特許第6897267号(P6897267)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2015.5.11 β版

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特許6897267溶出時間の変動に影響を受けないピーク同定方法
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6897267
(24)【登録日】2021年6月14日
(45)【発行日】2021年6月30日
(54)【発明の名称】溶出時間の変動に影響を受けないピーク同定方法
(51)【国際特許分類】
   G01N 30/86 20060101AFI20210621BHJP
【FI】
   G01N30/86 M
【請求項の数】3
【全頁数】16
(21)【出願番号】特願2017-82149(P2017-82149)
(22)【出願日】2017年4月18日
(65)【公開番号】特開2018-179853(P2018-179853A)
(43)【公開日】2018年11月15日
【審査請求日】2020年3月10日
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】植松 原一
【審査官】 高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】 特開平08−005625(JP,A)
【文献】 特開2002−267646(JP,A)
【文献】 特開平03−073849(JP,A)
【文献】 特開平11−344482(JP,A)
【文献】 特開2006−322842(JP,A)
【文献】 特表2016−510900(JP,A)
【文献】 米国特許第05987959(US,A)
【文献】 中国特許出願公開第105051529(CN,A)
【文献】 特開平09−297197(JP,A)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
G01N 30/00 −30/96
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
2以上の未知試料を連続的に液体クロマトグラフィによって同定する方法であって、
1件目の未知試料は
標準試料の溶出時間を基に作成された同定テーブルに基づき、前記未知試料中の特定成分を同定し、
当該同定結果に基づいて、前記同定テーブルを補正し、
補正後の同定テーブルを基に前記特定成分以外の成分を同定し、
n件目(n=2以上の整数)の未知試料は
(n−1)件目で使用された補正後の同定テーブルで前記特定成分を同定し、
当該同定結果に基づいて、(n−1)件目で使用された補正後の同定テーブルを1件目と同様の方法で更に補正し、
補正後の同定テーブルを基に前記特定成分以外の成分を同定することを特徴とする方法。
【請求項2】
前記同定テーブルにおける前記特定成分の基準溶出時間に対する許容幅が、前記特定成分以外の成分の許容幅の2〜5倍とすることを特徴とする請求項1に記載の同定方法。
【請求項3】
同定テーブルの補正方法が、前記特定成分の溶出時間を、同定に使用した同定テーブルに登録されている前記特定成分の基準溶出時間で除算して係数を算出し、前記同定テーブル中の各成分の基準溶出時間及びその許容幅に前記係数を乗じることで前記同定テーブルを補正することを特徴とする請求項1又は2に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複数のピークが存在するクロマトグラムにおいて、各ピークの溶出時間が経時的に変化する場合であっても、正確にピーク同定を可能とする方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
クロマトグラフィは複数成分を含む試料をカラムで分離定量する方法である。一般的には、各成分ピークの溶出時間から定性を行い、検出器の出力度合により定量を行う。定性分析を行うには、事前に目的の成分を含む標準試料を測定し、各成分の溶出時間を基準溶出時間として定め、それに対する許容幅を設定した同定範囲を定めた「同定テーブル」の作成を行う。
【0003】
未知試料の同定を行う場合は、未知試料のクロマトグラムに現れた複数の成分ピークの溶出時間と、同定テーブルとを比較して、同定範囲に収まるか否かを判断し、同定範囲に収まれば対応する成分と同定するのが一般的な手法である。
【0004】
しかしながら、実際のクロマトグラフィでは、溶離液の組成が経時的に僅かに変動し、それに伴い溶出時間も経時的に増加または減少することがしばしば見られる。また、クロマトグラフを構成するカラムオーブンや送液ポンプも溶出時間の変動に繋がる。設置環境の要因によりカラムオーブンの温度が僅かに変動したり、ポンプの送液量が僅かに変動したりして、溶出時間を変動させることもある。
【0005】
図1は、未知試料の測定の際に、溶出時間が経時的に遅くなっている場合を示した図である。この場合、未知試料1は各成分の溶出時間は−3%〜+3%の範囲に収まり、それぞれ、Comp_1、Comp_2、Comp_3、Comp_4、Comp_5、Comp_6と同定できるが、未知試料2、3は各成分の溶出時間は−3%〜+3%の範囲に収まらないことから、同定できず「未知成分」と判断されてしまう。
【0006】
このような場合であっても、正しく同定できるように、同定テーブルの基準溶出時間を同定された成分の溶出時間に置き換え、許容幅もそれに合わせて再計算し、同定テーブルを更新して、次の未知試料の同定に用いるといった方法も提案されているが、図2に示すように同定テーブルに登録されている成分が、未知試料測定時に同定できない場合や、一部成分が元々含まれない場合では、同定テーブルの更新が正常に機能しなくなってしまうといった問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、溶出時間に経時的な変動があっても正確に成分同定が可能であり、特に、同定テーブルに登録された成分が未検出な場合であっても、一連の同定に影響を及ぼさないピーク同定方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、2以上の未知試料を連続的に液体クロマトグラフィによって同定する方法に関するものであり、
1件目の未知試料は標準試料の溶出時間を基に作成された同定テーブルに基づき、前記未知試料中の特定成分を同定し、
当該同定結果に基づいて、前記同定テーブルを補正し、
補正後の同定テーブルを基に前記特定成分以外の成分を同定し、
n件目(n=2以上の整数)の未知試料は(n−1)件目で使用された補正後の同定テーブルで前記特定成分を同定し、
当該同定結果に基づいて、(n−1)件目で使用された補正後の同定テーブルを1件目と同様の方法で更に補正し、
補正後の同定テーブルを基に前記特定成分以外の成分を同定することを特徴とする。
【0009】
以下に、本発明の詳細を説明する。
【0010】
図3aは標準試料、未知試料1〜3のクロマトグラム、図3bは未知試料1〜3の各成分(Comp_1〜Comp_6)の溶出時間をプロットした図である。標準試料にはComp_1〜Comp_6の6成分が含まれ、同定テーブルにも登録される。未知試料2、3は同様にComp_1〜Comp_6に相当する6成分が含まれるが、未知試料1にはComp_1〜Comp_5に相当する5成分しか含まれていない。
【0011】
まず、一般的な同定方法と同様に標準試料の各成分(Comp_1〜Comp_6)の溶出時間から、同定の基準となる溶出時間およびその同定範囲を指定する(同定テーブルの作成)。同定範囲は成分毎に絶対時間で指定しても良いが、基準となる溶出時間に対する比率で指定した方が、設定が容易に行える。
【0012】
以下、基準となる溶出時間に対する比率で算出する方法について説明する。
【0013】
まず、標準試料および未知試料で必ず検出される成分を特定成分(以下、内部標準成分ということがある)として指定する。内部標準成分は、他の成分と完全に分離できており、含有量が比較的に高い(出力が大きい)ものを指定することが望ましいため、5番目に溶出するComp_5を内部標準成分とした。
【0014】
各成分の同定範囲について、内部標準成分は、その他の成分より大きな値で設定することが好ましい。具体的には、内部標準の同定範囲(η%)は、その他の成分の同定範囲(γ%)の2〜5倍程度とすることが望ましい。これにより、未知試料の測定の際に、溶出時間が変動しても、内部標準成分の同定がより確実に行えることになる。図3、表1では内部標準成分(Comp_5)の同定許容幅は基準溶出時間に対して±15%、その他の成分では±3%とした。
【0015】
【表1】
【0016】
未知試料1を測定し、少なくとも各々のピークの溶出時間(表2)を検出し、前記同定テーブル(表1)と比較して、少なくとも内部標準成分の許容範囲に入るか否かにより、内部標準成分の同定を実施する。
【0017】
【表2】
【0018】
次に、前記で得られた未知試料1の内部標準成分の溶出時間(8.670)を前記同定テーブルに登録されている内部標準成分の基準溶出時間(8.500)で除算し、溶出時間の補正係数(f)を算出する。ここでは補正係数(f)は、8.670/8.500=1.020と算出される。
【0019】
次に、この補正係数(f)により、前記同定テーブルを更新する。
前記同定テーブル(表1)の基準溶出時間に補正係数1.020を乗じて、新たな基本溶出時間として同定テーブルを更新する。これに合わせて同定範囲も再計算し、同定テーブルを更新する(表3)。
【0020】
【表3】
【0021】
次に、未知試料1のPeak_1〜Peak_4の溶出時間を、前記更新された同定テーブル(表3)と比較して、許容範囲に入るか否かにより、内部標準成分以外のピークを同定する。その結果、Peak_1はComp_1、Peak_2はComp_2、Peak_3はComp_3、Peak_4はComp_4にそれぞれ該当していることが分かる。
【0022】
次の未知試料を測定する場合は、前記で更新された同定テーブル(表3)を基に、まず、内部標準成分(Comp_5)を同定し、補正係数(f)を算出し、前記同定テーブルを再度更新し、内部標準成分以外のピークを同定する。
【0023】
本方法の同定法を使用することで、図3のように、同定テーブルに登録されている成分が未知試料で検出されない場合であっても、同定テーブルは全成分に対して更新することができ、以降の測定で、前記で検出されなかった成分が検出されても、確実に同定を行うことが可能となる。
【発明の効果】
【0024】
本発明では、2以上の未知試料を連続的に液体クロマトグラフィによって同定する場合に、溶出時間に経時的な変動があっても正確に成分同定が可能であり、特に、同定テーブルに登録された成分が未検出な場合であっても、一連の同定に影響を及ぼさない。
【図面の簡単な説明】
【0025】
図1】同定条件を一切変更しないで行う一般的な手法により、同定がうまく行かない様子を示した図である。
図2】同定条件の更新を伴う手法により、同定がうまく行かない様子を示した図である。
図3】本発明の同定方法により、同定対象の成分が検出されない場合でも、以降の測定、同定に影響を示さない様子を示した図である。
図4】実施例1で使用した液体クロマトグラムシステムを示した図である。
図5】実施例1でのクロマトグラムおよび、本発明の同定方法で同定した図である。図中の破線は同定範囲を示している。
図6】実施例1でのクロマトグラムおよび、同定条件を更新しない従来の方法で同定した図である。図中の破線は同定範囲を示している。
図7】実施例2で使用した液体クロマトグラムシステムを示した図である。
図8】実施例2でのクロマトグラムおよび、本発明の同定方法で同定した図である。図中の破線は同定範囲を示している。図aは主成分部を拡大した図、図bは全体図である。
図9】実施例2でのクロマトグラムおよび、同定条件を更新しない従来の方法で同定した図である。図中の破線は同定範囲を示している。図aは主成分部を拡大した図、図bは全体図である。
【実施例】
【0026】
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。なお、本発明は以下の実施例の内容に限定されて解釈されるものではない。
【0027】
(実施例1)
ノンサプレスイオンクロマトグラフィーの系で検証を実施した。図4に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置(SD−8020)2、サンプル側送液ポンプ(DP−8020)3、リファレンス側送液ポンプ(DP−8020)10、試料注入装置(AS−8020)4、カラムオーブン(CO−8020)6、電気伝導度計(CM−8020)12、及びデータ処理装置(LC−8020II)9で構成した(いずれも、東ソー(株)製)。分析カラム5としては、東ソー(株)製 TSKgel IC−Anion−PW XL(4.6mmI.D.×5cm)を使用し、陰イオン(NO、Br、NO、PO2−、SO2−)の分離を行った。
その他の条件は下記の通りである。
注入量:30uL、カラム温度:40℃、サンプル側流速:0.600 mL/min、リファレンス側流速:0.3 mL/min、
溶離液:ホウ酸 (360mg)、四ホウ酸ナトリウム (575mg)、グリセリン (5.0g)、グルコン酸カリウム(350mg)、アセトニトリル(40mL)、n−ブタノール (30mL)を純水にて1Lにメスアップ
なお、本発明の効果を分かりやすくするため、流速をわずかに変化させ、測定対象の陰イオンの含有成分数を変化させて検証を実施した。陰イオン混合比率および流速は表4、5、測定の組み合わせは表6に示す通りである。
【0028】
【表4】
【0029】
【表5】
【0030】
【表6】
【0031】
図5は、前記の組み合わせで測定したクロマトグラムである。
流速の低下(A_7〜B_1)とともに、各イオンの溶出時間が経時的に遅くなり、B_7から再び初期の溶出時間に戻っている様が分かる。なお、クロマトグラム中の下矢印で示される記号はイオン成分が欠落している箇所を表している(D_4のSO2−成分等)。
【0032】
まず、標準試料(A_7)の同定を行い、同定テーブル(初期値)を作成した(表7)。
【0033】
【表7】
【0034】
本実施例では、4番目に溶出するリン酸イオン(PO2−)を内部標準成分とした。
内部標準成分(PO2−)の許容幅を基準溶出時間の±12%とし、それ以外の成分(NO、Br、NO、SO2−)の許容幅を基準溶出時間の±4%として同定を実施した。
【0035】
未知試料(A_7〜C_6)の溶出時間を表8に示す。
【0036】
【表8】
【0037】
まず、未知試料A_7を測定した結果、9.217分に溶出したピークは表7のリン酸イオン(PO2−)の同定範囲内(8.116〜10.197分)にあるため、リン酸イオン(PO2−)と同定される。次に、同定条件の補正係数fを算出する。前記で同定されたリン酸イオン(PO2−)の溶出時間(9.217分)を内部標準としたリン酸イオン(PO2−)の基準溶出時間(9.223分)で除算した値が補正係数fとなる。この場合、9.217/9.223=0.9993となる。前記補正係数を基本となる同定テーブル(表7)の基準溶出時間及び許容幅に乗算し、同定範囲を更新した。更新後の同定テーブルと、未知試料の溶出時間を照合し、各ピークの同定を行った。
【0038】
上述した作業をB_6〜C_6にも同様に行っていくと、同定テーブルは表9のように更新されていく。同定テーブルを補正していった結果、確実かつ正確に同定を行うことが可能であることが分かった。
【0039】
【表9】
【0040】
比較のために、図6に同定テーブルを更新しない方法によって同定を行った結果を示す。図中の破線が同定範囲を示しているが、これだけ流量が変化し、溶出時間が変動すると、同定範囲を超えるピークが多発し、不具合を起こしていることが分かる。
【0041】
このような、溶出時間の経時的な遅れが生じ、あるタイミングで元の状態に戻ることは溶離液を再調整した場合などに良く見られる現象であり、本発明の同定法では、このような場合であっても、同定テーブルを再度1から作り直す必要がなく、続けて使用可能である。
【0042】
(実施例2)
グリコヘモグロビン分析計の系で検証を実施した。
図7に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。装置は自動グリコヘモグロビン分析計HLC−723GVIII(東ソー(株)製)、溶離液は同専用溶離液を使用した。検体は同専用HbA1cキャリブレータセットのLowレベル(A1c:5.4%程度)を使用した。
なお、本発明の効果を分かりやすくするため、Flow Factor(相対流速)をわずかに変化させ、検体の測定を実施した。Flow Factorは値が大きくなるにつれて絶対流速が増えるパラメータである。Flow Factorは0.960、0.980、0.990、1.000、1.010、1.020、1.0400の順に7つのパターンで検証を実施した。
まず、標準試料(Flow Factor=0.960)の同定を行い、同定テーブル(初期値)を作成した(表10)。
【0043】
【表10】
【0044】
本実施例では、内部標準ピークとして、最も多く含まれるA0ピークとし、同定の許容範囲は、A0ピークで基準溶出時間に対して±10%、その他のピークで5%とした。
【0045】
各Flow Factorにおける溶出時間の結果を表11に示す。
【0046】
【表11】
【0047】
まず、Flow Factor=0.980の条件で測定した結果、0.800分に溶出したピークは表10のA0の同定範囲内(0.7350〜0.8983分)にあるため、A0と同定される。次に、同定条件の補正係数fを算出する。前記で同定されたA0の溶出時間(0.8000分)を内部標準としたA0の基準溶出時間(0.8167分)で除算した値が補正係数fとなる。この場合、0.800/0.8167=0.9796となる。前記補正係数を基本となる同定テーブル(初期値)の基準溶出時間及び許容幅に乗算し、同定範囲を更新した。更新後の同定テーブルと、未知試料の溶出時間を照合し、各ピークの同定を行った。
【0048】
上述した作業を同様に行っていくと、同定テーブルは表12のように更新されていく。同定テーブルを補正していった結果、確実にかつ正確に同定を行うことが可能であることが分かった。
【0049】
【表12】
【0050】
図8は内部標準となるピークの溶出時間を基にした同定テーブルを更新する本発明の方法による同定の様を示した図である。図8から分かるように、Flow Factorが大きくなるにつれて、各ピークの溶出時間は早まる。
【0051】
このような状態でも、内部標準ピークA0の許容幅を他の成分より大きく設定していることから、A0ピークは確実の同定が行え、得られた補正係数による同定テーブルを更新することで他のピークも全て同定することができている。
【0052】
図9は同定テーブルを更新しないで、同定を行った結果を示したものである。なお、同定範囲は、基準溶出時間に対して±5%とした。 Flow Factorが0.960〜1.000までは全てのピークで正しく同定できているが、Flow Factorが1.010では、LA1C+のピークが、Flow Factorが1.020以上では全てのピークが同定範囲を超えるため同定できなくなる。
【符号の説明】
【0053】
1.溶離液
2.脱気装置
3.送液ポンプ
4.試料注入バルブ
5.分析カラム
6.カラム恒温槽
7.電気伝導度計
8.廃液
9.システム制御及びデータ処理装置
10.溶離液A
11.溶離液B
12.溶離液C
13.洗浄液/溶血液
14.開閉バルブ
15.可視検出器
16.ラインフィルタ
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9