特許 6927247 抗体の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6927247

(24)【登録日】2021年8月10日

(45)【発行日】2021年8月25日

(54)【発明の名称】抗体の精製方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/281 20060101AFI20210812BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20210812BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20210812BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20210812BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210812BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/281 R

   B01J20/281 X

   G01N30/88 J

   G01N30/26 A

   C07K16/00

   C12P21/08

【請求項の数】6

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2019-73726(P2019-73726)

(22)【出願日】2019年4月8日

(65)【公開番号】特開2020-171872(P2020-171872A)

(43)【公開日】2020年10月22日

【審査請求日】2020年3月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004455

【氏名又は名称】昭和電工マテリアルズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山下 七重

(72)【発明者】

【氏名】丸山 優史

(72)【発明者】

【氏名】松森 正樹

(72)【発明者】

【氏名】佐久間 広貴

【審査官】 高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５０１５９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５２３９５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１８／０９２６９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１７／１４５５５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１８７２２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−０３６１２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／００ −３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／００ −２０／３４

Ｂ０１Ｄ １５／００ −１５／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の精製方法であって、
抗体を含有するｐＨ４〜８．５の溶液を吸着材に接触させて、前記抗体を前記吸着材に吸着させる第１工程と、
前記吸着材をｐＨ５〜９の溶液に接触させて、前記吸着材を洗浄する第２工程と、
前記吸着材をｐＨ７〜１１の溶液に接触させて、前記吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収する第３工程と、
前記吸着材をｐＨ１１〜１４の溶液に接触させて、前記吸着材を洗浄する第４工程とを含み、
前記第３工程で用いる溶液のｐＨが前記第１工程及び前記第２工程で用いる溶液のｐＨよりも大きく、前記第４工程で用いる溶液のｐＨが前記第３工程で用いる溶液のｐＨよりも大きく、
前記吸着材が、担体と、前記担体に固定化されたｐＨ応答性高分子とを含み、
前記ｐＨ応答性高分子が、複数のアミノ基を有する高分子に前記抗体を吸着する吸着部位が導入されたものであり、前記吸着部位が、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の基

【化1】

（式中、
Ｌは、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基と吸着部位との結合部位であり、
Ｚ_１及びＺ_１０は、互いに独立して、Ｓ、ＳＣＨ_３^＋、ＮＨ、ＮＣＨ_３、Ｏ、ＣＨ_２又はＣＲ_１Ｒ_２であり、但しＲ_１及びＲ_２の少なくとも一方は水素ではなく、
Ｚ_２〜Ｚ_９、Ｚ_１１〜Ｚ_１５は、互いに独立して、Ｎ、ＮＣＨ_３^＋、ＣＨ又はＣＲ_３であり、Ｚ_１〜Ｚ_４の少なくとも１つ、Ｚ_５〜Ｚ_９の少なくとも１つ、又はＺ_１０〜Ｚ_１５の少なくとも１つは、ＣＨ_２、ＣＲ_１Ｒ_２、ＣＨ又はＣＲ_３ではなく、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は、互いに独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシ、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ又はシアノである）
から選ばれる少なくとも１つの基である、抗体の精製方法。

【請求項2】

前記第１工程で用いる抗体を含有する溶液のｐＨがｐＨ５．５〜８．５であり、前記第２工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ６〜８．５であり、前記第３工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ７．５〜１０であり、前記第４工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ１２〜１４である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項3】

前記第１工程で用いる抗体を含有する溶液のｐＨがｐＨ６〜７．５であり、前記第２工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ６〜８であり、前記第３工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ８〜１０であり、前記第４工程で用いる溶液のｐＨがｐＨ１２〜１３である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項4】

前記第１工程で用いる抗体を含有する溶液が、抗体を細胞培養して得た溶液から細胞又はその断片を除去した溶液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の精製方法。

【請求項5】

前記吸着部位が、Ｚ_１０がＳであり、Ｚ_１１〜Ｚ_１４がそれぞれＣＨであり、Ｚ_１５がＮであり、Ｌが、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基と吸着部位との結合部位である、式（ＩＩＩ）の基である、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【請求項6】

前記複数のアミノ基を有する高分子がε−ポリリジンである、請求項１に記載の抗体の精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の精製方法に関し、特に医薬品向け抗体の精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

抗体を標的物質としたアフィニティ精製は、アフィニティ吸着材への抗体の吸着、非吸着成分の洗浄、溶離液による抗体の吸着材からの回収工程を含む。吸着材は、多糖類や樹脂等からなる担体の表面上に、抗体と相互作用を示すリガンドと呼ばれる分子を固定化することで構成される。リガンドとして、例えばプロテインＡ等を用いた例が知られている。このとき、溶離液としては、強酸や強塩基のような過酷なｐＨの溶液又は高塩濃度の溶液を用いる。これは、アフィニティリガンドや抗体のイオン化状態を変え、電荷反発によりアフィニティリガンドと抗体の間の相互作用を弱める必要があるためである。しかし、強酸や強塩基のような過酷なｐＨ環境では、しばしば抗体は不安定であり、精製された抗体が劣化するリスクがある。このようなリスクを回避するため、温和なｐＨ環境にて抗体を精製可能な低刺激応答型アフィニティ吸着材の開発が求められている。

【0003】

このような低刺激応答型アフィニティ吸着材として、ｐＨ変化に応答する吸着材が知られており、例えば、特許文献１には、リガンドとの相互作用を利用して抗体を含有する医薬原料溶液から医薬品としての抗体を得る抗体製造方法において、（１）医薬原料溶液を、微酸性乃至弱酸性で塩を含む条件下、又は中性且つ塩を含まない条件下で複素環式芳香族アミノ酸あるいは複素環式芳香族アミノ酸のオリゴマーをリガンドとして有する不溶性担体に接触させることにより抗体をリガンドに吸着させる第一工程、（２）リガンドへの非吸着成分を除去する第二工程、（３）微酸性乃至弱酸性で第一工程よりも低濃度の塩を含む溶出液、又は微塩基性の溶出液を不溶性担体に接触させることにより吸着抗体をリガンドから解離させる第三工程、をこの順番に含むことを特徴とする抗体製造方法が開示されている。しかし、特許文献１に開示される抗体製造方法では、抗体の吸着量が十分ではない可能性があり、よって、抗体の回収率が十分であるとはいえず、抗体を用いた医薬品の生産性が低くなり得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１１−３６１２８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

前記のとおり、温和なｐＨ環境にて抗体を精製可能な従来の抗体の精製方法には、抗体の吸着材への吸着量及び回収率が十分ではない場合がある。よって、本発明は、抗体の吸着材への吸着量及び回収率が向上した抗体の精製方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

前記課題を解決するために、本発明の抗体の精製方法は、弱刺激で抗体を回収可能な特定の低分子化合物を吸着部位に用い、これを複数のアミノ基を有する高分子に導入し、この吸着部位が導入された高分子を担体に固定化したものを吸着材として用い、この吸着材への抗体の吸着と脱離にあたり、特定の溶液条件を適用することを特徴とする。

【発明の効果】

【0007】

本発明の抗体の精製方法は、特定の吸着材を特定の溶液条件にて用いることで、抗体の吸着材への吸着量及び回収率を向上でき、抗体医薬品の製造コスト低減が可能であり、且つ生産性を向上できる。

【0008】

前記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明の精製方法に用いる吸着材の一実施形態の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更及び修正が可能である。また、本発明を説明するための図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。

【0011】

本発明は、特定の吸着部位を複数のアミノ基を有する高分子に導入したｐＨ応答性高分子を担体に固定化したものを吸着材として用い、特定の溶液条件を適用する、抗体の精製方法に関する。

【0012】

精製する抗体は、医薬品として適用できるものが好ましいが、クラスやサブクラスは特に限定されない。抗体としては、例えば、定常領域の構造が異なるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類の免疫グロブリンが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。ヒト抗体においては、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、またＩｇＡにおいてもＩｇＡ１、ＩｇＡ２と２つのサブクラスがあるが、本発明においてはいずれも用いることができる。さらに抗体は、その由来や製造方法によらずに、天然のヒト抗体や遺伝子組み換え技術により生産された組み換えヒト抗体、あるいはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体の中でも、医薬品原料として重要性がもっとも大きいヒトＩｇＧを用いることが好ましい。また、抗体はヒトＩｇＧとのキメラ又はヒト化抗体であってもよい。本発明において、ヒトＩｇＧとのキメラとは、可変領域はマウス等のヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域をヒト由来の免疫グロブリンに置換したものをいう。また、ヒト化抗体とは、可変領域のうち、相補性決定領域がヒト以外の生物由来で、そのほかのフレームワーク領域をヒト由来にしたものをいう。

【0013】

本発明の精製方法において用いる吸着材は、担体と、担体に固定化されたｐＨ応答性高分子とを含む。ｐＨ応答性高分子は、複数のアミノ基を有する高分子（以下、単に高分子とも記載する）に、標的物質である抗体を吸着する吸着部位（以下、単に吸着部位とも記載する）が導入されたものである。ｐＨ応答性高分子が官能基としてのアミノ基及び吸着部位を有することにより、吸着材は、少なくともｐＨの変化によって抗体と相互作用を示し、抗体を吸着し、さらには抗体を脱離する。

【0014】

図１に、本発明の精製方法に用いる吸着材の一実施形態の模式図を示す。図１に示すように、吸着材１０は、担体５と、担体５に固定化されたｐＨ応答性高分子１とを含む。ｐＨ応答性高分子１は、複数のアミノ基を有する高分子２に、抗体４を吸着する吸着部位３が導入されたものである。なお、図１において、高分子の電荷の状態について一例を示したが、高分子は、吸着材が接触する溶液の塩濃度、誘電率、ｐＨ及び温度等の外部環境によって様々な電荷の状態となり得る。

【0015】

吸着材（図１参照）の推定される吸着・脱離メカニズムを以下に説明する。本発明の抗体の精製方法においては、少なくともｐＨの変化に応答して吸着材のｐＨ応答性高分子のコンフォメーション、並びにｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷が変化することにより、抗体が吸着及び脱離すると考えられる。具体的には、まず、ｐＨ応答性高分子はアミノ基を有するところ、アミノ基の等電点は、約１０程度であることが知られている。本発明の抗体の精製方法において、抗体を吸着材に吸着する第１工程のｐＨ４〜８．５の領域では、ｐＨ応答性高分子の正電荷がより多い状態であり、溶液中で官能基はより電荷を有した状態であり、電荷を有した部位同士の電荷反発により、ｐＨ応答性高分子の高分子主鎖は比較的伸長した状態となると考えられる（図１の左図）。このとき、吸着部位が溶液中に露出することで抗体を吸着する。一方、抗体を吸着材から脱離させ、回収する第３工程において、ｐＨが第１工程及びその後の洗浄工程である第２工程よりも大きくなると、ｐＨの上昇に伴い電荷の中性化が起こり、高分子中のアミノ基由来の電荷が少なくなり、ｐＨ応答性高分子の高分子主鎖は電荷反発が小さくなるため、比較的収縮した状態になると考えられる（図１の右図）。このように、溶液のｐＨを大きくすることにより、ｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化を誘起し、抗体を吸着材から脱離させ、回収する。また、ｐＨの上昇に伴いｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷が変化することにより、電荷反発又は電荷の中性化やｐＨ応答性高分子の疎水度の変化によって、抗体が吸着材から脱離することも考えられる。

【0016】

本発明の精製方法においては、少なくともｐＨの変化に応答して吸着材のｐＨ応答性高分子のコンフォメーション、並びにｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷が変化することを抗体の吸着及び脱離に利用しているが、ｐＨの変化に加えて、例えば、吸着材が接触している溶液の塩濃度、誘電率及び温度の変化等の他の外部環境の変化を加えることにより、ｐＨ応答性高分子のコンフォメーションや、ｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷を変化させてもよい。

【0017】

前記のとおり、本発明の精製方法において用いる吸着材は、担体と、担体に固定化されたｐＨ応答性高分子とを含む。

【0018】

ｐＨ応答性高分子は、複数のアミノ基を有する高分子に標的物質である抗体を吸着する吸着部位が好ましくは複数個導入されたものである。吸着部位は、好ましくは、複数のアミノ基を有する高分子の側鎖のアミノ基と結合している。ｐＨ応答性高分子において、好ましくは、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基の一部が吸着部位と結合している。

【0019】

吸着部位は、吸着する抗体の種類に応じて選ぶことができる。吸着部位は、ｐＨ応答性高分子の電荷密度の変化による物性の変化を受けやすいことが好ましく、親水性のｐＨ応答性高分子に対して疎水性の吸着部位が好ましい。

【0020】

吸着部位は低分子化合物に由来する部位であり、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の基

【0021】

【化1】

（式中、
Ｌは、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基と吸着部位との結合部位であり、
Ｚ_１及びＺ_１０は、互いに独立して、Ｓ、ＳＣＨ_３^＋、ＮＨ、ＮＣＨ_３、Ｏ、ＣＨ_２又はＣＲ_１Ｒ_２であり、但しＲ_１及びＲ_２の少なくとも一方は水素ではなく、
Ｚ_２〜Ｚ_９、Ｚ_１１〜Ｚ_１５は、互いに独立して、Ｎ、ＮＣＨ_３^＋、ＣＨ又はＣＲ_３であり、Ｚ_１〜Ｚ_４の少なくとも１つ、Ｚ_５〜Ｚ_９の少なくとも１つ、又はＺ_１０〜Ｚ_１５の少なくとも１つは、ＣＨ_２、ＣＲ_１Ｒ_２、ＣＨ又はＣＲ_３ではなく、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は、互いに独立して、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシ、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ又はシアノである）
から選ばれる少なくとも１つの基である。

【0022】

本明細書において、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を含む、直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。アルキルは、例えばＣ_１〜２０アルキルであり、好ましくはＣ_１〜１０アルキルであり、より好ましくはＣ_１〜５アルキルである。

【0023】

本明細書において、「アリール」は、６〜１５の炭素原子数を有する芳香族基を意味する。好適なアリールとしては、限定するものではないが、例えばフェニル、ナフチル及びアントリル（アントラセニル）等のＣ_６〜１５アリールを挙げることができる。

【0024】

本明細書において、「アルケニル」は、前記アルキルの１個以上のＣ−Ｃ単結合が二重結合に置換された基を意味する。好適なアルケニルは、限定するものではないが、例えばＣ_２〜２０アルケニルであり、好ましくはＣ_２〜１０アルケニルであり、より好ましくはＣ_２〜５アルケニルである。

【0025】

本明細書において、「アルキニル」は、前記アルキルの１個以上のＣ−Ｃ単結合が三重結合に置換された基を意味する。好適なアルキニルは、限定するものではないが、例えばＣ_２〜２０アルキニルであり、好ましくはＣ_２〜１０アルキニルであり、より好ましくはＣ_２〜５アルキニルである。

【0026】

本明細書において、「アラルキル」（アリールアルキル）は、前記アルキルの水素原子の１個が前記アリールに置換された基を意味する。好適なアラルキルは、限定するものではないが、例えばベンジル、１−フェネチル及び２−フェネチル等を挙げることができる。

【0027】

本明細書において、「アシル」は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｒ_４（Ｒ_４は、例えば前記のアルキル、アリール、アルケニル、アルキニルである）の構造を有する基を意味する。

【0028】

本明細書において、「シクロアルキル」は、特定の数の炭素原子を含む炭素環式基であり、例えばＣ_３〜２０シクロアルキルであり、好ましくはＣ_３〜１０シクロアルキルであり、より好ましくはＣ_３〜８シクロアルキルである。

【0029】

本明細書において、「アミノ」は、−ＮＲ_５Ｒ_６（式中、Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラルキル又はシクロアルキルである）で表される基を意味する。

【0030】

本明細書において、「アリールオキシ」は、ヒドロキシルの水素原子が、前記アリールに置換された基を意味する。好適なアリールオキシは、限定するものではないが、例えばフェノキシ、ビフェニルオキシ、ナフチルオキシ及びアントリルオキシ（アントラセニルオキシ）等のＣ_６〜Ｃ_１５アリールオキシを挙げることができる。

【0031】

本明細書において、「アルコキシ」は、ヒドロキシルの水素原子が、前記アルキルに置換された基を意味する。好適なアルコキシは、限定するものではないが、例えばＣ_１〜２０アルコキシであり、好ましくはＣ_１〜１０アルコキシであり、より好ましくはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等のＣ_１〜５アルコキシである

【0032】

本明細書において、「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。

【0033】

前記で説明した基は、１個若しくは複数個の置換基で置換されていてもよく、置換基としては、特に限定されずに例えば前記のアルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アシル、シクロアルキル、カルボキシル、アミノ、アリールオキシ、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ又はシアノが挙げられる。

【0034】

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）において、Ｌは、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基と吸着部位とが結合した部位である。Ｌは、例えばアミド結合（−ＣＯＮＨ−）、ウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）、尿素結合（−ＮＨＣＯＮＨ−）、チオ尿素結合（−ＮＨＣＳＮＨ−）、スルホンアミド結合（−ＳＯ_２ＮＨ−）、アミドエステル結合（−ＣＯＯＮＨ−）等の結合を含む部分であり、アミド結合を含む部分が好ましい。Ｌは、より好ましくはアミド結合と置換又は非置換アルキレン基とを含む部分であり、特に好ましくはアミド結合とＣ_１〜Ｃ_５非置換アルキレン基とからなる部分である。

【0035】

結合部位Ｌにおいて、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基と吸着部位との結合は、例えば、アミド結合、ウレタン結合、尿素結合、チオ尿素結合、スルホンアミド結合、アミドエステル結合等である。

【0036】

式（Ｉ）において、好ましくはＺ_１〜Ｚ_４の１つ、２つ又は３つは、ＣＨ_２、ＣＲ_１Ｒ_２、ＣＨ又はＣＲ_３ではなく、すなわち、Ｓ、ＳＣＨ_３^＋、ＮＨ、ＮＣＨ_３、Ｏ、Ｎ又はＮＣＨ_３^＋であり、より好ましくはＺ_１〜Ｚ_４の１つ又は２つは、ＣＨ_２、ＣＲ_１Ｒ_２、ＣＨ又はＣＲ_３ではなく、すなわち、Ｓ、ＳＣＨ_３^＋、ＮＨ、ＮＣＨ_３、Ｏ、Ｎ又はＮＣＨ_３^＋である。

【0037】

式（ＩＩ）において、好ましくはＺ_５〜Ｚ_９のうち１つがＮであり、その他はすべてＣＨであり、より好ましくはＺ_５〜Ｚ_９のうちＺ_５又はＺ_７がＮであり、その他はすべてＣＨである。式（ＩＩ）において、好ましくは、Ｌは−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−である。この場合、結合部位−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−において、−ＣＨ_２ＣＯ−部分は吸着部位に由来する部分であり、−ＮＨ−部分は複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基に由来する部分である。すなわち、この基は、（吸着部位の残りの部分）−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−（複数のアミノ基を有する高分子の残りの部分）の構造である。好ましい実施形態では、式（ＩＩ）において、Ｚ_５〜Ｚ_９のうち１つがＮであり、その他はすべてＣＨであり、Ｌは−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−である。より好ましい実施形態では、式（ＩＩ）において、Ｚ_５〜Ｚ_９のうちＺ_５又はＺ_７がＮであり、その他はすべてＣＨであり、Ｌは−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−である（吸着部位１）。

【0038】

式（ＩＩＩ）において、好ましくはＺ_１０はＳであり、Ｚ_１１〜Ｚ_１４はそれぞれＣＨであり、Ｚ_１５はＮである。式（ＩＩＩ）において、より好ましくはＺ_１０はＳであり、Ｚ_１１〜Ｚ_１４はそれぞれＣＨであり、Ｚ_１５はＮであり、Ｌは−ＣＨ_２ＣＯＮＨ−（吸着部位２）若しくは−（ＣＨ_２）_２ＣＯＮＨ−（吸着部位３）である。

【0039】

吸着部位は、好ましくは式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の基であり、より好ましくは式（ＩＩＩ）の基である。吸着部位としては、具体的には、前記の吸着部位１、２又は３が好ましく、前記の吸着部位２又は３がより好ましく、抗体吸着能が高いという観点から吸着部位２が特に好ましい。

【0040】

吸着部位は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の基に対応する化合物を複数のアミノ基を有する高分子と反応させることによって該高分子に導入できる。吸着部位は、好ましくは高分子の側鎖に導入される。吸着部位を導入するために用いられる化合物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の基に対応する化合物であって、高分子のアミノ基と結合可能な部分を有するものであれば特に限定されない。このような化合物としては、例えばアミド結合を形成するためのカルボキシル基、アズラクトン基、イミダゾール基、シアノエステル基、エポキシ基や、アセチル基、アセトキシ基、アクリロイル基、アルコキシ基を有する化合物若しくはカルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、尿素結合を形成するためのイソシアネート基を有する化合物、チオ尿素結合を形成するためのイソチオシアネート基を有する化合物、スルホンアミド結合を形成するための塩化スルホニル基を有する化合物、アミドエステル結合を形成するためのオキサゾリン基を有する化合物等が挙げられる。吸着部位を導入するために用いられる化合物として、具体的には、メルカプトイミダゾール、メルカプトベンゾチアゾール、メルカプトテトラゾールやメルカプトチアジアゾールが挙げられる。より具体的には、ベンゾチアゾール−２−酢酸、４−メルカプトベンゾチアゾール−２−酢酸エチル、５−メルカプトベンゾチアゾール−２−酢酸エチル、２−メルカプトチアゾール、３−（ベンゾチアゾール−２−イルチオ）プロパン−１−スルホン酸ナトリウム、２−メルカプト−６−ニトロベンゾチアゾール、３−（２−ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸、２−メルカプト−１，３，４−チアジアゾール、Ｎ−メチル−２−メルカプトイミダゾール等が挙げられる。吸着部位１に対応するピリジルチオ酢酸（２−ピリジルチオ酢酸、４−ピリジルチオ酢酸）、吸着部位２に対応する２−ベンゾチアゾリルチオ酢酸、吸着部位３に対応する３−（２−ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸が好ましく、２−ベンゾチアゾリルチオ酢酸及び３−（２−ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸がより好ましく、２−ベンゾチアゾリルチオ酢酸が特に好ましい。

【0041】

ｐＨ応答性高分子における吸着部位の導入量は、複数のアミノ基を有する高分子中に含まれるアミノ基の官能基数に対して５％以上であれば十分であるが、吸着材の高い吸着特性の観点から、好ましくは２５％以上であり、より好ましくは４０％以上である。本発明において、吸着材における吸着部位の導入量は、^１Ｈ−ＮＭＲにて１分子あたりのｐＨ応答性高分子内に導入された吸着部位を求め、その後担体上に固定化したｐＨ応答性高分子量を同定すること、すなわち１分子当たりの吸着部位導入率（量）と１ｍＬ担体上に固定化されたｐＨ応答性高分子量の積によって求められる。

【0042】

また、ｐＨ応答性高分子は、複数のアミノ基を有する高分子と、吸着部位を導入するための化合物を、高分子：吸着部位を導入するための化合物が１：０．０１〜１０のモル比で、好ましくは１：０．１〜５のモル比で、より好ましくは１：０．１〜２のモル比で反応させることで得られる。

【0043】

複数のアミノ基を有する高分子は、官能基として複数のアミノ基を有するもの（ポリアミン）であればよいが、アミノ基以外の他の官能基を有していてもよい。このような官能基としては、特に限定されずに、例えば、イミノ基、各種含窒素芳香族基（ピロール基、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、オキサゾリル基、チアゾリル基及びトリアゾリル基等）、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基、ホスホリル基、ホスフィニル基、シリケート基及びそれらの誘導体の基等を挙げることができる。他の官能基は、１種類のみを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0044】

複数のアミノ基を有する高分子は、デンドリマーであってもよい。複数のアミノ基を有する高分子としては、例えば、ポリリジン（α−ポリリジン、ε−ポリリジン）、ポリエチレンイミン（直鎖ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン）、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、並びにそれらを部分構造として有する誘導体及び共重合体等が挙げられるが、ε−ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン又はそれらを部分構造として含む高分子が好ましく、より多くの吸着部位を導入できるという観点から、ε−ポリリジンがより好ましい。

【0045】

複数のアミノ基を有する高分子の重量平均分子量は、通常１０００〜１０００００であり、好ましくは１０００〜６０００である。本発明において、複数のアミノ基を有する高分子の平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定した重量平均分子量をいう。

【0046】

複数のアミノ基を有する高分子と吸着部位の組み合わせとしては、吸着材の高い抗体吸着特性の観点から、ε−ポリリジン、ポリエチレンイミン又はポリアリルアミンと、前記の吸着部位１、２又は３の各組み合わせが好ましく、ε−ポリリジンと、前記の吸着部位２又は３の各組み合わせがより好ましい。

【0047】

複数のアミノ基を有する高分子への吸着部位の導入は、該高分子を担体に固定化する前及び後のいずれに行ってもよい。すなわち、吸着部位を高分子に導入し、その後、吸着部位が導入された高分子を担体に固定化してもよく、あるいは、吸着部位を有さない高分子を担体に固定化した後で、固定化した高分子に吸着部位を導入してもよい。好ましくは、高分子への吸着部位の導入は、該高分子を担体に固定化する前に行う。

【0048】

担体は、多孔質及び非多孔質のいずれの形状であってもよい。担体の形状としては、例えば、板状、ビーズ（粒子）状、不織布や織物等の繊維状、膜状、モノリス状及び中空糸状等が挙げられる。また、担体は、コアシェル構造のものであってもよい。

【0049】

担体は、例えば多糖類、合成樹脂、無機化合物及びそれらの複合材料を含む材料を有する。多糖類は、架橋された多糖類であってもよい。多糖類又は架橋された多糖類としては、例えば、アガロース、架橋アガロース、疎水化アガロース及びセルロース等が挙げられる。合成樹脂としては、例えば、アクリル樹脂（例えばポリアルキルアクリレート、ポリアルキルメタクリレート、ポリグリシジルアクリレート、ポリグリシジルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリシロキサン及びポリフッ化エチレン等が挙げられる。無機化合物としては、シリカ、金属酸化物（例えばアルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化鉄等）、フェライト、ハイドロキシアパタイト及びシリケート等が挙げられる。担体は、多糖類、架橋された多糖類、合成樹脂、シリカ又は金属酸化物を有することが好ましく、多糖類又は架橋された多糖類を有することがより好ましい。なお、担体は、これらの材料を少なくとも担体表面に有していればよく、すなわち、担体表面が、多糖類、架橋された多糖類、合成樹脂、シリカ又は金属酸化物、好ましくは多糖類又は架橋された多糖類を有するコアシェル構造のものであってもよい。よって、担体又は担体表面が、多糖類、架橋された多糖類、合成樹脂、シリカ又は金属酸化物を有するものが好ましく、多糖類又は架橋された多糖類を有するものがより好ましい。

【0050】

担体表面は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、エポキシ基、エステル基等の反応性基によって修飾されていてもよく、ｐＨ応答性高分子をより多く導入でき、すなわち吸着部位をより多く導入できるという観点からカルボキシル基が好ましい。また、担体表面は、ｐＨ応答性高分子以外の化合物によって修飾されていてもよい。例えば、担体表面は、抗体の非特異的な吸着を防止するブロッキングや、ｐＨ応答性高分子の配向性を制御する表面修飾や、担体の分散性又は吸着性を改質する修飾等が行われていてもよい。

【0051】

吸着材は、ｐＨ応答性高分子を担体に固定化することで製造できる。ｐＨ応答性高分子は、好ましくは、共有結合を介して担体に結合させることにより、担体に固定する。すなわち、一実施形態において、吸着材は、ｐＨ応答性高分子と担体とが共有結合を介して結合している。前記のとおり、吸着部位は、複数のアミノ基を有する高分子を担体に固定化する前及び後のいずれに導入してもよい。

【0052】

ｐＨ応答性高分子と担体が共有結合を介して結合している場合、この共有結合は、例えば、ｐＨ応答性高分子中のアミノ基等の官能基を用いて形成してもよい。この場合、共有結合を形成する担体の表面の官能基と、ｐＨ応答性高分子中の官能基との組み合わせとして、例えば、エポキシ基とアミノ基、エステル基（例えば、カルボン酸のＮＨＳエステル）とアミノ基、アミノ基とカルボキシル基との組み合わせ等が挙げられる。共有結合の形成は、担体にｐＨ応答性高分子の溶液又は懸濁液を接触させることで行うことができる。縮合反応により共有結合を形成する場合（例えば、アミノ基とカルボキシル基を用いる場合等）、縮合剤（例えば、ＤＭＴ−ＭＭやＥＤＣ等）の存在下で反応を行うことが好ましい。

【0053】

本発明の抗体の精製方法では、前記の吸着材を用いて抗体を精製する。本発明の抗体の精製方法は、抗体を含有するｐＨ４〜８．５の溶液を吸着材に接触させて、抗体を吸着材に吸着させる第１工程と、吸着材をｐＨ５〜９の溶液に接触させて、吸着材を洗浄する第２工程と、吸着材をｐＨ７〜１１の溶液に接触させて、吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収する第３工程と、吸着材をｐＨ１１〜１４の溶液に接触させて、吸着材を洗浄する第４工程とを含む。本発明の方法では、第１工程〜第４工程を順番通りに含んでいればよく、その限りにおいては、付加的な工程を間に挟むことや、第１工程と第２工程を繰返し行うこと、そして第１工程から第３工程まで連続的に行い、それを繰返し行う等変法も適宜適用できる。

【0054】

一実施形態において、本発明の精製方法は、吸着材が充填されたカラムを用いて実施される。従来の強酸を利用する精製方法では、過度なｐＨ変化によって、吸着材から脱離した抗体が凝集体を形成し、吸着材の一部がリーチングを生じ、それらが医薬品に混入することで、医薬品の副作用が高まることがあったが、本発明の方法は、マイルドなｐＨ変化により抗体を吸着又は脱離するため、そのようなリスクは少ない。

【0055】

別の実施形態において、本発明の精製方法は、吸着材を懸濁液の状態で用いて実施される。従来の溶解度の変化を利用する温度応答性の吸着材では、温度変化によって、疎水性が増大して分散性が低下し、懸濁状態の吸着材が凝集、壁面に付着、界面に局在化等するリスクが高いが、本発明の精製方法は、温度変化に伴う溶解度の変化を抗体の吸着又は脱離に利用していないため、そのようなリスクはほぼない。

【0056】

本発明の抗体の精製方法の第１工程では、抗体を含有するｐＨ４〜８．５の溶液を吸着材に接触させて、選択的に抗体を吸着材に吸着させる。

【0057】

抗体を含有する溶液のｐＨは、ｐＨ４〜８．５であり、好ましくはｐＨ５．５〜８．５であり、より好ましくはｐＨ６〜７．５である。本発明においては、抗体を含有する溶液のｐＨがｐＨ４〜８．５の場合、ｐＨ応答性高分子の正電荷がより多い状態であり、電荷を有した部位同士の電荷反発により、ｐＨ応答性高分子の高分子主鎖は伸長した状態となり、吸着部位が溶液中に露出することで抗体をより吸着しやすい状況となり、吸着材が抗体を高い吸着量で吸着することができる。

【0058】

抗体を含有する溶液としては、抗体の安定性の観点から、体液に近い浸透圧を有する溶液を用いることが好ましい。また、吸着材の電荷の影響を受け、ｐＨが変動することが起こり得るため、ｐＨを所定の範囲内に維持できるように、好ましくは、抗体を含有する溶液として緩衝液を用いる。抗体を含有する溶液としては、特に限定されずに、例えばＰＢＳ緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等の生化学で一般的に用いられる緩衝液を用いることができる。

【0059】

抗体を含有する溶液は、溶液中に存在する塩の濃度が抗体の吸着量に影響を与えることがあり得るため、通常、５ｍＭ〜１Ｍの低い塩濃度とする。また、抗体を含有する溶液として緩衝液を用いる場合、抗体を含有する溶液には、該緩衝液に含まれる塩以外の塩を添加しないことが好ましい。

【0060】

抗体を含有する溶液は、例えば、抗体を細胞培養によって産生することで準備することができる。細胞培養して得た抗体の溶液は、通常、抗体以外に多くのタンパク質由来夾雑物を含有しているため、本発明の精製方法を実施する前に、遠心分離等を行い、細胞の断片等大きな夾雑物を除去して用いることが好ましい。したがって、抗体を含有する溶液は、好ましくは、抗体を細胞培養して得た溶液から細胞又はその断片を除去した溶液である。

【0061】

抗体を含有する溶液は、通常０．１ｇ/Ｌ〜２０ｇ/Ｌ、好ましくは０．２ｇ/Ｌ〜２ｇ/Ｌの抗体濃度で用いる。抗体を細胞培養して得た溶液を用いる場合、必要であれば、この範囲の濃度となるように十分に希釈して用いる。

【0062】

本発明の抗体の精製方法の第２工程では、第１工程の処理後の吸着材をｐＨ５〜９の溶液に接触させて吸着材を洗浄する。第２工程では、第１工程において吸着材に吸着しなかった抗体、抗体の凝集体又はその断片や、吸着材と弱く相互作用して吸着した夾雑物も含めて、吸着材に吸着した夾雑物が除去される。

【0063】

第２工程で用いる溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９であり、好ましくはｐＨ６〜８．５であり、より好ましくはｐＨ６〜８である。第２工程で用いる溶液としては、このｐＨ範囲を満たす限りにおいて、第１工程と同じ溶液であって、抗体を含有しないものを用いてもよく、また、第１工程で用いた溶液のｐＨよりも大きいｐＨを有する溶液を用いてもよい。好ましくは、第２工程の溶液として、第１工程と同じ溶液であって、抗体を含有しないものを用いる。第２工程で用いる溶液としては、ｐＨを所定の範囲内に維持できるように、緩衝液を用いることが好ましい。第２工程で用いる溶液としては、特に限定されずに、例えばＰＢＳ緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等の生化学で一般的に用いられる緩衝液を用いることができる。また、抗体が吸着材から脱離することが無い条件で、第２工程の溶液のイオン強度や塩濃度を適宜選択することにより、非特異吸着成分を除去することができる。

【0064】

本発明の抗体の精製方法の第３工程では、第２工程の処理後の吸着材をｐＨ７〜１１の溶液に接触させて、吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収する。

【0065】

第３工程で用いる溶液のｐＨは、ｐＨ７〜１１であり、好ましくはｐＨ７．５〜１０であり、より好ましくはｐＨ８〜１０である。第３工程で用いる溶液のｐＨは、第１工程及び第２工程で用いる溶液のｐＨよりも大きい。

【0066】

本発明の精製方法では、前記の吸着材を、第１工程及び第２工程で用いる溶液のｐＨよりも大きいｐＨ７〜１１の溶液と組み合わせることで、第３工程において抗体を高収率で回収できる。前記のとおり、第１工程及び第２工程から第３工程へと用いる溶液のｐＨを大きくすることにより、吸着材の電荷密度を変化させて、吸着材のｐＨ応答性高分子のコンフォメーション変化、並びにｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷の変化を利用して抗体を脱離させることが可能であり、高収率で抗体を回収することができる。

【0067】

第３工程で用いる溶液は、特に限定されることなく、例えば、塩基を添加して所定のｐＨ範囲に調整すればよい。第３工程で用いる溶液としては、ｐＨを所定の範囲内に維持できるように、緩衝液を用いることが好ましい。第３工程で用いる溶液としては、特に限定されずに、例えば、トリス塩酸緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、エチレンジアミン−四酢酸緩衝液等が挙げられる。

【0068】

第３工程で用いる溶液は、溶液中に存在する塩の濃度が抗体の回収率に影響を与えることがあるため、抗体の回収率の観点から、通常５ｍＭ〜２５０ｍＭの低い塩濃度とする。また、第３工程で用いる溶液として緩衝液を用いる場合、該緩衝液に含まれる塩以外の塩を添加しないことが好ましい。

【0069】

第１工程及び第２工程から第３工程へと用いる溶液のｐＨを上昇させて吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収するが、例えば、吸着材をカラムに充填して用いる場合、ｐＨを上昇させる方法は、直接溶出、グラジエント溶出又はステップワイズ溶出のいずれによって行ってもよい。

【0070】

本発明の抗体の精製方法の第４工程では、吸着材をｐＨ１１〜１４の溶液に接触させて、吸着材を洗浄する。第４工程では、第３工程で回収できなかった抗体や夾雑物を除去して、吸着材の再生を行う。第４工程を行うことにより、吸着材を抗体の精製に再利用できる。

【0071】

第４工程で用いる溶液のｐＨは、ｐＨ１１〜１４であり、好ましくはｐＨ１２〜１４であり、より好ましくはｐＨ１２〜１３である。第４工程で用いる溶液のｐＨは、第３工程で用いる溶液のｐＨよりも大きい。

【0072】

第４工程で用いる溶液としては、特に限定されずに、例えば、水酸化ナトリウム溶液等が挙げられる。

【0073】

前記のようにして精製された抗体は、例えば、ウイルス除去工程、濃縮・液交換工程、製剤化工程にさらに供することにより、医薬品として利用可能となる。

【0074】

以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。

【実施例】

【0075】

１．ｐＨ応答性高分子の合成
＜ｐＨ応答性高分子１＞
複数のアミノ基を有する高分子としてε−ポリリジン（ＥＰＬ）を用い、吸着部位としてメルカプトベンゾチアゾール酢酸（ＭＢＴＡ、２−ベンゾチアゾリルチオ酢酸）を導入した。なおＭＢＴＡは、下記構造を有する、抗体吸着能を有するチオフィリック系の化合物である。

【0076】

【化2】

【0077】

ＥＰＬ（一丸ファルコス社製、ポリリジン１０）の水／ＤＭＦ溶液にＭＢＴＡ（０．５当量）及び脱水縮合剤の４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）（１．２当量）を加え、室温で３時間撹拌し、ＥＰＬのアミノ基とＭＢＴＡのカルボキシル基との反応によりアミド結合を形成することで、ＥＰＬにＭＢＴＡを導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、ＴＨＦにより透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでｐＨ応答性高分子１を固体として得た。

【0078】

＜ｐＨ応答性高分子２＞
複数のアミノ基を有する高分子としてε−ポリリジン（ＥＰＬ）を用い、吸着部位としてメルカプトベンゾチアゾールプロパン酸（ＭＢＴ、３−（２−ベンゾチアゾリルチオ）プロピオン酸）を導入した。なお、ＭＢＴは、下記構造を有する、抗体吸着能を有するチオフィリック系の化合物である。

【0079】

【化3】

【0080】

ＥＰＬの水／ＤＭＦ溶液にＭＢＴ（０．５当量）及びＤＭＴ−ＭＭ（１．２当量）を加え、室温で３時間撹拌し、ＥＰＬのアミノ基とＭＢＴのカルボキシル基との反応によりアミド結合を形成することで、ＥＰＬにＭＢＴを導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、ＴＨＦにより透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでｐＨ応答性高分子２を固体として得た。

【0081】

＜ｐＨ応答性高分子１、２の化学組成評価＞
ｐＨ応答性高分子１、２について、その組成及び吸着部位導入率を以下の表１に示す。表１において、吸着部位については、吸着部位の導入に用いた原料化合物を記載している。吸着部位導入率は、複数のアミノ基を有する高分子のアミノ基量に対し吸着部位により占有された割合を示し、^１Ｈ−ＮＭＲ測定によって求めた。

【0082】

【表1】

【0083】

２．吸着材の調製
＜実施例１の吸着材＞
ＴＨＦ／水混合溶液を溶媒として適用し、ｐＨ応答性高分子１の１重量％溶液を調製した。このｐＨ応答性高分子１の溶液と、カルボキシル基を表面に有するセファロース（架橋アガロース）担体（ＧＥヘルスケア社製、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）とＤＭＴ−ＭＭ（１０当量）とから得られた懸濁液を室温で一晩振盪させ、ＴＨＦ／水混合溶媒にて洗浄し、ｐＨ応答性高分子１が担体に固定化された実施例１の吸着材を得た。

【0084】

＜実施例２の吸着材＞
ｐＨ応答性高分子１に代えてｐＨ応答性高分子２を用いた以外は実施例１と同様にして、ｐＨ応答性高分子２が担体に固定化された実施例２の吸着材を得た。

【0085】

＜比較例１の吸着材＞
低分子リガンドとして広く用いられている４−ピリジルチオ基がエチレンジアミン（ＥＤＡ）を介して担体に固定化された比較例１の吸着材を調製した。具体的には、溶媒として水を適用し、エチレンジアミン（１０当量）とカルボキシル基を表面に有するセファロース（架橋アガロース）担体（ＧＥヘルスケア社製、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）、そして縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ（１当量）を混合し、エチレンジアミンを担体上に導入した。その後、水で担体を洗浄し、未反応のエチレンジアミンを除去した。次に、エチレンジアミンを固定化した担体をＴＨＦ／水混合溶媒に分散させた後、（４−ピリジルチオ）酢酸（ＰｙＳ）（１０当量）とＤＭＴ−ＭＭ（１０当量）を混合し、終夜攪拌した。反応後、ＴＨＦ／水混合溶媒で洗浄し、担体上に固定化されたＥＤＡにＰｙＳが導入された比較例１の吸着材を得た。なお、ＰｙＳは以下の構造を有する。

【0086】

【化4】

【0087】

実施例１、２及び比較例１の吸着材における担体の種類、ｐＨ応答性高分子の組成及び担体に固定化されたｐＨ応答性高分子の量（ｐＨ応答性高分子の固定化容量）を表２に示す。表２において、吸着部位については、吸着部位の導入に用いた原料化合物を記載している。また、固定化容量は、担体上へｐＨ応答性高分子を固定化させた際の反応溶液、及び担体の洗浄溶液をそれぞれ高速液体クロマトグラフィーにより分析し、初期投入したｐＨ応答性高分子量から各工程で検出されたｐＨ応答性高分子量を差し引くことで決定した。

【0088】

【表2】

【0089】

３．評価
＜試験例１＞
第１工程の溶液条件における実施例１、２及び比較例１の吸着材の抗体吸着能を評価した。具体的には、１ｍＬの実施例１、２及び比較例１の吸着材をそれぞれカラムに充填し、１重量％の所定のヒトＩｇＧを含むｐＨ７．４の中性のＰＢＳ緩衝液（リン酸３０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ）を５ｍＬ通液し、カラムから溶出される溶液内のヒトＩｇＧ濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から各吸着材への抗体吸着量を算出した。ここでいう抗体吸着量とは、吸着材への静的な抗体吸着量を意味し、吸着材１ｍＬ当たりの抗体の吸着量（ｍｇ）で表す。

【0090】

また、１ｍＬの実施例１、２及び比較例１の吸着材をそれぞれカラムに充填し、１重量％の所定のヒトＩｇＧを含むｐＨ５．５の弱酸性の酢酸緩衝液（２０ｍＭ）を５ｍＬ通液し、抗体吸着量を前記と同様にして測定した。

【0091】

実施例１、２及び比較例１の吸着材について、抗体吸着量の測定結果を表３に示す。

【0092】

【表3】

【0093】

表３に示すとおり、実施例１及び２の吸着材はいずれも、抗体含有溶液のｐＨが弱酸性から中性の領域で、該抗体含有溶液中に含まれる抗体の全量に対して７０％以上の高い吸着量で抗体を吸着することが分かった。一方、比較例１の吸着材の場合、実施例１及び２の吸着材とはｐＨに対する抗体の吸着挙動が異なり、中性から弱塩基性のｐＨ領域で抗体を多く吸着し、弱酸性領域では抗体を殆んど吸着しないことが分かった。

【0094】

前記のとおり、実施例１及び２の吸着材は、比較例１の吸着材と比較して、弱酸性から中性のｐＨ領域における抗体吸着量に明らかな差が見られたが、この違いが得られた理由として、まず１つめは吸着部位自身の抗体吸着能の違いから吸着量変化が見られたと考えられる。また、２つめとして比較例１の吸着材では担体と吸着部位をエチレンジアミンを介して固定化している。実施例１及び２の吸着材では、吸着部位を高分子に導入し、それを担体に固定化しているため、比較例１の吸着材と比較して担体上での立体構造がより嵩高くなったため、抗体吸着量が大きくなったと考えられる。

【0095】

＜試験例２＞
吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収する第３工程に関し、検討した。具体的には、実施例１、２及び比較例１の各吸着材を充填したカラムを用いて評価した。１重量％の所定のヒトＩｇＧを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸３０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ）５ｍＬをそれぞれカラムに通液し、カラムから溶出される溶液内のヒトＩｇＧ濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から各吸着材への抗体吸着量を算出した。その後、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液２５ｍＬを通液してカラムを洗浄した。回収用の溶液として、１００ｍＭのｐＨ８．７の弱塩基性の炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液及び１００ｍＭのｐＨ９．５の弱塩基性の炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液の２種を用いて、カラム内の吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収した。その際、溶出した抗体量が分かるため、吸着材に吸着した抗体量と回収した抗体量から回収率を、以下の式（１）：回収率（％）＝抗体回収量（ｍｇ・ｍＬ^−１）／抗体吸着量（ｍｇ・ｍＬ^−１）×１００に基づき算出した。結果を表４に示す。

【0096】

【表4】

【0097】

表４に示すとおり、実施例１及び２の吸着材ではｐＨ８．７以上の溶液条件で抗体を９０％以上回収できることが分かった。一方、比較例１の吸着材ではｐＨ８．７以上の溶液条件では抗体を殆んど脱離せず、回収率は６％以下であった。実施例１及び２の吸着材は、溶液ｐＨを、第１工程及び第２工程の中性領域から第３工程の弱塩基性領域へと上昇させることで、吸着材のｐＨ応答性高分子のコンフォメーション、並びにｐＨ応答性高分子及び抗体の電荷が変化し、抗体を高い回収率で回収できたと考えられる。また、吸着材の抗体の吸着及び脱離のメカニズムを考えると、第３工程で用いる溶液のｐＨは第１工程及び第２工程のｐＨよりも大きいことが必要であると考えられる。

【0098】

＜試験例３＞
第３工程で用いる溶液の塩濃度が抗体回収に与える影響を評価した。具体的には、実施例１、２及び比較例１の各吸着材を充填したカラムを用いて評価した。１重量％の所定のヒトＩｇＧを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸３０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ）５ｍＬをそれぞれカラムに通液し、カラムから溶出される溶液内のヒトＩｇＧ濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から各吸着材への抗体吸着量を算出した。その後、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液２５ｍＬを通液してカラムを洗浄した。回収用の溶液として、ＮａＣｌ無添加（ＮａＣｌ濃度０ｍＭ）又はＮａＣｌ添加（ＮａＣｌ濃度２０ｍＭ）の１００ｍＭのｐＨ８．７の弱塩基性の炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液２種を用いた。抗体の回収率は、試験例２と同様にして前記の式（１）を用いて算出した。結果を表５に示す。

【0099】

【表5】

【0100】

表５に示すとおり、実施例１及び２の吸着材ではｐＨ８．７の弱塩基性溶液条件で、塩化ナトリウムを炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液にさらに添加しないことで、抗体を９０％以上の回収率で回収できることが分かった。一方、比較例１の吸着材では、ｐＨ８．７の弱塩基性溶液条件で、塩化ナトリウムの添加の有無に関わらず抗体の回収率は＜１０％程度と低い値を示した。実施例１及び２の吸着材は、塩化ナトリウムの添加による塩濃度の増加に伴いｐＨ応答性高分子の疎水度が高まり、抗体の回収率がやや低下したと推測される。

【0101】

＜試験例４＞
吸着材を洗浄し、カラムを再生する第４工程に関し検討した。具体的には、実施例１、２及び比較例１の各吸着材を充填したカラムを用いて評価した。１重量％の所定のヒトＩｇＧを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸３０ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ）５ｍＬをそれぞれカラムに通液し、カラムから溶出される溶液内のヒトＩｇＧ濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から各吸着材への抗体吸着量を算出した。その後、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液２５ｍＬを通液してカラムを洗浄した。１００ｍＭのｐＨ８．７の弱塩基性の炭酸水素ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液を用いて、吸着材に吸着した抗体を脱離させ、回収した。抗体の回収率を試験例２と同様にして前記の式（１）を用いて算出した。最後に、０．１ＭのｐＨ１２の塩基性の水酸化ナトリウム溶液５ｍＬをカラムへ通液することで、カラムに残存する抗体を除去した。この工程で回収した抗体を定量し、抗体吸着量に対する回収した抗体の割合をカラム再生画分（％）として算出した。カラム再生画分は、以下の式（２）：カラム再生画分（％）＝抗体回収量（ｍｇ・ｍＬ^−１）／抗体吸着量（ｍｇ・ｍＬ^−１）×１００で求められる。結果を表６に示す。

【0102】

【表6】

【0103】

表６に示すとおり、実施例１及び２の吸着材ではｐＨ１２の水酸化ナトリウム溶液でカラムを洗浄することでカラムを約９８％以上再生できることが分かった。また、比較例１の吸着材も同様に、ｐＨ１２の水酸化ナトリウム溶液でカラムを洗浄するとカラムを９７％再生できたが、前記のとおり、比較例１の吸着材は抗体回収率が非常に低かった。以上の結果から、実施例１及び２の吸着材は、再生し繰り返し利用可能であることが分かった。

【0104】

本明細書に列挙した本発明の態様は単なる典型例としてのものであり、これらの総ての変更及び改質は、添付の請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内にあることを意図するものである。

【産業上の利用可能性】

【0105】

本発明によれば、抗体医薬品の低コスト製造、且つ生産性向上をかなえる、即ち抗体の回収率向上をかなえる、低分子化合物を用いた吸着材による抗体の精製方法を可能にする。従って、従来治療が困難であったリュウマチや癌治療等に用いる治療用抗体はもちろん、分析、試験で用いられる生化学試薬や臨床検査試薬中の抗体をも含めて高効率に生産、提供が可能となるため、医療技術の進歩に大きく貢献できる。

【符号の説明】

【0106】

１０ 吸着材
１ ｐＨ応答性高分子
２ 複数のアミノ基を有する高分子
３ 吸着部位
４ 抗体
５ 担体

【図1】