特許 6960123 キメラ２重鎖核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6960123

(24)【登録日】2021年10月13日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】キメラ２重鎖核酸

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

【請求項の数】13

【全頁数】55

(21)【出願番号】特願2019-224279(P2019-224279)

(22)【出願日】2019年12月12日

(62)【分割の表示】特願2018-188022(P2018-188022)の分割

【原出願日】2012年12月17日

(65)【公開番号】特開2020-39364(P2020-39364A)

(43)【公開日】2020年3月19日

【審査請求日】2020年1月10日

(31)【優先権主張番号】特願2011-275488(P2011-275488)

(32)【優先日】2011年12月16日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504179255

【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】横田 隆徳

(72)【発明者】

【氏名】仁科 一隆

(72)【発明者】

【氏名】小比賀 聡

(72)【発明者】

【氏名】水澤 英洋

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５００００３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−１１０８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１１９０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５２２５８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１３５７１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Database GenBank [online], Accessin No. NM_018963，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/335057563?sat=15&satkey=2677537> 03-SEP-2011 updated，[retrieved on 2018-02-22]

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の核酸鎖、第１の核酸鎖とアニーリングする第２の核酸鎖、及び第１の核酸鎖の末端に位置する第３の核酸鎖であって第２の核酸鎖とアニーリングする第３の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体であって、
（ｉ）第１の核酸鎖は、
細胞内の転写産物にハイブリダイズすることができ、そして
（ａ）前記転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドを含み、さらに（ｂ）前記ＲＮａｓｅＨにより認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドの５’末側に配置された１又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む５’ウイング領域、ならびに／または
（ｃ）前記ＲＮａｓｅＨにより認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドの３’末側に配置された１又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む３’ウイング領域を含む核酸鎖であり、そして
（ｄ）第１の核酸鎖におけるヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、１２〜２５ヌクレオチドであり、かつ、
（ｉｉ）第３の核酸鎖は、
（ａ）前記転写産物にハイブリダイズし、そして
（ｂ）前記転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドもしくは任意にヌクレオチドアナログを含む核酸鎖であり、
（ｃ）ヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの総数は１２〜２０であり、
（ｉｉｉ）第２の核酸鎖は、
（ａ）第１の核酸鎖にアニーリングした際に、ＲＮａｓｅＨによって切断される、少なくとも４つの連続したＲＮＡヌクレオチド、
（ｂ）第３の核酸鎖にアニーリングした際に、ＲＮａｓｅＨによって切断される、少なくとも４つの連続したＲＮＡヌクレオチドと、さらに
（ｃ）前記少なくとも４つの連続したＲＮＡヌクレオチドの５’末側に配置された１又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび／もしくは修飾ヌクレオチドアナログ、ならびに／または
（ｄ）前記少なくとも４つの連続したＲＮＡヌクレオチドの３’末側に配置された１又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび／もしくは修飾ヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、
二本鎖核酸複合体。

【請求項2】

第３の核酸鎖は、
（ｉ）ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
（ｉｉ）第２の転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）ヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの総数は１２〜２０であり、かつ
（ｉｖ）前記転写産物にハイブリダイズする核酸鎖である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項3】

第３の核酸鎖は、第１の核酸鎖がハイブリダイズする第１の転写産物と異なる第２の転写産物とハイブリダイズする核酸鎖である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項4】

第３の核酸鎖は、第１の核酸鎖がハイブリダイズする第１の転写産物と異なる第２の転写産物とハイブリダイズする核酸鎖であり、かつ、第３の核酸鎖はＰＮＡヌクレオチドを含む核酸鎖である、請求項３に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項5】

第３の核酸鎖は、前記転写産物にハイブリダイズし、そして
（ａ）前記転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドを含み、さらに（ｂ）前記ＲＮａｓｅＨにより認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドの５’末側に配置された１又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む５’ウイング領域、ならびに／または
（ｃ）前記ＲＮａｓｅＨにより認識される少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドもしくは修飾ＤＮＡヌクレオチドの３’末側に配置された１又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む３’ウイング領域を含む核酸鎖である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項6】

第３の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項7】

第２の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項8】

第２の核酸鎖及び第３の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、請求項６乃至７のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項9】

前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項10】

前記機能性部分が、前記核酸鎖の３’末端のヌクレオチド又は５’末端のヌクレオチドに結合している、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項11】

前記脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される、請求項９に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項12】

前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。

【請求項13】

前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である、請求項８に記載の二本鎖核酸複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸に関し、より詳しくは、４塩基以上の連続した核酸を含む領域を含む、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さや低毒性の観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（センス鎖）の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ))を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。

【0003】

図１（上部）に示す通り、ＡＳＯとしてＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と当該ＡＳＯとが結合して、部分的に二本鎖が形成される。そして、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。

【0004】

一方、ＡＳＯとしてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、部分的にＤＮＡ−ＲＮＡのヘテロオリゴヌクレオチドが形成される。そして、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害される（図１、下部）。また、ＡＳＯとしてＤＮＡを用いた方（ＲＮａｓｅＨ依存的経路）がＲＮＡを用いるよりも、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。

【0005】

オリゴヌクレオチドを核酸医薬として利用する際には、標的ＲＮＡへの結合親和性の向上や生体内での安定性等を考慮し、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）（登録商標））等の様々な修飾核酸等が開発されている。

【0006】

図２に示す通り、天然核酸（ＲＮＡやＤＮＡ）の糖部分は４つの炭素原子と１つの酸素原子とからなる５員環を有し、その糖部分はＮ型とＳ型の２種類のコンホメーションを取る。これらコンホメーションは互いに揺らいでおり、これにより核酸のらせん構造もＡ型とＢ型の異なった型をとることが知られている。前述のＡＳＯの標的となるｍＲＮＡは主に糖鎖がＮ型でＡ型のらせん構造をとっているため、ＲＮＡに対する親和性を高めるという観点から、ＡＳＯの糖鎖もＮ型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−架橋化核酸（２’，４’−ＢＮＡ））等の修飾核酸である。例えば、ＬＮＡにおいては、２’位の酸素と４’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはＮ型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、ＬＮＡを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、ＲＮＡに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す（特許文献１ 参照）。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、アンチセンス法の利用等において、人工核酸は強く注目されている（特許文献１〜７参照）。

【0007】

また、オリゴヌクレオチドを医薬に適用する際には、当該オリゴヌクレオチドを標的部位に特異性高く効率良く送達できることが重要である。そして、オリゴヌクレオチドの送達方法として、コレステロールやビタミンＥ等の脂質を利用する方法（非特許文献１及び２）や、ＲＶＧ−９Ｒ等の受容体特異的ペプチドを利用する方法（非特許文献３）や、標的部位に特異的な抗体を利用する方法（非特許文献４）が開発されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開平１０−３０４８８９号公報

【特許文献2】国際公開第２００５／０２１５７０号

【特許文献3】特開平１０−１９５０９８号公報

【特許文献4】特表２００２−５２１３１０号公報

【特許文献5】国際公開第２００７／１４３３１５号

【特許文献6】国際公開第２００８／０４３７５３号

【特許文献7】国際公開第２００８／０２９６１９号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋａｚｕｔａｋａ Ｎｉｓｈｉｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、１６巻、７３４〜７４０ページ

【非特許文献2】Ｊｕｒｇｅｎ Ｓｏｕｔｓｃｈｅｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３２巻、１７３〜１７８ページ

【非特許文献3】Ｋａｚｕｔａｋａ Ｎｉｓｈｉｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、１６巻、７３４〜７４０ページ

【非特許文献4】Ｄａｎ Ｐｅｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、３１９巻、６２７〜６３０ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

ある実施形態において、二重鎖核酸複合体は、標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を含み、通常ＲＮＡ転写産物レベルを抑制するアンチセンス核酸を含む。本発明の他の目的は、二重鎖核酸複合体により、特異性高く効率良く標的部位にアンチセンス核酸鎖を送達することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、アンチセンス法におけるＡＳＯの安定性、生体内における標的遺伝子の発現に対する抑制活性（アンチセンス効果）、並びにＡＳＯの標的部位への送達における特異性及び効率（送達性）を向上させるべく、脂質（コレステロール）を直接結合させた、ＬＮＡ及びＤＮＡを含むＡＳＯ（ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー）を調製し、このＡＳＯをマウスに静脈投与して送達性及びアンチセンス効果を評価した。その結果、コレステロールを結合させることにより、ＡＳＯの肝臓への送達性は向上する一方で、アンチセンス効果は喪失してしまうことが明らかになった。

【0012】

そこで、本発明者らは、ＡＳＯの送達性を高めつつ、高いアンチセンス効果を有する核酸を開発すべく、鋭意研究を重ねた結果、１の実施形態において、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとそれに対するＲＮＡからなる相補鎖とをアニーリングさせた二重鎖核酸複合体を新たに着想し、先ずはそのアンチセンス効果について評価した。その結果、前記二重鎖核酸のアンチセンス効果は、１本鎖のＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーのそれと概して変わらず、むしろ用いるＡＳＯの鎖長によっては亢進することが明らかになった。また、本発明者らは、前記ＲＮＡを含む相補鎖にトコフェロールを結合させた二重鎖核酸を調製した。そして、当該二重鎖核酸をマウスに静脈投与し、そのアンチセンス効果を評価した。その結果、トコフェロールを結合させた相補鎖を含む二重鎖核酸は非常に高いアンチセンス効果を有していることが明らかになった。また、前記ＲＮＡの代わりにＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む相補鎖とアニーリングさせたＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーのアンチセンス効果は、１本鎖のＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーのそれと少なくとも同等であるか、または優れていることも本発明者らは見出した。さらに、ＰＮＡは、ＡＳＯと、ペプチド、タンパク質又は抗体とを直接結合させる上で有用であり、ＡＳＯの特定の部位への直接的な送達を可能とするものである。

【0013】

ある実施形態において、以下を提供する。
（１） 標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する、下記（ａ）及び（ｂ）の核酸を含む二重鎖核酸
（ａ）標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域を含む核酸
（ｂ）（ａ）の核酸に相補的な核酸。
（２） （ａ）の核酸が、前記４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域の５'末側及び３'末側の少なくともいずれか一方に配置された修飾核酸を含む領域をさらに含む核酸である（１）に記載の二重鎖核酸。
（３） （ａ）の核酸の修飾核酸を含む領域が、４塩基以上の連続したＤＮＡからなる領域の５'末側及び３'末側に配置された修飾核酸を含む領域であり、該修飾核酸がＬＮＡである、（２）に記載の二重鎖核酸。
（４） （ｂ）の核酸がＲＮＡ又はＰＮＡである、（１）〜（３）のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
（５） （ｂ）の核酸がＲＮＡであって、（ａ）の核酸の修飾核酸を含む領域に対して相補的な領域が修飾されており、前記修飾がＲＮＡ分解酵素による分解を抑制する効果を有するものである、（１）〜（３）のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
（６） 前記修飾が、２’−Ｏ−メチル化及び／又はホスホロチオエート化である、（５）に記載の二重鎖核酸。
（７） （ｂ）の核酸に機能性分子が結合している、（１）〜（６）のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
（８） （ａ）又は（ｂ）の核酸の鎖長が同一である、（１）〜（７）のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
（９） （ａ）又は（ｂ）の核酸の鎖長が異なる、（１）〜（７）のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
（１０） さらに、下記（ｃ）の核酸を含む、（９）に記載の二重鎖核酸
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸のうち鎖長が長い核酸における他の一方の核酸に対して突出した領域に対して相補的な核酸。
（１１） （ｃ）の核酸がＰＮＡである、（１０）に記載の二重鎖核酸。
（１２） （ｃ）の核酸に機能性分子が結合している、（１０）又は（１１）に記載の二重鎖核酸。
（１３） 機能性分子が、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子である、（７）又は（１２）に記載の二重鎖核酸。
（１４） （１）〜（１３）のいずれか一に記載の二重鎖核酸を有効成分として含有する、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物。
（１５） 細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、（ａ）第２の核酸鎖がアニーリングしている第１の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体を含み、
第１の核酸鎖は、
（ｉ）ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は８〜１００であり、
（ｉｉ）前記転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第２の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
（１６） 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
該医薬組成物は、(a)第２の核酸鎖がアニーリングしている第１の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体と、(ｂ)薬理学上許容される担体とを含み、
第１の核酸鎖は、
（ｉ）ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は８〜１００であり、
（ｉｉ）前記遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第２の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
（１７） 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第２の核酸鎖がアニーリングしている第１の核酸鎖を含み、
第１の核酸鎖は、
（ｉ）ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は８〜１００であり、
（ｉｉ）転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含み、かつ、
（ｉｖ）前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第２の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
（１８） 哺乳動物を治療するための医薬組成物であって、前記転写産物が哺乳動物の転写産物であり、（１７）に記載の二重鎖核酸複合体と、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。

【0014】

本発明の他の実施形態において、以下を提供する。
＜１＞ 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第２の核酸鎖がアニーリングしている第１の核酸鎖を含み、
第１の核酸鎖は、ＤＮＡヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
また、第１の核酸鎖は、５’末側に配置された１又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む５’ウィング領域、及び/又は、３’末側に配置された１又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む３’ウィング領域を含み、
また、第１の核酸鎖は、少なくとも４つの連続したＤＮＡヌクレオチドを含み、
また、第１の核酸鎖におけるＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は、１０〜１００ヌクレオチドであり、
第１の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第２の核酸鎖は、
（ｉ）ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含み、
（ｉｉ）ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
（ｉｉｉ）ＰＮＡヌクレオチドを含み、
また、第２の核酸鎖は、５’末側に配置された１又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む５’ウィング領域、及び/又は、３’末側に配置された１又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む３’ウィング領域を含み、
また、第２の核酸鎖におけるＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びＰＮＡヌクレオチドの総数は、１０〜１００ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜２＞ 前記転写産物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、＜１＞に記載の二重鎖核酸複合体。
＜３＞ 前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、＜１＞に記載の二重鎖核酸複合体。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第２の核酸鎖におけるそれとが同じである、二重鎖核酸複合体。
＜５＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第２の核酸鎖におけるそれとが異なる、二重鎖核酸複合体。
＜６＞ ＜５＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖におけるヌクレオチドの数が、第１の核酸鎖におけるヌクレオチドの数よりも大きい、二重鎖核酸複合体。
＜７＞ ＜１＞〜＜６＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖に含まれるヌクレオチドの総数が１０〜３５ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜８＞ ＜１＞〜＜７＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖に含まれるヌクレオチドは、全てヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜９＞ ＜１＞〜＜８＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
１又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記５’ウィング領域、及び／又は、
３’末側に配置された１又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記３’ウィング領域を含む、二重鎖核酸複合体。
＜１０＞ ＜１＞〜＜９＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
５’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記５’ウィング領域と、３’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記３’ウィング領域とを含む、二重鎖核酸複合体。
＜１１＞ ＜１０＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、
前記５’ウィング領域及び前記３’ウィング領域が、独立して２〜１０個のヌクレオチドアナログからなる、二重鎖核酸複合体。
＜１２＞ 請求項１１に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記５’ウィング領域及び前記３’ウィング領域が、独立して２〜３個のヌクレオチドアナログを含む、方法。
＜１３＞ ＜１＞〜＜１２＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜１４＞ ＜１＞〜＜１３＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖に含まれるヌクレオチドアナログは、架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜１５＞ ＜１４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜１６＞ ＜１４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−ＯＣＯ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−２’によって、２’位の炭素と４’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体（ｐ、ｍ及びｎは、各々１〜４、０〜２及び１〜３の整数である。Ｒ_３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す）。
＜１７＞ ＜１＞〜＜１６＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖における前記ＤＮＡヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
＜１８＞ ＜１＞〜＜１７＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖における前記ヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
＜１９＞ ＜１＞〜＜１８＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖は、４〜２０個の連続したＤＮＡヌクレオチドからなる部分を含む、二重鎖核酸複合体。
＜２０＞ ＜１＞〜＜１９＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖が、
（ｉ）５’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる５’ウィング領域、
（ｉｉ）３’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる３’ウィング領域、及び、
（ｉｉｉ）少なくとも４個の連続したＤＮＡヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜２１＞ ＜１＞〜＜１９＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖は、
（ｉ）５’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる５’ウィング領域、
（ｉｉ）３’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる３’ウィング領域、及び、
（ｉｉｉ）少なくとも４個の連続したＤＮＡヌクレオチド
を含み、前記５’ウィング領域及び前記３’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記ＤＮＡヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
＜２２＞ ＜１＞〜＜２１＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第１の核酸鎖の鎖長が１２〜２５ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜２３＞ ＜１＞〜＜２２＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖が、ＲＮＡヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡとを含む、二重鎖核酸複合体。
＜２４＞ ＜２３＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第２の核酸鎖における前記５’ウィング領域は少なくとも１のヌクレオチドアナログを含み、第２の核酸鎖における前記３’ウィング領域は少なくとも１のヌクレオチドアナログを含み、かつ、第２の核酸鎖は、少なくとも４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
＜２５＞ ＜２３＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第２の核酸鎖における前記５’ウィング領域は少なくとも１のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、第２の核酸鎖における前記３’ウィング領域は少なくとも１のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、かつ、第２の核酸鎖は、少なくとも４個の連続したＲＮＡヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
＜２６＞ ＜２４＞又は＜２５＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第２の核酸鎖における前記５’ウィング領域及び前記３’ウィング領域の全てのヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
＜２７＞ ＜２４＞〜＜２６＞のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖における前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、架橋化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡから独立して選択されるヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜２８＞ ＜２７＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
＜２９＞ ＜２７＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−ＯＣＯ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−２’によって、２’位の炭素と４’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体（ｐ、ｍ及びｎは、各々１〜４、０〜２及び１〜３の整数である。Ｒ_３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す）。
＜３０＞ ＜２４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖は、
（ｉ）前記５’末側に少なくとも２つの、ホスホロチオエート化されている２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡヌクレオチドからなる５’ウィング領域、
（ｉｉ）前記３’末側に少なくとも２つの、ホスホロチオエート化されている２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡヌクレオチドからなる３’ウィング領域、及び、
（ｉｉｉ）少なくとも４個の連続した天然ＲＮＡヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然ＲＮＡヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３１＞ ＜２４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖は、
（ｉ）前記５’末側に少なくとも２つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域、
（ｉｉ）前記３’末側に少なくとも２つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域、及び、
（ｉｉｉ）少なくとも４個の連続した天然ＲＮＡヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然ＲＮＡヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３２＞ ＜１＞〜＜２２＞のいずれか１に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖はＰＮＡヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３３＞ ＜２３＞〜＜３２＞のいずれか１に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３４＞ ＜１＞〜＜３＞及び＜５＞〜＜３３＞のいずれか１に記載の二重鎖核酸複合体であって、第２の核酸鎖にアニーリングする第３の核酸鎖を更に含む二重鎖核酸複合体。＜３５＞ ＜３４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第３の核酸鎖は、ＤＮＡヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログを含み、
また、第３の核酸鎖は、４個の連続したＤＮＡヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの総数が１０〜１００ヌクレオチドであり、
該第３の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチド配列を更に有する、二重鎖核酸複合体。
＜３６＞ ＜３５＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第３の核酸鎖は、
（ｉ）前記５’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる５’ウィング領域、
（ｉｉ）前記３’末側に少なくとも２つの連続したヌクレオチドアナログからなる３’ウィング領域、及び、
（ｉｉｉ）少なくとも４個の連続したＤＮＡヌクレオチド
を含み、前記５’ウィング領域及び前記３’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記ＤＮＡヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
＜３７＞ ＜３４＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、第３の核酸鎖はＰＮＡヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３８＞ ＜３４＞〜＜３７＞のいずれか１に記載の二重鎖核酸複合体であって、第３の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
＜３９＞ ＜３３＞〜＜３８＞のいずれか１に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、二重鎖核酸複合体。
＜４０＞ ＜３９＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、前記３’末端のヌクレオチド又は前記５’末端のヌクレオチドに結合している、二重鎖核酸複合体。＜４１＞ ＜３９＞又は＜４０＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が脂質である、二重鎖核酸複合体。
＜４２＞ ＜４１＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
＜４３＞ ＜４１＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
＜４４＞ ＜３９＞又は＜４０＞に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である、二重鎖核酸複合体。
＜４５＞ 薬理学上許容される担体と、＜１＞〜＜４４＞のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体とを含む、医薬組成物。
＜４６＞ 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための薬剤を製造するための、＜１＞〜＜４４＞のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
＜４７＞ 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための、＜１＞〜＜４４＞のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
＜４８＞ 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
第２の核酸鎖がアニーリングしている第１の核酸鎖と、薬理学上許容される担体とを含む、単離又は精製された二重鎖核酸複合体を、前記医薬組成物は含み、
第１の核酸鎖は、ＤＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、少なくとも４個の連続したＤＮＡヌクレオチドとを含み、第１の核酸鎖におけるＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は１０〜１００ヌクレオチドであり、
第１の核酸鎖は、哺乳動物の転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第２の核酸鎖は、
（ｉ）ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含み、
（ｉｉ）ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
（ｉｉｉ）ＰＮＡヌクレオチドを含み、
第２の核酸鎖におけるＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びＰＮＡヌクレオチドの総数は、１０〜１００ヌクレオチドである、方法。
＜４９＞ ＜４８＞に記載の方法であって、投与経路が経腸管的である、方法。
＜５０＞ ＜４８＞に記載の方法であって、投与経路が非経腸管的である、方法。
＜５１＞ ＜４８＞〜＜５０＞のいずれか一に記載の方法であって、前記二重鎖核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、方法。
＜５２＞ ＜４８＞〜＜５１＞の方法であって、前記哺乳動物がヒトある、方法。

【発明の効果】

【0015】

ある実施形態によれば、二重鎖核酸複合体中のアンチセンス核酸を送達することができ、かつ当該アンチセンス核酸によって標的遺伝子の発現を特異的に、非常に効果的に抑制することが可能となる。いくつかの実施形態においては、二重鎖核酸複合体に送達部分を結合させることによって、該複合体を特異性高く効率的に標的部位に送達することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、アンチセンス法の一般的なメカニズムを示す図である。概略図に示す通り、標的遺伝子のｍＲＮＡの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））（図中「ＤＮＡ」）を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が選択的に阻害される。破線での囲み部分においては、ＡＳＯにハイブリダイズした部位においてＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの切断が生じる、分解のメカニズムを示す。ＲＮａｓｅＨによる切断の結果、機能的な遺伝子発現産物を製造するための翻訳に、通常ｍＲＮＡを供することができなくなる。

【図2】図２は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＬＮＡヌクレオチドの構造を示す概略図である。

【図3】図３Ａ〜Ｂは、二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。５’−ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡ−３’核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸である。図中「（ｓ）」はホスホロチオエート結合している核酸を示し、「（ｏ）」は、天然のホスホロチオエート結合している核酸を示し、「（ｍ／ｓ）」は、ホスホロチオエート化及び２’−Ｏ−メチル化されているＲＮＡを示す。また、「Ｘ」は機能性分子を表わし、脂質（例えば、コレステロール、トコフェロール）、糖等、又はタンパク質やペプチド（例えば、抗体）等を独立して示す。

【図4】図４Ａ〜Ｂは、３本の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。該二重鎖核酸複合体においては、第１のＡＳＯ核酸鎖と第２の相補的核酸鎖とが異なる鎖長を有し、ペプチド、抗体等の機能性部分を結合させるためのＰＮＡを含む、第３の核酸鎖が含まれる。図中の表記は図３におけるそれらと同義である。

【図5】図５Ａ〜Ｂは、少なくとも第１のＡＳＯ核酸鎖と第２の相補的核酸鎖とが異なる鎖長を有している、二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。これらの態様においては、（Ａ）第２の核酸鎖に相補的な第３の核酸鎖を更に含む核酸、及び、（Ｂ）第２の核酸鎖にヘアピンリンカーによって結合している、ホスホロチオエート化しているＤＮＡからなる自己相補的領域を更に含む、第２の核酸のいずれかである。図中、「（ｍ）」は２’−Ｏ−メチル化されているＲＮＡを示す。他の表記は図３におけるそれらと同義である。

【図6】図６Ａは、５’−ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡ−３’の構造を有する核酸であって、５’末端をＣｙ３蛍光色素にて標識した核酸を示す概略図である。図６Ｂは、５’−ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡ−３’の構造を有する核酸であって、５’末端をＣｙ３蛍光色素にて標識し、３’末端をコレステロール（「Ｃｈｏｌ」）にて標識した核酸を示す概略図である。「（Ｓ）」はホスホロチオエート化されている核酸を示す。

【図7】図７は、Ｃｙ３にて蛍光標識してある「ＬＮＡ」（図６Ａに基づく）又はＣｙ３にて蛍光標識してある「ｃｈｏｌ−ＬＮＡ」（図６Ｂに基づく）を投与したマウスの肝臓を観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。

【図8】図８は、ＡｐｏＢ１遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有する、「１２ｍｅｒ Ｃｙ３−Ｃｈｏｌ−ＬＮＡ（ＡｐｏＢ１）」（図６Ｂに基づく）、「２０ｍｅｒ Ｃｙ３−Ｃｈｏｌ−ＬＮＡ（ＡｐｏＢ１）」若しくは「２９ｍｅｒ Ｃｙ３−Ｃｈｏｌ−ＬＮＡ（ＡｐｏＢ１）」、又は「１２ｍｅｒ Ｃｙ３−ＬＮＡ（ＡｐｏＢ１）」（図６Ａに基づく）をマウスに投与し、これらマウスの肝臓におけるＡｐｏＢ１遺伝子の発現量を定量的ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。

【図9】図９は、二重鎖核酸のある態様を示す概略図である。表記は図３〜６におけるそれらと同義である。

【図10】図１０は、ある実施態様によって、二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価するために用いた、アンチセンス鎖（ＡＳＯ）と、その相補鎖（ｃＲＮＡ（ｏ）、ｃＲＮＡ（Ｇ）、及びｃＲＮＡ（ｍ／Ｓ）)とを示す概略図である。表記は、図３〜６及び９におけるそれらと同義である。

【図11】図１１は、図１０に示したアンチセンス鎖と相補鎖とのアニーリングの有無を電気泳動により分析した結果を示す写真である。パネルＡはＵＶ照射下で写真撮影した結果を示し、パネルＢはゲルの写真を示す。

【図12】図１２は、図１０に示したアンチセンス鎖と相補鎖とをアニーリングさせ、さらにＲＮａｓｅＨにて処理したものを電気泳動により分析した結果を示す、ＵＶ照射下にて撮影した写真である。

【図13】図１３は、図１０に示したアンチセンス鎖、又は、図１０に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの１つとからなる二重鎖核酸を（０．４ｎＭ又は１０ｎＭの濃度にて）細胞に導入して、得られた結果を示すグラフである。転写産物が前記アンチセンス鎖の標的となるＡｐｏＢ１遺伝子の前記細胞における発現量は定量的ＰＣＲにて分析した。

【図14】図１４は、図１０に示したアンチセンス鎖、又は、図１０に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの１つとからなる二重鎖核酸を導入した細胞におけるＡｐｏＢ１遺伝子の発現量を、アンチセンス鎖のみを導入した細胞におけるそれを基準にして分析した結果を示すグラフである。

【図15】図１５は、二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価するために用いた、アンチセンス鎖と、相補鎖（ｃＲＮＡ(Ｇ)）と、トコフェロール機能性部分を備えた相補鎖（Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ(Ｇ)）とを示す概略図である。「Ｔｏｃ」は、トコフェロールを示す。他の表記は、図３〜６、９及び１０におけるそれらと同義である。

【図16】図１６は、図１５に示したアンチセンス鎖、又は、図１５に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの１つとからなる二重鎖核酸をマウスに投与し、転写産物が該アンチセンス鎖の標的となるＡｐｏＢ１遺伝子の当該マウスにおける発現量を分析した結果を示すグラフである。

【図17】図１７は、図１５に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の特異性を評価した結果を示すグラフである。

【図18】図１８は、図１５に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の用量依存性を評価した結果を示すグラフである。

【図19A】図１９Ａは、図１５に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の持続性を評価した結果を示すグラフである。なお図中、「ｄ」は当該二重鎖核酸を投与してからの日数を示す。

【図19B】図１９Ｂは、図１５に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の持続性を評価した結果を示すグラフである。なお図中、「ｄ」は当該二重鎖核酸を投与してからの日数を示す。

【図20A】図２０Ａは、ある実施態様における、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補鎖とを示す概略図である。

【図20B】図２０Ｂは、全て２’−Ｏ−メチル化処理されているＲＮＡを含む相補鎖を有する、本発明のある実施態様における二重鎖核酸複合体（ＬＮＡ／ｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭ）のアンチセンス効果を評価することにより、得られた結果を比較したグラフである。

【図21】図２１は、機能性部分としてのペプチド、タンパク質等を組み込むために利用可能な、二重鎖核酸の好適な態様を示す概略図である。図中の表記は図３及び４におけるそれらと同義である。

【図22】図２２は、３本の鎖、すなわちアンチセンス鎖と、ＲＮＡを含む相補鎖と、ペプチド等を結合させるためのＰＮＡ鎖とからなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価することによって得られた結果を示すグラフである。

【図23】図２３は、ＰＮＡを含む相補鎖とアンチセンス鎖とからなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価することによって得られた結果を示すグラフである。

【図24】図２４は、ある実施態様における、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補鎖とを示す概略図である。

【図25A】図２５Ａは、図２４に示す鎖から調製した二重鎖核酸複合体に関し、得られた結果を示すグラフである。

【図25B】図２５Ｂは、図２４に示す鎖から調製した二重鎖核酸複合体に関し、得られた結果を示すグラフである。

【図26】図２６は、二重鎖核酸複合体による発現抑制に関し、実施例１１において得られた結果を示すグラフである。

【図27A】図２７Ａは、異なる鎖長の二重鎖核酸複合体によるｈＴＴＲの発現抑制を評価した、実施例１２において得られた結果を示すグラフである。

【図27B】図２７Ｂは、異なる鎖長の二重鎖核酸複合体によるｈＴＴＲの発現抑制を評価した、実施例１２において得られた結果を示すグラフである。

【図28】図２８は、二重鎖核酸複合体が標的とするタンパク質の血清中のレベルを、該複合体の投与前後にて評価した、実施例１２において得られた結果を示すグラフである。

【図29】図２９は、３本の鎖を含む二重鎖核酸複合体の局在を示す、実施例１３において得られた結果を示す蛍光画像である。

【図30】図３０は、３本の鎖を含む二重鎖核酸複合体によって生じる発現抑制を示す、実施例１３の結果を示すグラフである。

【図31】図３１は、ｍｉＲＮＡレベルの抑制を示す、実施例１４の結果を示すグラフである。

【図32】図３２は、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）ヌクレオチドアナログを有するＡＳＯを含む二重鎖核酸複合体による発現抑制を示す、実施例１５において得られた結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

アンチセンス核酸と該アンチセンス核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸複合体
ある実施形態において、精製又は単離された二重鎖核酸複合体は、第２の核酸鎖にアニーリングしている第１の核酸鎖を含み、標的遺伝子の発現、又は通常転写産物レベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。

【0018】

第１の核酸鎖は、
（ｉ）ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は８〜１００であり、
（ｉｉ）転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含み、
（ｉｖ）前記転写産物にハイブリダイズする。

【0019】

第２の核酸鎖は、
（ｉ）ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含み、
（ｉｉ）ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
（ｉｉｉ）ＰＮＡヌクレオチドを含む。

【0020】

「アンチセンス効果」とは、標的転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、例えば、その部分配列に相補的なＤＮＡ鎖、又は通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合において、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果（図１の点線囲み枠外上部分の記載 参照）、及び/又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解（図１の点線囲み枠内の記載 参照）によって生じる、前記抑制を意味する。

【0021】

アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」又は「標的転写産物」としては、特に制限はなく、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡでもよい。

【0022】

「精製又は単離された二重鎖核酸複合体」という文言は、ここでは少なくとも１のヌクレオチド鎖を含む核酸複合体であって、天然では生じず、また天然に生じる核酸物質を実質的に含まないものを意味する。

【0023】

「相補的」という文言は、ここでは水素結合を介して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン−クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。標的転写産物の塩基配列、例えば、標的遺伝子の転写産物と、第１の核酸鎖の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。配列の相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより決定することができる。第１の核酸鎖と第２の核酸鎖とは、それらの配列が相補的である場合に「アニーリング」し得る。当業者であれば、２本の核酸鎖がアニーリングできる条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。また、当業者であれば、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。

【0024】

ある実施形態においては、第１の核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物等の標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、第１の核酸鎖が前記転写産物にハイブリダイズした際に、少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含む領域を有する核酸である。

【0025】

ここでは、「核酸」とはモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラ―ゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。

【0026】

第１の核酸鎖の鎖長としては特に制限はないが、少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、又は少なくとも１３塩基である。前記鎖長は、２０塩基以下、２５塩基以下又は３５塩基以下であってもよく、約１００塩基であってもよい。前記鎖長の範囲は、１０〜３５塩基であり、１２〜２５塩基であり、又は１３〜２０塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。

【0027】

「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチド」は、通常、４〜２０塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、５〜１６塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、又は、６〜１２塩基の連続しヌクレオチドを含む領域である。また、この領域には、天然型ＤＮＡのような、ＲＮＡヌクレオチドにハイブリダイズした際に、ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅＨによって認識されるヌクレオチドを用いることができる。修飾されたＤＮＡヌクレオチド及び他の塩基といった、好適なヌクレオチドは、この分野において知られている。また、ＲＮＡヌクレオチドのような、２’位にヒドロキシ基を有するヌクレオチドは、不適当であることも知られている。「少なくとも４つの連続したヌクレオチド」を含むこの領域への利用に関し、当業者であればヌクレオチドの適合性を容易に決定することができる。

【0028】

ある実施形態において、第１の核酸鎖は「ヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む。この文言は、第１の核酸鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意にヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。

【0029】

ここで「ＤＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＤＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＤＮＡヌクレオチドを意味する。同様に、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ヌクレオチドを含む領域の一部又は全部は、ＤＮＡ分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、ＤＮＡは修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’−Ｏ−メチル化、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。さらに、かかる修飾は同一のＤＮＡに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。また、後述の通り、同様の効果を奏するために、ＲＮＡヌクレオチドに修飾を施してもよい。

【0030】

ある場合において、修飾されたＤＮＡの数や位置によっては、ここで開示する二重鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の二重鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後の二重鎖核酸複合体の測定値が修飾前の二重鎖核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているような、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。

【0031】

ここで「ヌクレオチドアナログ」は天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、２以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が２以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。２以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における２箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、２’位の炭素と４’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における第１の核酸鎖においては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び/又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、第１の核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。「ヌクレオチドアナログ」としては、修飾（架橋、置換等）により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び/又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平１０−３０４８８９号公報国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０−１９５０９８号公報、特表２００２−５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する）において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸：ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化核酸、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）化核酸、２’−ＡＰ（２’−Ｏ−アミノプロピル）化核酸、２’−フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'−Ｆ−ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が挙げられる。

【0032】

ある実施態様におけるＢＮＡとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、２以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであればよい。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなＢＮＡの一のサブグループとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｐ−ＯＣＯ−２’、４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−２’によって架橋されているＢＮＡを挙げられる（ここで、ｐ、ｍ及びｎは、各々１〜４、０〜２及び１〜３の整数である。Ｒ_３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等）を示す）。さらに、ある実施態様におけるＢＮＡにおいて、３’位の炭素における置換基：ＯＲ_２及び５’位の炭素における置換基：ＯＲ_１のＲ_１及びＲ_２は、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−Ｐ（Ｒ_４）Ｒ_５（式中、Ｒ_４及びＲ_５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）であってもよい。このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’−ＢＮＡ）とも称される、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）又はβ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_３）−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^ＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡ^ＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡ，５’−メチルＢＮＡ，ｃＥｔ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ，ｃＭＯＥ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ，ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ （４’−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ （Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ），当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。

【0033】

さらに、ある実施態様における修飾核酸においては、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。

【0034】

全体として、修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載、特に１７〜２２欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。

【0035】

当業者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、適宜ヌクレオチドアナログを選択して利用することができるが、ある実施形態において、ヌクレオチドアナログは下記式（１）で表わされるＬＮＡである。

【0036】

【化1】

【0037】

（式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の修飾の例は、前述の通りである。
Ｒ_１、Ｒ_２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−Ｐ（Ｒ_４）Ｒ_５［ここで、Ｒ_４及びＲ_５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。

【0038】

なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、ある実施形態における「ＬＮＡ」及び通常ＢＮＡには、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、ＬＮＡといったＢＮＡは、二重鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。

【0039】

ある実施態様における「１又は複数のヌクレオチドアナログを含むウィング領域」は、前記少なくとも４つ以上の連続したＤＮＡヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）の５'末側及び／又は３'末側に配置されるものである。

【0040】

該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられているヌクレオチドアナログを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかるヌクレオチドアナログ以外に天然型の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）も含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１〜１０塩基であり、１〜７塩基、又は２〜５塩基である。

【0041】

さらに、５’ウィング領域及び３’ウィング領域において、ヌクレオチドアナログ及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも４つ以上の連続したＤＮＡヌクレオチド」を含む領域同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸のそれよりも有意に低下していなければ、当該修飾は好ましい態様であると評価することができる。

【0042】

なお、従前から試みられているＲＮＡやＬＮＡのみからなるアンチセンス法は、標的となるｍＲＮＡと結合することで翻訳を抑制したが、その効果は概して不十分であった。一方ＤＮＡのみからなるアンチセンス法では、標的遺伝子と結合するとＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖構造となるため、ＲＮａｓｅＨの標的となることでｍＲＮＡが切断されることにより強い標的遺伝子発現抑制効果が期待できたが、標的遺伝子との結合自体が弱いため実際の効果はやはり不十分だった。

【0043】

従って、第１の核酸鎖において、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡが配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つＬＮＡ（又は他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を促進することとなる。「鎖長が４塩基であるＤＮＡ」は、ＤＮＡヌクレオチドだけに制限されるわけではなく、第１の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを、第１の核酸鎖が含むことも意図するものである。ある実施形態において、標的転写産物とのヘテロ二重鎖形成により生じるアンチセンス効果が極めて高いという観点から、第１の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含む領域の、５'末側及び３'末側に配置された修飾核酸を含む領域は、任意にヌクレオチドアナログを含んでいることが望ましい。該ヌクレオチドアナログはＢＮＡであってもよく、例えばＬＮＡであってもよい。

【0044】

ある実施形態における第２の核酸鎖は、前述の第１の核酸鎖と相補的な核酸である。第２の核酸鎖の塩基配列と第１の核酸鎖の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。

【0045】

第２の核酸鎖としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及びＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１種の核酸からなるオリゴブクレオチドである。より具体的には、第２の核酸鎖は、（ｉ）ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含み、
（ｉｉ）ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含み、又は、（ｉｉｉ）ＰＮＡヌクレオチドを含む。

【0046】

「ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含む」という文言は、第２の核酸鎖はＲＮＡヌクレオチドを含み、さらに任意にヌクレオチドアナログを含んでもよく、さらにまた任意にＤＮＡヌクレオチドを含んでもよいということを意味する。「ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む」という文言は、第２の核酸鎖はＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのいずれかを含んでいてもよく、またＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを共に含んでいてもよいということを意味する。「ＰＮＡヌクレオチドを含む」とは第２の核酸鎖はＰＮＡヌクレオチドから構成されてもよいということを意味する。

【0047】

しかしながら、後述の実施例において示すように、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が細胞内のＲＮａｓｅＨに認識され、第２の核酸鎖が分解されることにより、第１の核酸鎖のアンチセンス効果が発揮し易くなるという観点から、第２の核酸鎖はＲＮＡを含む。また、ある実施形態における二重鎖核酸複合体にペプチド等の機能性分子を結合させ易いという観点からは、第２の核酸鎖はＰＮＡである。

【0048】

ここで、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。

【0049】

第２の核酸鎖において、核酸の一部又は全部は、ＲＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’−Ｏ−メチル化、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化が挙げられる。また、ウラシル塩基をチミジン塩基に置換したＲＮＡヌクレオチドの利用も考えられるが、薬物動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、かかる修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていても良く、例えば、後述の実施例において用いられているように、酵素による切断に対する抵抗性を付与するため、同一のＲＮＡに対して、ホスホロチオエ―ト化及び２’−Ｏ−メチル化を施してもよい。しかしながら、ＲＮａｓｅＨによってＲＮＡヌクレオチドが切断されることを期待し、又は望む場合には、ホスホロチオエ―ト化及び２’−Ｏ−メチル化のいずれかのみを施すことができる。

【0050】

修飾の数や位置は、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、第２の核酸鎖におけるヌクレオチドアナログの数及び修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述の第１の核酸鎖同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。このような好ましい態様として、第２の核酸鎖が特定の細胞の核内に送達されるまで、ＲＮａｓｅＡ等のＲＮＡ分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはＲＮａｓｅＨにより該核酸鎖が分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、第２の核酸鎖はＲＮＡであって、第１の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域（すなわち、５’ウィング領域及び／又は３’ウィング領域）に対して相補的な領域は、修飾された核酸又はヌクレオチドアナログであり、前記修飾又はアナログがＲＮＡ分解酵素等の酵素による分解を抑制する効果を有するものである。ある実施態様においては、前記修飾はＲＮＡに対する２’−Ｏ−メチル化及び／又はホスホロチオエ―ト化である。また、このような場合、第１の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域に相補的な領域の全てが修飾されていてもよく、第１の核酸鎖の修飾核酸を含む領域に相補的な領域の一部が修飾されていてもよい。さらに、修飾されている領域は、該一部を含む限り、第１の核酸鎖の修飾核酸を含む領域よりも長くなっていてもよく、短くなっていてもよい。

【0051】

ある実施形態における二重鎖核酸複合体において、第２の核酸鎖に機能性部分が結合していてもよい。第２の核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第２の核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。

【0052】

ある実施形態において、「機能性部分」の構造上、特に制限はなく、それを結合する二重鎖核酸複合体及び/又は核酸鎖に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物が挙げられる。

【0053】

また、第１の核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第２の核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二重鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。

【0054】

「標的への送達機能」を有する部分として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある実施形態における二重鎖核酸複合体を送達できるという観点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、ある実施形態において、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）を利用することが好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の二重鎖核酸を送達できるという観点から、ある実施形態における「機能性部分」としては、糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的にある実施形態における二重鎖核酸複合体を送達できるという観点から、受容体のリガンドや抗体、及び／又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質が、ある実施形態における「機能性部分」として挙げられる。

【0055】

ある実施形態における二重鎖核酸複合体において、第１の核酸鎖の鎖長と第２の核酸鎖の鎖長とは同一であってもよく、異なっていてもよい。ある実施形態において、第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖の鎖長が同一である二重鎖核酸複合体としては、例えば、図３に示す二重鎖核酸の態様が挙げられる。

【0056】

また、ある実施形態において、第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖の鎖長が異なる本発明の二重鎖核酸としては、例えば、図４及び５に示す二重鎖核酸の態様が挙げられる。すなわち、いくつかの実施態様においては、前述の第１及び第２の核酸鎖に加え、さらに、第３の核酸鎖を含む、二重鎖核酸を提供することができる。

【0057】

第３の核酸鎖は、第１及び第２の核酸鎖のうち鎖長が長い核酸における他の一方の核酸に対して突出した領域に対して相補的な核酸鎖である。

【0058】

いくつかの実施形態において、第３の核酸鎖は、第１の核酸鎖のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能する。第３の核酸鎖は、第１の核酸鎖と同一の配列を標的とすることも、異なる配列を標的とすることもできる。このように、前述の第１の核酸鎖に関する構造及びヌクレオチドの構成は、同様に、第３の核酸鎖の構造及び構成として適用し得る。また第２の核酸鎖と同様に、第３の核酸鎖に前述の機能性部分を直接又は間接的に結合させることにより、様々な機能を第３の核酸鎖に付与することができ、例えば、薬剤送達複合体として機能させることができる。

【0059】

例えば、図４に示すように、第３の核酸鎖としてＰＮＡを用いた場合には、ＰＮＡとタンパク質（アミノ酸）とはペプチド結合を介して結合させることができるので、いくつかの実施形態において、タンパク質等を含む機能性部分を有する二重鎖核酸複合体を容易に調製することができる。また、図４に示す二重鎖核酸のＰＮＡは、図３の下部に示す、いくつかの実施形態における二重鎖核酸のＲＮＡよりも鎖長が短くて済み、さらに標的遺伝子の塩基配列にＰＮＡを対応させる必要がないので、量産することができる。一般的にＰＮＡの合成にはコストがかかるため、図４に示す二重鎖核酸は比較的安価な二重鎖核酸を提供できるという点で好ましい態様である。特に、図４の下部に示す二重鎖核酸については、タンパク質等を含む第１の機能性部分のみならず、脂質等を含んでいてもよい第２の機能性部分も有しているので、二重鎖核酸複合体を標的部位により特異性高く、より効率良く送達することが可能となる。

【0060】

また、一般的に、化合物を経腸投与（経口投与等）した場合には、その化合物は血管ではなく、リンパ管を通して生体内に拡散されていく。しかしながら、リンパ管に達するためには、化合物の分子量は１１０００〜１７０００ダルトン以上であることが必要となる。さらに、経腸投与した化合物は、腸管内のＲＮａｓｅＡに曝露されることになるため、ＲＮＡを含有する核酸医薬は、当該ＲＮＡの部分を全て２’−Ｏ−メチル化等にて修飾しておくことが極めて好ましい。従って、図５に示す二重鎖核酸は、約１８０００ダルトンの分子量を有し、ＲＮＡ部分が全て２’−Ｏ−メチル化されているので、経腸投与に好適に利用できる。また、図５の下部に示す二重鎖核酸においては、ＤＮＡ鎖（第３の核酸鎖）と、該ＤＮＡ鎖及びＲＮＡからなる相補鎖（第２の核酸鎖）を結合させるヘアピンループ核酸（好ましくは４〜９塩基からなる核酸）とを有する。

【0061】

以上、いくつかの実施態様において、二重鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における二重鎖核酸は上記典型例に限定されるものではない。また、いくつかの実施形態において、第１の核酸鎖、第２の核酸鎖及び第３の核酸鎖は、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列（又は、いくつかの場合においては標的遺伝子の塩基配列）の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約９０〜９８℃にて数分間（例えば、５分間）かけて変性させた後、約３０〜７０℃にて約１〜８時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を調製することができる。また、機能性部分が結合している二重鎖核酸複合体は、予め機能性部分を結合させた核酸種を用いて、前記の通り、合成、精製及びアニーリングすることにより、調製することができる。機能性部分と核酸とを結合させるための多くの方法は、当該分野においてよく知られている。

【0062】

以上、本発明の二重鎖核酸の好適な実施態様について説明したが、後述の実施例において示す通り、いくつかの実施形態にかかる「第２の核酸鎖」は、アンチセンス効果を低下させることなく、アンチセンス核酸を標的部位に効率良く送達できるという点において優れている。従って、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は上記実施態様に限定されるものではなく、例えば、前述の第１の核酸鎖の代わりに、下記アンチセンス核酸を含む態様も提供することができる。

【0063】

標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸複合体であって、（ｉ）標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、ＤＮＡを含まない核酸と、（ｉｉ）（ｉ）の核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸複合体。

【0064】

すなわち、ある実施形態において、アンチセンス核酸はＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果を有する。「ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果」とは、標的遺伝子の転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、その部分配列に相補的な核酸鎖とがハイブリダイズすることによる翻訳の阻害やエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果によって生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性のことを意味する（図１の点線囲み枠外上部分の記載参照）。

【0065】

「ＤＮＡを含まない核酸」は、天然型ＤＮＡ及び修飾されたＤＮＡを含まないアンチセンス核酸を意味し、例えば、ＰＮＡ又はモルホリノ核酸からなる核酸が挙げられる。また、「ＤＮＡを含まない核酸」において、第１の核酸鎖又は第２の核酸鎖同様に、核酸の一部又は全部は、核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、修飾されたヌクレオチドにて構成されていてもよい。このような修飾の例としては前述の通りであり、さらに、修飾は同一の核酸に対して複数種組み合わせて施されていてもよい。また、修飾された核酸の数や修飾の位置に関する好ましい態様は、前述の第１の核酸鎖同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。

【0066】

「ＤＮＡを含まない核酸」の塩基配列と、該核酸に相補的な核酸の塩基配列又は標的遺伝子の転写産物の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。

【0067】

「ＤＮＡを含まない核酸」の鎖長としては特に制限はないが、通常１０〜３５塩基であり、好ましくは１２〜２５塩基であり、より好ましくは１３〜２０塩基である。

【0068】

いくつかの実施形態にかかる「ＤＮＡを含まない核酸に相補的な核酸」は、前述の第２の核酸鎖と同様である。また、ＤＮＡを含まない核酸と該核酸に相補的な核酸との鎖長が異なる場合には、この態様においても前記第３の核酸鎖を含んでもよい。さらに、この態様においても、「ＤＮＡを含まない核酸に相補的な核酸」及び／又は第３の核酸鎖に前述の機能性部分が結合していてもよい。

【0069】

標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制するための組成物 いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率良く標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の送達標的領域以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるため、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も、いくつかの実施形態において提供することができる。

【0070】

いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。

【0071】

これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。

【0072】

製剤化等に際し、非特許文献１に示すように、機能性部分として脂質が結合している、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体においては、カイロミクロンやカイロミクロンレムナント等のリポタンパク質との複合体を形成させてもよい。さらに、経腸投与の効率を高めるという観点から、前記リポタンパク質に加え、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体（塩、エステル体又はエーテル体））及び界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。

【0073】

いくつかの実施形態における組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。

【0074】

いくつかの実施形態における組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。

【0075】

いくつかの実施形態における組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。

【0076】

いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率的に標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態においては、対象に対して、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を投与し、標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、いくつかの実施形態における組成物を対象に投与することによって、標的遺伝子の発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。

【実施例】

【0077】

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下に記載の実験に供したマウスは、ＩＣＲマウス、４〜６週齢、雌、体重は２０〜２５ｇであり、マウスを用いた実験は特に断りのない限り、全てｎ＝３〜４にて施行した。また、本実施例で用いたＢＮＡは前記式（１）で表わされるＬＮＡである。また、比較例１及び実施例１〜１５に記載の配列を表１〜３に示す。

【0078】

【表1】

【0079】

【表2】

【0080】

【表3】

【0081】

（比較例１）
アンチセンス法におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の安定性、生体内における標的遺伝子の発現に対する抑制活性（アンチセンス効果）及び送達性を向上させるべく、コレステロールを直接結合させた、ＬＮＡヌクレオチド及びＤＮＡヌクレオチドを含むＡＳＯ（ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー）の生体内における送達性及びアンチセンス効果を評価した。

【0082】

概要を図６に示した、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー構造を有する２つのＡＳＯを調製した。すなわち、蛍光色素であるＣｙ３をＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーＡＳＯの５’末端に共有結合したＡＳＯ（Ｃｙ３−ＡＳＯ）(図６Ａ）と、Ｃｙ３−ＡＳＯの３’末端にコレステロールを共有結合したＡＳＯ（Ｃｙ３−Ｃｈｏｌ−ＡＳＯ）(図６Ｂ）とを用意した。なお、このＡＳＯの標的遺伝子はアポリポ蛋白Ｂ（ＡｐｏＢ）遺伝子であり、その配列は以下に示す通りである。また、これらＡＳＯは株式会社ジーンデザインに合成を依頼して調製した。
ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣ（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間：ホスホロチオエート結合）（配列番号：１）。

【0083】

なお、公知の手法に沿って、Ｃｙ３とＡＳＯとは、ホスホロチオエート結合にて結合させ、またコレステロールとＡＳＯとは、テトラエチレングリコールを介して結合させた。

【0084】

そして、これらＡＳＯをそれぞれマウス尾静脈から１０ｍｇ／ｋｇで静脈注射し、その１時間後に解剖して肝臓を取り出した。得られた肝臓を４％ ホルマリン溶液で固定した後、３０％スクロース溶液で置換し、ＯＣＴコンパウンドで包埋した後、１０μｍの厚さで切片を作製した。次いで、ＤＡＰＩを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡で切片におけるＣｙ３の信号強度を比較した。得られた結果を図７に示す。

【0085】

また、Ｃｙ３−ＡＳＯ及びＣｙ３−Ｃｈｏｌ−ＡＳＯを、それぞれマウス３匹ずつに尾静脈から静脈注射し、その三日後にも二回目のＡＳＯの投与を行った。投与量はいずれも１０ｍｇ／ｋｇとした。また、陰性対照群としてＡＳＯの代わりにＰＢＳのみを投与したマウスも用意した。そして、二回目の投与の翌日にマウスをＰＢＳにて灌流した後、解剖して肝臓を摘出した。摘出した肝臓８０ｍｇに核酸抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ、ニッポンジーン社製）１ｍｌを加え、添付のプロトコールに従ってｍＲＮＡを抽出した。次いで、これらのｍＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｍＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III(インビトロジェン株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。そして、このように調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ ｓｙｓｔｅｍ（ロシュアプライドバイオサイエンス社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。また、温度、時間の条件は次の通りである。：９５℃にて１５秒、６０℃にて３０秒及び７２℃にて１秒を１サイクルとし、それを４０サイクル行った。そして、このようにして得られた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果に基づき、ｍＡｐｏＢの発現量／ｍＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を各々算出して、陰性対照群の算出結果とＡＳＯ投与群の算出結果とをｔ検定にて比較して評価した。得られた結果を図８に示す。

【0086】

図７に示した結果から明らかなように、コレステロールを直接結合させたＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーの方が、コレステロールを結合させていないそれよりもはるかに多く肝臓に集積していた。

【0087】

しかし、図８に示す通り、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーにコレステロールを直接結合させて用いると、そのアンチセンス効果は喪失してしまうことが明らかになった。

【0088】

（実施例１）
コレステロール等の機能性部分をＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（アンチセンス鎖）に直接結合すると、そのアンチセンス効果が損なわれてしまうことが明らかになった。そこで、ＡＳＯの相補鎖が、ＡＳＯを直接送達するための機能性部分のキャリアーとして機能する、二重鎖核酸複合体を利用することを本発明者らは着想した。図９に、かかる複合体の１の実施態様の概略を示す。

【0089】

例えば、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（ＬＮＡ及びＤＮＡを含むＡＳＯ）の相補鎖としてＲＮＡを用い、さらに当該ＲＮＡに機能性部分を結合させた場合には、当該ＡＳＯとＲＮＡからなる相補鎖（ｃＲＮＡ）との複合体は、ｃＲＮＡに結合させた機能性分子により標的部位に特異的に効率良く送達されることになる。そして、標的部位の細胞の核内に運ばれると、元々ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロオリゴヌクレオチドであるため核内に存在するＲＮａｓｅＨによってｃＲＮＡが切断され、前記ＡＳＯは単独で存在することになる。次いで、このＡＳＯが標的遺伝子のｍＲＮＡに結合し、新たなＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖が形成されることにより、アンチセンス効果を奏するため、ＲＮａｓｅＨにより当該ｍＲＮＡを分解されることになる。

【0090】

すなわち、機能性部分が結合しているｃＲＮＡの切断と、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解とをＲＮａｓｅＨを利用して行うことにより、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（ＬＮＡ及びＤＮＡを含むＡＳＯ）を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ、当該ＡＳＯのアンチセンス効果は機能性部分によって阻害されることなく、標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制することが可能となることを、本発明者らは着想した。

【0091】

そして、このような着想を実証すべく、先ずは、以下に示す方法にて、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとｃＲＮＡとの二重鎖ＤＮＡを調製し、その物性について評価した。

【0092】

ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとして、比較例１と同様に調製したＣｙ３−ＡＳＯを使用した。また、ｃＲＮＡとして、異なる３つの相補鎖を調製した。それら構造の概要を図１０に示す。１の構造は、通常のＲＮＡ（天然型ＲＮＡ)のみからなる相補鎖（ｃＲＮＡ−Ｏ）である。第２の構造においては、ｃＲＮＡ鎖の両末端の２塩基ずつを化学修飾（２’−Ｏ−メチル化及びホスホロチオエート化）してＲＮａｓｅ耐性を持たせている（ｃＲＮＡ（Ｇ））。第３の構造においては、全て化学修飾（２’−Ｏ−メチル化及びホスホロチオエート化）してＲＮａｓｅで切断されないようにしている（ｃＲＮＡ（ｍ／Ｓ））。これらプローブは、北海道システム・サイエンス株式会社に委託して製造した。ｃＲＮＡ鎖の配列は以下の通りである。
ｃＲＮＡ（ｏ）：５’−ＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵＧＣ−３’（配列番号：２）
ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：３）
ｃＲＮＡ（ｍ／ｓ）：５’−ｇ_ｓａ_ｓａ_ｓｕ_ｓａ_ｓｃ_ｓｃ_ｓａ_ｓａ_ｓｕ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：４）
（大文字：ＲＮＡ，小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ，ｓ：核酸間の結合がホスホロチエート結合）。

【0093】

ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとｃＲＮＡとをそれぞれ等モル量にて混合し、９５℃で５分間加熱した後、３７℃で１時間保温することにより、これら核酸鎖をアニーリングさせ、二重鎖核酸複合体を形成させた。アニーリングさせた核酸は４℃又は氷上で保存した。

【0094】

次いで、各ｃＲＮＡとアニーリングさせたＣｙ３−ＡＳＯ、及びＣｙ３−ＡＳＯを、それぞれＬＮＡ量で１００ｐｍｏｌずつ１５％アクリルアミドゲルにアプライし、１００Ｖで１時間電気泳動した。泳動後、ゲルを直接写真撮影し、次いでＵＶ下で写真撮影した。得られた結果を図１１Ａ、Ｂに示す。

【0095】

また、各ｃＲＮＡとアニーリングさせたＣｙ３−ＡＳＯ、及びＣｙ３−ＡＳＯをＲＮａｓｅＨに処理したものを前記同様に電気泳動し、ゲルをＵＶ照射下にて写真撮影した。得られた結果を図１２に示す。

【0096】

図１１に示した結果から明らかなように、一本鎖ＡＳＯであるＣｙ３−ＬＮＡ（レーン１）と比較して、Ｃｙ３−ＡＳＯとｃＲＮＡ（ｏ）とをアニーリングさせたもの、Ｃｙ３−ＡＳＯとｃＲＮＡ（Ｇ）とをアニーリングさせたもの、Ｃｙ３−ＡＳＯとｃＲＮＡ（ｍ／Ｓ）とをアニーリングさせたものは、移動速度が遅く、各々二重鎖核酸を形成していることが確認された。

【0097】

また、図には示さないが、ＤＮＡを含む相補鎖（ｃＤＮＡ）とＣｙ３−ＡＳＯとを混合して、前記同様にアニーリング処理したものを電気泳動にて分析したが、Ｃｙ３−ＡＳＯとバンドの高さが等しく、ｃＤＮＡとＣｙ３−ＡＳＯとでは二重鎖核酸が形成できないことも確認した。なお、評価したｃＤＮＡの配列及び修飾は、ウラシルをチミンに変更した以外、前記ｃＲＮＡ（ｏ）、ｃＲＮＡ（Ｇ）及びｃＲＮＡ（ｍ／Ｓ）と同じである（以下、同様）。

【0098】

また、図１２に示した結果から明らかなように、ＲＮａｓｅＨ処理を施しても、Ｃｙ３−ＡＳＯ及びｃＲＮＡ（ｍ／ｓ）からなる二本鎖は二重鎖核酸構造を維持したままであった。一方、ｃＲＮＡ（ｏ）及びｃＲＮＡ（Ｇ）は、Ｃｙ３−ＡＳＯと同程度の移動度であったため、二本鎖のうちの相補的ＲＮＡ鎖がＲＮａｓｅＨにより分解され、１本鎖核酸Ｃｙ３−ＡＳＯが二本鎖から放出され、一本鎖と同程度の移動を示し得ることが確認された。

【0099】

次に、前記電気泳動の他、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びｃＲＮＡを含む二重鎖核酸の融点（Ｔｍ）について下記に示す方法にて評価した。

【0100】

終濃度をそれぞれ塩化ナトリウム１００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、各オリゴヌクレオチド鎖２μＭとしたサンプル溶液（１００μＬ）を沸騰水中に浴し、１２時間かけて室温まで冷却した後、４℃で２時間放置した。窒素気流下、サンプル溶液を５℃まで冷却し、さらに１５分間５℃に保った後、測定を開始した。０．５℃／ｍｉｎの割合で９０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をプロットした。また、Ｔ_ｍ値は微分法により算出した。なお、上記測定はＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１６５０ＰＣを用いて行った。得られた結果を表４に示す。

【0101】

【表4】

【0102】

表４に示した結果から明らかなように、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとｃＤＮＡとが乖離する温度（Ｔｍ）は、全て体温よりも低かった。それに対し、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとｃＲＮＡとが乖離する温度（Ｔｍ）は、いずれも４０℃台を保っており、当該二重鎖核酸は室温や体温では乖離しないことが明らかになった。

【0103】

（実施例２）
実施例１と同様に、通常のＲＮＡのみからなる相補鎖（ｃＲＮＡ（ｏ））(配列番号：２）、全てのＲＮＡにおいて２’−ＯＭｅ（２’−Ｏ−メチル化）修飾及び核酸間がホスホロチオエート結合（Ｓ化）してある相補鎖（ｃＲＮＡ（ｍ／Ｓ））（配列番号：４）、末端の２塩基のＲＮＡのみに２’−ＯＭｅ修飾及び核酸間がＳ化してあり、中央の８塩基を通常のＲＮＡとしている相補鎖（ｃＲＮＡ（Ｇ））（配列番号：３）を用意し、いずれもＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーとアニーリングさせ、二重鎖核酸を調製した。ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーの標的遺伝子はラット由来のアポリポ蛋白Ｂ（ｒＡｐｏＢ）遺伝子である。ＡＳＯは、株式会社ジーンデザインにおいて合成にて製造された。

【0104】

ラット肝細胞の培養系（ＭｃＡ−ＲＨ７７７７）に、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー単独又は前記二重鎖核酸を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、添付の使用プロトコールに従い、トランスフェクションした。トランスフェクションの際の培地への添加濃度は０．４ｎＭ又は１０ｎＭとした。また、コントロールとして、核酸未添加の細胞も用意した。次いで、トランスフェクションしてから２４時間後にＩＳＯＧＥＮを用いて細胞を回収して、添付の使用プロトコールに従い、ｍＲＮＡを採取した。

【0105】

これらｍＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｍＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ IIIを用いて、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。次いで、このように調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。また、温度、時間の条件は次の通りである。９５℃にて１５秒、６０℃にて３０秒及び７２℃にて１秒を１サイクルとし、それを４０サイクル行った。そして、このようにして得られた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果に基づき、ｒＡｐｏＢの発現量／ｒＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を各々算出して、コントロールの算出結果と核酸投与群の算出結果とをｔ検定にて比較して評価した。得られた結果を図１３に示す。また、前記二重鎖核酸複合体における算出結果とＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー単独における算出結果とをｔ検定にて比較して評価した。得られた結果を図１４に示す。

【0106】

図１３に示す通り、０．４ｎＭという低濃度で投与した場合には、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（ｓｓ−ＡＳＯ）と比較して、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びｃＲＮＡ（ｏ）を含む二重鎖核酸（ＬＮＡ／ＲＮＡ（ｏ））、並びにＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びｃＲＮＡ（Ｇ）を含む二重鎖核酸（ＬＮＡ／ＲＮＡ（Ｇ））のアンチセンス効果はほぼ変わらないものであった。しかしながら、図１４に示す通り、１０ｎＭという高濃度で投与した場合には、その結果から、相補鎖は切断の影響を受けやすく（ＬＮＡ／ＲＮＡ（ｏ）及びＬＮＡ／ＲＮＡ（Ｇ））、一本鎖としてギャップマーＡＳＯを投与した場合と比較して、約２０％までアンチセンス効果が改善されることが示された。

【0107】

従って、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーにＲＮＡを含む相補鎖をハイブリダイズさせて２重鎖核酸複合体としても、細胞内の標的遺伝子の発現抑制効果（アンチセンス効果）は保たれていることが明らかになった。また、ＲＮａｓｅＨに影響を受けやすい相補的ＲＮＡ鎖を用いた場合、さらに細胞内のアンチセンス効果が上昇した。かかるアンチセンス効果の上昇は、核内で相補的ＲＮＡ鎖が切断されことによるものだと推測される。

【0108】

（実施例３）
次に、図１５に示す通り、前記ｃＲＮＡ（Ｇ）の５’末端にトコフェロール（Ｔｏｃ）を結合させた相補的ＲＮＡ鎖（Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ））を作製した。さらにＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（アンチセンス鎖）をアニーリングさせることにより、間接的にトコフェロールをアンチセンス鎖に結合することに成功した。なお、実施例において用いたＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及び相補鎖（ｃＲＮＡ）の配列、構成及び鎖長は下記の通りである。

【0109】

アンチセンスＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー鎖
１．ＡＳＯ １２ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣ−３’（配列番号：１）
２．ＡＳＯ １３ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ−３’（配列番号：５） ３．ＡＳＯ １４ｍｅｒ：５’−ＡＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ−３’（配列番号：６）
（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間は全てホスホロチオエート結合である）
相補鎖
１．ｃＲＮＡ １２ｍｅｒ：５’−ｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：２）
２．ｃＲＮＡ １３ｍｅｒ：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：７）
３．ｃＲＮＡ １４ｍｅｒ：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ_ｓｕ−３’（配列番号：６）
（大文字：ＲＮＡ、小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線付：ＰＮＡ、ｓ：核酸間がホスホロチオエート結合である）。

【0110】

トコフェロールとｃＲＮＡとの結合は、公知の手法に沿って行った。トコフェロールのクロマン環の６位の水酸基をホスホルアミダイト化したトコフェロールアミダイトを用意した。そして、標準的なカップリング法を用い、ＲＮＡの５‘末端とトコフェロールアミダイトとを連結させた。

【0111】

そして、このように調製した、１２塩基、１３塩基又は１４塩基の鎖長を有する、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（ｓｓ−ＡＳＯ）、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びｃＲＮＡ（Ｇ）を含む二重鎖核酸複合体（ＬＮＡ／ｃＲＮＡ（Ｇ））、並びにＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びＴｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）からなる二重鎖核酸複合体（ＬＮＡ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ））を０．７５ｍｇ／ｋｇずつ、それぞれマウスに尾静脈から静脈注射した。また、陰性対照群として一本鎖ＡＳＯ又は二重鎖核酸複合体の代わりにＰＢＳのみを注射したマウスも用意した。そして、注射してから７２時間後に、マウスをＰＢＳにて灌流した後、解剖して肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の方法と同様の方法にて、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｍＡｐｏＢの発現量／ｍＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を算出して、ＰＢＳのみ投与した群（ＰＢＳ ｏｎｌｙ）と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図１６に示す。

【0112】

図１６に示す通り、相補鎖にトコフェロールを結合させることにより、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）は特異的に効率良く肝臓に送達、集積され、ＡＳＯ／ｃＲＮＡ（Ｇ）と比較しても、顕著なアンチセンス効果を有していることが明らかになった。特に１３塩基の鎖長を有するＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡにおけるその効果は格別のものであった。

【0113】

（実施例４）
実施例３に記載の方法と同様の方法にて、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡの標的遺伝子に対する特異性を評価した。すなわち、１３塩基の鎖長を有するＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー及びＴｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）を含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ））を調製した。そして、それをマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のｃＤＮＡを用いて、肝臓内の標的遺伝子（ｍＡｐｏＢ遺伝子）及び内在性コントロール遺伝子（ｍＴＴＲ遺伝子、ｍＳＯＤ１遺伝子及びｍＧＡＰＤＨ遺伝子）の発現を定量的ＰＣＲにて評価した。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。得られた結果を図１７に示す。

【0114】

図１７に示した結果から明らかなように、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ １３ｍｅｒを投与したマウスの肝臓においては、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー（ＡＳＯ）の標的となる遺伝子転写産物である、ｍＡｐｏＢ遺伝子のみについて、その発現の顕著な低下が示された。従って、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー及びＴｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）を含む二重鎖核酸複合体においても、標的遺伝子に対する高い特異性が維持されていることが明らかになった。

【0115】

（実施例５）
実施例３に記載の方法と同様の方法にて、１３塩基の核酸鎖を用い、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）によるアンチセンス効果の用量依存性を評価した。すなわち、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ） １３ｍｅｒ二重鎖核酸複合体を０、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ又は０．７５ｍｇ／ｋｇずつマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のｃＤＮＡを用いて、ｍＡｐｏＢ遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにて評価した。得られた結果を図１８に示す。

【0116】

図１８に示した結果から明らかなように、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）のアンチセンス効果は用量依存的に発揮されることが示された。また、この結果から、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）の標的遺伝子の発現を半分まで抑制するのに必要な量（ＥＤ５０）は、約０．０３６ｍｇ／ｋｇであり、極めて低い濃度にて５０％抑制を達成することが明らかになった。

【0117】

（実施例６）
実施例３に記載の方法と同様の方法にて、ＡＳＯ／ｃＲＮＡ及びＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡによるアンチセンス効果の持続性を評価した。すなわち、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー（ｓｓ−ＡＳＯ）、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びｃＲＮＡ−Ｇを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＲＮＡ（Ｇ））又はＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びＴｏｃ−ｃＲＮＡを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ））をマウスに静脈注射した。静脈注射した全ての核酸の鎖長は１３塩基である。コントロールとして、核酸を含まないＰＢＳ溶液のみを注射したマウスも用意した。第１の実験においては、静脈注射してから１日後、３日後、７日後、１４日後、２８日後に肝臓を摘出し、当該肝臓由来のｃＤＮＡを用いて、ｍＡｐｏＢ遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにて評価した。得られた結果を図１９Ａに示す。ＰＢＳ溶液コントロール、一本鎖ＬＮＡのみ、及び二重鎖複合体ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）を用いて実験を繰り返し、同様の方法にて、静脈注射してから１日後、３日後、７日後、１４日後、２８日後及び４２日後のｍＡｐｏＢ遺伝子の発現レベルを評価した。得られた結果を図１９Ｂに示す。

【0118】

図１９Ａに示す通り、供試したいずれの核酸においても、投与してから３日目に最大のアンチセンス効果が示された。また、投与７日後でも投与１日目と同様のアンチセンス効果が示された。さらに、投与１４日後でも標的遺伝子の発現を６０％程度、投与２８日後でも２０％程度、一本鎖ＡＳＯと比較して、それぞれ有意差を持って抑制することが示された。第２の実験においても、図１９Ｂに示す通り、同様の傾向が示された。投与してから３日目に最大のアンチセンス効果が示された。また、投与７日後でも投与１日目と同様のアンチセンス効果が示された。投与１４日後及び２８日後において、各々８０％及び５０％抑制することが示された。また、投与４２日後でも測定可能な効果が検出された。従って、いくつかの実施形態において、二重鎖核酸はアンチセンス効果に関して高い持続性を有していることも明らかになった。

【0119】

（実施例７）
他の実施形態における二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価した。その比較する核酸鎖の構成の概要を図２０Ａに示す。先の実験においては、天然型のＲＮＡ塩基からなる中央領域と、２’−ＯＭｅ修飾及びホスホロチオエート化してある５’及び３’ウィング領域とを有する、ｃＲＮＡ（Ｇ）（配列番号：３）を用いた。ここで用いる相補鎖は、同じ５’及び３’ウィング領域（末端の２塩基のＲＮＡ塩基に２’−ＯＭｅ修飾及びホスホロチオエート結合）を有する。しかし、中央の８塩基のＲＮＡに２’−ＯＭｅ修飾が施されており、核酸間は天然型のリン酸ジエステル結合である（ｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭ）（配列番号：９）。

【0120】

すなわち、マウスアポリポ蛋白Ｂ（ｍＡｐｏＢ）に対する１２−ｍｅｒ ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー、異なる修飾が施されたＲＮＡ塩基が組み込まれている１２塩基の相補鎖を設計し、調製した。

【0121】

アンチセンスＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １２ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣ−３’（配列番号：１）
（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間は全てホスホロチオエート結合である）
相補鎖
１．ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：３）
２．ｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭ：５’−ｇ_ｓａ_ｓａｕａｃｃａａｕ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：９）
（大文字：ＲＮＡ、小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、ｓ：核酸間がホスホロチオエート結合である）。

【0122】

前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーは、株式会社ジーンデザインに委託して調製したものを用いた。前記相補鎖は、北海道システム・サイエンス株式会社に委託して調製したものを用いた。

【0123】

そして、前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーと前記相補鎖とを等モル量にて加え、９５℃にて５分間加熱した後、３７℃にて１時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後４℃にて保存した。

【0124】

次いで、ＬＮＡ １２ｍｅｒ及びｃＲＮＡ １２ｍｅｒを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＲＮＡ（Ｇ））又はＬＮＡ １２ｍｅｒ及びｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭ １２ｍｅｒを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭ）を、マウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。また、コントロールとしてＰＢＳのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の方法と同様の方法にて、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｍＡｐｏＢの発現量／ｍＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を算出して、ＰＢＳのみ投与した群（ＰＢＳ ｏｎｌｙ）と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図２０Ｂに示す。

【0125】

図２０Ｂに示した結果から明らかなように、ｃＲＮＡ（Ｇ）の代わりにｃＲＮＡ（Ｇ）−ＯＭを本発明の二重鎖核酸に用いても、そのアンチセンス効果は減弱することはなかった。

【0126】

一般的に、医薬品を経腸投与（経口投与等）した場合には、その医薬品は腸管内のＲＮａｓｅＡに曝露されることになるため、ＲＮＡを含有する核酸医薬は、当該ＲＮＡの部分を全て２’−ＯＭｅ等にて修飾しておくことが極めて好ましい。

【0127】

従って、いくつかの実施形態において、二重鎖核酸における相補鎖として、全て２’−ＯＭｅ修飾したＲＮＡ鎖も利用することができるため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は経腸投与の態様にも適用できることが明らかになった。

【0128】

（実施例８）
ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びＴｏｃ−ｃＲＮＡを含む二重鎖核酸複合体については前述の通り、高いアンチセンス効果を有しつつ、肝臓等へ特異的に効率良く送達できることが明らかになった。

【0129】

このように、トコフェロール等の脂質を結合させることにより肝臓等への送達性は飛躍的に増大するが、他の臓器への送達は逆に困難となることが知られている。現在、他臓器への送達方法として最もよく用いられているのは、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合するような、一種の標的ペプチドを利用する方法である。いくつかの実施形態においては、上述のようなＲＮＡを含む相補鎖を有する二重鎖複合体にて、核酸と送達性部分としてのペプチドとを直接結合させることが検討され得る。

【0130】

他の実施形態においては、後述の実施例にて示されるような、ペプチド又は抗体を基礎とする機能性部分への結合が容易であるペプチド核酸（ＰＮＡ）を、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体の相補鎖として用いた。下記式に示す通り、ＰＮＡは、通常の核酸のようにリン酸結合を持たず、ペプチド結合となっているところが大きな特徴であり、そのためペプチドとの結合が容易になる。その他、ＬＮＡと同様に高いＴｍ値を有し、二重鎖が離れにくいことやＲＮａｓｅに対する耐性が強いこと等の特徴も有している。

【0131】

【化2】

【0132】

前記検証において、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーに標的ペプチド等の機能性分子を直接結合させない二重鎖核酸複合体の一部であって、標的ペプチド等を結合させるための核酸鎖（ペプチド結合鎖）について、多くの実施形態を検討した。そのような実施形態の例を図２１Ａ〜Ｃに示す。図２１Ａにおいて、機能性部分は相補的ＲＮＡ鎖に結合している。図２１Ｂにおいて、二重鎖核酸複合体を形成するために、３本の核酸鎖が用いられる。ここで、相補的ＲＮＡ鎖は、ＬＮＡ／ＤＮＡアンチセンス鎖及びＰＮＡ鎖にアニーリングする。ペプチドを基礎とする機能性部分をＰＮＡ鎖に結合することによって、送達機能性部分を複合体に担持させる。しかし、該部分はアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合していない。第３の核酸鎖はＰＮＡでなくともよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はヌクレオチドアナログを含み得る。通常、この態様において、アンチセンス鎖よりも長い相補鎖を用い、その相補鎖における突出部分に第３の核酸鎖を備えさせ、アンチセンス鎖と機能性部分とを間接的に結合させることができる。また、図２１Ｃに示す通り、相補鎖自体に機能性部分を備えさせることもできる。図２１Ｃに示す機能性部分は独立して選択される。

【0133】

次に、このコンセプトに基づき、以下に示す通り、マウスアポリポ蛋白Ｂ（ｍＡｐｏＢ）に対するＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー、ＲＮＡを含む相補鎖及びペプチド結合鎖を、本発明者らは設計して調製した。

【0134】

アンチセンスＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １２ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣ−３’（配列番号：１）
（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間は全てホスホロチオエート結合である）
相補鎖
ｃＲＮＡ ２１ｍｅｒ：５’−ｕ_ｓｕ_ｓｃＧＣＡＣＣＡＧＡＡＵＡＣＣＡＡｕ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：１０）
（大文字：ＲＮＡ、小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、ｓ：核酸間がホスホロチオエート結合である）
第３の核酸（ペプチド）鎖
ＰＮＡ ９ｍｅｒ：Ｎ‘−ＴＧＧＴＧＣＧＡＡ−Ｃ’（配列番号：１１）
（下線付：ＰＮＡ）。

【0135】

前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーは、株式会社ジーンデザインに委託して調製したものを用いた。前記相補鎖は、北海道システム・サイエンス株式会社が調製したものを用いた。また、前記ペプチド結合鎖は、株式会社ファスマックが調製したものを用いた。

【0136】

そして、前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー、前記相補鎖及び前記ペプチドを基礎とする鎖を等モル量にて加え、９５℃にて５分間加熱した後、３７℃にて１時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後４℃にて保存した。

【0137】

次いで、ＡＳＯ １２ｍｅｒ（ｓｓ−ＡＳＯ）又は（１）ＡＳＯ １２ｍｅｒ、（２）ｃＲＮＡ（Ｇ）２１ｍｅｒ及び（３）ＰＮＡ ９ｍｅｒを含む二重鎖核酸複合体（ＡＳＯ，ＰＮＡ／ｃｒＮＡ（Ｇ））を、マウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。また、コントロールとしてＰＢＳのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の方法と同様の方法にて、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｍＡｐｏＢの発現量／ｍＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を算出して、ＰＢＳのみ投与した群（ＰＢＳ ｏｎｌｙ）と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図２２に示す。

【0138】

図２２に示した結果から明らかなように、ＡＳＯ，ＰＮＡ／ｃｒＮＡ（Ｇ）複合体のアンチセンス効果は、ＬＮＡ １２ｍｅｒのそれと比較して減弱していなかった。

【0139】

（実施例９）
ＰＮＡ鎖が二重鎖核酸の相補鎖として利用できることを以下に示す実施例にて実証した。

【0140】

すなわち、図３Ｂに示すように、相補鎖としてＲＮＡの代わりにＰＮＡ鎖を利用し得ることを検討した。この配置においては、アンチセンス鎖（例えば、ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー）に標的ペプチド等の機能性部分を直接結合させないが、間接的に結合させる、二重鎖核酸複合体の態様を可能とする。

【0141】

このコンセプトに基づき、以下に示す通り、マウスアポリポ蛋白Ｂ（ｍＡｐｏＢ）に対するＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及びＰＮＡを含む相補鎖を設計して調製した。

【0142】

アンチセンスＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １２ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣ−３’（配列番号：１）
（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間は全てホスホロチオエート結合である）
相補鎖
１．ｃＰＮＡ １２ｍｅｒ：Ｎ‘−ＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵＧＣ−Ｃ’（配列番号：１２）
２．ｃＰＮＡ １０ｍｅｒ：Ｎ‘−ＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ−Ｃ’（配列番号：１３）
３．ｃＰＮＡ ８ｍｅｒ：Ｎ‘−ＧＡＡＵＡＣＣＡ−Ｃ’（配列番号：１４）
（下線付：ＰＮＡ）。

【0143】

前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマーは、株式会社ジーンデザインが調製したものを用いた。前記相補鎖は、株式会社ファスマックが調製したものを用いた。

【0144】

前記ＬＮＡ/ＤＮＡギャップマー及び各相補鎖を等モル量にて加え、９５℃にて５分間加熱した後、３７℃にて１時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後４℃にて保存した。

【0145】

次いで、ＡＳＯ １２ｍｅｒ（ｓｓ−ＡＳＯ）、ＡＳＯ １２ｍｅｒ及びｃＰＮＡ １２ｍｅｒを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＰＮＡ １２ｍｅｒ）、ＡＳＯ １２ｍｅｒ及びｃＰＮＡ １０ｍｅｒを含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＰＮＡ １０ｍｅｒ）又はＡＳＯ １２ｍｅｒ及びｃＰＮＡ ８ｍｅｒ含む二重鎖核酸（ＡＳＯ／ｃＰＮＡ ８ｍｅｒ）を、マウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。また、コントロールとしてＰＢＳのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の方法と同様の方法にて、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｍＡｐｏＢの発現量／ｍＧＡＰＤＨ(内部標準遺伝子）の発現量を算出して、ＰＢＳのみ投与した群（ＰＢＳ ｏｎｌｙ）と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図２３に示す。

【0146】

図２３に示した結果から明らかなように、ＡＳＯ／ｃＰＮＡ複合体のアンチセンス効果は、いずれにおいても、ｓｓーＡＳＯ １２ｍｅｒのそれと比較して減弱していなかった。

【0147】

（実施例１０）
この実施例においては、「ＲＮＡヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む、様々な構造の相補鎖を用いても、二重鎖核酸複合体がアンチセンス効果を発揮できることを実証する。４種類の相補鎖構造を設計し、調製した。それら構造の概要を図２４に示す。図２４に示す通り、２種類の中央の領域と、２種類の５‘及び３‘ウィング領域とを結合させた。ウィング領域は、ホスホロチエート結合を伴う２‘−Ｏメチル化修飾されたＲＮＡと、ホスホロチエート結合を伴うヌクレオチドアナログとの、いずれかを含むものである。中央領域は、天然型リン酸ジエステル結合のＲＮＡと、ホスホロチエート結合のＲＮＡとのいずれかを含むものである。

【0148】

以下に示す１３塩基のヌクレオチド鎖を作製して試験した。

【0149】

アンチセンスＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ１３−ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ−３’（配列番号：５）
（大文字：ＬＮＡ、小文字：ＤＮＡ、核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である）
相補鎖
１．Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵｓｇｓｃ−３’（配列番号：７）
２．Ｔｏｃ−ｃＬＮＡ（Ｇ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵｓｇｓｃ−３’（配列番号：１５）
３．Ｔｏｃ−ｃＬＮＡ（ｓ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡｓＵｓＡｓＣｓＣｓＡｓＡｓＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：１６）
４．Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（ｓ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡ_ｓＵｓＡｓＣｓＣｓＡｓＡｓＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：１７）
（大文字：ＲＮＡ、小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線付小文字：ＬＮＡ、ｓ：核酸間の結合がホスホロチエート結合である）
ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーと各相補鎖とを等モル量混合し、実施例７に記載の通り、アニーリングした。次に、二重鎖核酸複合体をマウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。また、コントロールマウスとしてＰＢＳ溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の通り、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＡｐｏＢの相対的発現レベルを、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。得られた結果を図２５Ａ〜Ｂに示す。
図２５Ａに示す通り、Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）とＴｏｃ−ｃＬＮＡ（Ｇ）との結果を比較したところ、ＲＮＡ同様に、相補鎖の５‘及び３’ウィング領域を架橋化核酸にて調製しても、同等の高いアンチセンス効果を得ることができた。
さらに、このデータから、ウィング領域のいずれかの種類に対しても、核酸鎖の中央のＲＮＡ部分をホスホロチエート化することができ、核酸鎖の中央部分が天然型のＲＮＡとした場合に得られたアンチセンス効果と同程度のそれが維持されていることが示された。Ｔｏｃ−ｃＬＮＡ（ｓ）及びＴｏｃ−ｃＲＮＡ（ｓ）において、得られた効果に関し、Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）と比較した結果を、図２５Ａ及び図２５Ｂに各々示す。

【0150】

実施例７と併せて論じるに、アンチセンス効果を損なうことなく、相補鎖のヌクレアーゼ耐性を向上させることができる他の態様が、この実施例において示された。

【0151】

特に、相補鎖において、その全長をホスホロチエート化することができ、なおかつ、ホスホロチエート修飾されたＲＮＡを含む中央領域を有していても、アンチセンス鎖を放出することができ、さらにｍＲＮＡ転写産物レベルを抑制することもできることが示された。

【0152】

（実施例１１）
この実施例においては、たとえ第１の核酸鎖と第２の核酸鎖（アンチセンスと相補鎖）との鎖長が異なっていたとしても、アンチセンス効果は発揮されるということを実証する。ここで、１３塩基のＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーと、３１塩基の相補的ＲＮＡを基礎とする核酸鎖とをアニーリングさせ、マウスにおけるＡｐｏＢ遺伝子の発現抑制試験に供した。また、該３１塩基の核酸鎖は、３つの２’−Ｏメチル修飾及びホスホロチエート化されたＲＮＡヌクレオチドを含む５’ウィング領域と、２０個の２’−Ｏメチル修飾及びホスホロチエート化されたＲＮＡヌクレオチドと、ホスホロチオエート結合している８個のＲＮＡヌクレオチドを含む中央領域とを結合させることにより、調製した。１３−ｍｅｒ／３１−ｍｅｒ複合体の活性と、１３−ｍｅｒ／１３−ｍｅｒ複合体の活性とを比較した。

【0153】

アンチセンスＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー鎖
ＬＮＡ １３−ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ−３’（配列番号：５）
（大文字：ＬＮＡ，小文字：ＤＮＡ，核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合）
相補鎖
１．１３−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：７）
２．３１−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（ｓ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵｇｃｕａｃｇｃａｕａｃｇｃａｃｃａ_ｓｃ_ｓｃ_ｓａ−３’（配列番号：１８）
（大文字：ＲＮＡ，小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ，ｓ：核酸間の結合がホスホロチエート結合）。

【0154】

ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーと各相補鎖とを等モル量混合し、実施例７に記載の通り、アニーリングした。次に、アニーリングした二重鎖核酸複合体をマウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。また、コントロールマウスとしてＰＢＳ溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の通り、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＡｐｏＢの相対的発現レベルを、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。結果を図２６に示す。

【0155】

図２６に示す通り、３１−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（ｓ）相補鎖を有する二重鎖複合体によって達成される抑制と、１３−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＬＮＡ（Ｇ）相補鎖を有する二重鎖複合体によって達成されるそれとを比較したところ、共に同程度に高いアンチセンス効果が得られていた。

【0156】

このデータから、相補鎖において中央のＲＮＡ部分をホスホロチオエートすることができ、たとえ該相補鎖の鎖長がアンチセンス鎖と異なっていたとしても、相補鎖の中央領域を天然型のＲＮＡとした場合と比較して、同程度のアンチセンス効果が維持されていることが、更に示された。

【0157】

（実施例１２）
ここで開示した二重鎖核酸複合体は、配列特異性及び普遍的な適用性を有していることを実証するため、異なる遺伝子、ヒトのトランスチレチン（ｈＴＴＲ）の転写産物を標的とするアンチセンスプローブを調製した。実験は、ｈＴＴＲを有するよう改変されたトランスジェニックマウスを用いて行った（該マウスは、ｈＴＴＲ及びｍＴＴＲを有する）。アンチセンスと相補鎖とは、２つの鎖長のもの、１３塩基の核酸鎖及び２０塩基の核酸鎖を用意した。そして、１３−ｍｅｒ／１３−ｍｅｒ二重鎖複合体と２０−ｍｅｒ／２０−ｍｅｒ二重鎖複合体とを試験に供した。また、該複合体が肝臓に送達されるよう、５’−トコフェロール機能性部分を備えた相補鎖を調製した。また、ｈＴＴＲは、最終的には血中で検出されるタンパク質として産生されるので、その発現タンパク質の血清濃度を分析した。そして、二重鎖複合体注入後に生じる発現の減少を検出した。以下に示す様々な核酸鎖の配列及び複合体を設計して作製し、試験に供した。

【0158】

アンチセンスＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー核酸鎖
１．ＡＳＯ １３−ｍｅｒ：５’−ＴＧｔｃｔｃｔｇｃｃＴＧＧ−３’（配列番号：１９）
２．ＡＳＯ ２０−ｍｅｒ：５’−ＴＴＡＴＴｇｔｃｔｃｔｇｃｃｔＧＧＡＣＴ−３’（配列番号：２１）
（大文字：ＬＮＡ，小文字：ＤＮＡ，核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である）
相補鎖
１．１３−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｃ_ｓｃ_ｓａ_ｓＧＧＣＡＧＡＧＡ_ｓｃ_ｓａ−３’（配列番号：２０）
２．２０−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ａ_ｓｇ_ｓｕ_ｓｃ_ｓｃ_ｓＡＧＧＣＡＧＡＧＡＣ_ｓａ_ｓａ_ｓｕ_ｓａ_ｓａ−３’（配列番号：２２）
（大文字：ＲＮＡ，小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ，ｓ：核酸間の結合がホスホロチエート結合である）
１３塩基のアンチセンス及び相補鎖を、２０塩基のアンチセンス及び相補鎖を、各々等モル量にて混合し、実施例７に記載の通り、アニーリングさせた。次に、１３塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした１３塩基の二重鎖複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。同様に、２０塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした２０塩基の二重鎖複合体とを、６ｍｇ／ｋｇずつ注射した。また、コントロールマウスとしてＰＢＳ溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の通り、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｈＴＴＲの相対的発現レベルを、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。１３塩基の核酸鎖に関する結果を図２７Ａに、２０塩基の核酸鎖に関する結果を図２７Ｂに示す。

【0159】

ｈＴＴＲは肝臓で合成され、血中へと分泌される。従って、もしアンチセンスプローブが肝臓に送達され、ｈＴＴＲの発現を効率的に抑制できるのなら、この抑制の結果、該タンパク質の血清中の濃度は低減されるはずである。血清中の濃度レベルは、１３塩基の核酸鎖を注射する前、該注射の３日後に、民間試験所にて測定した。得られた血清濃度を図２８に示す。

【0160】

図２７Ａに示す通り、１３塩基の二重鎖核酸複合体は効果的にｍＲＮＡ転写を９５％以上抑制した。それと比較して、ＡＳＯ単一鎖のみによる抑制は約５０％であった。また、図２７Ｂに示す通り、２０塩基の複合体による抑制レベルも同程度の約５０％であったが、２０塩基の単一鎖を用いた場合には、実質的な抑制は認められなかった。オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなるほど、通常、発現抑制能は低減されることが認められる。しかしながら、オリゴヌクレオチドが長いほど、選択性がより高まり、それゆえに安全性も高まることになる。例えば、アンチセンス鎖の、投与量、投与計画、鎖長、配列及び組成物を調節することによって、治療の効能を適合させることができる。しかしながら、これら実施例において示す通り、本発明の様々な実施形態における二重鎖核酸複合体として、アンチセンス鎖を送達させることによって単一鎖としてアンチセンス鎖を送達した場合よりも、顕著に高い抑制を達成することができる。

【0161】

処置前後の血清濃度レベルを図２８に示す。その結果から、１３塩基の二重鎖複合体により、〜４０ｍｇ／ｄｌ〜＜５ｍｇ／ｄｌという、１３塩基の単一鎖の場合（〜４４ｍｇ／ｄｌ〜〜２８ｍｇ／ｄｌ）及びＰＢＳコントロール（ほぼ変化なし）と比較して、顕著な低減が認められた。

【0162】

（実施例１３）
この実施例においては、送達機能性部分としてペプチドを用い、神経系の細胞に二重鎖核酸複合体が送達されることを実証した。図２８に一般的な構造を示した、アンチセンス鎖、相補鎖及びＰＮＡ鎖の３つの核酸鎖を含む二重鎖複合体を用いた。後神経節（ＤＲＧ）細胞に該複合体を局在させるための薬剤として機能させるため、ドデカペプチド ＤＲＧ１を、９塩基のＰＮＡ鎖のＮ末端に結合させた。この９塩基のＰＮＡを、以下に示す、１３塩基のアンチセンス鎖及び２２塩基の相補鎖にアニーリングさせることにより、二重鎖複合体を形成させ、本実験に用いた。該アンチセンス鎖が標的とする遺伝子は、ＴＲＰＶ１である。

【0163】

アンチセンスＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １３−ｍｅｒ：５’−ＴＡｇｔｃｃａｇｔｔＣＡＣ−３’（配列番号：２３）（大文字：ＬＮＡ；小文字：ＤＮＡ；核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である）
相補鎖
ｃＲＮＡ（Ｇ） ２２−ｍｅｒ：５’−ｇ_ｓｕ_ｓｇ_ｓＡＡＣＵＧＧＡＣｕａｕａｃｇｃａｃ_ｓｃ_ｓａ−３’（配列番号：２４）
（大文字：ＲＮＡ；小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ；ｓ：核酸間の結合がホスホロチエート結合）
第３の核酸（ペプチド）鎖
ｐｅｐ−ＰＮＡ ９−ｍｅｒ：Ｎ’−ＳＰＧＡＲＡＦＧＧＧＧＳ−ｔｇｇｔｇｃｇｔａ−Ｃ’（配列番号：２５及び３１）
（大文字：アミノ酸；下線付，小文字：ＰＮＡ）
ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー、相補鎖及びペプチド−ＰＮＡ鎖を、等モル量にて混合し、この混合物を９５℃で５分間加熱した。その後、３本の核酸鎖をアニーリングさせるべく、該混合物を３７℃にて１時間、定温にて放置した（「ｔｓ−ＴＲＰＶ１」）。また、すぐに使用しない場合は４℃にて保存した。また、同様に、アンチセンス鎖及び相補鎖のみを含有する二重鎖複合体を調製した（「ｄｓ−ＴＲＰＶ１」）。マウスは、三協ラボサービス株式会社（東京、日本）より入手し、病原体フリ―の施設内にて維持し、自由に餌及び水を摂取させた。８週齢、平均体重２７ｇの雌ＩＣＲマウスに、髄腔内注射にて、ＰＢＳ、ｄｓ−ＴＲＰＶ１又はｔｓ−ＴＲＰＶ１を２．６６μｇずつ投与した。動物の処置は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を得た倫理性及び安全性に関わる実験計画書に従って、動物実験の許可を得た処置者によって行われた。抱水クロラ―ル（０．５ｍｇ／ｇ体重）及び塩酸ケタミン（０．０５ｍｇ／ｇ体重）の腹腔内注射により、麻酔導入した後に髄腔内注射を行った。全てのマウスをうつ伏せにし、第２腰椎及び第３腰椎（Ｌ２−Ｌ３）において部分椎弓切除を施した。一旦露出させたこれら脊椎骨をｓ ２７ゲージ針にて穿刺し、次いで、１０μＬハミルトンシリンジが接続されているＰＥ−１０カテーテルを、くも膜下腔内の後方、大体Ｌ５付近に挿入した。そして、１分間にわたって１０μＬ量を着実に投与した。カテーテルを除去した後に、筋膜及び皮膚を4-0-ナイロンにて縫合し、抗生物質溶液にて処理した。そして、当該動物の頭部を挙上させ、加温パッド上で回復させた。

【0164】

組織学的分析は以下の通りにして行った。注射してから２日後に、３ｍｇの抱水クロラ―ルを腹腔内注射することによってマウスを安楽死させた。ＰＦＡ（４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液）にて灌流固定した後、ＰＢＳにて灌流した。ＤＲＧ（Ｌ６の片側）を回収し、４％ホルマリン溶液に固定した。次いで、３０％スクロース溶液で置換し、肝臓をＯＣＴコンパウンドで包埋した後、１０μｍの厚さで切片を作製した。次いで、ＤＡＰＩを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡で切片におけるＣｙ３の信号強度を検出した。共焦点顕微鏡による画像分析を図２９に示す。

【0165】

ＴＲＰＶ１の相対的発現レベルの分析を以下の通りにして行った。麻酔導入及び経心臓的ＰＢＳ灌流にて、注射してから７日後のマウスを犠牲死させた。各マウスから３つの片側ＤＲＧ、すなわちＬ４、Ｌ５及びＬ６の腰椎ＤＲＧ（ＬＳＤ）を回収した。その後、ｍＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを、比較例１に記載の通りに行った。ｍＴＲＰＶ１の相対的発現レベルは、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。得られた結果を図３０に示す。

【0166】

図２９に示した組織学的分析から、Ｃｙ３標識アンチセンス鎖はＤＲＧ細胞の核に局在していることが明らかになった。これは、アンチセンス鎖上の蛍光標識の蛍光シグナルと、核染色のそれとが一致したことから明らかである。また、この実験により、二重鎖複合体に含まれている３本の核酸鎖は損傷を受けることなく、第３の核酸鎖上の送達性部分によって、アンチセンス鎖は所望の細胞まで送達されていることが示された。図３０に示す通り、ｍＴＲＰＶ１発現抑制により、アンチセンス効果は検出された。ＤＲＧ細胞に誘導可能なペプチド−ＰＮＡ鎖を含むｔｓ−ＰＲＰＶ１複合体は、約４０％の抑制を示した。対して、ペプチド−ＰＮＡ鎖を欠くｄｓ−ＴＲＰＶ１複合体は、遺伝子発現を抑制したが、せいぜい２０％程度であった。この実施例において、再度、３本の核酸鎖を含む複合体を用いることによって、アンチセンス鎖を細胞の種類特異的に送達できることが示された。また、この実施例において、送達を誘導するペプチドを用いることにより、他の実施例に示したものと異なる細胞の種類（ＤＲＧ）及び組織にも（肝臓の代わりに神経系にも）、アンチセンス鎖を送達できることも示された。

【0167】

（実施例１４）
この実施例においては、非タンパク質コーディングＲＮＡ転写産物、すなわちｍｉＲＮＡに対する、二重鎖核酸複合体によるアンチセンス効果について実証する。マウスの肝臓においては、ｍｉＲ−１２２というｍｉＲＮＡが発現していることが知られている。１５塩基のアンチｍｉＲ鎖を設計し、３つのヌクレオチドアナログ（架橋化核酸、ＬＮＡ）を含む５’ウィング及び３’ウィングと、ＤＮＡを含む９塩基の中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。２’−ＯＭｅ及びホスホロチエート化されたＲＮＡを含む５’及び３’ウィングと、天然型のＲＮＡを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。

【0168】

アンチ−ｍｉＲ ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １５−ｍｅｒ：５’−ＣＣＡｔｔｇｔｃａｃａｃＴＣＣ−３’（配列番号：２６）
（大文字：ＬＮＡ；小文字：ＤＮＡ；核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である）
相補鎖
Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ） １５−ｍｅｒ：５’−Ｔｏｃ−ｇｓｇｓａｓＧＵＧＵＧＡＣＣＡｓｕｓｇｓｇ−３’（配列番号：２７）
（大文字：ＲＮＡ；小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ；ｓ：核酸間の結合が、ホスホロチエート結合である）

【0169】

アンチ−ｍｉＲ ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマー及び相補鎖を、等モル量にて混合し、実施例７に記載の通りアニーリングさせた。次に、アンチｍｉＲ単一鎖と、アニーリングした二重鎖核酸複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から０．７５ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。コントロールマウスとしてＰＢＳ溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから３日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の通り、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＡｐｏＢの相対的発現レベルを、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。結果を図３１に示す。

【0170】

図３１に示す通り、二重鎖複合体により、ｍｉＲ−１２２レベルは、ほぼ５０％に減少した。一方、アンチ−ｍｉＲオリゴヌクレオチドによっては〜２０％だけ減少した。特筆すべきは、ｍｉＲＮＡレベルを低減させるための典型的な方法では、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）型プローブ構造が用いられ、そのプローブにより５０％の減少を達成するためには、〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量（ＥＤ５０）にて送達する必要がある。前述の通り、この実施例において示した、いくつかの実施形態における二重鎖複合体によれば、相当に低い投与量をＥＤ５０とすることができる。

【0171】

（実施例１５）
この実施例においては、アンチセンス効果を奏するために、アミド架橋化核酸である「アミドＢＮＡ」を含むアンチセンス鎖を用いた。アミド架橋化核酸（「ＡｍＮＡｓ」とも称する）は、ＬＮＡアナログであり、糖環における２’位の炭素と４’位の炭素とが結合している、環状アミド架橋構造（４’−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−２’；Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ）を有する。
ＡｍＮＡｓの合成、それらオリゴヌクレオチドへの導入や、結合強度及びヌクレアーゼ耐性等の物性については、Ａ．Ｙａｈａｒａら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１２年、１３巻、２５１３〜２５１６ページにて最近報告されている。この文献に開示されている内容は、この参照により、本願明細書において援用される。Ｙａｈａｒａらが開示している通り、ＡｍＮＡｓは相補鎖に対して優れた結合活性を示し、また高いヌクレアーゼ耐性を示す。このように、ＡｍＮＡｓは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用に適している。１３塩基のアンチセンス鎖を設計し、ヌクレオチドアナログ（アミドＢＮＡ、ＡｍＮＡ）を２個及び３個各々含む、５’ウィング及び３’ウィングと、８塩基のＤＮＡを含む中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。２’−ＯＭｅ及びホスホロチエート化されたＲＮＡを含む５’及び３’ウィングと、天然型のＲＮＡを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。

【0172】

アンチセンスアミドＲＮＡ（ＡｍＮＡ）／ＤＮＡギャップマー鎖
ＡＳＯ １３−ｍｅｒ：５’−ＧＣａｔｔｇｇｔａｔＴＣＡ−３’（配列番号：２８） （大文字：Ｎ−メチルアミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ），小文字：ＤＮＡ，核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である）
相補鎖
１．１３−ｍｅｒ Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）：５’−ｕ_ｓｇ_ｓａ_ｓＡＵＡＣＣＡＡＵ_ｓｇ_ｓｃ−３’（配列番号：７）
（大文字：ＲＮＡ，小文字：２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ，ｓ：核酸間の結合は、ホスホロチエート結合である）

【0173】

アンチセンスアミドＢＮＡ／ＤＮＡギャップマー（ＡＳＯ）と相補鎖とを、等モル量混合し、実施例７に記載の通り、アニーリングさせた。次に、ＡＳＯ単一鎖と、アニーリングした二重鎖核酸複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から各々様々な投与量にて静脈注射した（ｓｓ−ＡＳＯ：０．７５ｍｇ／ｋｇ；２．２５ｍｇ／ｋｇ；Ｔｏｃ−ＡＳＯ／ｃＲＮＡ（Ｇ）：０．３３ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ）。コントロールマウスとしてＰＢＳ溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。注射してから７日後又は１４日後に、当該マウスをＰＢＳにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例１に記載の通り、ｍＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍＡｐｏＢの相対的発現レベルを、ｍＧＡＰＤＨ（内部標準遺伝子）と比較して算出した。結果を図３２に示す。

【0174】

図３２に示す通り、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）を第１の核酸鎖（アンチセンスオリゴブクレオチド）の５’ウィング及び３’ウィング領域に組み込んだ、二重鎖複合体は、生体内でアンチセンス効果を発揮した。二重鎖複合体をマウスに低量にて注射した時でさえ、ＡＳＯ単一鎖を注射した場合よりも、二重鎖複合体はきわめて高い抑制を達成した。例えば、注射してから７日後に測定した際に、ＡＳＯ／Ｔｏｃ−ｃＲＮＡ（Ｇ）複合体を１．０ｍｇ／ｋｇにて注射した際には、ｍＡｐｏＢの相対的発現レベルは約５５％まで抑制されていた。これは、ｓｓーＡＳＯを２．２５ｍｇ／ｋｇ投与した場合において、ようやく２０％抑制されたのに対し、顕著に低かった。この実施態様にて示す通り、ここで開示している二重鎖複合体を用いた方法を実践することによって、より少ない試薬量で、より大きな発現抑制が達成される。

【産業上の利用可能性】

【0175】

以上説明したように、本発明の実施形態にかかる二重鎖核酸複合体を用いることによって、いくつかの実施形態においては、アンチセンス核酸を特異性高く効率的に特定の臓器（細胞）に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することが可能となる。また、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体には、特定の臓器に送達させるための機能性分子として、脂質（例えば、トコフェロール、コレステロール）、糖（例えば、グルコース、スクロース）、タンパク質、ペプチド、抗体等の多種多様な分子を適用できるため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、様々な臓器、組織、細胞を標的とすることができる。さらには、いくつかの実施形態における二重鎖核酸に、ＲＮａｓｅ等に対する耐性を付与するための修飾を施しても、そのアンチセンス効果は低減することはないため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、経腸投与の態様でも利用できる。

【0176】

したがって、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の標的以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるという点に優れているため、代謝性疾患、腫瘍、感染症等の、標的遺伝子の発現亢進及び/又は転写産物レベル亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物等として、二重鎖核酸は有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]