特許 6973714 ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法並びにニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6973714

(24)【登録日】2021年11月8日

(45)【発行日】2021年12月1日

(54)【発明の名称】ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法並びにニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20211118BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20211118BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20211118BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

【請求項の数】3

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2017-114596(P2017-114596)

(22)【出願日】2017年6月9日

(65)【公開番号】特開2018-201477(P2018-201477A)

(43)【公開日】2018年12月27日

【審査請求日】2020年6月4日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 外来因子フリー難病由来ｉＰＳ細胞のライブラリー構築とそれを使った疾患モデルと薬剤開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504207433

【氏名又は名称】学校法人金城学院

(73)【特許権者】

【識別番号】504159235

【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100202913

【弁理士】

【氏名又は名称】武山 敦史

(74)【代理人】

【識別番号】100111464

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 悦子

(72)【発明者】

【氏名】古川 潤一

(72)【発明者】

【氏名】篠原 康郎

(72)【発明者】

【氏名】江良 択実

(72)【発明者】

【氏名】入江 徹美

(72)【発明者】

【氏名】松本 志郎

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１８６９４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１６／０７７７７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 TOMATSU S. et al.，J Inherit Metab Dis，Vol.33 (2010)，p.141-150

【文献】 STRECKER G. et al.，Eur. J. Biochem.，75(1977)，p.391-403

【文献】 VRUCHTE D. et al.，J. Biol. Chem.，Vol.279 No.25 (2004)，p.26167-26175

【文献】 ELLEDER M. et al.，Acta Neuropathol(Berl)，66 (1985)，p.325-336

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＣｉＮｉｉ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を生体外で測定する工程と、
ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患していない対象由来の試料と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が減少していること、または少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が増加していることを決定する工程と、を含む、
ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法。

【請求項2】

ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療後に生体外で測定する工程と、
治療前と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が増加していること、もしくは少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が減少していること、または、ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患していない対象由来の試料と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量、もしくは少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が同等であることを決定する工程と、を含む、
ことを特徴とする、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法。

【請求項3】

（ａ）ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、候補薬剤存在下及び非存在下で、生体外で測定する工程と、
（ｂ）前記候補薬剤存在下において、候補薬剤非存在下と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が増加していること、または少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が減少していることを決定する工程と、
を含む、
ニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法並びにニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ライソゾーム病は、ライソゾーム内の酸性分解酵素等を含むタンパク質（構成する輸送タンパク質等）の遺伝的欠損により、ライソゾーム内に大量の脂質又はムコ多糖などを蓄積し、肝臓・脾臓の腫大、骨変形、中枢神経障害など、種々な症状を呈する疾患群である。ライソゾーム病の一つであるニーマン・ピック病Ｃ型は、細胞内コレステロール輸送に関係するＮＰＣ１遺伝子又はＮＰＣ２遺伝子の変異により発症することが知られている。ニーマン・ピック病Ｃ型の発症頻度は１２万人に１人とされる。発症年齢及び症状は幅広く、新生児期に死亡する患者（１０％）がいる一方で、成人期に発症する患者（９０％）もいる。新生児発症型を除くと、主に小児期（１０代）以降に発病する。通常は進行性で、典型的には診断から５〜１０年後に死亡する経緯をたどる。

【0003】

ニーマン・ピック病Ｃ型の確定診断は、一般に、培養繊維芽細胞のフィリピン染色によって遊離型コレステロールの蓄積を確認して、ＮＰＣ１／ＮＰＣ２遺伝子変異を同定することによって行われてきた。

【0004】

ライソゾーム病はその蓄積物質に基づき多くの種類に分けられ、それぞれ欠損する酵素活性等に依存して異なる物質がライソゾーム内外に蓄積する。このため、疾患に特徴的な種々の分子が個々のライソゾーム病の診断やモニタリングのためのバイオマーカーとして報告されている。

【0005】

非特許文献１、２には、ｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ−３β，５α，６β−ｔｒｉｏｌ及び７−ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌがニーマン・ピック病Ｃ型患者の血清中に健常人よりも高濃度に存在し、病態を反映する特異的なバイオマーカーであることが報告され、臨床応用されている。非特許文献３では、２４（Ｓ）−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌがニーマン・ピック病Ｃ型患者の血漿及び脳脊髄液中で増加すること、治療薬である２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（ＨＰＢＣＤ）投与でその濃度が低下することが報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｐｏｒｔｅｒ，Ｆ．Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｌｏｏｄ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ Ｃ１ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１０，２，１−１２．

【非特許文献2】Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ Ｃ１ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２０１１，５２，１４３５−１４４５．

【非特許文献3】Ｔｏｒｔｅｌｌｉ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ Ｎｉｅｍａｎｎ−ＰｉｃｋＣ１（ＮＰＣ１）．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０１４，２３，６０２２−６０３３．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、非特許文献１、２のマーカーは、ニーマン・ピック病Ｃ型の病態を反映するマーカーではあるものの、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果については、臨床症状との相関が十分ではなく、課題とされてきた。また、非特許文献３のマーカーは、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断又はモニタリングのためのバイオマーカーとして使用可能であるものの、感度、特異度、簡便性などの点で課題を残していた。

【0008】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法並びにニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法は、
対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を生体外で測定する工程と、
ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患していない対象由来の試料と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が減少していること、または少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が増加していることを決定する工程と、を含む。

【0011】

本発明の第２の観点に係るニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法は、
ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療後に生体外で測定する工程と、
治療前と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が増加していること、もしくは少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が減少していること、または、ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患していない対象由来の試料と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量、もしくは少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が同等であることを決定する工程と、を含む、
ことを特徴とする。

【0013】

本発明の第３の観点に係るニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法は、
（ａ）ニーマン・ピック病Ｃ型に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３、
（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３及び
（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、候補薬剤存在下及び非存在下で、生体外で測定する工程と、
（ｂ）前記候補薬剤存在下において、候補薬剤非存在下と比較して、少なくとも１つの前記グリコサミノグリカンの発現量が増加していること、または少なくとも１つの前記遊離オリゴ糖の発現量が減少していることを決定する工程と、
を含む。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断を補助する方法、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果の判定を補助する方法並びにニーマン・ピック病Ｃ型治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるＧＳＬ糖鎖発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）は（Ｈｅｘ）２、（ｂ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｃ）は（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｄ）は（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（ｅ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｆ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｇ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（ｈ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｉ）は（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｊ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２のグラフ図である。

【図2】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるＮ−グリカン発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）はＭａｎ３Ｆ、（ｂ）はＭａｎ４、（ｃ）はＭａｎ４Ｆ、（ｄ）はＭａｎ５Ｆ、（ｅ）はＭａｎ５、（ｆ）はＭａｎ６、（ｇ）はＭａｎ７、（ｈ）はＭａｎ８、（ｉ）はＭａｎ９、（ｊ）は（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｋ）は（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｌ）は（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｍ）は（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｎ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｏ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｐ）は（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｑ）は（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｒ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、（ｓ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２のグラフ図である。

【図3】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるＮ−グリカン発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）はＰＭ、ＨＭ、Ｈｙｂ、Ｃｏｍ、（ｂ）はＨｙｂ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（＋）、（ｃ）はＨｙｂ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（−）、（ｄ）はＨｙｂ Ｆｕｃ（−）Ｓｉａ（＋）、（ｅ）はＨｙｂ Ｆｕｃ（−）Ｓｉａ（−）、（ｆ）はＣｏｍ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（＋）、（ｇ）はＣｏｍ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（−）、（ｈ）はＣｏｍ Ｆｕｃ（−）Ｓｉａ（＋）、（ｉ）はＣｏｍ Ｆｕｃ（−）Ｓｉａ（−）のグラフ図である。

【図4】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるＯ−グリカン発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）はＯ−グリカンの総量、（ｂ）は（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（ｃ）は（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１のグラフ図である。

【図5】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるグリコサミノグリカン発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）はＣＳ（コンドロイチン硫酸）系、（ｂ）はＨＳ（ヘパラン硫酸）系、（ｃ）はＣＳ、（ｄ）はＨＳのグラフ図である。

【図6】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるｆＯＳ発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｂ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｃ）は（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｄ）は（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｅ）は（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｆ）は（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、（ｇ）は（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｈ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｉ）は（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ｊ）は（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２のグラフ図である。

【図7】ＷＴ（−）、ＮＰＣ（−）及びＮＰＣ（＋）におけるｆＯＳ発現の解析結果のグラフ図である。（ａ）はＰＭ−Ｇｎ１、ＨＭ−Ｇｎ１、ＰＭ−Ｇｎ２、ＨＭ−Ｇｎ２、Ｃ／Ｈ、（ｂ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（ｃ）は（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、（ｄ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（ｅ）は（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３、（ｆ）は（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４のグラフ図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

まず、本実施形態によるライソゾーム病に対する治療効果を判定するためのマーカーについて詳細に説明する。

【0018】

本実施形態によるライソゾーム病に対する治療効果を判定するためのマーカーは、以下に記載の糖鎖より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４。

【0019】

上記のグリコサミノグリカンについて説明する。なお、本明細書において、グリコサミノグリカンを「ＧＡＧ」と称する場合がある。

【0020】

「ＣＳ−２Ｓ４Ｓ」は、２位と４位に硫酸修飾を受けたコンドロイチン硫酸構成２糖である。

【0021】

「ＨＳ−０Ｓ」は硫酸修飾を受けないヘパラン硫酸構成２糖である。

【0022】

「ＨＳ−ＮＳ」はＮ位に硫酸修飾を受けたヘパラン硫酸構成２糖である。

【0023】

「ＨＳ−２Ｓ６Ｓ」は２位と６位に硫酸修飾を受けたヘパラン硫酸構成２糖である。

【0024】

上記の遊離オリゴ糖について説明する。なお、本明細書において、遊離オリゴ糖を「ｆＯＳ」と称する場合がある。

【0025】

（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0026】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0027】

（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0028】

（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0029】

（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0030】

（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１は、例えば、（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１である。

【0031】

（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２は、例えば、（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0032】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２は、例えば、（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0033】

（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２は、例えば、（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0034】

（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２は、例えば、（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0035】

「高マンノース型Ｇｎ１型の総量」は、高マンノース型でＧｌｃＮＡｃ残基が１個の遊離オリゴ糖の総量であり、本明細書において「ＨＭ−Ｇｎ１」と称する場合がある。

【0036】

「高マンノース型Ｇｎ２型の総量」は、高マンノース型でＧｌｃＮＡｃ残基が２個の遊離オリゴ糖の総量であり、本明細書において「ＨＭ−Ｇｎ２」と称する場合がある。

【0037】

「パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量」は、パウチマンノース型でＧｌｃＮＡｃ残基が２個の遊離オリゴ糖の総量であり、本明細書において「ＰＭ−Ｇｎ２」と称する場合がある。

【0038】

「複合型／ハイブリッド型の総量」は、遊離オリゴ糖の複合型とハイブリッド型とを合わせた総量であり、本明細書において「Ｃ／Ｈ」と称する場合がある。

【0039】

（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３は、例えば、（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３である。

【0040】

（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１は、例えば、（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0041】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１は、例えば、（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0042】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３は、例えば、（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３である。

【0043】

（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４は、例えば、（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４である。

【0044】

ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記の少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に対する治療前よりも、当該治療後において増加している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の治療後の試料中の上記より少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該グリコサミノグリカンの発現量と略同等である場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記より少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該グリコサミノグリカンの発現量より減少しており、さらに治療後の該グリコサミノグリカンの発現量が治療前の該グリコサミノグリカンの発現量より増加している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。

【0045】

ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記の少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に対する治療前よりも、当該治療後において減少している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の治療後の試料中の上記より少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該遊離オリゴ糖の発現量と略同等である場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記より少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該遊離オリゴ糖の発現量より増加しており、さらに治療後の該遊離オリゴ糖の発現量が治療前の該遊離オリゴ糖の発現量より減少している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。

【0046】

ライソゾーム病として、以下が例示される。本実施形態において、ライソゾーム病は、例えば、ニーマン・ピック病Ｃ型である。
（１）ゴーシェ（Ｇａｕｃｈｅｒ）病
（２）ニーマン・ピック（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ）病Ａ型、Ｂ型
（３）ニーマン・ピック病Ｃ型
（４）ＧＭ１ガングリオシドーシス
（５）ＧＭ２ガングリオシドーシス（テイ・サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）病、サンドホフ（Ｓａｎｄｈｏｆｆ）病、ＡＢ型）
（６）クラッベ（Ｋｒａｂｂｅ）病
（７）異染性白質ジストロフィー
（８）マルチプルサルファターゼ欠損症
（９）ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）病（ハーラー／シェイエ（Ｈｕｒｌｅｒ／Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）
（１０）ムコ多糖症Ｉ型
（１１）ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）症候群）
（１２）ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリポ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）症候群）
（１３）ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ（Ｍｏｒｑｕｉｏ）症候群）
（１４）ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ）症候群）
（１５）ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ（Ｓｌｙ）病）
（１６）ムコ多糖症ＩＸ型（ヒアルロニダーゼ欠損症）
（１７）シアリドーシス
（１８）ガラクトシアリドーシス
（１９）ムコリピドーシスＩＩ型、ＩＩＩ型
（２０）α−マンノシドーシス
（２１）β−マンノシドーシス
（２２）フコシドーシス
（２３）アスパルチルグルコサミン尿症
（２４）シンドラー（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ）病／神崎病
（２５）ポンペ（Ｐｏｍｐｅ）病
（２６）酸性リパーゼ欠損症
（２７）ダノン（Ｄａｎｏｎ）病
（２８）遊離シアル酸蓄積症
（２９）セロイドリポフスチノーシス
（３０）ファブリー（Ｆａｂｒｙ）病
（３１）シスチン症

【0047】

本明細書において「ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料」とは、例えば、上記に例示されたライソゾーム病に罹患している、ヒトを含む哺乳動物から得られた生体液サンプル（血液、血清、血漿、胃粘液、十二指腸液、膵液、胆汁、腹水、喀痰、気管支肺胞洗浄液等）、組織又は細胞サンプル（胃、十二指腸、大腸、膵臓、胆嚢、胆管、気管支、肺等の癌の組織又は細胞）；ライソゾーム病の原因遺伝子をノックアウトさせた細胞の抽出液又は該細胞を培養した培地などである。また、本明細書において「ライソゾーム病に対する治療」とは、ライソゾーム病を治癒させるために又はその症状を軽減若しくは消失させるために行う治療行為全般を表し、例えば、ライソゾーム病を治療するために薬剤を投与すること、ライソゾーム病を治療するために外科的手術を行うこと等を表す。

【0048】

糖鎖の発現量を測定する方法としては、公知の方法が用いられるが、例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。また、上記糖鎖の単独のものをマーカーとして用いてもよく、又は、２以上の糖鎖の組み合わせをマーカーとして用いてもよい。

【0049】

次に、本実施形態によるライソゾーム病に対する治療効果を判定するための方法について詳細に説明する。

【0050】

本実施形態によるライソゾーム病に対する治療効果を判定するための方法は、
ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、ライソゾーム病に対する治療後に測定する工程を含む。

【0051】

上記の糖鎖及びライソゾーム病の詳細については、前述の通りである。

【0052】

ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記の少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に対する治療前よりも、当該治療後において増加している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の治療後の試料中の上記より少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該グリコサミノグリカンの発現量と略同等である場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記より少なくとも１つ選択されるグリコサミノグリカンの発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該グリコサミノグリカンの発現量より減少しており、さらに治療後の該グリコサミノグリカンの発現量が治療前の該グリコサミノグリカンの発現量より増加している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。

【0053】

ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記の少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に対する治療前よりも、当該治療後において減少している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の治療後の試料中の上記より少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該遊離オリゴ糖の発現量と略同等である場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。また、ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の上記より少なくとも１つ選択される遊離オリゴ糖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の該遊離オリゴ糖の発現量より増加しており、さらに治療後の該遊離オリゴ糖の発現量が治療前の該遊離オリゴ糖の発現量より減少している場合に、その治療は効果を奏していると判定することができる。

【0054】

次に、本実施形態によるライソゾーム病治療薬のスクリーニング方法について詳細に説明する。

【0055】

本実施形態によるライソゾーム病治療薬のスクリーニング方法は、
（ａ）ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、候補薬剤存在下及び非存在下で測定する工程と、
（ｂ）前記候補薬剤存在下及び非存在下での前記糖鎖の発現量を比較する工程と、
を含む。

【0056】

上記工程（ａ）において、上記の糖鎖及びライソゾーム病の詳細については、前述の通りである。また、「ライソゾーム病に罹患している対象由来の上記糖鎖の発現量を、候補薬剤存在下及び非存在下で測定する」とは、例えば、ライソゾーム病の原因遺伝子をノックアウトさせた細胞の培地に候補薬剤を添加して培養した場合（候補薬剤存在下）と候補薬剤を添加しないで培養した場合（候補薬剤非存在下）とで上記糖鎖の発現量を測定する；ライソゾーム病に罹患している哺乳動物に候補薬剤を投与した場合（候補薬剤存在下）と候補薬剤を投与しない場合（候補薬剤非存在下）とで該哺乳動物由来の試料中の上記糖鎖の発現量を測定すること等を表す。

【0057】

上記工程（ｂ）において、候補薬剤存在下及び非存在下での前記糖鎖の発現量を比較して、候補薬剤非存在下に比して候補薬剤存在下でグリコサミノグリカンの発現量が増加している場合、その候補薬剤はライソゾーム病治療薬として有用である可能性があると判断できる。また、候補薬剤非存在下に比して候補薬剤存在下で遊離オリゴ糖の発現量が減少している場合、その候補薬剤はライソゾーム病治療薬として有用である可能性があると判断できる。

【0058】

以上説明したように、本実施形態によるマーカー及び方法によれば、ライソゾーム病に対する治療効果を確実に判定することができる。また、ライソゾーム病治療薬の効率的なスクリーニング方法が提供される。

【0059】

次に、本実施形態によるライソゾーム病の診断マーカーについて詳細に説明する。

【0060】

本実施形態によるライソゾーム病の診断マーカーは、以下に記載の糖鎖より少なくとも１つ選択される糖鎖からなる。
ＧＳＬ糖鎖である、
（Ｈｅｘ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２、
Ｎ−グリカンである、
Ｍａｎ３Ｆ、
Ｍａｎ４、
Ｍａｎ４Ｆ、
Ｍａｎ５Ｆ、
Ｍａｎ５、
Ｍａｎ６、
Ｍａｎ７、
Ｍａｎ８、
Ｍａｎ９、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型糖鎖の総量、
ハイブリッド型糖鎖の総量、
複合型糖鎖の総量、
フコシル化とシアリル化の両者を受けた複合型糖鎖の総量、
Ｏ−グリカンである、
Ｏ−グリカンの総量、
（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４。

【0061】

ＧＳＬ糖鎖である、
（Ｈｅｘ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２
については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して増加している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができる。

【0062】

Ｎ−グリカンである、
Ｍａｎ３Ｆ、
Ｍａｎ４、
Ｍａｎ４Ｆ、
Ｍａｎ５Ｆ、
Ｍａｎ５、
Ｍａｎ６、
Ｍａｎ７、
Ｍａｎ８、
Ｍａｎ９、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型糖鎖の総量、
ハイブリッド型糖鎖の総量、
複合型糖鎖の総量、
フコシル化とシアリル化の両者を受けた複合型糖鎖の総量
については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して増加している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができ、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して減少している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができる。

【0063】

上記のＮ−グリカンについて説明する。

【0064】

Ｍａｎ３Ｆは、パウチマンノース型で、マンノースが３個、フコースが１個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１である。

【0065】

Ｍａｎ４は、パウチマンノース型で、マンノースが４個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0066】

Ｍａｎ４Ｆは、パウチマンノース型で、マンノースが４個、フコースが１個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１である。

【0067】

Ｍａｎ５Ｆは、パウチマンノース型で、マンノースが５個、フコースが１個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１である。

【0068】

Ｍａｎ５は、パウチマンノース型で、マンノースが５個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0069】

Ｍａｎ６は、パウチマンノース型で、マンノースが６個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0070】

Ｍａｎ７は、パウチマンノース型で、マンノースが７個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0071】

Ｍａｎ８は、パウチマンノース型であり、マンノースが８個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0072】

Ｍａｎ９は、パウチマンノース型で、マンノースが８個のＮ−グリカンであり、例えば、（Ｍａｎ）９（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0073】

（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0074】

（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0075】

（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0076】

（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0077】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）４（ＧｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0078】

（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0079】

（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0080】

（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0081】

（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２は、例えば、（Ｇａｌ）４（ＧｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２である。

【0082】

「高マンノース型糖鎖の総量」は、Ｎ−グリカンの高マンノース型糖鎖の総量であり、本明細書において「ＨＭ」と称する場合がある。

【0083】

「ハイブリッド型糖鎖の総量」は、Ｎ−グリカンのハイブリッド型糖鎖の総量であり、本明細書において「Ｈｙｂ」と称する場合がある。

【0084】

「複合型糖鎖の総量」は、Ｎ−グリカンの複合型糖鎖の総量であり、本明細書において「Ｃｏｍ」と称する場合がある。

【0085】

「フコシル化とシアリル化の両者を受けた複合型糖鎖の総量」は、本明細書において「Ｃｏｍ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（＋）」と称する場合がある。

【0086】

Ｏ−グリカンである「Ｏ−グリカンの総量」及び「（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して増加している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができ、「（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１」については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して減少している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができる。

【0087】

以下、Ｏ−グリカンについて説明する。

【0088】

（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１は、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃ、シアリル−Ｔｎである。

【0089】

（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１は、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、シアリル−Ｔである。

【0090】

グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ
については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して減少している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができる。

【0091】

グリコサミノグリカンの各糖鎖の詳細については、前述同様である。

【0092】

遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
については、被験対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量が、ライソゾーム病に罹患していない対象由来の試料中の上記糖鎖の発現量に比して増加している場合、該被験対象はライソゾーム病に罹患していると診断することができる。

【0093】

遊離オリゴ糖の各糖鎖の詳細については、前述同様である。

【0094】

以上説明したように、本実施形態による診断マーカーによれば、ライソゾーム病の診断を確実に行うことができる。

【実施例】

【0095】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0096】

ライソゾーム病の一つであるニーマン・ピック病Ｃ型の遺伝子を欠損した細胞を作製し、ニーマン・ピック病Ｃ型の治療薬である２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）を用いて、ニーマン・ピック病Ｃ型の治療効果を判定することのできる糖鎖マーカーを探索した。

【0097】

（細胞の調製）
以下３種類の細胞を用意した。
・ＷＴ（−）：野生型Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ（ＣＨＯ）細胞（以下、「野生型ＣＨＯ細胞」と称する）
・ＮＰＣ（−）：ニーマン・ピック病Ｃ型の原因遺伝子であるＮｐｃ１をノックアウトさせたＣＨＯ細胞（以下、「Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞」と称する）
・ＮＰＣ（＋）：Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞にニーマン・ピック病Ｃ型の治療薬である２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）（日本食品化工社）で処理した細胞

【0098】

「ＷＴ（−）」（野生型ＣＨＯ細胞）及び「ＮＰＣ（−）」（Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞）は、鳥取大学より提供を受けた。ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変性イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２（シグマ−アルドリッチ社）中で培養した。「ＮＰＣ（＋）」（Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞をＨＰＢＣＤ処理）については、Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞を１ｍＭ ＨＰＢＣＤの存在下で４日間培養した。

【0099】

「ＷＴ（−）」（野生型ＣＨＯ細胞）、「ＮＰＣ（−）」（Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞）及び「ＮＰＣ（＋）」（Ｎｐｃ１ ＫＯ ＣＨＯ細胞をＨＰＢＣＤ処理）について、各々、グライコブロッティングにより網羅的糖鎖解析を行った。

【0100】

（細胞糖タンパク質及び遊離オリゴ糖の抽出）
Ｎ−グリカン及びｆＯＳの分析のために、糖タンパク質及びｆＯＳを、Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｊ．−ｉ．；Ａｒａｋｉ，Ｋ．；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｙ．；Ｐｉａｏ，Ｊ．；Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．； Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｍ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３，１１０，２１０５−２１１０．に記載の方法で抽出した。２％ラウリル硫酸ナトリウムを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００μＬ中に約１×１０^６細胞を懸濁し、超音波ホモジナイザー（タイテック社）を用いて均質化した。細胞タンパク質の還元的アミノ化を行い、４倍量の氷冷エタノールの存在下でタンパク質を沈殿させた。約２．５×１０^５細胞タンパク質と等量の沈殿物を乾燥させ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶解させ、トリプシンで消化した。２ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆを添加することで、脱グリコシル化を行った。細胞ｆＯＳを含む上清を遠心エバポレーターを用いて脱水し、脱イオン水に溶解させた。サンプルを直接、グライコブロッティングに供した。

【0101】

（ＧＳＬ及びＧＡＧの抽出）
ＧＳＬ及びＧＡＧの抽出は、Ｋａｎｎａｎ，Ｒ．；Ｔｊｉｏｎｇ，Ｈ．Ｂ．；Ｄｅｂｕｃｈ，Ｈ．；Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｈ．Ｒ．Ｕｎｕｓｕａｌ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ ａ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｌｉｐｉｄｏｓｉｓ（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ？）．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３５５，５５１−５５６．に記載の方法で行った。細胞ペレットにクロロホルム／メタノール（Ｃ／Ｍ）溶液（２／１、ｖ／ｖ）４５０μＬを添加して脱脂質を行い、Ｎ−グリカン及び糖タンパク質で記載したように、室温で超音波処理を行った。その後、メタノール（１５０μＬ）を加えて、Ｃ／Ｍ＝１／１（ｖ／ｖ）の溶媒組成物を作製し、サンプルを超音波処理した。その後、メタノール（３００μＬ）を加え（Ｃ／Ｍ＝１／２（ｖ／ｖ））、サンプルを再度、超音波処理した。得られた抽出物を１０分間、２０，０００×ｇで遠心分離し、上清及びペレットを各々、ＧＳＬ糖鎖及びＧＡＧの分析に供した。ＧＳＬ糖鎖の分析のために、粗製の細胞脂質を含む上清を遠心エバポレーターを用いて乾燥させた。粗製の細胞脂質を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ−アルドリッチ社）を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μＬに懸濁させ、２５ｍＵのＥＧＣａｓｅＩを添加して、ＧＳＬからインタクトなグリカンを離脱させた。ＧＡＧの分析のために、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）中のプロナーゼ１００μｇを添加することで、ペレットを３７℃で非特異的なプロテアーゼ消化に一晩供した。ＧＡＧ鎖に結合したペプチドを沈殿させるために、エタノール沈殿を糖タンパク質及びｆＯＳの抽出で記載した方法で行った。エタノール沈殿のサンプルをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼＳＤ及びコンドロイチナーゼＡＢＣの各々５ｍＵの混合物を用いて二糖ＧＡＧに消化した。サンプル及び酵素を５ｍＭ酢酸カルシウムを含む１００ｍＭ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μＬ中で３７℃で一晩インキュベートした。消化されたサンプルを遠心分離し、上清を収集し、遠心エバポレーターを用いて乾燥させて、内部標準であるイソマルトトリオース（シグマ−アルドリッチ社）５０ｐｍｏｌを含む脱イオン水２５μＬ中に溶解させた。サンプルを直接、グライコブロッティングに供した。

【0102】

（細胞Ｏ−グライコミクス）
タンパク質のペレットを、糖タンパク質及びｆＯＳの抽出で記載された方法と同様に、約１×１０^６細胞から調製した。エタノール沈殿させたタンパク質をＯ−グライコミクス分析に供した。タンパク質をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（分子量カットオフ、３０００Ｄａ）（ミリポア社）を用いて濃縮した。濃縮されたタンパク質を、Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００マイクロ波リアクターを用いたマイクロ波ＢＥＰ反応に供した。ＢＥＰ反応後、ｂｉｓ−ＰＭＰラベル化ＧＮ４を外部標準として加え、混合物を１．０Ｍ塩酸で中和した。クロロホルムを加えて、混合物を攪拌した。クロロホルム層を除き、水層のＰＭＰラベル化グリカンを、Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｊ．−ｉ．；Ａｒａｋｉ，Ｋ．；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｙ．；Ｐｉａｏ，Ｊ．；Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．；Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｍ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３，１１０，２１０５−２１１０．に記載の方法で、グラファイトカーボンカラム及びイアトロビーズカラムを用いて精製した。

【0103】

（グライコブロッティング）
Ｎ−グリカン、ｆＯＳ、ＧＡＧ及びＧＳＬ糖鎖をグライコブロッティングに供した。グライコブロッティングは、Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｊ．−ｉ．；Ａｒａｋｉ，Ｋ．；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｙ．；Ｐｉａｏ，Ｊ．；Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．；Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｍ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３，１１０，２１０５−２１１０．及びＦｕｒｕｋａｗａ，Ｊ．；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．；Ｋｕｒａｍｏｔｏ，Ｈ．；Ｍｉｕｒａ，Ｙ．；Ｓｈｉｍａｏｋａ，Ｈ．；Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ，Ｍ．；Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｌｙｃｏｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔａｇ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，１０９４−１１０１．に記載の方法で行った。

【0104】

（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ分析）
精製されたＮ−グリカン、Ｏ−グリカン、ｆＯＳ及びＧＳＬ糖鎖溶液に、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（３０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｎ．；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｊ．−ｉ．；Ａｒａｋｉ，Ｋ．；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｙ．；Ｐｉａｏ，Ｊ．；Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｔ．；Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．；Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｍ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３，１１０，２１０５−２１１０．に記載の方法でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析に供した。測定は、リフレクターを備えたＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトロメーターを用いて行われ、付属のプロトコルに従ってＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ ３．０ソフトウェアパッケージ（ブルカーダルトニクスＧｍｂＨ）により制御された。スペクトルを、加速電圧２５ｋＶ、反射電圧２６．３ｋＶ及びポジティブイオンモードでの１６ｎｓのｐｕｌｓｅｄ ｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎで、リフレクトロンモードにおいて得た。質量を、ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ ３．０ ソフトウェアパッケージを用いてアノテートした。ＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅｄｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ／ｇｌｙｃｏｄｂ）及びＳｐｈｉｎＧＯＭＡＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｈｉｎｇｏｍａｐ．ｏｒｇ／）のオンラインデータベースをＧＳＬ糖鎖の構造決定に用いた。絶対定量を、各グリカン由来のＭＳシグナルの領域と１０ｐｍｏｌの内部標準であるＮｅｕＡｃ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２＋Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃｌ（Ａ２ＧＮｌ）（グライコブロッティングの前にサンプル溶液に加えられた）との間の比較分析により行った。フラグメントイオン分析に対するＴＯＦ／ＴＯＦモード測定値を得るために、プリーカーサイオンを８ｋＶに加速し、イオンゲートにおいて選択した。プリーカーサのレーザーによる分解によって生成されたフラグメントイオンをさらに、ＬＩＦＴセルにおいて１９ｋＶまで加速した。フラグメントイオン質量をイオンリフレクターによるイオン通過後に分析した。

【0105】

（結果）
（１．ＧＳＬ糖鎖）
ＧＳＬ糖鎖の解析結果を図１に示す。以下のＧＳＬ糖鎖については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が増加することが示された（図１（ａ）−（ｊ））。したがって、以下のＧＳＬ糖鎖は、ニーマン・ピック病Ｃ型の疾患マーカー（診断マーカー）として有用であることが示唆された。
・（Ｈｅｘ）２：図１（ａ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１：図１（ｂ）
・（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２：図１（ｃ）
・（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１：図１（ｄ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１：図１（ｅ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２：図１（ｆ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１：図１（ｇ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２：図１（ｈ）
・（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２：図１（ｉ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２：図１（ｊ）

【0106】

（２．Ｎ−グリカン）
Ｎ−グリカンの解析結果を図２に示す。以下のＮ−グリカンについては、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が増加することが示された（図２（ａ）−（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）−（ｓ））。したがって、以下のＮ−グリカンは、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。
・Ｍａｎ３Ｆ（（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１）：図２（ａ）
・Ｍａｎ４（（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｂ）
・Ｍａｎ４Ｆ（（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１）：図２（ｃ）
・Ｍａｎ５Ｆ（（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１）：図２（ｄ）
・Ｍａｎ５（（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｅ）
・Ｍａｎ６（（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｆ）
・Ｍａｎ７（（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｇ）
・Ｍａｎ８（（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｈ）
・Ｍａｎ９（（Ｍａｎ）９（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｉ）
・（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｋ）
・（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｍ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｎ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）４（ＧｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｏ）
・（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｐ）
・（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｑ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｒ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）４（ＧｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｓ）

【0107】

また、以下のＮ−グリカンについては、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が減少することが示された（図２（ｊ）、（ｌ））。したがって、以下のＮ−グリカンは、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。
・（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図２（ｊ）
・（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２：図２（ｌ）

【0108】

Ｎ−グリカンのグループの解析結果を図３に示す。以下のＮ−グリカンのグループについては、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が増加することが示された（図３（ａ）、（ｆ））。したがって、以下のＮ−グリカンのグループは、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。
・高マンノース型（ＨＭ）：図３（ａ）
・ハイブリッド型（Ｈｙｂ）：図３（ａ）
・複合型（Ｃｏｍ）：図３（ａ）
・フコシル化とシアリル化の両者を受けた複合型（Ｃｏｍ Ｆｕｃ（＋）Ｓｉａ（＋））：図３（ｆ）

【0109】

（３．Ｏ−グリカン）
Ｏ−グリカンの解析結果を図４に示す。

【0110】

Ｏ−グリカンの総量について、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が増加することが示された（図３（ａ））。したがって、Ｏ−グリカンは、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。

【0111】

また、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃ、シアリル−Ｔｎ）については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が減少することが示された（図４（ｂ））。したがって、（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１は、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。

【0112】

また、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、シアリル−Ｔ）については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で有意に発現が増加することが示された（図４（ｃ））。したがって、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１は、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であることが示唆された。

【0113】

（４．グリコサミノグリカン）
グリコサミノグリカンの解析結果を図５に示す。以下については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で発現が減少し、ＨＰＢＣＤ処理されたＮＰＣ（＋）でＮＰＣ（−）に比して発現が増加することが示された（図５（ａ）、（ｂ））。したがって、以下については、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であるとともに、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果を判定するマーカーとしても有用であることが示唆された。
・ＣＳ−２Ｓ４Ｓ（２位と４位に硫酸修飾を受けたコンドロイチン硫酸構成２糖）：図５（ａ）
・ＨＳ−０Ｓ（硫酸修飾を受けないヘパラン硫酸構成２糖）：図５（ｂ）
・ＨＳ−ＮＳ（Ｎ位に硫酸修飾を受けたヘパラン硫酸構成２糖）：図５（ｂ）
・ＨＳ−２Ｓ６Ｓ（２位と６位に硫酸修飾を受けたヘパラン硫酸構成２糖）：図５（ｂ）

【0114】

（５．遊離オリゴ糖（ｆＯＳ））
ｆＯＳの解析結果を図６に示す。以下については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で発現が増加し、ＨＰＢＣＤ処理されたＮＰＣ（＋）でＮＰＣ（−）に比して発現が減少することが示された（図６（ａ）−（ｊ））。したがって、以下については、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であるとともに、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果を判定するマーカーとしても有用であることが示唆された。
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ａ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ｂ）
・（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ｃ）
・（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ｄ）
・（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）７（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ｅ）
・（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１（（Ｍａｎ）８（ＧｌｃＮＡｃ）１）：図６（ｆ）
・（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図６（ｇ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図６（ｈ）
・（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２（（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図６（ｉ）
・（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２（（Ｍａｎ）６（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図６（ｊ）

【0115】

ｆＯＳの解析結果を図７に示す。以下については、ＷＴ（−）に比してＮＰＣ（−）で発現が増加し、ＨＰＢＣＤ処理されたＮＰＣ（＋）でＮＰＣ（−）に比して発現が減少することが示された（図７（ａ）−（ｆ））。したがって、以下については、ニーマン・ピック病Ｃ型の診断マーカーとして有用であるとともに、ニーマン・ピック病Ｃ型に対する治療効果を判定するマーカーとしても有用であることが示唆された。
・高マンノース型Ｇｎ１型の総量（ＨＭ−Ｇｎ１）：図７（ａ）
・パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量（ＰＭ−Ｇｎ２）：図７（ａ）
・高マンノース型Ｇｎ２型の総量（ＨＭ−Ｇｎ２）：図７（ａ）
・複合型／ハイブリッド型の総量（Ｃ／Ｈ）：図７（ａ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）３）：図７（ｂ）
・（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（（ＮｅｕＡｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図７（ｃ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（（Ｆｕｃ）１（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）：図７（ｄ）
・（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（（Ｇａｌ）１（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３）：図７（ｅ）
・（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４（（Ｇａｌ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）４）：図７（ｆ）

【0116】

（付記項）
（付記項１）
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるライソゾーム病に対する治療効果を判定するためのマーカー。

【0117】

（付記項２）
ライソゾーム病は、ニーマン・ピック病Ｃ型である、
ことを特徴とする付記１に記載のマーカー。

【0118】

（付記項３）
ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、ライソゾーム病に対する治療後に測定する工程を含む、
ことを特徴とするライソゾーム病に対する治療効果を判定するための方法。

【0119】

（付記項４）
ライソゾーム病は、ニーマン・ピック病Ｃ型である、
ことを特徴とする付記３に記載の方法。

【0120】

（付記項５）
（ａ）ライソゾーム病に罹患している対象由来の試料中の
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖の発現量を、候補薬剤存在下及び非存在下で測定する工程と、
（ｂ）前記候補薬剤存在下及び非存在下での前記糖鎖の発現量を比較する工程と、
を含むライソゾーム病治療薬のスクリーニング方法。

【0121】

（付記項６）
ライソゾーム病は、ニーマン・ピック病Ｃ型である、
ことを特徴とする付記５に記載のスクリーニング方法。

【0122】

（付記項７）
ＧＳＬ糖鎖である、
（Ｈｅｘ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）２、
Ｎ−グリカンである、
Ｍａｎ３Ｆ、
Ｍａｎ４、
Ｍａｎ４Ｆ、
Ｍａｎ５Ｆ、
Ｍａｎ５、
Ｍａｎ６、
Ｍａｎ７、
Ｍａｎ８、
Ｍａｎ９、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
高マンノース型、
ハイブリッド型、
複合型、
フコシル化とシアリル化の両者を受けた複合型、
Ｏ−グリカンである、
Ｏ−グリカンの総量、
（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
グリコサミノグリカンである、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２Ｓ６Ｓ、
遊離オリゴ糖である、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）７（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）８（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）６（ＨｅｘＮＡｃ）２、
高マンノース型Ｇｎ１型の総量、
パウチマンノース型Ｇｎ２型の総量、
高マンノース型Ｇｎ２型の総量、
複合型／ハイブリッド型の総量、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３及び
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４
からなる群より少なくとも１つ選択される糖鎖からなるライソゾーム病の診断マーカー。

【0123】

（付記項８）
ライソゾーム病は、ニーマン・ピック病Ｃ型である、
ことを特徴とする付記７に記載のマーカー。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】