特許 6912166 乳酸菌発酵促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6912166

(24)【登録日】2021年7月12日

(45)【発行日】2021年7月28日

(54)【発明の名称】乳酸菌発酵促進剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20210715BHJP

   A23C 9/12 20060101ALI20210715BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 G

   A23C9/12

【請求項の数】14

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2016-120225(P2016-120225)

(22)【出願日】2016年6月16日

(65)【公開番号】特開2017-221157(P2017-221157A)

(43)【公開日】2017年12月21日

【審査請求日】2019年5月27日

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-6999

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-77

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10740

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10741

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-76

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11269

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-19638

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000006138

【氏名又は名称】株式会社明治

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】古市 圭介

(72)【発明者】

【氏名】遠山 恵美

【審査官】 玉井 真人

(56)【参考文献】

【文献】 Prikl. Biokhim. Mikrobiol.，１９８１年，Vol. 17, No. 3，pp. 348-367

【文献】 福岡女子短大紀要，１９９７年，No. 53，pp. 65-80

【文献】 Milchwissenschaft，１９９９年，Vol. 54, No. 4，pp. 187-190

【文献】 European J. Appl. Microbiol. Biotechnol.，１９７８年，Vol. 6，pp. 79-86

【文献】 J. Dairy Sci.，１９８７年，Vol. 70，pp. 2220-2225

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ０１Ｊ；Ａ２３Ｃ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＦＳＴＡ／ＣＡＢＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を含む、乳酸菌用の発酵促進剤であって、
前記発酵促進剤が、発酵基質において3〜7時間にわたって乳酸菌を培養し発酵させることを含む発酵食品の製造方法に用いるためのものであり、
乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、及びロイコノストック・ラクティスからなる群から選択され、
前記化合物がイノシン、デオキシイノシン、及びイノシン酸、並びにそれらの塩からなる群から選択され、
発酵基質が乳又は乳由来産物を含み、発酵食品が乳発酵食品である、
発酵促進剤（但し酵母エキスを含むものを除く）。

【請求項2】

乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、及びロイコノストック・ラクティスからなる群から選択される、請求項１に記載の発酵促進剤。

【請求項3】

乳発酵食品が発酵乳である、請求項１又は２に記載の発酵促進剤。

【請求項4】

前記の発酵食品の製造方法が、発酵基質において、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを混合培養することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発酵促進剤。

【請求項5】

前記化合物がイノシン酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発酵促進剤。

【請求項6】

前記化合物が発酵基質の0.0001〜10重量％となる量で使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発酵促進剤。

【請求項7】

前記化合物が発酵基質の0.0001〜0.002重量％となる量で使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発酵促進剤。

【請求項8】

２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を発酵基質に添加すること（但し酵母エキスを発酵基質に添加することを除く）、及び、その発酵基質において3〜7時間にわたって乳酸菌を培養し発酵させて乳酸菌による発酵を促進することにより、発酵基質の発酵を行うことを含む、発酵食品の製造方法であって、
乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、及びロイコノストック・ラクティスからなる群から選択され、
前記化合物がイノシン、デオキシイノシン、及びイノシン酸、並びにそれらの塩からなる群から選択され、
発酵基質が乳又は乳由来産物を含み、発酵食品が乳発酵食品である、方法。

【請求項9】

乳酸菌がストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、及びロイコノストック・ラクティスからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

乳発酵食品が発酵乳である、請求項８又は９に記載の方法。

【請求項11】

発酵基質において、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを混合培養する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記化合物がイノシン酸ナトリウムである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記化合物を発酵基質に0.0001〜10重量％の量で添加する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記化合物を発酵基質に0.0001〜0.002重量％の量で添加する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌発酵促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌は多くの食品を含む発酵物の製造に使用されている菌である。乳酸菌の増殖・発酵の促進は、乳酸菌の増殖・発酵工程の合理化の観点から、産業面で多大な利益をもたらす。一方で、ヨーグルトなどの食品では、美味しさも極めて重要な要素となることから、風味に悪影響を与える発酵促進剤は望まれない。また、食品製造に利用することを考えると、発酵促進剤は、安価に製造できることや、微量で発酵促進効果を示すことも重要となる。微量で効果を発揮することができれば、例えば発酵促進剤の添加用の設備などの設備増強をすることなく、既存の製造設備をそのまま使用できて有用である。

【0003】

乳酸菌の増殖や発酵を促進する技術として、乳酸菌の死菌体を含む酸性バターミルクを有効成分とする乳酸菌の増殖促進剤（特許文献１）、還元糖量と重量平均分子量が一定の範囲に調整された寒天を含有する乳酸菌増殖促進剤（特許文献２）、及びバショウ属種由来の抽出物を使用した、乳酸菌などのグラム陽性菌の増殖促進方法（特許文献３）などがある。しかし微量でも効果を示し、安価で調製でき、風味にほとんど影響を及ぼさない、乳酸菌の発酵促進剤の開発がなお望まれている。

【0004】

特許文献４は、イノシン-5'-リン酸をラクトバチルス属菌やラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスの凍結培養液に添加することにより、凍結損傷に対する保護効果を得られることを開示している。

【0005】

特許文献５は、ラクトバチルス属又はビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌の生育のために合成培地に加える必要があるDNA前駆体の最少の組み合わせとして、「２種の遊離核酸塩基、１種のリボヌクレオシド及び２種のデオキシヌクレオシド」、特にグアニン、チミン、シチジン、2'-デオキシアデノシン及び2'-デオキシウリジンの組み合わせを開示している。

【0006】

特許文献６は、イノシン及びグアノシンをそれぞれ1.25mM添加したラクトバチルス属菌の菌体懸濁液を培養し、イノシン及びグアノシンの分解率を測定することにより、高いプリン体分解能を有するラクトバチルス属菌を同定したことを開示している。

【0007】

しかし特許文献４〜６も、乳酸菌発酵促進剤について記載も示唆もしていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２００８／００１４９７

【特許文献2】特開２０１４−０９４００１号公報

【特許文献3】国際公開ＷＯ２００７／０５２０８１

【特許文献4】国際公開ＷＯ２００５／００３３２７

【特許文献5】特開２０００−２７９１６６号公報

【特許文献6】国際公開ＷＯ２００９／０６９７０４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、食品製造での利用に適した、乳酸菌発酵促進剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物が乳酸菌による発酵を効果的に促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] ２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を含む、乳酸菌用の発酵促進剤。
[2] 前記化合物が、アデニン若しくはヒポキサンチンであるプリン塩基、それを構成要素として含むプリンヌクレオシド若しくはプリンヌクレオチド、又はその塩である、上記[1]に記載の発酵促進剤。
[3] 前記化合物が、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、及びイノシン酸、並びにそれらの塩からなる群から選択される、上記[1]又は[2]に記載の発酵促進剤。
[4] 乳酸菌が、ストレプトコッカス属菌である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の発酵促進剤。
[5] ストレプトコッカス属菌がストレプトコッカス・サーモフィルスである、上記[4]に記載の発酵促進剤。
[6] 乳酸菌が、ラクトバチルス属菌である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の発酵促進剤。
[7] ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、又はラクトバチルス・ガセリである、上記[6]に記載の発酵促進剤。
[8] 乳酸菌が、ラクトコッカス属菌である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の発酵促進剤。
[9] ラクトコッカス属菌がラクトコッカス・ラクティスである、上記[8]に記載の発酵促進剤。
[10] 乳酸菌が、ロイコノストック属菌である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の発酵促進剤。
[11] ロイコノストック属菌がロイコノストック・ラクティスである、上記[10]に記載の発酵促進剤。
[12] 乳又は乳由来産物を含む発酵基質の発酵に用いるための、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の発酵促進剤。
[13] ２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を発酵基質に添加し、その発酵基質において乳酸菌を培養し発酵させることを含む、乳酸菌による発酵を促進する方法。
[14] 前記化合物が、アデニン若しくはヒポキサンチンであるプリン塩基、それを構成要素として含むプリンヌクレオシド若しくはプリンヌクレオチド、又はその塩である、上記[13]に記載の方法。
[15] 前記化合物が、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、及びイノシン酸、並びにそれらの塩からなる群から選択される、上記[13]又は[14]に記載の方法。
[16] 乳酸菌が、ストレプトコッカス属菌、ラクトバチルス属菌、ラクトコッカス属菌及びロイコノストック属菌からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記[13]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17] ストレプトコッカス属菌がストレプトコッカス・サーモフィルスである、上記[16]に記載の方法。
[18] ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・デルブルッキー、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、及びラクトバチルス・ガセリからなる群から選択される少なくとも１つである、上記[16]又は[17]に記載の方法。
[19] ラクトコッカス属菌がラクトコッカス・ラクティスである、上記[16]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[20] ロイコノストック属菌がロイコノストック・ラクティスである、上記[16]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21] ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを混合培養する、上記[13]〜[18]のいずれかに記載の方法。
[22] 前記化合物を発酵基質に0.0001〜10重量％の量で添加する、上記[13]〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23] 上記[13]〜[22]のいずれかに記載の方法により、発酵基質の発酵を行うことを含む、発酵食品の製造方法。
[24] 発酵基質が乳又は乳由来産物を含み、発酵食品が乳発酵食品である、上記[23]に記載の方法。
[25] 乳発酵食品が発酵乳である、上記[24]に記載の方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、少ない添加量の発酵促進剤でも、乳酸菌の発酵を促進することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】イノシン酸ナトリウムのS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角:0.0001%、黒三角: 0.0002%、黒ひし形: 0.0004%、×: 0.001%、白四角: 0.002%、白丸: 対照。横軸の発酵時間の単位Hは時間［hour(s)］である（図中において、以下同じ）。

【図2】イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物のS. thermophilus発酵促進効果を示す図である。黒四角:0.0001%、黒三角: 0.0002%、黒ひし形: 0.0005%、×: 0.0010%、白丸: 対照。

【図3】より高濃度のイノシン酸ナトリウムのS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角:0.1%、黒三角: 0.5%、黒ひし形: 1%、白丸: 対照。

【図4】より高濃度のイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物のS. thermophilusに対する発酵促進効果を示す図である。黒四角:0.1%、黒三角: 1%、白丸: 対照。

【図5】アデニン及びその誘導体のS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角:アデニン、黒三角: アデノシン、黒ひし形: デオキシアデノシン（d-アデノシン）、黒丸：AMP、白丸: 対照。

【図6】ヒポキサンチン及びその誘導体のS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角: ヒポキサンチン、黒三角: イノシン、黒ひし形: デオキシイノシン（d-イノシン）、黒丸：IMP、白丸: 対照。

【図7】グアニン及びその誘導体のS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角: グアニン、黒三角: グアノシン、黒ひし形: デオキシグアノシン（d-グアノシン）、白丸: 対照。

【図8】キサンチン及び尿酸のS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角: キサンチン、黒三角: 尿酸、白丸: 対照。

【図9】ピリミジン塩基及びその誘導体のS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。黒四角: シトシン、白四角: シチジン、黒三角: ウラシル、白三角: ウリジン、黒ひし形: チミン、白ひし形: チミジン、白丸: 対照。

【図10】S. thermophilus OLS3059株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図11】S. thermophilus OLS3294株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図12】S. thermophilus OLS3289株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図13】S. thermophilus OLS3469株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図14】S. thermophilus OLS3058株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図15】S. thermophilus OLS3290株に対するイノシン酸の発酵促進効果を示す図である。

【図16】S. thermophilusとL. bulgaricusの混合発酵（スターターＡ）におけるイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を酸度を指標として示す図である。黒四角: イノシン酸ナトリウム、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物、白丸: 対照。

【図17】S. thermophilusとL. bulgaricusの混合発酵（スターターＢ）におけるイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を酸度を指標として示す図である。黒四角: イノシン酸ナトリウム、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物、白丸: 対照。

【図18】S. thermophilusとL. bulgaricusの混合発酵（スターターＡ）におけるイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果をL-乳酸濃度を指標として示す図である。黒四角: イノシン酸ナトリウム、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物、白丸: 対照。

【図19】S. thermophilusとL. bulgaricusの混合発酵（スターターＢ）におけるイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果をL-乳酸濃度を指標として示す図である。黒四角: イノシン酸ナトリウム、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物、白丸: 対照。

【図20】S. thermophilus OLS3059株とL. bulgaricus OLL1073R-1株の混合凍結スターターによる、イノシン酸ナトリウムを含む発酵系での発酵レベルを酸度を指標として示す図である。白ひし形: 発酵ベースにイノシン酸ナトリウムを添加、黒ひし形: スターター凍結時にイノシン酸ナトリウムを添加。

【図21】S. thermophilus OLS3059株とL. bulgaricus OLL1073R-1株の混合凍結スターターによる、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を含む発酵系での発酵レベルを酸度を指標として示す図である。白ひし形: 発酵ベースにイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（「１：１混合物」）を添加、黒ひし形: スターター凍結時にイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を添加。

【図22】S. thermophilus OLS3294株とL. bulgaricus OLL1255株の混合凍結スターターによる、イノシン酸ナトリウムを含む発酵系での発酵レベルを酸度を指標として示す図である。白ひし形: 発酵ベースにイノシン酸ナトリウムを添加、黒ひし形: スターター凍結時にイノシン酸ナトリウムを添加。

【図23】S. thermophilus OLS3294株とL. bulgaricus OLL1255株の混合凍結スターターによる、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を含む発酵系での発酵レベルを酸度を指標として示す図である。白ひし形: 発酵ベースにイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（「１：１混合物」）を添加、黒ひし形: スターター凍結時にイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を添加。

【図24】各種混合比率のアデノシンとグアノシンの混合物についてのS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。白丸: 対照、白ひし形: 10:0、黒丸: 7:3、黒四角: 5:5、黒ひし形: 3:7。

【図25】各種混合比率のイノシンとグアノシンの混合物についてのS. thermophilus発酵促進効果の試験結果を示す図である。白丸: 対照、白ひし形: 10:0、黒丸: 7:3、黒四角: 5:5、黒ひし形: 4:6。

【図26】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1株、Ｂ：Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2693株。

【図27】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus gasseri OLL2716株、Ｂ：Lactobacillus helveticus OLL1482株。

【図28】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactococcus lactis subsp. lactis OLS3445株、Ｂ：Leuconostoc lactis OLS5167株。

【図29】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus acidophilus OLL1836株、Ｂ：Lactobacillus johnsonii OLL2725株。

【図30】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus casei OLL2230株、Ｂ：Lactobacillus fermentum OLL2690株。

【図31】各種乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactococcus lactis subsp. diacetylactis OLS3021株、Ｂ：Lactococcus lactis subsp. cremoris OLS3313株。

【図32】Lactobacillus delbrueckii菌株に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1181株、Ｂ：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1255株。黒四角:イノシン酸ナトリウム（0.002%）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図33】Lactobacillus delbrueckii菌株に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2708株、Ｂ：Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii OLL203471株。黒四角:イノシン酸ナトリウム（0.002%）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図34】Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus OLL203412株に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を示す図である。黒四角:イノシン酸ナトリウム（0.002%）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図35】Lactobacillus種の菌株に対するイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus acidophilus OLL1846株、Ｂ：Lactobacillus johnsonii OLL203276株。黒四角:イノシン酸ナトリウム（0.002%）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図36】Lactobacillus種の菌株に対する、アデニル酸、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1株、Ｂ：Lactobacillus gasseri OLL2716。黒四角:AMP（0.05mmol/kg）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図37】Lactobacillus種の菌株に対する、アデニル酸、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactobacillus acidophilus OLL1836株、Ｂ：Lactobacillus johnsonii OLL2725株。黒四角:AMP（0.05mmol/kg）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図38】Lactobacillus helveticus OLL1482株に対する、アデニル酸、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を示す図である。黒四角:AMP（0.05mmol/kg）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【図39】各種乳酸菌株に対する、アデニル酸、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を示す図である。Ａ：Lactococcus lactis subsp. lactis OLS3445株、Ｂ：Leuconostoc lactis OLS5167株。黒四角:AMP（0.05mmol/kg）、黒三角: イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（0.025%）、白丸: 対照。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物が、乳酸菌による発酵を促進する作用を有するという、本発明者らが見出した知見に基づく。本発明は、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を含む、乳酸菌用の発酵促進剤に関する。

【0015】

「プリン骨格を有する化合物」とは、以下の構造（プリン骨格）：

【化1】

（式I中の数字は炭素原子又は窒素原子の位置番号を表す）
を基本骨格として有する物質を指す。プリン骨格を有する化合物は、一般にプリン体とも総称される。プリン骨格を有する化合物としては、典型的には、プリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、又はそれらの塩が挙げられる。

【0016】

本発明の発酵促進剤の有効成分として用いる、プリン骨格を有する化合物は、プリン骨格の２位の炭素原子（上記式I中、2で表す炭素原子）に水素原子が結合したプリン骨格を有する。そのような化合物としては、アデニン及びヒポキサンチン（プリン塩基）、アデニン又はヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシド、アデニン又はヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオチド、並びにそれらの塩が挙げられる。

【0017】

プリンヌクレオシドは、プリン塩基と糖（リボース、又はデオキシリボース等）が結合した物質であり、リボヌクレオシドであってもデオキシリボヌクレオシドであってもよい。アデニン又はヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシドとしては、例えば、アデノシン及びイノシン（リボヌクレオシド）、並びにデオキシアデノシン及びデオキシイノシン（デオキシリボヌクレオシド）が挙げられる。

【0018】

プリンヌクレオチドは、プリンヌクレオシドに１つ以上のリン酸基が結合した物質であり、リボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよい。プリンヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸（ヌクレオシドモノリン酸）、ヌクレオシド二リン酸、又はヌクレオシド三リン酸であってよい。アデニン又はヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオチドとしては、例えば、アデニル酸（アデノシン一リン酸又はアデノシンモノリン酸；AMP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン三リン酸（ATP）、デオキシアデノシン一リン酸（dAMP）、デオキシアデノシン二リン酸（dADP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、イノシン酸（イノシン一リン酸又はイノシンモノリン酸；IMP）、イノシン二リン酸（IDP）、イノシン三リン酸（ITP）、デオキシイノシン一リン酸（dIMP）、デオキシイノシン二リン酸（dIDP）、及びデオキシイノシン三リン酸（dITP）が挙げられる。

【0019】

本発明における、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、プリン塩基、プリンヌクレオシド、又はプリンヌクレオチドの誘導体も包含する。本発明において「誘導体」とは、プリン塩基、プリンヌクレオシド若しくはプリンヌクレオチドのプリン塩基部分、糖残基部分、及び／又リン酸基部分を化学修飾した又は置換基を導入した化合物をいう。

【0020】

本発明における、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、塩、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、又はアデニン若しくはヒポキサンチンを構成要素として含むプリンヌクレオシド若しくはプリンヌクレオチドの塩であってよい。本発明において、特に好ましい塩はアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）であり、例えばアデニル酸ナトリウム及びイノシン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0021】

一実施形態では、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、イノシン酸、及びそれらの塩からなる群から選択されるものであり得る。

【0022】

本発明の発酵促進剤は、上記の２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を少なくとも１種、好ましくは１〜４種、例えば１〜３種又は１〜２種含むものであってよい。

【0023】

本発明の発酵促進剤は、一実施形態では、ピリミジン骨格を有する化合物（例えば、チミン、シトシン、ウラシル、及び5'-メチルシトシン、並びにそれらを構成要素として含むヌクレオシド及びヌクレオチド等；プリン骨格を有する化合物を除く）を含まない。本発明の発酵促進剤は、２位の炭素原子にアミノ基又は酸素原子が結合したプリン骨格を有する化合物（例えば、グアニン、グアノシン、デオキシグアノシン、グアニル酸、キサンチン、若しくは尿酸、又はそれらの塩など）を含んでもよいが含まなくてもよい。本発明の発酵促進剤が、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物と２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物とを含む場合には、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物の量（g）は、当該化合物と２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物との総重量（g）に対して30重量％以上、好ましくは40重量％以上、より好ましくは50重量％以上、かつ100重量％未満とすることが好ましい。例えば、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物と、２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物は、1：1.5〜1.5：1の混合比（重量比）で発酵基質に添加してもよい。

【0024】

一実施形態では、本発明の発酵促進剤は、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、及びイノシン酸からなる群から選択されるいずれか、又はその塩）と、グアニル酸又はその塩とを含んでもよい。塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の発酵促進剤は、例えば、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの両方（例えば、１：１の配合比で）を含んでもよい。

【0025】

本発明の発酵促進剤は、有効成分として、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物のみを含むものであってもよい。本発明の発酵促進剤は、一例では、有効成分としてイノシン酸ナトリウムのみを含むものであってもよい。本発明の発酵促進剤はまた、別の例では、有効成分としてイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの混合物（例えば、１：１混合物）のみを含むものであってもよい。本発明の発酵促進剤の別の例では、有効成分としてアデニル酸のみを含むものであってもよい。

【0026】

本発明の発酵促進剤は、２種の核酸塩基、１種のリボヌクレオシド及び２種のデオキシヌクレオシドの組み合わせ、例えばグアニン、チミン、シチジン、2'-デオキシアデノシン及び2'-デオキシウリジンの組み合わせを含む必要はなく、本発明の発酵促進剤の好ましい実施形態では、当該組み合わせを含まない。

【0027】

本発明で用いる２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤は、乳酸菌の発酵を促進することができる。

【0028】

当該化合物又は本発明の発酵促進剤を添加した発酵基質において乳酸菌を培養し発酵させて、その発酵状態の進行を示す指標を経時的に調べ、その結果、対照（２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤を添加しない群）と比較して発酵がより速く進行している場合には、当該化合物又は発酵促進剤が発酵促進作用を有することを確認することができる。発酵状態の進行を示す指標として、例えば、乳酸菌が発酵により生成する乳酸の量の増加、乳酸量の増加に伴う発酵物の酸度の上昇又はpH値の低下を用いることができるが、指標はこれらに限定されるわけではない。対照と比較して発酵状態の進行を示す指標値が向上し、対照と比較したその指標値の差が、発酵中に（好ましくは少なくとも２時間にわたって）経時的に拡大し、その後も一定時間（例えば、少なくとも１時間以上）にわたり対照と比較して向上した指標値を示した場合には、当該化合物又は発酵促進剤が乳酸菌に対する発酵促進作用を有すると判断することができる。発酵物の酸度（乳酸の重量パーセント濃度）は、例えば、発酵物にフェノールフタレインを徐々に滴下し、薄く赤色に呈色する（約pH 8.5）までに要した0.1N NaOH（=0.1mol/L NaOH）の量を決定し、そこから常法により算出することができる。またL-乳酸濃度は、例えば温度40℃、移動相2mM CuSO₄ (II)・5H₂O及び5% 2-プロパノールを用いた、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって測定することができる。具体的な試験手順については後述の実施例の記載を参照することができる。

【0029】

なお２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物及び本発明の発酵促進剤は、ストレプトコッカス属菌やラクトバチルス属菌などを含む乳酸菌、例えばストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスに対する凍結保護効果を有する必要はなく、乳酸菌に対する凍結保護効果を有しないものであってもよい。

【0030】

本発明は、乳酸菌の発酵を促進するための、本発明で用いる２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物にも関する。

【0031】

本発明の乳酸菌用の発酵促進剤は、他の成分、典型的には、担体、賦形剤、又は保存剤などの食品又は食品添加物の製造技術分野において使用される補助剤をさらに含んでもよい。乳酸菌用の発酵促進剤は、液体、粉末、顆粒、ゲル、固体、カプセル封入体などの任意の形態であってよい。溶媒への溶解、粉末化、顆粒化、ゲル化、固体化、カプセル封入などは公知の製剤技術に従って実施することができる。

【0032】

本発明において用いる、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤は、乳酸菌による発酵に利用可能な任意の発酵基質の発酵のために用いることができる。例えば、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又はそれを含む本発明の発酵促進剤は、乳又は乳由来産物を含む発酵基質の発酵に用いるためのものであってよい。

【0033】

本発明は、上記の２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤を用いて、乳酸菌による発酵を促進する方法を提供する。より具体的には、本発明は、当該化合物又は本発明の発酵促進剤を発酵基質に添加し、その発酵基質において乳酸菌を培養し発酵基質を発酵させることを含む、乳酸菌による発酵を促進する方法を提供する。あるいは本発明は、当該化合物又は本発明の発酵促進剤を発酵基質に添加し、その発酵基質において乳酸菌を培養し発酵させることを含む、乳酸菌を用いた発酵方法にも関する。本発明はまた、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を発酵基質に添加し、その発酵基質において乳酸菌を培養し、乳酸菌によって産生された乳酸菌生産物を回収することを含む、乳酸菌生産物の製造方法にも関する。これらの方法において、乳酸菌は、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤を発酵基質に添加する前に発酵基質に接種してもよいし、発酵基質に添加するのと同時又はそれよりも後に発酵基質に接種してもよい。

【0034】

本発明において「発酵基質」とは、乳酸菌の発酵に利用可能な基質化合物（糖質等）又は基質材料を意味する。発酵基質としては、以下に限定されないが、乳、乳由来産物、穀物糖化物、豆乳、大豆抽出物、果実、野菜、果汁、野菜汁、果実若しくは野菜抽出物、又はそれらの少なくとも１つを含む発酵ベース（例えばヨーグルトベース）などが挙げられる。本発明における「乳」は、生乳、成分調整（成分標準化）後の生乳、乳脂肪分を除去又は低減した乳（脱脂乳など）、脱脂粉乳及び全脂粉乳等の粉乳、還元脱脂乳、希釈乳、濃縮乳、及び他の加工乳などを含む。「乳」は、均質化、殺菌・冷却、及び／又はろ過等の食品製造で使用される事前処理を行ってもよい。本発明における「乳」は、任意の非ヒト哺乳動物の乳（動物乳）であってよく、例えば、牛乳、山羊乳、水牛乳、馬乳、ラクダ乳、羊乳等であってよい。「乳由来産物」は、ラクトースを含有するものであってもなくてもよいが、ラクトースを含有するものが好ましい。「乳由来産物」としては、カード（凝乳）、クリーム、バターミルク、バターミルクパウダー、ホエー、乳タンパク質（カゼイン、ホエータンパク質等）及びその分解物（カゼイン分解ペプチド等）などが挙げられる。本発明においては、１種又は２種以上の発酵基質を組み合わせて用いてもよい。

【0035】

本発明の方法において、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物は、少なくとも１種、好ましくは１〜４種、例えば１〜３種又は１〜２種を、発酵基質に添加すればよい。

【0036】

２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤は、発酵基質の総重量（g）に対し、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物（g）が典型的には0.0001重量％以上、20重量％以下、好ましくは0.0001〜10重量％、より好ましくは0.0001〜1重量％、例えば0.0005〜0.1重量％となる量で添加することができるが、この量に限定されない。その添加量は、２種以上の当該化合物を使用する場合は、それらの合計量である。なお総重量に対する当該化合物の重量％の単位を、%（wt/wt）、wt/wt（%）又はw/w%と表記することができる。本発明の上記化合物又は発酵促進剤は、ごく少量の添加で乳酸菌の発酵を促進できる。このことは、発酵食品の製造コストを抑えることができるだけでなく、発酵食品の風味への雑味などの影響も顕著に低減又は阻止することができる。

【0037】

本発明の方法の一実施形態では、ピリミジン骨格を有する化合物（例えば、チミン、シトシン、ウラシル、及び5'-メチルシトシン、並びにそれらを構成要素として含むヌクレオシド及びヌクレオチド等；プリン骨格を有する化合物を除く）を発酵基質に添加しない。本発明の一実施形態では、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物に加えて、上述のような、２位の炭素原子にアミノ基又は酸素原子が結合したプリン骨格を有する化合物を発酵基質に添加してもよいが添加しなくてもよい。本発明の方法において、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物と、２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物の両方を発酵基質に添加する場合には、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物の添加量を、当該化合物と２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物（g）との総重量（g）に対して30重量％以上、好ましくは40重量％以上、より好ましくは50重量％以上、かつ100重量％未満とすることが好ましい。例えば、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物と、２位の炭素原子にアミノ基が結合したプリン骨格を有する化合物を、1：1.5〜1.5：1の混合比（重量比）で発酵基質に添加してもよい。

【0038】

本発明の方法の一実施形態では、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、アデノシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシイノシン、アデニル酸、及びイノシン酸からなる群から選択されるいずれか、又はその塩）又はそれを含む発酵促進剤と、グアニル酸又はその塩を発酵基質に添加してもよい。

【0039】

本発明の方法では、２種の核酸塩基、１種のリボヌクレオシド及び２種のデオキシヌクレオシドを組み合わせて発酵基質に添加する必要はなく、特に、グアニン、チミン、シチジン、2'-デオキシアデノシン及び2'-デオキシウリジンを組み合わせて発酵基質に添加することはしない。

【0040】

一実施形態では、本発明の方法において、イノシン酸ナトリウム、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの混合物（例えば、１：１混合物）を発酵基質に添加してもよい。

【0041】

上記の２位の炭素原子にアミノ基又は酸素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤は、様々な乳酸菌による発酵を促進することができる。本発明において発酵に用いる乳酸菌は動物由来のものであっても植物由来のものであってもよい。

【0042】

好ましい乳酸菌の例としては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属菌が挙げられる。好ましいストレプトコッカス属菌として、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus又はS. thermophilus）などのトレプトコッカス種が挙げられるが、これに限定されない。ストレプトコッカス・サーモフィルス株の例としては、例えば、S. thermophilus OLS3059株（受託番号FERM BP-10740）、S. thermophilus OLS3294株（受託番号NITE P-77）、S. thermophilus OLS3289株（ATCC 19258）、S. thermophilus OLS3469株（IFO 13957 / NBRC 13957）、S. thermophilus OLS3058株、及びS. thermophilus OLS3290株（受託番号FERM BP-19638）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0043】

S. thermophilus OLS3059株は、1996年2月29日付け（原寄託日）で独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室）に、受託番号FERM BP-10740の下でブタペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は2006年11月29日に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

【0044】

S. thermophilus OLS3294株は、2005年2月10日付け（寄託日）で独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）に、受託番号NITE P-77の下で寄託されている。

【0045】

またS. thermophilus OLS3290株は、2004年1月19日付け（原寄託日）で独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）に、受託番号FERM BP-19638の下でブタペスト条約に基づき国際寄託されている。なお本寄託株は2013年9月6日付の移管請求に基づき、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

【0046】

S. thermophilus OLS3289株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection; ATCC）から、受託番号ATCC 19258の下で入手することができる。

【0047】

S. thermophilus OLS3469株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8）から、受託番号NBRC 13957の下で入手することができる。

【0048】

好ましい乳酸菌のさらなる例としては、ラクトバチルス（Lactobacillus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、及びロイコノストック（Leuconostoc）属菌が挙げられるが、これに限定されない。ラクトバチルス属菌の例としては、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、及びラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）などのラクトバチルス種が挙げられるが、これらに限定されない。ラクトバチルス・デルブルッキーの例としては、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス； ラクトバチルス・ブルガリクスとも称される）、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス）、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・デルブルッキー）、Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・インディクス）が挙げられるが、これらに限定されない。ラクトコッカス・ラクティスの例としては、Lactococcus lactis subsp. lactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Lactococcus lactis subsp. diacetylactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ジアセチラクティス）、及びLactococcus lactis subsp. cremoris（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）が挙げられるが、これらに限定されない。ラクトコッカス属種の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス種が挙げられるが、これに限定されない。ロイコノストック属菌の例としては、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）などのロイコノストック種が挙げられるが、これに限定されない。ラクトバチルス属菌、ラクトコッカス属菌、又はロイコノストック属菌の例としては、以下に限定されないが、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1株、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2693株、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1181株、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1255株、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2708株、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii OLL203471株、Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus OLL203412株、Lactobacillus helveticus OLL1482株、Lactobacillus acidophilus OLL1836株、Lactobacillus acidophilus OLL1846株、Lactobacillus johnsonii OLL2725株、Lactobacillus casei OLL2230株、Lactobacillus fermentum OLL2690株、Lactobacillus gasseri OLL2716株、Lactobacillus johnsonii OLL203276株、Lactococcus lactis subsp. lactis OLS3445株、Lactococcus lactis subsp. diacetylactis OLS3021株、Lactococcus lactis subsp. cremoris OLS3313株、Leuconostoc lactis OLS5167株等が挙げられる。

【0049】

以下の表１に示す株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室）又は独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。

【0050】

【表1】

【0051】

またLactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2693株、Lactobacillus helveticus OLL1482株、Leuconostoc lactis OLS5167株、Lactobacillus acidophilus OLL1836株、Lactobacillus johnsonii OLL2725株、Lactobacillus casei OLL2230株、Lactobacillus fermentum OLL2690株、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis OLL2708株、Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii OLL203471株、Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus OLL203412株、Lactobacillus acidophilus OLL1846株、Lactobacillus johnsonii OLL203276株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC）微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）（RIKEN BRC-JCM、日本）から、それぞれ受託番号JCM1148、JCM1120T、JCM6123T、JCM1132T、JCM2012T、JCM1124T、JCM1120T、JCM1557、JCM20075、JCM15610T、JCM1023、JCM1022Tの下で入手することができる。

【0052】

乳酸菌の発酵（培養）条件は常法に従って設定することができる。例えば、発酵は通常は35〜50℃、例えば40℃〜45℃で行うことができる。発酵時間は、発酵基質や発酵条件によって異なるが、例えば2〜24時間程度とすることができる。必要に応じて発酵前に発酵基質のpHを適宜調整（例えばpH 6.5付近に調整）してもよい。

【0053】

乳酸菌は、常法に従って調製することができる。乳酸菌の接種量は、乳酸菌の発酵に使用できる任意の接種量であってよいが、例えば、発酵基質の総重量（g）に対する接種量（ml）の比率で0.01〜％（v/w%）の範囲で設定することができる。なお総重量に対する体積の比率（％）（v/w%）を、%（vol/wt）又はvol/wt（%）と表記することがある。上記化合物又は本発明の発酵促進剤は乳酸菌の発酵を顕著に促進できるため、乳酸菌の接種量は、例えば一般的な接種量（接種菌数）の1/10〜2/3程度に低減することもできる。

【0054】

本発明の方法では、少なくとも１つの菌株の乳酸菌を用いる。乳酸菌としては、上述の乳酸菌、例えば、ストレプトコッカス属菌、ラクトバチルス属菌、ラクトコッカス属菌及びロイコノストック属菌からなる群から選択される少なくとも１つを含む乳酸菌を用いることができる。

【0055】

本発明の方法では、２種以上及び／又は２以上の菌株の乳酸菌を混合培養（共培養）することも好ましい。例えば、本発明の方法では、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスを混合培養することも好ましい。２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤は、乳酸菌の混合培養、例えばストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスの混合培養においても、それら乳酸菌による発酵を促進することができる。好ましい実施形態では、乳酸菌の混合培養、例えばストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスの混合培養を、乳又は乳由来産物を含む発酵基質を用いて行う。

【0056】

世界的にヨーグルトは様々な乳酸菌又は酵母を用いて製造されているが、一般的なヨーグルトの製造においては、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスの混合培養（混合発酵）を行う。ストレプトコッカス・サーモフィルスは、モッツァレラチーズなどの各種チーズを始めとする発酵食品の製造にもしばしば利用されている。ラクトバチルス種、ラクトコッカス種、及びロイコノストック種の乳酸菌は、発酵乳（ヨーグルト）、チーズ、発酵クリーム、発酵バター、パン、発酵野菜、乳酸菌発酵物含有飲料、アルコール飲料等の発酵食品の製造に利用されている。本発明の乳酸菌の発酵促進方法は、発酵食品の製造を効率化する上でも非常に有用である。本発明は、本発明の乳酸菌の発酵促進方法により、発酵基質を発酵させて発酵食品を製造する方法も提供する。なお、発酵食品の製造において、乳酸菌、例えばストレプトコッカス・サーモフィルスは一般的にスターターとして用いられる。発酵食品に用いる発酵基質は、それ自体可食性（例えば、ヒト又は家畜等の非ヒト哺乳動物にとって）のものが好ましい。発酵食品の製造方法において、１種又は２種以上の発酵基質を組み合わせて用いてもよい。

【0057】

好ましい実施形態では、本発明は、本発明の乳酸菌の発酵促進方法により、乳又は乳由来産物を含む発酵基質の発酵を行うことを含む、乳発酵食品の製造方法に関する。乳又は乳由来産物を含む発酵基質は、乳又は乳由来産物それ自体であってもよい。乳、及び乳由来産物の定義は上述のとおりである。乳又は乳由来産物を含む発酵基質はまた、乳又は乳由来産物に、他の基質化合物（糖質等）若しくは基質材料、又は他の成分を加えたものであってもよい。この方法で製造される発酵食品（乳発酵食品）としては、以下に限定されないが、例えば、発酵乳、乳酸菌発酵物含有飲料、チーズ、発酵クリーム、発酵バター等が挙げられる。本発明において発酵乳とは、乳酸菌又は乳酸菌と他の発酵微生物（典型的には、酵母）を用いて乳を発酵させたものをいう。発酵乳としては例えばヨーグルトなどが挙げられる。チーズとしては、例えば、モッツァレラチーズ、カマンベールチーズ、クワルクチーズ、ゴーダチーズ、チェダーチーズが挙げられる。この乳発酵食品の製造方法では、１種又は２種以上の発酵基質を組み合わせて用いてもよく、例えば、２種以上の乳、例えば生乳と脱脂粉乳を含む発酵基質を用いてもよい。あるいは、発酵基質として乳と乳由来産物を組みあわせて用いてもよく、例えば、生乳と脱脂粉乳とホエイタンパク質を組み合わせて用いてもよい。さらに、乳又は乳由来産物を含む発酵基質と、乳又は乳由来産物を含まない発酵基質とを組み合わせて用いてもよい。これらの発酵基質に必要量の水や、甘味料等の他の成分を添加して混合した発酵ベースも、発酵基質として用いることができる。

【0058】

本発明に係る発酵食品（例えば乳発酵食品）の製造方法は、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤を適当量で発酵系に添加して乳酸菌の発酵を促進させる点を除いて、基本的に、従来の発酵食品の製造方法と同様の方法で実施することができる。発酵を、それぞれの発酵食品に適した状態まで完了させた後、発酵物を加工、容器充填等して発酵食品を製造すればよい。例えば、発酵乳は、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を上記の発酵促進方法に従って添加した乳に、乳酸菌を接種して発酵させることにより製造することができる。一般的なヨーグルトは、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を上記の発酵促進方法に従って添加した乳に、ストレプトコッカス・サーモフィルスと乳酸桿菌属菌（典型的にはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス）を接種してそれらの混合培養で乳を発酵させることにより製造することができる。但しヨーグルトを始めとする発酵乳の製造手順はこれらに限定されるものではない。

【0059】

本発明に係る発酵食品の製造方法においては、発酵食品（例えば乳発酵食品）の製造に使用されることが公知の乳酸菌を好適に使用することができる。

【0060】

発酵食品（例えば、乳発酵食品）の製造においては、適切な段階で、発酵基質以外に他の原料を添加してもよい。他の原料としては、甘味料（ショ糖、ステビア、スクラロース等）、酸味料、保存料、香料、増粘剤、乳酸カルシウム等の食品添加物、寒天、ゼラチン、果汁、果肉、果実ソース、クリーム、アロエ葉肉、ジャム等が挙げられるが、これらに限定されない。雑味の増加を避けるためには、ビフィズス菌増殖促進剤として知られる酵母エキスは通常は添加しないことが好ましい。

【0061】

ヨーグルトなどの発酵乳の製造は、前発酵タイプと後発酵タイプのいずれの方法で行ってもよい。前発酵タイプの場合、乳に乳酸菌（スターター）を接種し、発酵を完了させた後で、容器に充填する。容器への充填前に、均質化、果肉等の他の原料の添加、フリージング等を行ってもよい。後発酵タイプの場合、乳、乳酸菌及び他の原料を容器に充填した後で発酵させる。発酵乳の製造に使用される複数の乳酸菌、例えばストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス等の乳酸桿菌属菌の混合培養は、通常は、通常は35〜50℃、例えば40℃〜45℃で行うことができる。発酵乳の場合、以下の方法に限定されないが、通常は酸度が0.7〜0.8%に達するまで発酵させた後、10℃以下まで冷却して発酵を停止させる。発酵時間は例えば1〜24時間、より一般的には3〜7時間程度とすることができる。

【0062】

チーズは、典型的には、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を上記の発酵促進方法に従って添加した乳にチーズの製造に使用される乳酸菌、例えばストレプトコッカス・サーモフィルスを含む乳酸菌をスターターとして接種して発酵させ、次いでレンネット（凝乳酵素）を添加することにより、乳を凝固させ、その凝固物（カード）をホエーから分離し、成形、殺菌、及び／又は発酵・熟成等することにより、製造することができる。しかしチーズの製造手順はこれに限定されるものではない。

【0063】

本方法によれば、乳酸菌による発酵を顕著に促進できることから、２位の炭素原子に水素原子が結合したプリン骨格を有する化合物又は本発明の発酵促進剤を使用しない場合と比較して、発酵時間を短縮化することができる。例えば、本方法によるヨーグルトなどの発酵乳の製造においては、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を使用しない場合と比較して、発酵時間を好ましくは1〜4時間短縮しうるが、発酵条件等に応じて変化するため短縮時間はこれに限定されない。本方法によれば、乳発酵食品の製造における発酵工程を早期に完了することができ、乳発酵食品の製造を効率化することができる。

【0064】

このような本発明の方法を用いれば、上記化合物又は本発明の発酵促進剤を添加しない点以外は同様に製造された発酵食品（例えば乳発酵食品）と比較して、風味（酸味、甘味、また苦みやえぐ味の有無等）、物性（滑らかさ、硬さ等）などの点においてほとんど差がないか又は優れた乳発酵食品を製造することができる。

【実施例】

【0065】

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0066】

［実施例１］イノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの混合物の発酵促進効果の評価
本実施例では、イノシン酸ナトリウムと、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の２種の被験物質について、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus又はS. thermophilus）に対する発酵促進効果を調べた。

【0067】

上記被験物質を、それぞれ、UHT殺菌乳（UHT法（超高温殺菌法）で殺菌した牛乳；130℃、2秒殺菌）に添加し、43℃に加温した。イノシン酸ナトリウムは、0.0001%、0.0002%、0.0004%、0.001%、又は0.002%（それぞれ、%（wt/wt））で、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物は0.0001%、0.0002%、0.0005%、又は0.001%（それぞれ、%（wt/wt））でUHT殺菌乳に添加した。加温後のUHT殺菌乳に、ストレプトコッカス・サーモフィルスOLS3059株（受託番号FERM BP-10740）をスターターとして1%（vol/wt）（菌体濃度で1〜2×10⁷cfu/mL）の接種量で接種して43℃で発酵を開始した。対照として、上記被験物質を添加していないUHT殺菌乳での発酵も実施した。なお、S. thermophilus OLS3059株はMRS（Difco）を用いて37℃で16時間の培養により得た菌体を使用した。MRSでの培養後、遠心分離（8000 g × 5分）で菌体を回収し、0.8%の食塩水に菌体を懸濁して得られた菌液（菌体濃度1〜2×10⁹cfu/mL）をスターターとした。S. thermophilusを用いる以降の実施例では、特に記載の無い限り、同じ方法で調製したS. thermophilus菌液をスターターとして使用している。

【0068】

発酵液のpHを経時的に測定した。乳酸菌培養培地や発酵液におけるpHの低下は、乳酸菌の発酵に伴う乳酸産生量の増加を意味し、乳酸菌の発酵の進行度の指標として用いられている。測定結果を図１及び図２に示す。

【0069】

イノシン酸ナトリウムは、添加率0.0001%（wt/wt）でも、対照と比較したpH低下が認められ、発酵促進効果を示した。さらに、添加率の上昇に伴い、イノシン酸ナトリウムの発酵促進効果は増大した（図１）。イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物は、この試験では、添加率0.0002%（wt/wt）以上で発酵促進効果を示し、添加率の上昇に伴い、発酵促進効果も増大した（図２）。

【0070】

このことから、イノシン酸、及びイノシン酸とグアニル酸の１：１混合物は、S. thermophilusに対する発酵促進効果を有することが示された。

【0071】

次に、これらの被験試料をさらに高濃度で使用した場合の発酵促進効果を調べた。イノシン酸ナトリウムを0.1%、0.5%、又は1%（wt/wt）で、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を0.1%、又は1%（wt/wt）でUHT殺菌乳に添加した。その結果、UHT殺菌乳のpHが上昇したため、乳酸を用いてUHT殺菌乳のpHを6.5付近に調整してから、上記と同様の方法で発酵を行った。

【0072】

発酵液のpHを経時的に測定した結果、イノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物は共に、高い添加率0.1〜1%（wt/wt）でも明確な発酵促進効果を示した（図３、図４）。

【0073】

［実施例２］プリン塩基、ピリミジン塩基、及びそれらの誘導体の発酵促進効果の評価
実施例１でイノシン酸、及びイノシン酸とグアニル酸の１：１混合物のS. thermophilusに対する発酵促進効果が示されたことから、他のプリン体についても、S. thermophilusに対する発酵促進効果を調べた。

【0074】

以下の試験では、各被験物質（プリン体）を10 mMとなるように0.1N NaOH溶液に溶解した溶液を、UHT殺菌乳中の各被験物質の濃度が0.05 mmol/kgとなる量でUHT殺菌乳に添加することにより、被験物質を添加したUHT殺菌乳を調製した。また対照として、被験物質（プリン体）を添加していないUHT殺菌乳での発酵も実施した。

【0075】

まず、プリン塩基であるアデニン、及びその誘導体であるアデノシン、デオキシアデノシン、及びアデニル酸（アデノシンモノリン酸；AMP）を被験物質として添加したUHT殺菌乳を、43℃に加温した後、S. thermophilus OLS3059株をスターターとして1%（vol/wt）接種して、43℃で発酵を開始した。発酵液のpHを経時的に測定した。測定結果を図５に示す。その結果、アデニン、アデノシン、デオキシアデノシン、及びAMPは全て、顕著な発酵促進効果を示した（図５）。

【0076】

続いて、プリン塩基であるヒポキサンチン、及びその誘導体であるイノシン、デオキシイノシン、イノシン酸（イノシンモノリン酸；IMP）を被験物質として用いて、上記のアデニン等の場合と同様の方法で発酵促進効果を試験した。測定の結果、図６に示すように、ヒポキサンチン、イノシン、デオキシイノシン、IMPは全て、顕著な発酵促進効果を示した（図６）。

【0077】

また、プリン塩基であるグアニン、その誘導体であるグアノシン及びデオキシグアノシン、またキサンチン、及び尿酸を被験物質として用いて、上記と同様の方法で発酵促進効果を試験した。その結果、図７及び図８に示すように、これらの化合物は発酵促進効果を示さなかった。

【0078】

さらに、ピリミジン塩基であるシトシン、ウラシル、チミン、及びその誘導体であるシチジン、ウリジン、チミジンを被験物質として用いて、上記と同様の方法でS. thermophilusに対する発酵促進効果を試験した。その結果、図９に示すように、シトシン、ウラシル、チミン、シチジン、ウリジン、及びチミジンは全て、発酵促進効果を示さなかった（図９）。

【0079】

［実施例３］各種ストレプトコッカス・サーモフィルス株に対する発酵促進効果
イノシン酸をUHT殺菌乳に0.05 mmol/kgとなるように添加し、43℃に加温した。加温後のUHT殺菌乳にS. thermophilus株を1%（vol/wt）接種して43℃で発酵を開始した。

【0080】

S. thermophilus株としては、S. thermophilus OLS3059株（受託番号FERM BP-10740）、S. thermophilus OLS3294株（受託番号NITE P-77）、S. thermophilus OLS3289株（ATCC 19258）、S. thermophilus OLS3469株（IFO 13957 / NBRC 13957）、S. thermophilus OLS3058株、及びS. thermophilus OLS3290株（受託番号FERM BP-19638）の6株を個別に用いた。

【0081】

なお、S. thermophilus 6株の調製は、実施例１に記載したS. thermophilus OLS3059株の調製法に準じて行った。また同等の菌数が添加されるように、OLS3059株とOLS3294株は1%（vol/wt）、OLS3289株、OLS3469株、OLS3058株は1.5%（vol/wt）、OLS3290株は3%（vol/wt）の量でUHT殺菌乳に接種した。

【0082】

また対照として、イノシン酸を添加していないUHT殺菌乳での発酵も実施した。
発酵液のpHを経時的に測定（モニタリング）した。測定結果を図１０〜１５に示す。試験した全てのS. thermophilus株に対してイノシン酸の発酵促進効果が認められた。

【0083】

このことから、イノシン酸は、各種S. thermophilus株に対して発酵促進効果を発揮することが示された。

【0084】

［実施例４］S. thermophilus とL. bulgaricusの混合発酵における発酵促進効果
本実施例では、ヨーグルトの製造に用いられる菌種ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 以下、L. bulgaricusとも称する）をスターターとして用いた混合培養（共培養）における、プリン体のS. thermophilusに対する発酵促進効果を試験した。

【0085】

被験物質としては、イノシン酸ナトリウム（イノシン酸Na）、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を用いた。

【0086】

２種類のスターターを用いた。１つ目のスターター（スターターＡ）は、S. thermophilus OLS3059株とL. bulgaricus OLL1073R-1株（受託番号FERM BP-10741）を混合して高濃度に培養し、凍結して得たものである。２つ目のスターター（スターターＢ）は、S. thermophilus OLS3294株とL. bulgaricus OLL1255株（受託番号NITE BP-76）を混合して高濃度に培養し、凍結して得たものである。これらのスターターを、表２の配合比に従って調製した発酵ベースに接種した。具体的にはUHT殺菌乳、脱脂粉乳、ショ糖、ステビア及び水（表２）を混合して発酵ベースを調製し、95℃で殺菌した。その後、試験群の発酵ベースにはイノシン酸ナトリウム（イノシン酸Na）、又はイノシン酸Naとグアニル酸ナトリウム（グアニル酸Na）の１：１混合物を添加し、さらにスターターを0.05%（vol/wt）接種した。対照群の発酵ベースにはスターターを0.15%（vol/wt）接種した。スターターの接種後、43℃で発酵を開始した。

【0087】

【表2】

【0088】

発酵開始後、発酵液の酸度を経時的に測定した。具体的には、発酵液9gにフェノールフタレインを0.5 mL添加した後、0.1N NaOHを発酵液が薄く赤色に呈色するまで添加することにより中和滴定を行い、要した0.1N NaOHの全量が乳酸量に相当するものとみなして発酵液中の乳酸濃度（％）を算出し、それを酸度（％）とした。

【0089】

また、発酵開始後の発酵液中のL-乳酸濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて経時的に測定した。用いたHPLC測定条件を表３に示す。

【0090】

【表3】

【0091】

測定結果を図１６〜１９に示す。イノシン酸ナトリウム、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を使用した場合、スターターＡ（図１６）及びスターターＢ（図１７）のいずれを用いた場合でも、スターターを対照群の1/3量しか接種していないにもかかわらず、対照群と比較して発酵液の酸度の上昇が示され、発酵が促進されたことが示された。さらに、イノシン酸ナトリウム、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を使用した場合、スターターＡ（図１８）及びスターターＢ（図１９）のいずれを用いた場合でも、対照群と比較してL-乳酸の産生が促進されたことが示された。S. thermophilusはL-乳酸、L. bulgaricusはD-乳酸を産生することが知られている（微生物, Vol.6, No.1, p2-3 (1990)；モダンメディア, Vol.57, No.10, p277-287 (2011)）。L-乳酸濃度の測定により、S. thermophilus とL. bulgaricusの混合発酵時においてもS. thermophilus単独による発酵量を確認することができる。したがってL-乳酸の産生が促進されたという結果は、S. thermophilus とL. bulgaricusの混合発酵（混合培養）においても、S. thermophilusによる発酵が促進されたことを意味する。

【0092】

このことから、プリン体は、S. thermophilusとL. bulgaricusの混合発酵において、少なくともS. thermophilusの発酵を促進することが明らかとなった。

【0093】

［実施例５］イノシン酸ナトリウムのヨーグルト発酵における風味への影響
被験物質としてイノシン酸ナトリウムを用いて、表４の配合比に従ってヨーグルトを製造した。具体的には、表４中の酵母エキス、イノシン酸ナトリウム及びスターター以外の成分を混合してヨーグルトベースを調製し、95℃で殺菌した後、イノシン酸ナトリウムを添加した（イノシン酸ナトリウム群）。風味の比較のため、イノシン酸ナトリウムの代わりに発酵促進物質として知られている酵母エキスを添加した試験群（酵母エキス群）、イノシン酸ナトリウムも酵母エキスも添加しない対照群も用意した（表４）。これらはスターター接種前に90℃で殺菌した。

【0094】

【表4】

【0095】

L. bulgaricus OLL1255株（受託番号NITE BP-76）とS. thermophilus OLS3294株（受託番号NITE P-77）を混合して高濃度に培養し、凍結して得た凍結スターターを用意した。このスターターを、酵母エキス群とイノシン酸ナトリウム群には0.05%（vol/wt）、対照群には0.15%（vol/wt）接種した。スターター接種後、43℃で発酵液の酸度が0.75％になるまで発酵させ、その後、5℃で冷却し、ヨーグルトを調製した。

【0096】

調製したヨーグルトの風味の評価を、ヨーグルトの官能に長けた5人のパネラーで実施した。ヨーグルトについて、カード物性、酸味、甘味、雑味の各評価項目を５段階評価で評点を付け、各評価項目の対照群の平均評点を１とした場合の酵母エキス群とイノシン酸ナトリウム添加群の平均評点の相対値を算出した。物性の評価は「滑らかさ」と「硬さ」を考慮して評価した。結果を表５に示す。

【0097】

【表5】

【0098】

その結果、これらのヨーグルトに関して、物性、酸味、甘味では差はほとんど見られなかった。雑味は、酵母エキス群のヨーグルトが明らかに劣っていた。一方、イノシン酸ナトリウム群のヨーグルトでは雑味に関して対照群との差はなかった。雑味に関する評価内訳を見ても、酵母エキスを添加して調製したヨーグルトでは明らかに雑味を感じたパネラーが３人いたが、イノシン酸ナトリウムを添加して調製したヨーグルトでは、酵母エキスもイノシン酸ナトリウムも添加せずに調製したヨーグルト（対照）と同様に、雑味を感じたパネラーは1人もいなかった。このようにヨーグルトの風味にほとんど悪影響を与えない点で、イノシン酸ナトリウムは、酵母エキスよりも優れていた。

【0099】

なお、イノシン酸ナトリウム又は酵母エキスを添加した場合のヨーグルトの発酵では、対照の1/3量しかスターターを接種しなかったにもかかわらず、対照よりも、発酵終了までの時間が２時間以上も短縮された。このことは、イノシン酸ナトリウムがヨーグルト生産のための発酵も顕著に促進することを示している。

【0100】

［実施例６］スターターに対するプリン体の凍結保護効果の評価
本実施例では、S. thermophilus とL. bulgaricusの混合スターターに添加したプリン体が凍結保護効果を有するかどうかを調べた。プリン体としてはイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を用いた。

【0101】

S. thermophilus OLS3059株とL. bulgaricus OLL1073R-1株を混合して高濃度培養し、凍結して得た凍結スターター、及びS. thermophilus OLS3294株とL. bulgaricus OLL1255株を混合して高濃度培養し、凍結して得た凍結スターターを使用した。これらの凍結スターターを解凍し、それぞれを以下の３群に分けて、プリン体を添加するか又は添加せずに再凍結した。

【0102】

1) 解凍スターターに何も添加せずにそのまま再凍結（対照）
2) 解凍スターターにイノシン酸ナトリウムを2.8%（wt/wt）添加し、再凍結
3) 解凍スターターにイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を2.8%（wt/wt）添加し、再凍結

【0103】

続いて、1)〜3)群で得られた再凍結スターターを用いて発酵を行い、スターターの発酵能を調べた。発酵ベースは表６の配合比に従い、イノシン酸ナトリウム及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物以外の成分を混合し、95℃で殺菌した後、イノシン酸ナトリウム又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を添加することによって調製した。1)の凍結スターターを、表６のB及びCの配合比に従って調製した発酵ベースに0.05%（vol/wt）接種し、発酵を行った。また、2)又は3)の凍結スターターを、表６のA)の配合比に従って調製した発酵ベースに0.05%（vol/wt）接種し、43℃で発酵を開始した。なお、凍結スターター1)と配合比Bの組合せ（発酵ベースにイノシン酸ナトリウム添加）、凍結スターター2)と配合比Aの組合せ（スターター凍結時にイノシン酸ナトリウム添加）は、いずれも発酵開始時のイノシン酸ナトリウム濃度が0.0014%（wt/wt）である。同様に凍結スターター1)と配合比Cの組合せ（発酵ベースにイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を添加）、凍結スターター3)と配合比Aの組合せ（スターター凍結時にイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を添加）も、発酵開始時のプリン体濃度が同じである。

【0104】

【表6】

【0105】

発酵開始後、発酵液の酸度を経時的に測定した。測定結果を図２０〜２３に示す。S. thermophilus OLS3059株とL. bulgaricus OLL1073R-1株の混合凍結スターターを用いた試験において、凍結スターター1)と配合比Bの組合せと、凍結スターター2)と配合比Aの組合せの間で発酵レベルにほとんど差異はなかった（図２０）。また凍結スターター1)と配合比Cの組合せと、凍結スターター3)と配合比Aの組合せの間でも発酵レベルにほとんど差異はなかった（図２１）。同様に、S. thermophilus OLS3294株とL. bulgaricus OLL1255株の混合凍結スターターを用いた試験においても、凍結スターター1)と配合比Bの組合せと、凍結スターター2)と配合比Aの組合せの間で発酵レベルにほとんど差異はなかった（図２２）。また凍結スターター1)と配合比Cの組合せと、凍結スターター3)と配合比Aの組合せの間でも発酵レベルにほとんど差異はなかった（図２３）。

【0106】

以上の結果から、イノシン酸ナトリウムや、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物は、発酵ベースに添加した場合でも、凍結スターターに添加した場合でも、発酵に対する効果は同等であることが示された。もし、イノシン酸ナトリウムや、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物が乳酸菌に対する凍結保護効果を発揮するのであれば、それを凍結スターターに添加した群では、発酵ベースに添加した群と比較して、発酵がより促進されると考えられる。しかし図２０〜２３に示されるとおり、それらの発酵レベルに差はなかったことから、イノシン酸ナトリウムや、イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物は、乳酸菌に対する凍結保護作用を有さないことが示された。

【0107】

［実施例７］アデノシン又はイノシンとグアノシンとの混合物の発酵促進効果
被験物質として、各種混合比率のアデノシンとグアノシンの混合物、又は各種混合比のイノシンとグアノシンの混合物を用いた点以外は、実施例２と同様の方法で、S. thermophilusに対する発酵促進効果を調べた。

【0108】

用いた被験物質は、アデノシンとグアノシンを、10:0（アデノシン単独）、7:3、5:5、及び3:7の混合比率（重量比）で調製したもの、並びにイノシンとグアノシンを、10:0（イノシン単独）、7:3、5:5、及び4:6の混合比率（重量比）で調製したものである。なお被験物質は、双方の化合物の合計濃度が0.05 mmol/kgとなる量でUHT殺菌乳に添加した。

【0109】

これらの被験物質存在下でのS. thermophilusの発酵において、発酵液のpHを経時的に測定した結果を図２４（アデノシン及びグアノシン）及び図２５（イノシン及びグアノシン）に示す。グアノシンの混合比率が増加するにつれて、発酵促進効果は低下したことから、グアノシンはS. thermophilusに対する発酵促進効果を示さず、アデノシン及びイノシンは濃度依存的に発酵促進効果を示すことが確認された。

【0110】

［実施例８］S. thermophilus以外の乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果−１
表７に示すラクトバチルス（Lactobacillus）属菌、ラクトコッカス（Lactococcus）属菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属菌の発酵における、イノシン酸ナトリウム（イノシン酸Na）の発酵促進効果を調べた。発酵はUHT殺菌乳を用いて43℃で行い、イノシン酸ナトリウムを濃度0.002%（wt/wt）で添加した。スターター（菌体懸濁液）は各菌株を実施例１と同様の方法で調製した。スターターは1％（vol/wt）の接種量で接種した。それ以外は実施例１と同様にして発酵促進効果の評価を行った。

【0111】

【表7】

【0112】

その結果、供試した全ての株に関して、イノシン酸ナトリウムの添加による発酵促進効果が認められた（図２６〜２８）。

【0113】

［実施例９］S. thermophilus以外の乳酸菌に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果−２
表８に示す乳酸菌株の発酵におけるイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果を調べた。発酵はカゼイン分解ペプチド（FrieslandCampaina社、Hyvital^(R) Casein CMA 500）を0.2%（wt/wt）添加したUHT殺菌乳を用いて43℃で行い、イノシン酸ナトリウムを0.002%（wt/wt）（UHT殺菌乳とカゼイン分解ペプチドの合計量に対する%；以下の実施例において同じ）で添加した。また、スターターの調製法及び接種量（%）は実施例１に記載したとおりである。カゼイン分解ペプチドは、アミノ酸の補充のために加えた。それ以外は実施例１と同様にして発酵促進効果の評価を行った。

【0114】

【表8】

【0115】

その結果、供試した全ての株に関して、イノシン酸ナトリウムの添加による発酵促進効果が認められた（図２９〜３１）。

【0116】

［実施例１０］Lactobacillus delbrueckii菌株に対するイノシン酸ナトリウムの発酵促進効果
表９に示すLactobacillus delbrueckii菌株の発酵におけるイノシン酸ナトリウム（イノシン酸Na）、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（１：１混合物とも称する）の発酵促進効果を調べた。発酵はカゼイン分解ペプチド（FrieslandCampaina社、Hyvital^(R) Casein CMA 500）を0.2%（wt/wt）添加したUHT殺菌乳を用いて43℃で行い、イノシン酸ナトリウムを0.002%（wt/wt）、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を0.025%（wt/wt）添加した。スターターの調製法及び接種量（%）は実施例１に記載したとおりである。それ以外は実施例１と同様にして発酵促進効果の評価を行った。

【0117】

【表9】

【0118】

その結果、供試した全ての株に関して、イノシン酸ナトリウム、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の添加による発酵促進効果が認められた（図３２〜３４）。

【0119】

［実施例１１］Lactobacillus種に対するイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果
表１０に示すLactobacillus acidophilus及びLactobacillus johnsonii菌株の発酵におけるイノシン酸ナトリウム、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果を調べた。発酵はカゼイン分解ペプチド（FrieslandCampaina社、Hyvital^(R) Casein CMA 500）を0.2%（wt/wt）添加したUHT殺菌乳を用いて43℃で行い、イノシン酸ナトリウムを0.002%（wt/wt）、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を0.025%（wt/wt）添加した。スターターの調製法及び接種量（%）は実施例１に記載したとおりである。それ以外は実施例１と同様にして発酵促進効果の評価を行った。

【0120】

【表10】

【0121】

その結果、供試した全ての株に関して、イノシン酸ナトリウム、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の添加による発酵促進効果が認められた（図３５）。

【0122】

［実施例１２］各種乳酸菌株に対する、アデニル酸、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の発酵促進効果
表１１に示すLactobacillus種の菌株、表１２に示すLactococcus種及びLeuconostoc種の菌株の発酵におけるアデニル酸（AMP）、及びイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物（１：１混合物とも称する）の発酵促進効果を調べた。なお、本実施例で使用する菌株は実施例８〜１１のいずれかで使用した株である。発酵はカゼイン分解ペプチド（FrieslandCampaina社、Hyvital^(R) Casein CMA 500）を0.2%（wt/wt）添加したUHT殺菌乳を用いて43℃で行い、アデニル酸を0.05 mmol/kg (約0.00174%（wt/wt）)、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物を0.025%（wt/wt）添加した。スターターの調製法及び接種量（%）は実施例１に記載したとおりである。それ以外は実施例１と同様にして発酵促進効果の評価を行った。

【0123】

【表11】

【0124】

【表12】

【0125】

その結果、供試した全ての株に関して、アデニル酸、又はイノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの１：１混合物の添加による発酵促進効果が認められた（図３６〜３９）。

【産業上の利用可能性】

【0126】

本発明によれば、ごく少量でS. thermophilusの発酵を促進できる素材を提供することができる。この素材を用いれば、発酵乳などの発酵食品の風味に雑味などの影響をほとんど与えることなく発酵食品生産において発酵工程を短縮化することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】