特許 6903661 アレルゲン検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6903661

(24)【登録日】2021年6月25日

(45)【発行日】2021年7月14日

(54)【発明の名称】アレルゲン検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20210701BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20210701BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20210701BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/88 JZNA

   G01N30/06 E

   G01N27/62 X

   G01N27/62 V

【請求項の数】9

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2018-528848(P2018-528848)

(86)(22)【出願日】2017年7月20日

(86)【国際出願番号】JP2017026179

(87)【国際公開番号】WO2018016551

(87)【国際公開日】20180125

【審査請求日】2019年11月28日

(31)【優先権主張番号】特願2016-142994(P2016-142994)

(32)【優先日】2016年7月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000226998

【氏名又は名称】株式会社日清製粉グループ本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】関 友輔

【審査官】 倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５２５５８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 RAHMAN, A.M.A. et al.，Analysis of the allergic proteins in black tiger prawn (Penaeus monodon) and characterization of the major allergen tropomyosin using mass spectrometry，RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY，２０１０年，vol. 24，pp. 2462-2470

【文献】 RAHMAN, A.M.A. et al.，Characterization and de novo sequencing of snow crab tropomyosin enzymatic peptides by both electrospary ionization and matrix-assisted laser desorption ionization QqToF tandem mass spectrometry，JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY，２０１０年 ３月 ２日，vol.45，pp.372-381

【文献】 PARK, M.H. et al.，Proteomic Approach of the Protein Profiles during Seed Maturation in Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.)，Korean Journal of Plant Resources，２００９年，Vol.22, No.3，pp.227-235

【文献】 永井宏幸 ほか，LC-MS/MSを用いたアレルギー物質検査法開発，岐阜県保健環境研究所報，２０１４年，Vol. 22，pp. 1-5

【文献】 ANSARI, P. et al.，Selection of possible marker peptides for the detection of major ruminant milk proteins in food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ANALYTICAL BIOANALYTICAL CHEMISTRY，２０１１年，vol. 399，pp.1105-1115

【文献】 CHASSAIGNE, H. et al.，Proteomics-Based Approach To Detect and Identify Major Allergens in Processed Peanuts by Capillary LC-Q-TOF (MS/MS)，JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY，vol. 55, no. 11，pp. 4461-4473

【文献】 LOCK, S. et al.，The Detection of Allergens in Bread and Pasta by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，FOOD & ENVIRONMENTAL，２０１０年，pp.1-5，[online]，[令和2年12月24日検索]，インターネット＜URL:https://sciex.com/Documents/brochures/Allergens-QTRAP4k_1830610.pdf＞

【文献】 HON, L. et al.，Identification of the Major Allergen in Greasy-Back Shrimp (Metapenaeus ensis) by MALDI-TOF-MS，Journal of Ocean University of China，２０１０年，Vol.9，No.178-184

【文献】 YANO, M. et al.，Purification and Properties of Allergenic Proteins in Buckwheat Seeds，AGRICULTURAL BIOLOGICAL CHEMISTRY，１９８９年，vol. 53, no. 9，pp. 2387-2392

【文献】 NAGAI, H. et al.，Development of a Method for Crustacean Allergens UsingLiquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry，Journal of AOAC International，２０１５年１０月，Vol. 98, No. 5，pp. 1355-1365

【文献】 KORTE, R. et al.，New High-Performance Liquid Chromatography Coupled Mass Spectrometry Method for the Detection of Lobster and Shrimp Allergens in Food Samples via Multiple Reaction Monitoring and Multiple Reaction Monitoring Cubed，JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY，２０１６年 ７月 ８日，vol. 64，pp. 6219-6227

【文献】 TAKAOKA, M. et al.，Changes in Proteome Patterns in Buckwheat Seed under Submergence，PROCEEDING OF THE 9TH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON BUCKWHEAT，２００４年，pp.95-98

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３０／００ − ３０／９６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲンがソバを含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが配列番号４、６及び７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上を含む、
方法。

【請求項2】

前記アレルゲンがソバおよび甲殻類を含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号４、６及び７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含む、
請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記アレルゲンがソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイであり、前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号４、６及び７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１３〜１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１８〜２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号２２〜２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上とを含む、請求項１記載の方法。

【請求項4】

前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む、請求項１記載の方法。

【請求項5】

試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲンが甲殻類を含み、
該アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む、
方法。

【請求項6】

前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む、請求項２記載の方法。

【請求項7】

前記アレルゲン由来ポリペプチドが、配列番号１〜２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てを含む、請求項３記載の方法。

【請求項8】

前記クロマトグラフィー分離を利用した分析が液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

前記タンパク質分解酵素がトリプシンである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

食物アレルギーは、食物を原因とする免疫応答により、皮膚炎、喘息、胃腸管機能障害、アナフィラキシーショックなどの不利益な症状を引き起こす。食物アレルギーの原因となる食物の種類は様々であるが、特にえび、かに、小麦、そば、卵、乳および落花生の７品目は、アレルギー患者数が多く、また重篤なアレルギー症状を引き起こしやすい。

【0003】

アレルゲンとなる食品を原材料に含まない加工食品であっても、アレルゲンを含む加工食品と工場での製造ラインを共有していたり、または当該原材料の製造過程でアレルゲンを使用していたりした場合、最終製品にアレルゲンが混入している場合がある。わずかなアレルゲンの混入でも、食物アレルギーの患者にとっては危険である。食品等の試料中における微量のアレルゲンを検出することができる高感度なアレルゲン測定方法が求められている。

【0004】

高感度なアレルゲン測定方法として、特許文献１には、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、コムギタンパク質、ライムギタンパク質、カラスムギタンパク質、オオムギタンパク質、カラシナタンパク質、ゴマタンパク質、マカダミアナッツタンパク質、ピスタチオナッツタンパク質、ブラジルナッツタンパク質、クルミタンパク質、ラッカセイタンパク質およびヘーゼルナッツタンパク質からなる群より選択されるアレルゲンを酵素分解して得られる特定の配列のペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで検出する、試料中の上記アレルゲンを検出する方法が記載されている。特許文献２には、試料組成物からアレルゲンを含む抽出液を形成し、該抽出液中のアレルゲンの量をＬＣ−ＵＶ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳを使用して測定する、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２０１４−５２５５８８号公報

【特許文献2】特表２０１３−５３９０３９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

食品等の試料中におけるアレルゲン（特にソバまたは甲殻類）の存在を高感度に検出することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、各アレルゲンについて、それに含まれる特定のアミノ酸配列を検出することにより、当該アレルゲンの存在を高感度に検出することができることを見出した。

【0008】

したがって、本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法であって、
試料をタンパク質分解酵素で処理すること、および
クロマトグラフィー分離を利用した分析により、該酵素処理した試料中におけるアレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することを含み、
該アレルゲンが、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上である、
方法を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明は、食品等の試料中における微量のアレルゲン（特にソバまたは甲殻類）の存在を検出することができる、高感度なアレルゲン検出方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ソバアレルゲンのトリプシン消化物についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図2】甲殻類アレルゲンのトリプシン消化物についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図3】ソバアレルゲン含有小麦粉のトリプシン消化物についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。上；ソバアレルゲン無添加小麦粉、下；ソバアレルゲン添加小麦粉。

【図4】甲殻類アレルゲン含有小麦粉のトリプシン消化物についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。上；甲殻類アレルゲン無添加小麦粉、下；甲殻類アレルゲン添加小麦粉。

【図5】乳アレルゲンについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図6】卵アレルゲンについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図7】ラッカセイアレルゲンについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図8】乳添加パンにおけるカゼインについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【図9】ラッカセイ添加パンにおけるAra h1またはh3についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、試料中のアレルゲンを検出する方法を提供する。本発明の方法によれば、ソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイからなる群より選択される１種以上のアレルゲンを検出することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法により検出されるアレルゲンは、少なくともソバおよび甲殻類からなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはソバおよび甲殻類からなる群より選択される１種以上であり、さらに好ましくは、ソバまたは甲殻類のいずれかである。あるいは、本発明の方法により検出されるアレルゲンは、少なくともソバを含み、例えば、ソバ単独、ソバおよび甲殻類、またはソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイであり得る。

【0012】

本発明において、アレルゲン検出に供する対象物の例としては、食品、化粧品、医薬品、それらの原材料、それらの製造工程で使用する機器類、などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの対象物を、通常の前処理、例えば粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。あるいは、対象物が機器類の場合、その洗浄液やふき取り検体など、またはそれらを粉砕、溶解、懸濁、抽出等、もしくはそれらの組み合わせにかけたものを、本発明の方法の試料として用いることができる。なお、本発明の方法に用いる試料の調製方法は、上記に限定されず、次に述べるタンパク質分解酵素処理のための試料の調製に用いることができるあらゆる方法を包含し得る。

【0013】

本発明の方法においては、調製した試料を、タンパク質分解酵素で処理する。本発明の方法で用いられるタンパク分解酵素の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、テルモリシンなどが挙げられ、好ましくはトリプシンである。処理の条件は、酵素の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えばトリプシンの場合、酵素濃度１０００〜２００００Ｕ、２５〜４５℃、ｐＨ７〜９程度で４〜２４時間が好ましい。当該酵素処理は、標的のアレルゲンのタンパク質分子を分解して、該アレルゲンに由来するポリペプチドを生成する。したがって、試料中に標的のアレルゲンが含まれていれば、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含む。一方、試料中に標的のアレルゲンが含まれていなければ、上記酵素処理後の試料は、標的アレルゲンに由来するポリペプチドを含まない。

【0014】

したがって、上記タンパク分解酵素で処理した試料中における標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出することにより、該試料中における標的アレルゲンの存在の有無を判定することができる。

【0015】

ソバについては、ソバ２２ｋＤａタンパク質分子（配列番号２５）の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンがソバの場合、下記配列番号１〜７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
VQVVGDEGR （配列番号１）
SVFDDNVQR （配列番号２）
GQILVVPQGFAVVLK（配列番号３）
EGLEWVELK （配列番号４）
NFFLAGQSK （配列番号５）
GFIVQAR （配列番号６）
NDDNAITSPIAGK （配列番号７）
本発明の方法においては、上記配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。

【0016】

カニ、エビなどの甲殻類については、トロポミオシンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが甲殻類の場合、下記配列番号８〜１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
IQLLEEDLER（配列番号８）
MDALENQLK （配列番号９）
FLAEEADR （配列番号１０）
IVELEEELR （配列番号１１）
LAMVEADLER（配列番号１２）
本発明の方法においては、上記配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。

【0017】

アレルゲンがソバおよび甲殻類の場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上であり、より好ましくは、配列番号１〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。

【0018】

乳については、カゼインまたはβラクトグロブリン（ＢＬＧ）の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが乳の場合、下記配列番号１３〜１７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。下記ポリペプチドのうち、配列番号１３〜１５はカゼイン由来ポリペプチドであり、配列番号１６〜１７はＢＬＧ由来ポリペプチドである。
FFVAPFPEVFGK（配列番号１３）
YLGYLEQLLR （配列番号１４）
NAVPITPTLNR （配列番号１５）
VLVLDTDYK （配列番号１６）
TPEVDDEALEK （配列番号１７）
本発明の方法においては、上記配列番号１３〜１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。カゼインについては、好ましくは配列番号１３〜１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出され、ＢＬＧについては、好ましくは配列番号１６〜１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。

【0019】

卵については、オボアルブミンの分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンが卵の場合、下記配列番号１８〜２１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。
YPILPEYLQCVK （配列番号１８）
ELINSWVESQTNGIIR（配列番号１９）
LTEWTSSNVMEER （配列番号２０）
HIATNAVLFFGR （配列番号２１）
本発明の方法においては、上記配列番号１８〜２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。

【0020】

ラッカセイについては、Ara h1-3の分解産物を、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出することができる。本発明の方法の好ましい実施形態においては、アレルゲンがラッカセイの場合、下記配列番号２２〜２４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、アレルゲン由来ポリペプチドとして検出する。下記ポリペプチドのうち、配列番号２２〜２３はAra h1由来ポリペプチドであり、配列番号２４はAra h3由来ポリペプチドである。
DLAFPGSGEQVEK （配列番号２２）
VLLEENAGGEQEER（配列番号２３）
SPDIYNPQAGSLK （配列番号２４）
本発明の方法においては、上記配列番号２２〜２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上の有無が検出されればよいが、好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出される。Ara h1については、好ましくは配列番号２２〜２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上、より好ましくはそれらのポリペプチドの全ての有無が検出され、Ara h3については、好ましくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの有無が検出される。

【0021】

したがって、アレルゲンがソバ、甲殻類、乳、卵およびラッカセイの場合、検出されるアレルゲン由来ポリペプチドは、好ましくは配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号８〜１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１３〜１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号１８〜２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上と、配列番号２２〜２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか１種以上であり、より好ましくは、配列番号１〜２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てである。

【0022】

上記タンパク分解酵素で処理した試料中における標的アレルゲン由来ポリペプチドの存在の有無を検出する手段としては、クロマトグラフィー分離を利用した分析が好適である。クロマトグラフィー分離を利用した分析としては、液体クロマトグラフィー−質量分析、例えば、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析（ＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）などが挙げられる。測定精度（Ｓ／Ｎ比）が高くかつ複数ペプチドを一度に検出できることから、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。

【0023】

本発明の方法において、標的アレルゲン由来ポリペプチドの検出に用いるクロマトグラフィーとしては、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が好ましく、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）がより好ましい。また好ましくは、該ＬＣは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であり、さらに好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣである。ＲＰＬＣ用の担体としては、シリカゲルやポリマーゲル基材に炭化水素鎖（好ましくはオクタデシル基）を結合した充填剤を有する担体、例えばＣ１８カラム、Ｃ８カラムなどが挙げられる。該ＬＣの移動相（溶離液）は、目的の各アレルゲン由来ポリペプチドを個別に分離することができるものであればよく、例えば、ギ酸水溶液（Ａ）とギ酸アセトニトリル水溶液（Ｂ）との１００：０〜０：１００（体積比）グラジエント溶液が挙げられるが、これに限定されない。

【0024】

液体クロマトグラフィー−質量分析においては、上記ＬＣの溶出物を質量分析（ＭＳ／ＭＳ、ＴＯＦ／ＭＳ等）にかける。質量分析は、タンデム四重極型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置等の公知の質量分析装置を用いて、ペプチドの検出に用いられる通常の条件に従って実施することができる。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）または大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を用いた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。質量分析では、溶出物中の各ポリペプチドは、質量数／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離される。例えば、目的のポリペプチドのｍ／ｚ値を予めデータベース化しておくことにより、測定されたｍ／ｚ値に基づいて、試料中における目的のポリペプチドの有無を検出することができる。

【実施例】

【0025】

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0026】

（試薬）
アセトニトリル（和光純薬工業、特級、ＨＰＬＣ用）
トリプシン（和光純薬工業、ブタ脾臓由来 生化学分析用）
ヨードアセトアミド（ＩＡ）（和光純薬工業、生化学分析用）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬工業、生化学分析用）
尿素（和光純薬工業、特級）
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（純正化学 特級）
（緩衝液）
Ａ：０．１ＭＤＴＴ＿０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ＿４Ｍ尿素（ｐＨ８．２）緩衝液
Ｂ：０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ＿２Ｍ尿素（ｐＨ８．２）緩衝液

【0027】

参考例１ アレルゲン含有試料の調製
検体０．５ｇを１５ｍＬディスポ試験管に採取し、緩衝液Ａ（試験例１〜３）または緩衝液Ｂ（試験例４〜５）を５ｍＬ加え、３時間（試験例１〜３）または５時間（試験例４〜５）振とう抽出した。得られた反応物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した。

【0028】

実施例１ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるトリプシン消化物の分析
１）トリプシン消化
アレルゲン分子１ｍｇまたは参考例１で調製した上清０．２５ｍＬを１．５ｍＬ用ポリチューブに採取し、緩衝液Ａ（試験例１〜３）または緩衝液Ｂ（試験例４〜５）を０．２５ｍＬ加えて完全に溶解させた。得られた溶液に４０ｍｇ／ｍＬ ＤＴＴ５０μＬを加えて、３７℃で９０分間インキュベートし、次いで４０ｍｇ／ｍＬ ＩＡ５０μＬを加えて、３７℃で３０分間、遮光化でインキュベートした。反応液に５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム６００μＬを加え、次いで１０ｍｇ／ｍＬトリプシン５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液を１００μＬ加え、３７℃で１６時間インキュベートした（ｐＨ７〜９）。反応後、ＴＦＡ１０μＬを加えてトリプシンを失活させた。

【0029】

２）脱塩
ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（３ｃｃ、６０ｍｇ；Ｗａｔｅｒｓ）をメタノール１ｍＬおよび水２ｍＬでコンディショニングした。これに１）で得られた反応液の全量を滴下した後、水１ｍＬで洗浄し、次いで６０％アセトニトリル１ｍＬにより溶出した。

【0030】

３）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
２）で得られた溶出物を、４０℃で窒素乾固後、２５％アセトニトリル０．２ｍＬに溶解させた。得られた溶液をフィルターろ過後、下記条件にてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭを行った。

【0031】

（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置）
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＮｅｘｅｒａＸ２
ＭＳ／ＭＳ：ＡＢＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ５５００
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｋｉｎｅｔｉｋ Ｃ１８ １５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径２．６μｍ
カラム温度：５０℃
カラム流量：０．３ｍＬ
溶離液Ａ：０．１％ギ酸；溶離液Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル
グラジエント：Ａ：Ｂ ９５：５（０ｍｉｎ）→４０：６０（２０ｍｉｎ）→２０：８０（５０ｍｉｎ）→９５：５（５５ｍｉｎ）→９５：５（９０ｍｉｎ）
（質量分析条件）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
極性：ポジティブ
スプレー電圧：５５００Ｖ
ターボヒーター温度：４５０℃

【0032】

試験例１ ソバアレルゲンの検出
２２ｋＤａタンパク質（配列番号２５）を標的アレルゲン分子として、表１に示す条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭにより標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。結果を図１に示す。

【0033】

【表1】

【0034】

試験例２ 甲殻類アレルゲンの検出
トロポミオシン（配列番号２６）を標的アレルゲン分子として、表２に示す条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭにより標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。結果を図２に示す。

【0035】

【表2】

【0036】

試験例３ 食品組成物からのソバアレルゲンおよび甲殻類アレルゲンの検出
ソバまたは甲殻類（エビパウダー）を０．０１質量％添加した小麦粉から、参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。得られた試料を、実施例１に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。対照として、ソバまたは甲殻類無添加小麦粉を用いて同様の分析を行った。検出するソバおよび甲殻類のアレルゲン由来ポリペプチド、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の条件は、それぞれ表１および表２と同じとした。測定結果を図３および４に示す。

【0037】

試験例４ 乳、卵およびラッカセイアレルゲンの検出
全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のそれぞれから、参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。各試料を、実施例１の１）〜３）に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のそれぞれについての標的アレルゲン分子、および検出したアレルゲン由来ポリペプチドを、表３〜５に示す。全粉乳、全卵粉およびラッカセイ粉のいずれのアレルゲンも、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で検出することができた（図５〜７）。

【0038】

【表3】

【0039】

【表4】

【0040】

【表5】

【0041】

試験例５ 食品組成物からの乳およびラッカセイアレルゲンの検出
全粉乳および落花生粉のいずれかを添加したパン（添加パン；添加量０．８４質量％）、ならびに乳および落花生を含まないパン（無添加パン）を製造した。添加パンと無添加パンを混合し、１００倍希釈添加パン（全粉乳および落花生粉の添加量０．００８４質量％）を調製した。得られた１００倍希釈添加パンに含まれる乳またはラッカセイアレルゲン（カゼインおよびAra hを含むラッカセイ可溶性タンパク質）の濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した（定量下限値１ｐｐｍ）。測定結果を表６に示す。

【0042】

【表6】

【0043】

次に、無添加パンおよび１００倍希釈添加パンから参考例１に従ってアレルゲン含有試料を調製した。得られた試料を、実施例１に従ってトリプシン消化、脱塩およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭにかけ、標的アレルゲン由来ポリペプチドを検出した。検出対象には、乳についてはカゼイン由来ポリペプチド（配列番号１３〜１５）、ラッカセイについてはAra h1またはh3由来ポリペプチド（配列番号２２〜２４）を選択した。

【0044】

その結果、１００倍希釈添加パンについて、乳アレルゲン（カゼイン）およびラッカセイアレルゲン（Ara h1またはh3）のピークを十分な感度で確認することができた（図８および９）。さらに、５００倍希釈添加パンを用いての同様のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭ測定でも、ピークのＳ／Ｎが１０以上あることが確認された。他方、無添加パンではピークは確認されなかった。したがって、本発明の方法によれば、ＥＬＩＳＡ法と同等の測定感度（定量下限値１ｐｐｍ）でアレルゲンを検出することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]