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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6911543
(24)【登録日】2021年7月12日
(45)【発行日】2021年7月28日
(54)【発明の名称】ベースラインの判定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 30/86 20060101AFI20210715BHJP
【ＦＩ】
G01N30/86 L
【請求項の数】3
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2017-109455(P2017-109455)
(22)【出願日】2017年6月1日
(65)【公開番号】特開2018-205068(P2018-205068A)
(43)【公開日】2018年12月27日
【審査請求日】2020年5月19日
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】植松 原一
【審査官】
高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】
特開平５−１８２０１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平７−２４１２９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００３−１６１７２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平９−０５４０７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２００５／０２８５０２３（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９６
Ｇ０１Ｎ ２７／６０−２７／９２
Ｇ０１Ｎ ２１／００−２１／７４
Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロマトグラムの測定開始から終了までの一部又は全部の時間について、
特定のプロット及び当該プロットの前後数点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値をプロットごとに選定し、
前記最大値と前記最小値の差分をプロットごとに算出し、
前記差分を階級として度数分布を作成し、
前記度数分布の階級の低い方からの極大度数を示す階級の平均値を当該クロマトグラムのノイズ値と決定する方法。
特定のプロット及び当該プロットの前後数点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値をプロットごとに選定し、
前記最大値と前記最小値の差分をプロットごとに算出し、
前記差分を階級として度数分布を作成し、
前記度数分布の階級の低い方からの極大度数を示す階級の平均値を当該クロマトグラムのノイズ値と決定する方法。
【請求項2】
請求項１で決定したノイズ値に１．０以下の係数を乗じた値より前記差分が小さくなるプロットをクロマトグラム中から抽出し、
抽出されたプロット群を数学的手法により近似計算したものを当該クロマトグラムから差し引くことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
抽出されたプロット群を数学的手法により近似計算したものを当該クロマトグラムから差し引くことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
【請求項3】
請求項１で決定したノイズ値に１．０以上の係数を乗じた値を排除ピーク高さとして設定することを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クロマトグラムにおけるベースラインのノイズレベルの判定およびデータ処理方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
クロマトグラフィは複数成分を含む試料をカラムで分離定量する方法である。クロマトグラフィでは、ベースライン上に様々な要因による周期的あるいは不定期なノイズが重畳してくるため、一定の高さ、面積値以下のピークを排除する処理が併用される。出現したピークを確実に検出するため、ベースラインのノイズの度合に合わせて排除値を決定する方法が好ましく、ベースラインのノイズがどの程度か、常に正確に把握しておく必要がある。一般的なノイズ算出法としては、ＡＳＴＭ（ＡＳＴＭ 米国材料試験協会 Ｅ ６８５−９３）に準拠して行われる。ベースラインを３０秒間隔で分割し、各区間のノイズ幅を計測し、１０区間の平均をノイズとして表す方法である（図１参照）。
【0003】
前記方法は、規格化されていることから、装置間差の確認、装置の性能確認やバリデーションには非常に有効であるが、正確にノイズ値を算出するには、ベースラインがかなり安定した状態（うねりやドリフトが少ない状態）で行わないと、正確なノイズ値を取得することは難しい。また、ベースラインのノイズは、使用時点の溶離液、検出器、送液ポンプ、使用環境の状態などにより大きく影響されるため、測定日もしくは測定毎にノイズの度合が変化するといった問題もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、クロマトグラムからノイズ値を算出する方法を提供するものである。更に前記ノイズ値から適切な条件でクロマトグラムをデータ処理する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、鋭意検討を行った結果、クロマトグラム中の特定のプロット及び当該プロットの前後数点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値の差分に着目し、本発明を完成するに至った。以下、本発明について詳細に説明する。
【0006】
本発明は、クロマトグラムの測定開始から終了までの一部又は全部の時間について、特定のプロット及び当該プロットの前後数点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値をプロットごとに選定し、
前記最大値と前記最小値の差分をプロットごとに算出し、
前記差分を階級として度数分布を作成し、
前記度数分布の階級の低い方からの極大度数を示す階級の平均値を当該クロマトグラムのノイズ値と決定する方法である。
【0007】
本発明は、まず、クロマトグラムの測定開始から終了までの一部又は全部の時間について、特定のプロット及び当該プロットの前後数点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値をプロットごとに選定する。具体的に図４ａおよび図２ａに示すクロマトグラムを用いて説明する。図２ａは図４ａの０分から０．１５分までを拡大した図である。図２ａに示すクロマトグラムのプロットされている点を表にまとめると表１のようになる。
【0008】
【表1】
【0009】
特定のプロットを＃４（時間 ０．０２５）、前後３点をプロット群に含める場合、＃１（時間 ０．０００）〜＃７（時間 ０．０５０）が＃４にとってのプロット群となる。このプロット群だと最大値が１．８１７（＃１）、最小値が０．３００（＃４）となる。これを＃５以降も繰り返していく。前後３点をプロット群に含める場合、特定のプロットとなるのは＃４から＃１６までとなる。すなわち、クロマトグラムの測定開始から終了までの全部の時間が対象であっても、測定開始直後の数点と測定終了直前の数点について、本工程は行われないこととなる。なお、上述の説明では前後３点をプロット群に含める態様を用いたが、前後何点をプロット群に含めるかは任意に決めて問題ない。
【0010】
図２ａに示すクロマトグラムについて、特定のプロット及び当該プロットの前後３点のプロットからなるプロット群における出力値の最大値及び最小値をプロットしていくと図２ｂ、ｃとなる。
【0011】
次に、前記最大値と前記最小値の差分をプロットごとに算出する。引き続き、図２ａに示すクロマトグラムを用いて説明すると、図３のようになる。各プロットの前記最大値と前記最小値の差分を表にすると表２のようになる。
【0012】
【表2】
【0013】
次に、前記差分を階級として度数分布を作成する方法について説明する。前記の手順で０分から９０分までの全領域階に対して差分を算出し、差分を階級とし、その頻度を度数として度数分布を作成する（図４、５参照）。作成した度数分布の階級の低い方からの極大度数を示す階級は、１．６〜１．７となっていることが分かり、その平均値である１．６５が図４ａに示すクロマトグラムのノイズ値（Ｎｚ）と決定できる。
【0014】
上述した本発明の方法で決定されたノイズ値は、対象としたクロマトグラムの中で、特に安定した点（ベースポイント）を算出するのに有用である。具体的には、ノイズ値に１．０以下の係数を乗じた値より前記差分が小さくなるプロットをクロマトグラム中から抽出し（ベースポイントの抽出）、抽出されたプロット群（ベースポイント群）を数学的手法により近似計算したものを当該クロマトグラムから差し引くことで、ベースラインの変動を排除したクロマトグラムを取得することができる。
【0015】
ノイズ値に乗じる係数は１．０以下の値であれば良いが、０．１〜０．８の値が好適である。使用するベースポイントは、前記条件に合致するデータ点全てを用いても良いが、その一部のみを使用しても良い。特に、時間間隔ができるだけ均等になるようにベースポイントを選択して計算を行うと、より正確な近似が可能で好適である。また、ここで言う数学的手法とは単純な折れ線近似、最小二乗法による一次式近似、最小二乗法による多項式近似、最小二乗法による非線形関数近似、スプライン処理による近似等が使用可能であるが、一般的なクロマトグラムでは、最小二乗法による一次式近似、または、最小二乗法による二次式近似が相関が良く、計算の負荷も少ないため好適である。
【0016】
さらに、上述した本発明の方法で決定されたノイズ値は、ピーク検出処理時に、排除対象とするピーク高さを決定する際にも有用である。具体的には、ノイズ値に１．０以上の係数を乗じた値を排除ピーク高さとして設定することで効率的に不要なピークを排除することができる。ノイズ値に乗じる係数は１．０以上の値であれば良いが、３〜１０が好適である。
【0017】
本発明の実施態様としては、測定ごとにノイズ値を決定するのみでも問題なく、ノイズ値を利用して、上述した方法でベースラインの変動を排除及び／又は排除対象とするピーク高さを決定することでクロマトグラムのデータ処理を行っても良い。
【発明の効果】
【0018】
本発明は、クロマトグラムのノイズ値を簡便に決定することが可能であり、当該ノイズ値を用いることにより、効率的にベースラインの変動や不要なピークを排除するためのデータ処理が行える。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】一般的な方法（ＡＳＴＭ法）でのノイズ計算の手法を示した図である。
【図6】実施例１で使用したシステム構成を示した図である。
【図8】実施例１での、最大値から最小値を引いた差分（ノイズ幅）を示した図である。
【図10】実施例１で得られたノイズ値を自動データ処理機に適用し、ピーク検出を行った結果を示した図である。
【図11】実施例１で得られたノイズ値を基にベースラインの基本となるポイントおよび、得られたベースラインをサプレッションした結果を示した図である。図１１ａは生クロマトグラムとベースポイント（符号○）を重ね描いた図、図１１ｂは生クロマトグラムからベースライン（１次式）を差し引いた図、図１２ｃは生クロマトグラムからベースライン（２次式）を差し引いた図である。
【図12】実施例２で使用したシステム構成を示した図である。
【図15】実施例２で得られたノイズ値を自動データ処理機に適用し、ピーク検出を行った結果を示した図である。
【実施例】
【0020】
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。ただし、本発明は実施例の記載に限定されるものではない。
【0021】
（実施例１）イオンクロマトグラフィの系（ノンサプレスアニオン）で検証を実施した。図６に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、電気伝導度計（ＣＭ−８０２０）７、及びデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。
分析カラム５としては、東ソー（株）製 ＴＳＫｇｅｌ ＩＣ−Ａｎｉｏｎ−ＰＷＸＬ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）を使用し、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＰＯ４２−、ＳＯ４２−イオンの分離を行った。
【0022】
その他の条件は下記の通りである。データ収集サンプリング：２００ｍｓｅｃ
注入量：３０ｕＬ
カラム温度：４０℃
流速：１．２００ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離液：以下を混合し、純水で１Ｌにメスアップして使用
ホウ酸：３６０ｍｇ、四ホウ酸ナトリウム１０水和物：５７５ｍｇ、グリセリン：５．０ｇ、グルコン酸カリウム：３５０ｍｇ、アセトニトリル：４０ｍＬ、ｎ−ブタノール：３０ｍＬ
【0023】
図７は上記条件で得られたクロマトグラムである。図ａは生のクロマトグラム、図ｂは前後３点で計算した最大値、最小値を示している。
【0024】
図８は（最大値―最小値）つまりノイズ幅を示した図である。図１０から分かるように、このようにして得られたノイズ値は、目的のＢｒ−、ＮＯ３−、ＰＯ４２−、ＳＯ４２−イオンのピーク付近では若干高くなるものの、クロマトグラム上でうねりが生じている部分や、ベースラインがドリフトしている部分でもほぼ一定の値を示していることが分かる。
【0025】
次に、前記で得られたノイズ値の度数分布を作成する。図９ａはノイズ値を０ｍＶから０．１ｍＶまで０．００５ｍＶ刻みで区間を設定し頻度を表した図である。この場合、０．０１５ｍＶ〜０．０２０ｍＶの区間の度数が８９４と最も高いため、平均値である０．０１７５ｍＶをノイズ値（Ｎｚ）とする。
【0026】
なお、比較のために液体クロマトグラフィの分野で一般的に使用されることが多いＡＳＴＭ法でノイズ計算を実施した場合、図９ｂのようになる。図１の手法で３０秒間隔の区切り、ノイズ幅を算出し、１０区間の平均を採った。この方法で計算すると第一の区間で６．４０４ｍＶ、第二の区間で１．２１４ｍＶ、第三の区間で１．８５５ｍＶと、本法で得られたノイズ値（０．０１７５ｍＶ）と比較して１０倍以上大きな値と計算される。
【0027】
図１０は以下のピーク検出条件で実際のデータ処理を行った結果を示した図である。基本的なピーク検出条件は下記の通りである。排除ピーク高さはノイズ値（０．０１７５ｍＶ）の５倍（Ｓ／Ｎ＝５）として０．０８８ｍＶと設定した。ピークスタート検出感度：０．５００［ｍＶ／分］
ピークエンド検出感度 ：０．５００［ｍＶ／分］
排除ピーク面積 ：０．０００［ｍＶ×秒］
排除ピーク半値幅 ：０．０００［秒］
排除ピーク高さ ：０．０８８（０．０１７５×５）［ｍＶ］
この場合、ベースライン上のノイズはピークでないと判断され、総ピーク件数は７となり、ほぼ、目的としたイオン成分のピークのみとなる。このように、本発明の方法を使用することで、ピーク検出時の排除ピーク高さを自動算出が可能となり、常に適切なピーク検出結果が得られることが分かる。
【0028】
前記の手法で得られたノイズ値を使用したベースラインサプレッションの効果も確認した。まず、対象クロマトグラムについて、ノイズ値（Ｎｚ）に０．８０の係数（Ｎｆ）を乗じたノイズ値（最大値―最小値）を有するデータを抽出した。図１１ａに示す通り、ピークやうねりが無い領域がベースポイント（符号○）として抽出されていることが分かる。次に、ベースポイント群を数学的手法で近似して、元のクロマトグラムから減算した。図１１ｂは１次式で近似して得られたベースラインを差し引いたもの、図１１ｃは、二次式で近似して得られたベースラインを差し引いたものである。いずれの場合でも、クロマトグラムのドリフトをキャンセルできていることが分かる。
【0029】
（実施例２）分子排除クロマトグラフィの系（ＧＰＣ）で検証を実施した。図１２に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、高速ＧＰＣ装置ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣと、紫外可視検出器（２５４ｎｍ）（ＵＶ−８０２０）１２、及びデータ処理装置（ＧＰＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。
分析カラム５としては、東ソー（株）製 ＴＳＫｇｅｌ ＭｕｔｉｐｏｒｅＨＸＬ−Ｍを４本使用し、エポキシ樹脂の分離を行った。
【0030】
その他の条件は下記の通りである。データ収集サンプリング：５００ｍｓｅｃ
注入量：１００ｕＬ
カラム温度：４０℃
流速：１．０００ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）。
なお、本実施例では紫外可視検出器１２にて得られたクロマトグラムで検証を行った。
【0031】
図１３は上記条件で得られたクロマトグラムである。図１３ａは生のクロマトグラム、図１３ｂは前後５点で計算した最大値、最小値を示している。
【0032】
図１４は、前記で得られた最大値と最小値の差分、つまりノイズ値の度数分布であり、ノイズ値を０ｍＶから０．０３ｍＶまで０．００２ｍＶ刻みで区間を設定し頻度を表した図である。この場合、０．００６ｍＶ〜０．００８ｍＶの区間の度数が１７０６と最も高いため、平均値である０．００７ｍＶをノイズ値（Ｎｚ）とする。
【0033】
なお、比較のためにＡＳＴＭ法でノイズ計算を実施した場合、図１４ｂのようになる。図１の手法で３０秒間隔の区切り、ノイズ幅を算出し、１０区間の平均を採った。この方法で計算すると第一の区間で０．０１２７ｍＶ、第四の区間で１１５．３４５８ｍＶ、第六の区間で３．３２６２ｍＶとかなりバラついていることがわかる。
【0034】
図１５は以下のピーク検出条件で実際のデータ処理を行った結果を示した図である。基本的なピーク検出条件は下記の通りである。排除ピーク高さはノイズ値（０．００７ｍＶ）の５倍（Ｓ／Ｎ＝５）として０．０３５ｍＶと設定した。ピークスタート検出感度：０．０５０［ｍＶ／分］
ピークエンド検出感度 ：０．０５０［ｍＶ／分］
排除ピーク面積 ：０．０００［ｍＶ×秒］
排除ピーク半値幅 ：０．０００［秒］
排除ピーク高さ ：０．０３５（０．０１７５×５）［ｍＶ］
この場合、ベースライン上のノイズはピークでないと判断され、総ピーク件数は１１となり、ほぼ、目的としたオリゴマーピークのみとなる。
【0035】
前記の手法で得られたノイズ値を使用したベースラインサプレッションの効果も確認した。まず、対象クロマトグラムについて、ノイズ値（Ｎｚ）に０．８０の係数（Ｎｆ）を乗じたノイズ値（最大値―最小値）を有するデータを抽出した。図１６ａに示す通り、ピークやうねりが無い領域がベースポイント（符号○）として抽出されていることが分かる。次に、ベースポイント群を２次式で近似して、元のクロマトグラムから減算したが、図１６ｂに示す通りクロマトグラムのドリフトをキャンセルできていることが分かる。
【符号の説明】
【0036】
１．溶離液２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．電気伝導度計
８．廃液
９．システム制御及びデータ処理装置
１０．示差屈折計
１１．抵抗管
１２・紫外可視検出器
１３．送液ポンプ（リファレンス側）
１４．ポンプオーブン
１５．ＧＰＣシステム