質アッセイキット（Bio-Rad）によりタンパク質定量を行った。１０μｇとなるように調製した各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、セミドライトランスファーによりＰＶＤＦ膜へ転写した。転写後のＰＶＤＦ膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングを行い、２０００倍に希釈したα−チューブリン抗体（Abcam）、およびＡｃＶ５−ｔａｇ抗体（Sigma）と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、２０００倍に希釈したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体コンジュゲートＨＲＰ（Bio-Rad）と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Thermo Fisher）を用いて発光させ、Ｘ線フィルムに感光した。【0070】
（２）結果結果を図３に示す。内部標準としてα−チューブリンに対するモノクローナル抗体を用いて、細胞破砕液中のタンパク質量の比較を行ったところ、ＺＦＮを形質導入していないコントロール細胞において、チューブリンの蓄積量が多くなっていた。各ヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮを発現させた場合には、ＦｏｋＩ−ＮＤとＮＤ１がやや少なく見えるが、ほぼ等量のチューブリン蓄積量が示され、ほぼ等量のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびＰＶＤＦ膜への転写が示された。
【0071】
一方、チューブリンの蓄積量から分かるように、コントロールでは、各ヌクレアーゼドメインを発現させた細胞破砕液よりも多いタンパク質量で解析をしているにも拘わらず、ＡｃＶ５タグ抗体に由来する非特異的なシグナルは見られず、ＡｃＶ５抗体は特異的にタグを認識していることがわかった。このＡｃＶ５抗体により、タンパク質蓄積量の解析を行うと、各ヌクレアーゼドメインを形質導入した細胞破砕液では、ＦｏｋＩ−ＮＤ、ＮＤ１〜ＮＤ３において、期待される大きさである約３５ｋＤａ付近にＡｃＶ５タグに由来するシグナルが得られた。また、ＦｏｋＩ−ＮＤ、ＮＤ１およびＮＤ２のシグナルは、ほぼ同程度であった。内部標準として用いたチューブリンの量と併せて考えると、ＦｏｋＩ−ＮＤ、ＮＤ１およびＮＤ２の各ヌクレアーゼドメインの細胞内における蓄積量は、ＦｏｋＩ−ＮＤが最も多く細胞内に蓄積し、ついでＮＤ１、ＮＤ２の順に蓄積していることが示唆された。一方、ＮＤ３については、ＡｃＶ５タグに由来するシグナルがＦｏｋＩ−ＮＤ等などと比べ、著しく強く得られたことから、細胞内におけるＮＤ３の蓄積量は、ＦｏｋＩ−ＮＤ等よりも多いことが明らかとなった。【0072】
（３）細胞内蓄積量および局在の解析（ＺＦＮ−ＥＧＦＰの発現解析）さらに、切断活性は失ってしまうが、各ＺＦＮの細胞内での蓄積量と局在について明らかにするために、Ｃ末端にＥＧＦＰを融合したコンストラクトを作製した。作製したコンストラクトを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ形質導入し、共焦点レーザー顕微鏡でＧＦＰ由来の蛍光を観察することでＺＦＮの発現量を、同時に細胞内局在を明らかにするため、核をＤＡＰＩ染色し解析した。
【0073】
実施例２で作製した各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型にＰＣＲを行い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応後、大腸菌へ形質転換し、ＺＦアレイのＣ末端側にＥＧＦＰが付加された各ＺＦＮプラスミドを得た。該ＺＦＮプラスミド２４０ｎｇを含有する７．２μＬのプラスミド溶液を調製した。該プラスミド溶液は、実施例２に記載のＳＳＡアッセイと同様にしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ形質導入し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で３日間培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、コラーゲン処理を行った２４ウェルガラスボドムプレートへ塗布した。【0074】
生育させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、パラホルムアルデヒドで固定をした。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＡＰＩによる核酸の染色を行った。再度ＰＢＳ（−）で洗浄をした後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＤ−１０００Ｄ、Olympus）で観察を行った。ＥＧＦＰはＥｘ：４７３ｎｍ／Ｅｍ：５１０ｎｍで、ＤＡＰＩはＥｘ：４０５ｎｍ／Ｅｍ：４７３ｎｍでそれぞれ蛍光像を取得した。【0075】
（４）結果結果を図４に示す。ＺＦＮを発現させていないネガティブコントロールでは、ＧＦＰ由来の蛍光は見られず、ＤＡＰＩによる核酸由来の蛍光のみが観察された。各ヌクレアーゼドメインにＥＧＦＰを融合したＺＦＮを導入した細胞では、ＧＦＰ由来の蛍光強度に違いが見られるものの、ＧＦＰ由来の蛍光が細胞質および核で観察できた。
【0076】
ＦｏｋＩ−ＮＤ−ＥＧＦＰを発現させると、ＧＦＰの蛍光が細胞質に多く観察される細胞と、さらに核にも観察される細胞が見られた。ＮＤ１−ＥＧＦＰを発現させると、ＦｏｋＩ−ＮＤの時よりも多くの細胞でＧＦＰ由来の蛍光が見られたが、それぞれの蛍光の強さはＦｏｋＩ−ＮＤの時よりも弱かった。ＮＤ２−ＥＧＦＰを発現させると、観察した細胞では、ＧＦＰ由来の蛍光を有する細胞の数はＦｏｋＩ−ＮＤと比べて少なかったが、細胞質と核に局在することがわかった。ＮＤ３−ＥＧＦＰを発現させると、ＦｏｋＩ−ＮＤなどと同様に、核と細胞質で、ＧＦＰ由来の蛍光が観察された。また、ＮＤ３ではＧＦＰ由来の蛍光が他のヌクレアーゼドメインよりも強く見られたことから、その分細胞内において発現量が多いと考えられた。ＮＤ３はウェスタンブロットによる解析でも、細胞内における蓄積量はＦｏｋＩ−ＮＤよりも多い結果となっていたが、核に局在できても見かけの変異導入率は低く、また至適温度がＦｏｋＩ−ＮＤとは異なるなど、酵素の生化学特性も異なると考えられた。【0077】
（５）まとめ抗体による解析およびＧＦＰの蛍光による解析結果から、ＦｏｋＩ−ＮＤとＮＤ１およびＮＤ２は同程度細胞内に蓄積していることが明らかとなった。このことは、新規ヌクレアーゼドメインであるＮＤ１とＮＤ２の切断活性が高いのは、細胞内における蓄積量が多いためではなく、切断活性がＦｏｋＩ−ＮＤよりも高いためであることが明らかになり、ＮＤ１およびＮＤ２が、従来ＺＦＮなどで使用されていたＦｏｋＩ−ＮＤをしのぐ切断活性を有する天然素材由来のヌクレアーゼドメインであることを意味している。
【0078】
実施例５：新規ヌクレアーゼドメインの標的配列の選択性解析ＮＤ１およびＮＤ２のさらなる有用性を検証するため、ＺＦアレイとヌクレアーゼドメイン間のリンカー配列の改変を試みた。従来のＺＦＮでは、リンカー配列の改変を行うと、切断活性を示すスペーサー配列の長さや細胞に与える毒性が異なることが報告されている。そこで、これまでの解析に使用してきた従来型リンカー配列であるＴＧＡＡＡＲＡリンカーの他、ＧＳリンカー、ＲＰＧＥＫＰリンカーおよびＴＧＰＧＡＡＡＲＡリンカーに改変したＺＦＮベクターを構築し解析に用いた。
【0079】
（１）実験方法ＴＧＡＡＡＲＡリンカーを有するＺＦＮベクターとして、実施例２で作製した各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを用いた。ＧＳリンカー、ＲＰＧＥＫＰリンカーおよびＴＧＰＧＡＡＡＲＡリンカーの選択はHandelら（２００９）（非特許文献１）、Wilsonら（２０１３）（Wilson et al. (2013) Expanding the Repertoire of Target Sites for Zinc Nuclease-mediated Genome modification. Mol. Ther-Nucleic Acids 2:e88）、およびＮｏｍｕｒａら（２０１２）（Nomura et al. (2012) Effects of DNA Binding of the Zinc Finger and Linkers for Domain Fusion on the Catalytic Activity of Sequence-Specific Chimeric Recombinase Determined by a Facile Fluorescent System. Biochemistry. 51:1510-1517）の報告を参考にした。各リンカーを改変したＺＦＮベクターは、ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型に各リンカー改変用プライマーペアーでＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Takara）によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Clontech）を用いて反応させ、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することで、目的とするプラスミドを得た。さらに、スペーサーの長さを５ｂｐまたは７ｂｐに改変したＳＳＡレポータープラスミドを用いて、実施例２に記載したようにＳＳＡレポーターアッセイを行い、各ＺＦＮのヌクレアーゼ活性を測定した。
【0080】
（２）結果結果を図５に示す。なお、切断活性はいずれも、従来型リンカーを含み、スペーサー配列６ｂｐのＺＦＡ−ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性を１００％とした場合の相対活性で示す。
【0081】
スペーサー配列の長さを６ｂｐとした場合、ＦｏｋＩ−ＮＤでは、従来型リンカー（ＴＧＡＡＡＲＡ）でＺＦアレイとヌクレアーゼドメインをつないだ時の切断活性に比べ、ＧＳリンカーまたはＲＰＧＥＫＰリンカーに改変すると２０％以下の活性に低下した。一方、ＴＧＰＧＡＡＡＲＡリンカーに改変すると、ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性はリンカー改変前の約９０％程度であった（図５Ａ）。【0082】
ＮＤ１では、スペーサー配列が６ｂｐの場合、リンカー配列を改変しても切断活性は影響を受けず、リンカー配列改変前のＦｏｋＩ−ＮＤの約９０％程度の切断活性があった。ＮＤ２では、スペーサー配列が６ｂｐの場合、リンカー配列改変前のＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性に比べ、ＧＳリンカー配列に改変すると約６０％、ＲＰＧＥＫＰリンカー配列に改変すると約３５％程度まで切断活性が低下した。これらの結果から、これまで報告がなされてきているように、スペーサー配列の長さが同じでも、解析に用いたリンカー配列によりヌクレアーゼドメインの切断活性に影響が及ぼされることが明らかとなった。【0083】
スペーサー配列の長さを５ｂｐにすると、６ｂｐの時に比べ、ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性は、従来型リンカー配列（ＴＧＡＡＡＲＡリンカー）で約４０％程度に低下したが、ＧＳリンカーに改変すると約５０％程度の切断活性は残っていた。しかしながら、ＲＰＧＥＫＰリンカーやＴＧＰＧＡＡＡＲＡリンカーに改変すると、ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性は従来型リンカー配列の場合の約２０％となり、ほとんど切断できなかった。ＮＤ１においては、スペーサー配列が５ｂｐの場合、ＧＳリンカーに改変すると切断活性は高いままであったが、従来型リンカー配列では、約３０％程度まで切断活性が低下し、またその他のリンカー配列に変換すると、ほとんど切断できなくなることが明らかとなった。【0084】
ＮＤ２においては、スペーサー配列の長さを５ｂｐにすると、リンカー配列を改変しても、ほとんど切断活性を示さなかった。スペーサー配列の長さが短い時、リンカー配列の影響が大きく、リンカー配列は、より短い方が切断活性が維持されやすいと考えられた。【0085】
スペーサー配列の長さを７ｂｐにした場合、ＦｏｋＩ−ＮＤでは、ＴＧＰＧＡＡＡＲＡリンカーに改変した時のみ、切断活性が見られたが、この活性は従来型のリンカー配列でスペーサー配列の長さが６ｂｐの切断活性の５０％程度であった。他のリンカー配列に変換した時は、ほとんど切断活性を示さなかった。【0086】
ＮＤ１では、スペーサー配列の長さを７ｂｐにするとＧＳリンカー配列に改変すると切断活性を示さなくなったが、その他のリンカー配列に改変すると約５０％以上の切断活性を示すことがわかった。特に、ＴＧＰＧＡＡＡＴＡリンカー配列では、対象となるＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性よりも高くなると考えられた。一方、ＮＤ２については、従来型のリンカー配列で、約４０％程度の切断活性を示したが、その他のリンカー配列に改変するとほとんど切断活性を示さなかった。スペーサー配列の長さが長い場合、リンカー配列は、長い方が切断活性が高くなる傾向となった。【0087】
以上の結果から、ＦｏｋＩ−ＮＤに比べて、ＮＤ１は、リンカー配列の改変による影響を受け難く、且つスペーサー配列に対する制限も低く、ＦｏｋＩ−ＮＤよりも高い切断活性を示すことが明らかとなった。このことは、ＮＤ１が、標的配列の選択性等においても、ＦｏｋＩ−ＮＤより汎用性が高いヌクレアーゼドメインであることを示す。【0088】
これまでＺＦＮにおいて、ＦｏｋＩ−ＮＤの改変について報告がなされている。また、ヌクレアーゼドメインそのものをＦｏｋＩ−ＮＤからＰｖｕＩＩやＩ−ＴｅｖＩといったエンドヌクレアーゼに改変する報告もされている。このＩ−ＴｅｖＩを用いた改変ＺＦＮでは、ＦｏｋＩ−ＮＤよりも切断活性は高いものの、ＺＦアレイの他、Ｉ−ＴｅｖＩ内に存在する分子内リンカーやＤＮＡ結合モチーフのため、スペーサー配列が約３０ｂｐ程度と、ＦｏｋＩの時に比べ長くなる。ＰｖｕＩＩに改変した時も同様に、スペーサー配列が長くなっている。その結果、ＺＦＮにおいて作用するＤＮＡ配列も長く塩基配列による制限を受けやすくなると考えられる。一方、本発明のヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮにおいて利用した場合、従来型のＦｏｋＩ−ＮＤと同じタンパク質の構造でありながら高い変異導入率を持ち、ＺＦＮにおいて作用する標的ＤＮＡ配列も全体で２４ｂｐと短くなる。このことから、本発明のヌクレアーゼドメインは、Ｉ−ＴｅｖＩなどに比べて塩基配列による制限も緩くなり、より簡便なゲノム編集ツールとして扱いやすい。【0089】
実施例６：Ｓｈａｒｋｅｙ変異を導入した新規ヌクレアーゼドメインの切断活性ＦｏｋＩ−ＮＤに導入すると切断活性が高くなるアミノ酸置換（Ｓｈａｒｋｅｙ変異）が知られている（Guo, J., Gaj, T. and Barbas, C.F., 3rd. (2010) Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J Mol Biol, 400, 96-107）。そこで、新規ヌクレアーゼドメインのＮＤ１とＮＤ２において、より切断活性を高めることを目的として、Ｓｈａｒｋｅｙ変異と同じアミノ酸置換をそれぞれ導入することを試みた。
【0090】
（１）実験方法Ｓｈａｒｋｅｙ変異（ＦｏｋＩ−ＮＤにおけるＳ４１８ＰおよびＫ４４１Ｅアミノ酸置換、および他のヌクレアーゼドメインにおける対応するアミノ酸置換）を導入した各ヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮベクターは、Ｇｕｏらの報告を参考に各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型にして、Ｓｈａｒｋｅｙ変異導入用プライマーペアーでＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Takara）によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Clontech）を用いて反応させ、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することで、目的とするプラスミドを得た。実施例２に記載したようにＳＳＡレポーターアッセイを行い、各ＺＦＮのヌクレアーゼ活性を測定した。Ｓｈａｒｋｅｙ変異を有しないコントロールとして、実施例２で作製した各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを用いた。
【0091】
（２）結果ＦｏｋＩ−ＮＤ、Ｓｈａｒｋｅｙ変異、ＮＤ１およびＮＤ２のアミノ酸配列を比較することで、Ｓｈａｒｋｅｙ変異でもたらされたアミノ酸置換部位を特定した（図６）。結果を図６に示す。なお、切断活性はいずれも、Ｓｈａｒｋｅｙ変異を有しないＺＦＡ−ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性を１とした場合の相対活性で示す。
【0092】
ＮＤ１では、Ｓｈａｒｋｅｙ変異の導入に必要なアミノ酸の部位であるＦｏｋＩ−ＮＤのＳ４１８およびＫ４４１の位置に相当するアミノ酸は、ＦｏｋＩ−ＮＤと同一でそれぞれＳ４２４およびＫ４４７であった。一方、ＮＤ２では、ＦｏｋＩ−ＮＤのＳ４１８の位置に相当するアミノ酸はＳｈａｒｋｅｙ変異と同じ（Ｐ４２２）となっていたが、ＦｏｋＩ−ＮＤのＫ４４１の位置に相当するアミノ酸については、Ｓ４４５となっていた。そのため、上記アミノ酸部位にＳｈａｒｋｅｙ変異と同じアミノ酸置換を導入したＮＤ１およびＮＤ２を、それぞれＮＤ１−Ｓｈａｒｋｅｙ、ＮＤ２−Ｓｈａｒｋｅｙとした。これらを用いてルシフェラーゼレポーターを利用した切断活性を測定したところ、ＦｏｋＩ−ＮＤのＳｈａｒｋｅｙ変異では、切断活性が約１．５倍程度上昇した（図６Ｂ）。既に報告がなされているように、Ｓｈａｒｋｅｙ変異は、ＦｏｋＩ−ＮＤの切断活性を高めることが明らかとなった。しかしながら、ＮＤ１−ＳｈａｒｋｅｙおよびＮＤ２−Ｓｈａｒｋｅｙのどちらにおいても、アミノ酸置換導入前と比べその切断活性は低下し、期待した高切断活性は得られなかった。この結果は、ＮＤ１やＮＤ２のヌクレアーゼの切断メカニズムが、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なっていることを意味している。したがって、新規ヌクレアーゼドメインＮＤ１およびＮＤ２は、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なるヌクレアーゼドメインである。【0093】
実施例７：ヘテロ二量体型ヌクレアーゼドメインを利用した切断活性ＺＦＮにより標的配列を切断する時、ＦｏｋＩ−ＮＤは二量体を形成している。さらに、ＦｏｋＩ−ＮＤは、特定のアミノ酸を置換することでヘテロ二量体形成時のみ切断活性を示すＤＤＤ型／ＲＲＲ型等の変異体へ機能変換が可能であることが知られている。そこで、新規ヌクレアーゼドメインのＮＤ１とＮＤ２において、切断活性を維持するような機能改変が可能となるかを明らかにするため、さらに解析を行った。
【0094】
ＦｏｋＩ−ＮＤとのアライメントを作製することでヘテロ二量体形成に関わるアミノ酸がＮＤ１およびＮＤ２においても保存性があるのか検証した（図１Ｂ）。その結果、ＦｏｋＩ−ＮＤで明らかにされているヘテロ二量体型ヌクレアーゼへのアミノ酸置換部位で、最もＣ末端側に存在するヒスチジン残基以外のアミノ酸がＮＤ１およびＮＤ２でも保存されていた。このことからＮＤ１およびＮＤ２はＦｏｋＩ−ＮＤと同様に、ヘテロ二量体型への機能変換が可能であると推測できた。そこで、ＮＤ１およびＮＤ２において、ヘテロ二量体形成時の切断活性を測定した。【0095】
（１）実験方法ＮＤ１およびＮＤ２にヘテロ二量体型への機能変換を行うため、表２に示すように、該当するアミノ酸部位に置換を導入した。なお、表中、「ＦｏｋＩ」はＦｏｋＩ−ＮＤを意味する。表中、アミノ酸ナンバーは、各ヌクレアーゼドメインの全長アミノ酸に基づく。
【0096】
【表2】
【0097】
ヘテロ二量体形成の解析を行うためには、ＺＦアレイの標的配列であるターゲットハーフサイト−Ｌとターゲットハーフサイト−Ｒが異なる配列である必要がある。これまでの実施例で用いていたＺＦアレイとは異なる配列を標的配列とするＺＦアレイを用いてコンストラクトを構築した。該ＺＦアレイとして、ｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１をＩＤＴ社で人工合成した（以下、「ＺＦＬ１」ともいう）。実施例２で作製した各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤのＺＦアレイをｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１と置換するため、ＺＦアレイ置換用プライマーペアーで、各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型にし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘによりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物およびｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎを用いて反応させ、大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、塩基配列を確認することで、目的とする各ｐＳＴＬ−ｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１−ＮＤプラスミドを得た。【0098】
さらに、ＦｏｋＩ−ＮＤのヘテロ二量体化に関わるアミノ酸（Ｄ４８３、Ｒ４８７、Ｎ４９６）に相当する各新規ヌクレアーゼドメインのアミノ酸をＤＤＤ型へ機能変換するため、各ｐＳＴＬ−ｈＰＧＲＮ＿ＺＦＬ１−ＮＤを鋳型として、プライマーペアーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘによりＰＣＲを行った。また、ＲＲＲ型へ機能変換するため、各ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６−ＮＤを鋳型として、同様にＰＣＲを行った。得られた各ＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応後、大腸菌へ形質転換を行った。得られた各形質転換体からプラスミドを抽出し、シークエンス確認後、目的とするコンストラクト（以下、それぞれ、「ＤＤＤ型変異ＺＦＬ１−ＮＤ」および「ＲＲＲ型変異ＺＦＡ３６−ＮＤ」ともいう）を調製した。得られた各ＤＤＤ型ＺＦＬ１−ＮＤおよび各ＲＲＲ型ＺＦＡ３６−ＮＤを用いて、実施例２に記載したようにＳＳＡレポーターアッセイを行い、各ＺＦＮのヌクレアーゼ活性を測定した。但し、ＳＳＡレポーターアッセイに用いるプラスミド溶液７．２μＬ中の各ＺＦＮプラスミドの量を、ターゲットハーフサイトＬについて１２０ｎｇおよびターゲットハーフサイトＲについて１２０ｎｇに変更した。さらに、実施例３の記載と同様にして、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによりヌクレアーゼ活性を測定した。【0099】
（２）結果ＳＳＡレポーターアッセイの結果を図７および図８Ａに示す。切断活性は、これまでのレポーター解析と同様、６ｂｐスペーサー配列とし、ＺＦＡ３６が左右二つの標的配列を認識するＺＦＡ３６−ＦｏｋＩの切断活性に対する相対活性で算出した。Ｃｅｌ−Ｉアッセイの結果を図８Ｂに示す。
【0100】
ホモ二量体となるように、ＺＦＬ１に各ヌクレアーゼドメインつないだコンストラクトで、レポーター上の標的配列（ＺＦＬ１−ＺＦＬ１）の切断活性を測定したところ、図１Ｃに示した結果と同様、ＮＤ１やＮＤ２の活性はＦｏｋＩ−ＮＤよりも高かった（図７Ａ）。この結果から、異なるＺＦアレイを用いても、新規ヌクレアーゼドメインＮＤ１およびＮＤ２の高切断活性は普遍性があることが明らかとなった。【0101】
ＺＦＬ１とヌクレアーゼドメインをつないだコンストラクトを用いてホモニ量体を形成させ、レポーター上の標的配列（ＺＦＬ１−ＺＦＡ３６）の切断活性を測定したところ、ＮＤ１では、約４０％の切断活性を有していたが、ＦｏｋＩ−ＮＤおよびＮＤ２では、切断活性はほとんど見られなかった（図８Ａ）。一方、実施例２〜６で使用してきたＺＦアレイ（ＺＦＡ３６）とヌクレアーゼドメインをつないだコンストラクトでホモニ量体を形成させ、同様に解析を行うと、ＦｏｋＩ−ＮＤやＮＤ２でも切断活性が見られ、それぞれ約３５％と約５０％であった。さらに、ＮＤ１では切断活性がより高く、約９０％程度となっていた（図８Ａ）。【0102】
上記ホモ二量体型の各ヌクレアーゼドメインのＺＦアレイをＺＦＡ３６とＺＦＬ１としたＺＦＮコンストラクトを用いてヘテロ二量体を形成させ、切断活性を解析したところ、ＺＦＡ３６のみで解析した時と同様にＮＤ１とＮＤ２の活性がＦｏｋＩ−ＮＤよりも高くなった（図８Ａ）。このことからもＮＤ１とＮＤ２はＺＦアレイに関わらず、高い切断活性を有し、普遍性があることがわかった。【0103】
次に、ヘテロ二量体型の各ヌクレアーゼドメインのみを発現させた場合に二量体を形成し、切断活性を示すかを検証するため、レポーター上の標的配列（ＺＦＬ１−ＺＦＬ１またはＺＦＡ３６−ＺＦＡ３６）の切断活性を測定した。ＺＦＬ１につないだ各ヌクレアーゼドメインにはＤＤＤ型変異を、ＺＦＡ３６につないだ各ヌクレアーゼドメインにはＲＲＲ型変異を導入したが、レポーター解析の結果、ＤＤＤ型変異ＺＦＬ１−ＮＤおよびＲＲＲ型変異ＺＦＡ３６−ＮＤのそれぞれは、単独ではほとんど切断活性が見られなかった（図７Ａおよび図７Ｂ）。このことから、新規ヌクレアーゼドメインのＮＤ１とＮＤ２においても、ＦｏｋＩ−ＮＤと同様にＤＤＤ型／ＲＲＲ型へのアミノ酸置換を導入することによりホモ二量体は形成できないことが明らかになった。【0104】
各ヌクレアーゼドメインをヘテロ二量体型を形成するよう形質導入を行い、レポーター上の標的配列（ＺＦＬ１−ＺＦＡ３６）の切断活性を測定した。結果を図８Ａに示す。ＦｏｋＩ−ＮＤでの切断活性は対象の約６０％程度にまで減少した。しかし、ＮＤ１では、ヘテロ二量体型としても、切断活性の低下は認められず、対象に比べ約１．６倍程度と高い活性が見られた。一方、ＮＤ２では、ヘテロ二量体型にすると切断活性がほとんど消失した。これらの結果から、ＮＤ１はＦｏｋＩ−ＮＤよりも、高切断活性を有するヘテロ二量体型への機能変換が可能であることが明らかとなった。【0105】
さらに、各ヘテロ二量体型ヌクレアーゼのゲノム標的配列に対する変異導入効率を明らかにするため、Ｃｅｌ−Ｉによる解析を行った（図８Ｂ）。表１に示すように、ゲノム上の標的塩基配列は、１ｓｔ ｓｉｔｅで、完全一致していた。ホモ二量体型およびヘテロ二量体型ヌクレアーゼを発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞からゲノムを調製し、これらの標的配列を含むＰＣＲ断片をＣｅｌ−Ｉで処理したところ、ホモニ量体型では、これまで得られている結果と同様に、各ヌクレアーゼドメインは標的ゲノムＤＮＡを切断した。一方、ヘテロ二量体型では、ＳＳＡレポーター解析の結果と同様に、ＦｏｋＩ−ＮＤでも変異導入は認められたが、ＮＤ１の方が変異導入率はより高くなっていた。ＮＤ２においては、標的ゲノム配列でも、検出可能な変異導入は見られず、切断活性を消失していると考えられた。【0106】
これらの結果は、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なり、ＮＤ１は高活性を維持するヘテロ二量体型への機能変換が可能であること、またヘテロ二量体型への変換はＮＤ２に構造変化を大きくもたらす可能性が示唆され、これはそれぞれの構造特性がＦｏｋＩ−ＮＤと異なっていることを意味している。【0107】
実施例８：ヘテロ二量体型ヌクレアーゼドメインの組合せを利用した切断活性への効果ヘテロ二量体形成時のヌクレアーゼドメインの組合せを変えることにより、従来型のＦｏｋＩ−ＮＤよりも高切断活性を示すことが可能となるかについて、さらに解析を行った。
【0108】
実施例７で作製した各ＤＤＤ型変異ＺＦＬ１−ＮＤおよび各ＲＲＲ型変異ＺＦＡ３６−ＮＤを用いて様々に組み合わせ、実施例２の記載と同様にしてＳＳＡレポーターアッセイによりヌクレアーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。【0109】
ＤＤＤ型変異ＦｏｋＩ−ＮＤと、ＲＲＲ型変異を導入した各ヌクレアーゼドメインで解析したところ、これまで切断活性が高かったＮＤ１と組合せても、レポーターの切断活性の上昇は見られず、ＦｏｋＩ−ＮＤホモ二量体型の切断活性の約６０％となった。また、ＮＤ２との組合せではほぼ切断活性は見られなくなった（図９Ａ）。【0110】
ＤＤＤ型変異ＮＤ１では、ＲＲＲ型変異ＦｏｋＩ−ＮＤとの組合せでは約８０％程度の切断活性となったが、ＲＲＲ型変異ＮＤ２との組合せでは、ＤＤＤ型変異ＦｏｋＩ−ＮＤの時と同様、ほぼ切断活性を失っていた（図９Ｂ）。【0111】
ＤＤＤ型変異ＦｏｋＩ−ＮＤやＤＤＤ型変異ＮＤ１の結果と異なり、ＤＤＤ型変異ＮＤ２では、ＲＲＲ型変異ＮＤ１との組合せでのみ、高い切断活性が認められ、ＲＲＲ型変異ＦｏｋＩ−ＮＤまたはＲＲＲ型変異ＮＤ２との組合せでは、切断活性はほぼ失っていた（図９Ｃ）。この結果、ＲＲＲ型変異ＮＤ２のへテロ二量体型にすると、ヌクレアーゼドメインの組合せによらず、切断活性を喪失してしまうことが明らかとなった。【0112】
切断活性を示すヘテロ二量体型ヌクレアーゼドメインの組合せが可能であることがわかったが、今回解析したアミノ酸置換では、ＤＤＤ型変異ＮＤ１とＲＲＲ型変異ＮＤ１の組合せにおいてのみ切断活性を高めることが可能であった。また、ＤＤＤ型変異ＮＤ２とＲＲＲ型変異ＮＤ１との組合せでも、ＦｏｋＩ−ＮＤのホモ二量体と同等の切断活性を有することが明らかとなった。これらの結果、ＮＤ１およびＮＤ２が二量体を形成する際、ＦｏｋＩ−ＮＤとは異なる構造的特性が影響していることが分かった。【0113】
実施例９：ＺＦＮによる変異導入の塩基配列レベルでの解析ＺＦＮによる標的配列への変異導入により塩基配列にどのような変化が生じるのかを調べた。
【0114】
（１）シークエンス解析ＣＨＯ−Ｋ１細胞のゲノム配列上に存在するＺＦＡ３６の標的配列（１ｓｔサイトおよび２ｎｄサイト）に対し、ＺＦＮによる変異導入がどのような塩基配列の変化をもたらすのか明らかにするため、標的配列を含むゲノム領域のシークエンス解析を以下のようにして行った。実施例３に記載のＣｅｌ−Ｉアッセイと同様にして、各ＺＦＮを形質導入したＣＨＯ−Ｋ１ゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物はＴＡｒｇｅｔ ｃｌｏｎｅ ｐｌｕｓ（Toyobo）により、ＰＣＲ産物へのＡ付加後、ＴＡクローニングを行った。該ＰＣＲ産物を大腸菌でクローニングし、独立した大腸菌形質転換体を無作為に、少なくとも１６個以上選び、それぞれのプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを４００ｎｇと終農度６．４ｐｍｏｌとなるように、Ｍ１３−ｆプライマーを加え、Ｆａｓｍａｃ社にＰＣＲとシークエンス解析を依頼した。得られたシークエンス配列から、各ＺＦＮにおける標的配列の変異型シークエンスの配列とその割合を算出した。
【0115】
（２）結果結果を図１０に示す。ＺＦＡ３６−ＺＦＡ３６の１ｓｔサイトでは、ＦｏｋＩ−ＮＤでは、解析した１７クローンのうち、１塩基挿入が１クローン、４塩基挿入が３クローン得られた。ＮＤ１では解析できた１４クローンのうち、１塩基挿入、２塩基欠失および８塩基欠失がそれぞれ１クローン存在した。さらに、２塩基挿入かつ１塩基欠失となる変異が２クローン得られ、４塩基挿入となる変異が６クローンと今回の解析では最も多く得られた。ＮＤ２では解析できた１３クローンのうち、１塩基挿入、２塩基挿入、２塩基欠失および４塩基欠失がそれぞれ１クローンずつ得られた。解析できたＮＤ３の１５クローンおよびＮＤ４の１６クローンでは、今回のＺＦＡ３６−ＺＦＡ３６ １ｓｔサイトの解析では、塩基の挿入や欠失は認められなかった。また、ＺＦＡ３６標的配列の２ｎｄサイトにおける各ヌクレアーゼドメインの変異導入を解析したところ、ＦｏｋＩでは解析した２０クローンのうち、２塩基挿入、５塩基挿入および２塩基欠失がそれぞれ１クローンずつ得られ、２３０塩基を越す挿入も１クローン得られた。またＺＦＡ３６ １ｓｔサイトと同様、４塩基挿入の変異が最も多く、３クローン得られた。ＮＤ１では解析した１７クローンのうち、２塩基欠失および４塩基欠失がそれぞれ２クローンずつ得られた。この他、４塩基挿入が３クローン得られ、２塩基挿入が本解析では最も多く６クローン得られた。ＮＤ２では解析した１６クローンのうち、１塩基挿入が１クローン得られた他、２塩基挿入が２クローン、４塩基挿入が解析した中で最も多い５クローン得られた。また、７１塩基という大きな塩基の挿入が１クローン得られた。ＮＤ３では、１ｓｔサイトと異なり２ｎｄサイトでは標的配列への変異導入が存在しており、解析した１６クローンに、２塩基挿入、２塩基欠失および８塩基欠失がそれぞれ１クローンずつ得られた。ＮＤ４においては、解析できた１４クローンは、全て１ｓｔサイトと同様２ｎｄサイトでも標的配列への変異導入は見られなかった。
【0116】
シークエンス解析の結果、ＮＤ１やＮＤ２による標的並列への変異導入は、ＦｏｋＩ−ＮＤと似て４塩基挿入されたクローンが多く見られたが、ＦｏｋＩ−ＮＤでは見られないような様々なパターンがゲノムへの変異として見られた。新規ヌクレアーゼドメインにより生じる塩基の突出端がＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと異なる可能性がある。シークエンス解析により得られたＺＦＡ３６の各標的サイトでの変異率を表３に示す。本解析条件では、シークエンス解析においても、標的ゲノム配列における各ヌクレアーゼドメインの変異導入率はＣｅｌ−Ｉアッセイと同様となることが明らかとなった。【0117】
【表3】
【0118】
実施例１０：ＺＦＡ以外の核酸結合ドメインと組み合わせた新規ヌクレアーゼドメインの切断活性本発明の新規ヌクレアーゼドメインがＺＦＡ以外の核酸結合ドメインを用いてもＦｏｋＩ−ＮＤより高い切断活性を有するのかを明らかにするために、ＮＤ１とＴＡＬＥとを含む人工核酸切断酵素を作製し、その切断活性を測定した。具体的には、発明者の研究室で開発したＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ（doi:10.1038/srep03379）技術を用いてＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ−ＮＤおよびＴＡＬＥ−ＮＤ１を作製し、これらの切断活性をＳＳＡレポーターアッセイ法により評価した。
【0119】
（１）ＴＡＬＥ−ＮＤ１のデスティネーションベクターの構築核酸結合モジュール未挿入のＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ用デスティネーションベクターであるｐｔＣＭＶ−１５３／４７−ＶＲ−ＮＧ（https://www.addgene.org/50704/）を鋳型とし、ｐｔＴＡＬＥ−ヌクレアーゼドメイン置換用プライマーペア（ベクター増幅用）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍａｘにより増幅し、ベクターフラグメントを得た。また、ｐｔＴＡＬＥ−ヌクレアーゼドメイン置換用プライマーペア（インサート増幅用）を用いてＮＤ１のインサートフラグメントを得た。これらのベクターフラグメントとインサートフラグメントを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。大腸菌を形質転換した後、得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、目的とするＴＡＬＥ−ＮＤ１のデスティネーションベクター（ｐｔＣＭＶ−１５３／４７−ＶＲ−ＮＧ中のＦｏｋＩ−ＮＤをＮＤ１に置換したベクター）を得た。
【0120】
（２）核酸結合モジュールの組み込みとＳＳＡレポータープラスミドの構築上記（１）で得られたデスティネーションベクターに、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＲＯＳＡ２６遺伝子座およびＨＰＲＴ１遺伝子座の配列を認識させるための核酸結合モジュールを、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法により組み込んだ（doi:10.1038/srep03379に記載された手法に準拠）。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体から目的とするプラスミド（ＴＡＬＥ−ＲＯＳＡ２６−ＮＤ１およびＴＡＬＥ−ＨＰＲＴ１−ＮＤ１）を得た。また、従来型のＦｏｋＩ−ＮＤを保持するＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ）についても同様にして核酸結合モジュールを組み込んだコンストラクト（ＴＡＬＥ−ＲＯＳＡ２６−ＦｏｋＩおよびＴＡＬＥ−ＨＰＲＴ１−ＦｏｋＩ）を調製した。ＳＳＡレポータープラスミドについては、それぞれの標的配列を含むもの（ＳＳＡ−ＣＨＯ−ＲＯＳＡ２６レポーターおよびＳＳＡ−ＣＨＯ−ＨＰＲＴ１レポーター）を常法により調製した。ＲＯＳＡ２６遺伝子座およびＨＰＲＴ１遺伝子座の標的配列を下記の表４に示す。
【0121】
【表4】
【0122】
（３）細胞への導入とレポーターアッセイ上記（２）で作製した、標的配列を認識させるための核酸結合モジュールを組み込んだＴＡＬＥＮプラスミド（ＴＡＬＥ−ＦｏｋＩ−ＮＤ、およびＴＡＬＥ−ＮＤ１）、および標的配列を組み込んだＳＳＡレポータープラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを用いて形質導入を行い、形質導入後２４時間の細胞を用いて、実施例２と同様にＳＳＡレポーターアッセイを行った。対照として、ＦｏｋＩ−ＮＤを含むＺＦＮプラスミド（ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６）およびＦｏｋＩ−ＮＤのみを発現するプラスミドｐＳＴＬを用いて同様に測定した。各ＴＡＬＥ−ＮＤの切断活性を、ＺＦＡ３６の標的配列を含むレポーターに対するＺＦＡ３６−ＦｏｋＩの切断活性の値を１とした時の相対活性として算出した。
【0123】
（４）結果結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａには、ＲＯＳＡ２６遺伝子座由来の配列を標的とした時の結果、図１１Ｂには、ＨＰＲＴ１遺伝子座由来の配列を標的とした時の結果が示される。
【0124】
図１１Ａから明らかなように、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインが従来型ＦｏｋＩ−ＮＤであるＴＡＬＥ−ＲＯＳＡ２６−ＦｏｋＩは、ＲＯＳＡ２６遺伝子座由来配列を標的としたレポーターの切断活性が、ＺＦＡ３６レポーターを標的としたＺＦＡ３６−ＦｏｋＩの切断活性に近い活性を有することが明らかとなった。一方で、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインをＮＤ１に置換したＴＡＬＥ−ＲＯＳＡ２６−ＮＤ１では、ＲＯＳＡ２６遺伝子座由来配列を標的とするレポーターの切断活性が、ＴＡＬＥ−ＲＯＳＡ２６−ＦｏｋＩに対して約２倍程度高値となることが明らかとなった。以上より、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の内在性ゲノムのＲＯＳＡ２６遺伝子座由来配列を標的としたとき、ＴＡＬＥ−ＮＤ１はヌクレアーゼドメインが従来型のＦｏｋＩ−ＮＤであるＴＡＬＥ−ＦｏｋＩよりも高い切断活性を有することが示された。【0125】
また、ＲＯＳＡ２６遺伝子座とは異なる座位であるＨＰＲＴ１遺伝子座に由来する配列を標的として、同様に解析を行った。その結果、図１１Ｂから明らかなように、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインが従来型ＦｏｋＩ−ＮＤであるＴＡＬＥ−ＨＰＲＴ１−ＦｏｋＩでは、ＨＰＲＴ１遺伝子座由来配列を標的とするレポーターの切断活性が、ＺＦＡ３６レポーターを標的としたＺＦＡ３６−ＦｏｋＩの切断活性の半分程度であることが明らかとなった。一方で、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインをＮＤ１に置換したＴＡＬＥ−ＨＰＲＴ１−ＮＤ１では、ＨＰＲＴ遺伝子座由来配列を標的とするレポーターの切断活性が、ＴＡＬＥ−ＦｏｋＩに比べ約２倍程度高い活性を示し、ＲＯＳＡ２６遺伝子座由来配列と同様の結果が得られた。【0126】
これらの結果から、ＮＤ１をＰｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインとしたＴＡＬＥ−ＮＤ１が、従来型のＦｏｋＩ−ＮＤを有するＴＡＬＥ−ＦｏｋＩよりも高い切断活性を示すことが明らかとなった。以上より、ＺＦＮだけでなく、他の核酸結合ドメインを用いた場合でも、本発明の新規ヌクレアーゼドメインがＦｏｋＩ−ＮＤよりも優れた切断活性を有するヌクレアーゼドメインであることが示唆された。【0127】
以上から、本発明の新規ヌクレアーゼドメインは以下の主な特徴を有することが実証された。【0128】
（ｉ）本発明のＮＤ１およびＮＤ２、とりわけＮＤ１は、ＦｏｋＩ−ＮＤよりも顕著に高い切断活性を有する。また、ＮＤ１では別配列を認識するＺＦアレイや、ＴＡＬＥにおいてもＦｏｋＩ−ＮＤを上回る切断活性を示すことから、ＮＤ１による切断活性の上昇効果は普遍性を有する。【0129】
（ｉｉ）ＺＦアレイとＮＤとの間のリンカーを改変することで、ＮＤ１では５ｂｐや７ｂｐのスペーサーでも６ｂｐスペーサーと同程度の切断活性を示すことから、ＮＤ１は二量体化する際にＦｏｋＩ−ＮＤよりも高い柔軟性を有し、標的配列の制限を緩めることができる。【0130】
（ｉｉｉ）ＮＤ１およびＮＤ２にＤＤＤ型変異とＲＲＲ型変異を導入することで、ＦｏｋＩ−ＮＤと同様にホモ二量体化を抑制できる。さらに、ＺＦＬ１−ＤＤＤとＺＦＡ３６−ＲＲＲを組み合わせることで、ＮＤ１においてはヘテロ二量体での切断が可能である。またその際の切断活性は、野生型ＮＤ１と同程度であることから、ＮＤ１−ＤＤＤ／ＲＲＲを用いることで、高い特異性と高い切断活性とを両立したヌクレアーゼドメインを得ることができる。【0131】
（ｉｖ）ＤＤＤ／ＲＲＲ型のＦｏｋＩ−ＮＤ、ＮＤ１、ＮＤ２を相互に組み合わせて活性を検証したところ、全ての組み合わせの中でＮＤ１−ＤＤＤとＮＤ１−ＲＲＲのペアーが最も高い活性を示すことが明らかとなり、ＮＤ１−ＤＤＤ／ＮＤ１−ＲＲＲヘテロダイマーシステムの優位性が証明された。【0132】
実施例１１：大腸菌におけるタンパク質の調製（１）ＺＦ−ＮＤ１およびＺＦ−ＦｏｋＩの発現ベクターの構築
Ｎ末端にＨｉｓタグを含むｐＥＴ−ＭＣＳプラスミドのＸｈｏＩサイトおよびＳａｌＩサイトを切断し、ＺＦ−ＮＤ１断片を挿入した。ＺＦ−ＮＤ１断片には、核局在シグナルＮＬＳ、Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ（以下ＺＦと省略）、およびヌクレアーゼドメインＮＤ１を含む。ＺＦとしては、２種類の配列を認識するドメインを用いた。一つはＺＦＡ３６であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＧＡＡＧＡＴＧＧＴを認識する。もう一つはＺＦＬ１であり、１２塩基対のＤＮＡ配列ＧＡＡＧＧＴＧＡＣを認識する。したがって、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＮＤ１、およびＺＦ（ＺＦＬ１）−ＮＤ１を発現するプラスミドとして、ｐＥＴ−ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）ＮＤ１、およびｐＥＴ−ＺＦ（ＺＦＬ１）ＮＤ１をそれぞれ作成した。
【0133】
上記プラスミドを基にして、制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（以下ＦｏｋＩと省略）をＮＤ１の代わりに挿入したプラスミド、ｐＥＴ−ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＦｏｋＩ、およびｐＥＴ−ＺＦ（ＺＦＬ１）−ＦｏｋＩをそれぞれ作成した。ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＮＤ１、ＺＦ（ＺＦＬ１）−ＮＤ１、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＦｏｋＩ、およびＺＦ（ＺＦＬ１）−ＦｏｋＩのアミノ酸配列を配列番号１１９〜１２２に示す。【0134】
（２）大腸菌におけるＺＦ−ＮＤ１タンパク質の発現および精製ＺＦ−ＮＤ１またはＺＦ−ＦｏｋＩを発現するｐＥＴプラスミド、並びにｐＲＡＲＥ２（ストラタジーン社）を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地にて培養した。形質転換した大腸菌を３７℃でＯＤ（６００ｎｍにおける吸光度）が０．６になるまで培養した後、１８°Ｃにて１時間培養した。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭになるように添加し、タンパク質の発現を誘導した。さらに１８°Ｃにて１７時間振盪培養した後、大腸菌を溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ フッ化ベンジルスルホニル、１ｍＭ ジチオスレイトール、ｐＨ８．０）を用いて溶解した。続いてニッケルＮＴＡカラムにタンパク質を吸着させ、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて夾雑物を除いた。タンパク質の溶出は溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて行った。溶出したタンパク質の一部は、タンパク質収量の解析のために、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解させた。溶出したタンパク質はゲルろ過クロマトグラフィーＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アメリカ合衆国、イリノイ）および緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、ｐＨ７．４）を用いて精製し、液体窒素を用いて瞬時に凍結した後、−８０℃で保存した。タンパク質収量の解析のため、イミダゾール溶出したタンパク質画分および、最終精製されたタンパク質をＳＤＳサンプルバッファーに溶解させてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行なった。電気泳動の際には、既知濃度のＢＳＡタンパク質を別レーンに泳動し、ＰＡＧＥ後のゲルをクマシー染色して目的のタンパク質分子量のバンドをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋により定量化し、タンパク質の分子量からタンパク質の収量を解析した。
【0135】
（３）結果ＺＦＮタンパク質を大腸菌で発現精製する際に、タンパク質収量が低いことが問題であった。ＺＦＮタンパク質の根本的な性質として、可溶性が低く、凝集してしまうことが原因として考えられる。従来技術であるＦｏｋＩと比較して、新規ＮＤ１のタンパク質の可溶性がどの程度か、検証した。
【0136】
【表5】
【0137】
表５に示した通り、ＺＦ−ＮＤ１を大腸菌で発現させたところ、総じてＺＦ−ＦｏｋＩよりも可溶性が高く、大腸菌培養１Ｌあたりの収量が向上していた。可溶性が高いほど高濃度にタンパク質を導入できるため、特にタンパク質を用いたゲノム編集において利便性が高い。【0138】
実施例１２： ＺＦ−ＮＤ１とＺＦ−Ｆｏｋ１の植物細胞における活性（１）レポーター細胞の構築
ＺＦ−ＮＤ１またはＺＦ−ＦｏｋＩの活性を評価するため、ＤＮＡ切断後のＳＳＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ： 一本鎖アニーリング）が誘導された場合に、完全長２．１ｋｂのＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ： グルクロニダーゼ）遺伝子が発現するレポーター細胞を構築した。具体的には、ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、ＺＦＡ３６の認識配列（ＧＡＡＧＣＴＧＧＴ）、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂをｐＣＡＭＢＩＡ１３０５．２（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ社）へ導入した。上記ＧＵＳ遺伝子の上流から１．８ｋｂ、およびＧＵＳ遺伝子の下流から０．８ｋｂは、５００ｂｐを共通配列（オーバーラップ領域）として有する。このベクターをアグロバクテリウムを介して、シロイヌナズナＴ８７培養細胞株（理化学研究所）へ形質転換し、樹立した細胞株をＴ８７−ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）とした。ＧＵＳの発現は青色の染色試薬であるＸ−Ｇｌｕｃを用いて容易に可視化・検出することが可能であるため、ＧＵＳタンパク質の検出によりＺＦ−ＮＤ１またはＺＦ−ＦｏｋＩの核内への導入およびＳＳＡ誘導活性を評価することができる。
【0139】
（２）エレクトロポレーション法による導入実施例１１において作成したタンパク質をエレクトロポレーション法により導入した。樹立したＴ８７−ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）細胞を用いて、細胞壁を有する状態のＴ８７細胞に対してエレクトロポレーション法によるＺＦ−ＮＤ１およびＺＦ−ＦｏｋＩの導入を試みた。エレクトロポレーションにはネッパジーン社より販売されているＮＥＰＡ２１ Ｔｙｐｅ ＩＩを使用した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩバッファーを用いてエレクトロポレーションを行い、２日後にＧＵＳ活性の評価を行った。その結果、図１２に示すように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩを用いてエレクトロポレーションした場合、非常に多くの細胞がＧＵＳを発現していた。ＺＦ−ＮＤ１タンパク質を用いた実験では、ＺＦ−ＦｏｋＩタンパク質を用いた場合と比較してＳＳＡ誘導活性が２倍程度高いことがわかった。本実験では、ＺＦ−ＮＤ１が遺伝子発現ベクターとしてだけではなくタンパク質として導入した場合にも、ＺＦ−ＦｏｋＩと比較して高い活性を有すること、および、ＺＦ−ＮＤ１が動物細胞だけでなく植物細胞においてもＺＦ−ＦｏｋＩと比較して高い活性を有することが明らかとなった。
【0140】
（３）プロテイントランスダクション法による導入実施例１１で作成したタンパク質を用いて、プロテイントランスダクション法による導入を試みた。すなわち細胞壁を有するＴ８７−ＧＵＵＳ（ＺＦＡ３６）に対して、最終濃度０．１−２μＭのＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＮＤ１タンパク質もしくはＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＦｏｋＩタンパク質を添加した後、１時間後に培養培地で洗浄し、３日間の培養を行なった。タンパク質を添加時には、プロテアーゼ処理等の生化学的な処理や、エレクトロポレーション等の物理化学的な処理は、まったく行っていない。したがって、タンパク質の自発的な取り込みを期待したものである。その結果、図１３に示す通り、エレクトロポレーション法と比較して少ない割合ではあるが、プロテイントランスダクション法によりＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＮＤ１タンパク質およびＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＦｏｋＩタンパク質が取り込まれてゲノム編集可能であることが明らかとなった。プロテイントランスダクション法を用いた場合、ＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＮＤ１の活性はＺＦ（ＺＦＡ３６Ａ）−ＦｏｋＩを比較して、同等もしくはそれ以上の活性であった。
【産業上の利用可能性】
【0141】
本発明の新規ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインとは異なる優れた特性を有し、本発明のヌクレアーゼドメインを含む人工核酸切断酵素は、ゲノム編集ツールとして非常に有用である。【配列表フリーテキスト】
【0142】
SEQ ID NO:9; ND1 substitution forward primerSEQ ID NO:10; ND1 substitution reverse primer
SEQ ID NO:11; ND2 substitution forward primer
SEQ ID NO:12; ND2 substitution reverse primer
SEQ ID NO:13; ND3 substitution forward primer
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SEQ ID NO:28; reverse primer for linker alteration, ZFN-RPGEKP-R
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SEQ ID NO:34; reverse primer for linker alteration, ZFN-FokI-TGPGAAARA-R
SEQ ID NO:35; forward primer for Sharkey mutation introduction in FokI-ND
SEQ ID NO:36; reverse primer for Sharkey mutation introduction in FokI-ND
SEQ ID NO:37; forward primer for Sharkey mutation introduction in ND1
SEQ ID NO:38; reverse primer for Sharkey mutation introduction in ND1
SEQ ID NO:39; forward primer for Sharkey mutation introduction in ND2
SEQ ID NO:40; reverse primer for Sharkey mutation introduction in ND2
SEQ ID NO:41; ZFA substitution forward primer
SEQ ID NO:42; ZFA substitution reverse primer
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SEQ ID NO:47; forward primer for ND2-DDD mutation introduction
SEQ ID NO:48; reverse primer for ND2-DDD mutation introduction
SEQ ID NO:49; forward primer for FokI-RRR vector mutation introduction
SEQ ID NO:50; reverse primer for FokI-RRR vector mutation introduction
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SEQ ID NO:52; reverse primer for FokI-RRR insert mutation introduction
SEQ ID NO:53; forward primer for ND1-RRR vector mutation introduction
SEQ ID NO:54; reverse primer for ND1-RRR vector mutation introduction
SEQ ID NO:55; forward primer for ND1-RRR insert mutation introduction
SEQ ID NO:56; reverse primer for ND1-RRR insert mutation introduction
SEQ ID NO:57; forward primer for ND2-RRR vector mutation introduction
SEQ ID NO:58; reverse primer for ND2-RRR vector mutation introduction
SEQ ID NO:59; forward primer for ND2-RRR insert mutation introduction
SEQ ID NO:60; reverse primer for ND2-RRR insert mutation introduction
SEQ ID NO:61; M13-F primer
SEQ ID NO:62; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:63; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:64; CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 3rd site
SEQ ID NO:65; CHO-K1 ZFL1-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:66; CHO-K1 ZFL1-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:67; FokI-DDD amino acid sequence
SEQ ID NO:68; FokI-RRR amino acid sequence
SEQ ID NO:69; ND1-DDD amino acid sequence
SEQ ID NO:70; ND1-RRR amino acid sequence
SEQ ID NO:71; ND2-DDD amino acid sequence
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SEQ ID NO:73; FokI-S418P/K441E amino acid sequence
SEQ ID NO:74; ND1-S418P/K441E amino acid sequence
SEQ ID NO:75; ND2-S441E amino acid sequence
SEQ ID NO:76; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:77; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:78; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:79; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:80; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:81; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:82; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:83; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:84; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:85; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:86; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:87; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:88; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:89; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:90; ND3-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:91; ND4-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 1st site
SEQ ID NO:92; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:93; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:94; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:95; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
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SEQ ID NO:97; FokI-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:98; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:99; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:100; ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:101 ND1-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
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SEQ ID NO:103; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:104; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:105; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:106; ND2-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
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SEQ ID NO:108; ND3-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:109; ND3-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:110; ND3-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:111; ND3-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:112; ND4-cleaved CHO-K1 ZFA36-ZFA36 target 2nd site
SEQ ID NO:113; forward primer for vector amplification for ptTALE-ND substitution, ptTALEN-inverse-F
SEQ ID NO:114; reverse primer for vector amplification for ptTALE-ND substitution, NC-inverse-R_2
SEQ ID NO:115; forward primer for insert amplification for ptTALE-ND substitution, ND1-NC-F_v2
SEQ ID NO:116; reverse primer for insert amplification for ptTALE-ND substitution, ND1-ptTALEN-R
SEQ ID NO:117; target sequence on ROSA26 locus in CHO-K1 cell
SEQ ID NO:118; target sequence on HPRT1 locus in CHO-K1 cell
SEQ ID NO:119; ZF(ZFA36A)-ND1 amino acid sequence
SEQ ID NO:120; ZF(ZFL1)-ND1 amino acid sequence
SEQ ID NO:121; ZF(ZFA36A)-FokI amino acid sequence
SEQ ID NO:122; ZF(ZFL1)-FokI amino acid sequence
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]