特許 6973772 匂いセンサ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6973772

(24)【登録日】2021年11月8日

(45)【発行日】2021年12月1日

(54)【発明の名称】匂いセンサ

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20211118BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20211118BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20211118BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20211118BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/34 BZNA

   C12Q1/02

   !C12N15/12

   !C07K14/705

【請求項の数】15

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2017-80896(P2017-80896)

(22)【出願日】2017年4月14日

(65)【公開番号】特開2018-113957(P2018-113957A)

(43)【公開日】2018年7月26日

【審査請求日】2020年4月13日

(31)【優先権主張番号】特願2017-7762(P2017-7762)

(32)【優先日】2017年1月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】照月 大悟

(72)【発明者】

【氏名】神崎 亮平

(72)【発明者】

【氏名】光野 秀文

(72)【発明者】

【氏名】櫻井 健志

(72)【発明者】

【氏名】ティクシェ三田 アニエス

(72)【発明者】

【氏名】三田 吉郎

(72)【発明者】

【氏名】岡本 有貴

(72)【発明者】

【氏名】年吉 洋

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０１３９１５２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０２７３７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１１２８３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biosens. Bioelectron.，2015年，Vol.65，pp.287-294

【文献】 J. Chem. Ecol.，2016年，Vol.42，pp.716-724

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

半導体基板と、前記半導体基板上に配置された酸化絶縁膜と、前記酸化絶縁膜上に配置されたアルミニウムからなるゲート電極と、を備えるトランジスターと、
前記ゲート電極上に配置された嗅覚受容体を有する昆虫細胞と、
前記昆虫細胞が匂いに反応した際に前記トランジスターで生じる電流を検出する検出装置と、
を備える、匂いセンサ。

【請求項2】

前記トランジスター上に配置された、前記昆虫細胞を入れるためのチャンバーをさらに備える、請求項１に記載の匂いセンサ。

【請求項3】

前記昆虫細胞が、導入遺伝子によって嗅覚受容体を発現している、請求項１又は２に記載の匂いセンサ。

【請求項4】

前記昆虫細胞が、昆虫の嗅覚受容体を発現している、請求項１又は２に記載の匂いセンサ。

【請求項5】

前記嗅覚受容体が、イオンチャンネル型受容体である、請求項１から４のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項6】

前記嗅覚受容体が、ＢｍＯＲ１、ＢｍＯＲ３、Ｏｒ１３ａ、Ｏｒ５６ａ、Ｏｒ８５ｂ及びＰｘＯＲ１から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項7】

前記昆虫細胞が、ガ由来の細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項8】

前記昆虫細胞が、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、及びＴｎｉ由来細胞から選択される、請求項７に記載の匂いセンサ。

【請求項9】

前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項10】

前記昆虫細胞が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である、請求項９に記載の匂いセンサ。

【請求項11】

前記昆虫細胞が、イオン濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現している、請求項１から１０のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項12】

前記トランジスターが、電界効果トランジスターである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項13】

前記ゲート電極が、伸長ゲート電極である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項14】

前記ゲート電極の表面に、アルミニウムが露出している、請求項１から１３のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【請求項15】

前記トランジスターを覆うファラデーケージをさらに備える、請求項１から１４のいずれか１項に記載の匂いセンサ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は検出技術に関し、匂いセンサに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、昆虫が匂いを受容し、識別する分子機構及び神経機構の解析が進み、感度が高く、識別力も高い、昆虫の匂い識別の仕組みが明らかになりつつある。そのため、昆虫の嗅覚機能を、人工的に再現することが可能となりつつある。昆虫は、匂い物質に対する応答選択性が異なる複数の嗅覚細胞の応答パターンの組み合わせにより、匂い物質を識別している。嗅覚細胞の匂い応答特性は、個々の細胞で発現している嗅覚受容体タンパク質の特性により決定される。したがって、匂い物質の情報は、嗅覚受容体の応答パターンの組み合わせとして表現される（例えば、特許文献１参照。）。

【0003】

一方、トランジスターの電極上に細胞を配置し、細胞内の電気的な変化を、トランジスターで検出する研究が進められている。ここで、アルミニウムは細胞毒性を有すると考えられている（例えば、非特許文献１、２参照。）。そのため、トランジスターの電極を金で形成したり、生体適合物質でコーティングしたりする方法が提案されている（例えば、非特許文献３参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１３−２７３７６号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Plattet al., "Aluminiumtoxicity in the rat brain: Histochemical and immunocytochemicalevidence", Brain Research Bulletin, 2001.

【非特許文献2】Campbell et al., "Differential toxicity of aluminum salts in human cell lines of neural origin: implications for neurodegeneration", NeuroToxicology, 2001.

【非特許文献3】Heer et al., "CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogeniccells", Biosensors and Bioelectronics, 2004.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

細胞が配置されるトランジスターの電極を金で形成したり、生体適合物質でコーティングしたりするのは、コストがかかる。そこで、本発明は、コストの低い匂いセンサを提供することを目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の態様によれば、アルミニウム又は酸化アルミニウムを含むゲート電極を備えるトランジスターと、ゲート電極上に配置された嗅覚受容体を有する昆虫細胞と、昆虫細胞が匂いに反応した際にトランジスターで生じる電流を検出する検出装置と、を備える、匂いセンサが提供される。

【0008】

また、本発明の態様によれば、アルミニウム又は酸化アルミニウムを含むゲート電極を備えるトランジスターと、トランジスター上に配置された、嗅覚受容体を有する昆虫細胞を入れるためのチャンバーと、ゲート電極上の昆虫細胞が匂いに反応した際にトランジスターで生じる電流を検出する検出装置と、を備える、匂いセンサが提供される。

【0009】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、導入遺伝子によって嗅覚受容体を発現していてもよい。

【0010】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、昆虫の嗅覚受容体を発現していてもよい。

【0011】

上記の匂いセンサにおいて、嗅覚受容体が、イオンチャンネル型受容体であってもよい。

【0012】

上記の匂いセンサにおいて、嗅覚受容体が、ＢｍＯＲ１、ＢｍＯＲ３、Ｏｒ１３ａ、Ｏｒ５６ａ、Ｏｒ８５ｂ及びＰｘＯＲ１から選択されてもよい。

【0013】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、ガ由来の細胞であってもよい。

【0014】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ及びＴｎｉ由来細胞から選択されてもよい。

【0015】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。

【0016】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞であってもよい。

【0017】

上記の匂いセンサにおいて、昆虫細胞が、イオン濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現していてもよい。

【0018】

上記の匂いセンサにおいて、トランジスターが、電界効果トランジスターであってもよい。

【0019】

上記の匂いセンサにおいて、ゲート電極が、伸長ゲート電極であってもよい。

【0020】

上記の匂いセンサにおいて、ゲート電極の表面に、アルミニウム又は酸化アルミニウムが露出していてもよい。

【0021】

上記の匂いセンサが、トランジスターを覆うファラデーケージをさらに備えていてもよい。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、コストの低い匂いセンサを提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】実施形態に係る匂いセンサの模式図である。

【図2】実施例に係る匂いセンサの模式的断面図である。

【図3】実施例に係るアルミニウム伸長ゲート電極を備える匂いセンサの写真である。

【図4】実施例に係る酸化アルミニウムをスパッタリングした伸長ゲート電極を備える匂いセンサの写真である。

【図5】ボンビコールとボンビカールの化学式である。

【図6】１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌの化学式である。

【図7】実施例に係るＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いた、匂い分子の検出結果を示すグラフである。

【図8】実施例に係るＯｒ１３ａ受容体を発現している細胞を用いた、匂い分子の検出結果を示すグラフである。

【図9】実施例に係るＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いた、匂い分子の検出結果を示すグラフである。

【図10】実施例に係るＯｒ１３ａ受容体を発現している細胞を用いた、匂い分子の検出結果を示すグラフである。

【図11】実施例に係る、アルミニウム基板上におけるＳｆ２１細胞の経時変化を示す顕微鏡写真である。

【図12】実施例に係る、アルミニウム基板上におけるＳｆ２１細胞の生存割合の経時変化を示すグラフである。

【図13】実施例に係る、アルミニウム基板上におけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の経時変化を示す顕微鏡写真である。

【図14】アルミニウム基板上におけるＳｆ２１細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞の増加曲線を示すグラフである。

【図15】ファラデーケージを設置した場合と、設置しなかった場合における、ＭＯＳＦＥＴのドレイン電流の時間変化を示すグラフである。

【図16】ファラデーケージを設置した場合と、設置しなかった場合における、ＭＯＳＦＥＴのドレイン電流のノイズの大きさを示すグラフである。

【図17】実施例に係るＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いた、異なる流量を用いた場合の匂い分子の検出結果を示すグラフである。

【図18】実施例に係るＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いて、匂い分子を繰り返し検出した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

【0025】

実施形態に係る匂いセンサは、図１に示すように、アルミニウム又は酸化アルミニウムを含むゲート電極１４を備えるトランジスター１０と、ゲート電極１４上に配置された嗅覚受容体を有する昆虫細胞５０と、昆虫細胞５０が匂いに反応した際にトランジスター１０で生じる電流を検出する検出装置８０と、を備える。

【0026】

トランジスター１０は、半導体基板１１を備える。トランジスター１０は、例えば、電界効果トランジスター（ＦＥＴ）であり、ＭＯＳＦＥＴであってもよい。半導体基板１１内の表面近傍には、ソース電極１２及びドレイン電極１３が、間隔をおいて設けられている。半導体基板１１のソース電極１２及びドレイン電極１３の間の上に、酸化絶縁膜を挟んでゲート電極１４が配置されている。ゲート電極１４には、伸長（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ゲート電極であってもよい。

【0027】

ゲート電極１４の表面には、アルミニウム又は酸化アルミニウムが露出している。例えば、ゲート電極１４は、アルミニウムからなり、表面近傍に酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）からなる酸化膜が形成されている。表面近傍に酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）からなる酸化膜が形成されていなくてもよい。伸長ゲート電極であるゲート電極１４は、昆虫細胞５０が配置される領域を有する。昆虫細胞５０が配置される領域の大きさは、例えば１００μｍ×１００μｍであるが、これに限定されない。ゲート電極１４に配置される昆虫細胞５０の数は、例えば１０個以下であるが、これに限定されない。

【0028】

昆虫細胞５０は、トランジスター１０のゲート電極１４上に配置されている。ゲート電極１４上に昆虫細胞５０を含む溶液を与え、数十分から数時間静置することにより、昆虫細胞５０は、ゲート電極１４に接着する。昆虫細胞５０は、細胞膜に嗅覚受容体を発現している。昆虫細胞５０において、嗅覚受容体は天然に発現されていてもよいし、導入遺伝子によって発現されていてもよい。

【0029】

昆虫細胞は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）等のガ由来の細胞であってもよい。ヨトウガ由来の細胞の例としては、Ｓｆ２１及びＳｆ９が挙げられる。Ｓｆ２１細胞は、卵巣細胞由来である。Ｓｆ２１細胞は、無限分裂し、導入した遺伝子を永続的に発現する安定発現系統を樹立することが可能である。また、Ｓｆ２１細胞は、１８℃から４０℃の広い温度範囲で生存可能であり、培養液のｐＨを調整するための二酸化炭素も不要である。Ｓｆ２１細胞は、本来、嗅覚受容体を有しないが、嗅覚受容体の遺伝子を導入することにより、嗅覚受容体を発現させることが可能である。Ｓｆ９細胞は、Ｓｆ２１のクローンである。イラクサギンウワバ由来の細胞の例としては、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ及びＴｎｉが挙げられる。Ｔｎｉ由来細胞は、卵巣細胞由来である。

【0030】

あるいは、昆虫細胞は、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。ショウジョウバエ由来の細胞の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞が挙げられる。

【0031】

嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャンネル型受容体であってもよい。イオンチャネル型受容体は、匂い分子であるリガンドと相互作用する部位と、イオンが流入する部位と、を有する。昆虫細胞５０のイオンチャンネル型受容体がリガンドと結合すると、昆虫細胞５０内にナトリウムイオンやカルシウムイオン等の陽イオンが流入する。昆虫細胞５０において、イオンの流入は、リガンドの結合から数１０ミリ秒程度で生じ得る。流入するイオンの量は多く、１個のリガンドの結合に対し、細胞内に流入するイオンの量は１０⁷個ともいわれている。

【0032】

一般に、特定の種類の嗅覚受容体は、特定の匂い分子に対する特異性を有する。昆虫細胞５０において、１種類の匂い分子に対応する１種類の嗅覚受容体のみを発現させてもよいし、複数種類の匂い分子に対応する複数種類の嗅覚受容体を発現させてもよい。また、発現させる嗅覚受容体の量を調整して、匂いセンサの検出感度を調整してもよい。

【0033】

嗅覚受容体の例としては、カイコガの性フェロモンであるボンビコール（Ｂｏｍｂｙｋｏｌ）の受容体であるＢｍＯＲ１、カイコガの性フェロモンであるボンビカール（Ｂｏｍｂｙｋａｌ）の受容体であるＢｍＯＲ３、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭である１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌの受容体であるＯｒ１３ａ、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭であるｇｅｏｓｍｉｎの受容体であるＯｒ５６ａ、キイロショウジョウバエの一般臭受容体であるＯｒ８５ｂ、及びコナガの性フェロモン受容体であるＰｘＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

遺伝子工学的に嗅覚受容体を昆虫細胞５０に発現させる場合は、例えば、嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせる。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚器官からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して単離することができる。単離されたｃＤＮＡから、ＰＣＲプライマーを用いて、嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部をＰＣＲ法にて増幅することが可能である。

【0035】

嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖ｃＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製することによっても取得することができる。ｃＤＮＡは、制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法によって、ベクターに組込むことができる。

【0036】

昆虫細胞５０において、嗅覚受容体とともに蛍光タンパク質が発現されていてもよい。例えば昆虫細胞５０において、イオンチャンネル型嗅覚受容体に匂い分子が結合すると、昆虫細胞５０内にカルシウムイオン等のイオンが流れる。したがって、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現させる遺伝子を昆虫細胞５０に導入することにより、蛍光強度の変化からも、昆虫細胞５０が匂い分子を検出しているか否かを確認することが可能となる。蛍光タンパク質の例としては、ＧＣａＭＰ３、ＧＣａＭＰ６ｓ及びエクオリンが挙げられる。

【0037】

実施形態に係る匂いセンサのゲート電極１４の少なくとも一部は、チャンバー６０中に配置される。チャンバー６０には、検出対象となる匂い分子を含む可能性がある溶液７０が入れられる。溶液７０は、昆虫細胞５０の生存に必要な物質を適宜含んでいてもよい。また、チャンバー６０内には、溶液７０と接触するように、参照電極１５が配置される。

【0038】

チャンバー６０には、匂い分子を含む可能性のある溶液をチャンバー６０内に送り込むための導入口と、チャンバー６０内の溶液を排出するための排出口と、が設けられていてもよい。チャンバー６０の導入口には、溶液をチャンバー６０内に送り込むための導入ポンプが接続される。また、チャンバー６０の排出口には、溶液をチャンバー６０から排出するための排出ポンプが接続される。導入ポンプ及び排出ポンプとしては、例えば定量送液ポンプが使用可能である。

【0039】

溶液７０に、昆虫細胞５０が有する嗅覚受容体に対応する匂い分子が存在する場合、昆虫細胞５０が匂い分子に反応してゲート電極１４のゲート電位が変位し、ソース電極１２及びドレイン電極１３の間を流れるドレイン電流に変調が生じる。したがって、トランジスター１０のドレイン電流の変調を検出することによって、匂い分子の存在を検出することが可能である。

【0040】

検出装置８０は、例えば、トランジスター１０のソース電極１２、ドレイン電極１３、バックゲート１６、及び参照電極１５に接続されており、トランジスター１０のドレイン電流の変調を検出する。検出装置８０としては、ソースメジャーユニット（ＳＭＵ）等が使用可能である。検出装置８０には、検出された電流を分析したり、ディスプレイに表示したりするためのコンピュータシステム３００が接続されていてもよい。

【0041】

昆虫細胞５０が匂い分子に反応してゲート電極１４のゲート電位が変位する理由としては、昆虫細胞５０が匂い分子に反応すると、昆虫細胞５０において内向きのイオン流が生じるためと考えられるが、当該理論に拘束されるものではない。

【0042】

実施形態に係る匂いセンサをアレイ状に配置し、個々の匂いセンサの細胞に異なる嗅覚受容体を発現させることにより、異なる匂い分子を検出することも可能である。

【0043】

実施形態に係る匂いセンサは、トランジスター１０を覆うファラデーケージを備えていてもよい。ファラデーケージは、電場からトランジスター１０を遮蔽するため、匂いセンサにおけるドレイン電流のノイズを低下させることが可能である。

【0044】

従来、アルミニウム及び酸化アルミニウムは、細胞にとって有害と考えられていた。そのため、従来、トランジスターと細胞とを組み合わせた匂いセンサを製造する際には、トランジスターの電極を金で形成したり、生体適合物質でコーティングしたりして、その上に細胞を配置していた。しかし、これらの手法は、コストがかかる。これに対し、本発明者らは、鋭意研究の末、昆虫細胞は、アルミニウム又は酸化アルミニウムが表出する電極の上に配置されても、アルミニウム又は酸化アルミニウムによってダメージを受けず、長期にわたって生存可能であることを見出した。したがって、実施形態によれば、コストの低い匂いセンサを提供可能である。

【0045】

アルミニウム又は酸化アルミニウムを含むゲート電極１４上で、昆虫細胞５０は、例えば５日以上生存可能である。

【0046】

実施形態に係る匂いセンサは、使用後、洗浄することにより、トランジスター１０の部分を繰り返し再使用することが可能である。洗浄方法としては、例えば、トランジスター１０の表面に、市販の洗剤を滴下すればよい。

【0047】

（実施例）
（トランジスター等の製造）
アルミニウム伸長ゲート電極を備える、複数のＭＯＳＦＥＴが形成された６インチウェハをステルスダイシングで切断し、必要な個数のＭＯＳＦＥＴを含むチップを切り出した。さらに、スパッタリング装置を用いて、アルミニウム伸長ゲート電極表面に、イオン感応膜としての酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）膜を形成した。酸化アルミニウム膜の厚さは、４０ｎｍから８０ｎｍであった。その後、イオン感応膜が形成されたチップと、プリント回路基板と、をワイヤーボンディングで接続した。さらに、エポキシ樹脂を用いて、図２に示すように、ＭＯＳＦＥＴの伸長ゲート電極を含むチップを囲むチャンバーを形成した。

【0048】

（細胞の用意）
カイコガの触角ｃＤＮＡ由来の、共受容体であるＢｍＯｒｃｏの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＢｍＯｒｃｏ遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＢｍＯｒｃｏ遺伝子を、ｐＩＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＢ−ＢｍＯｒｃｏベクターを構築した。
BmOrco：
フォワード：5'-ATGATGACCAAGGTCAAGACGC-3'
リバース：5'-CTACTTCAGTTGGATCAACACC-3'

【0049】

ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、各１００ｐｍｏｌ／Ｌの濃度のフォワードプライマー及びリバースプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）Ｒ０１０Ａ）、当該ポリメラーゼに添付の反応バッファー、並びにｄＮＴＰを使用し、ポリメラーゼに添付のプロトコールに従って行った。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で１分間のステップ、次に、９８℃で１０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１．５分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返すステップ、その後、７２℃で５分間のステップとした。

【0050】

同様に、カイコガの触角ｃＤＮＡ由来の、受容体であるＢｍＯＲ３の遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、以下の遺伝子特異的な配列を含むプライマーで増幅し、ＢｍＯＲ３遺伝子（ＯＲＦの完全長）を得た。得られたＢｍＯＲ３遺伝子を、ｐＩＢベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＩＢ−ＢｍＯＲ３ベクターを構築した。
BmOR3：
フォワード：5'-ATGATATTCGTCGACGATGCTG-3'
リバース：5'-TCATTCGGACACGGTACG-3'

【0051】

次に、ｐＩＢ−ＢｍＯＲ３ベクターのタンパク質発現カセット（ＯｐＩＥ２プロモーター（Ｐ（ＯｐＩＥ２））、ＢｍＯＲ３、ＯｐＩＥ２ポリＡ付加シグナル（ＯｐＩＥ２ｐＡ）と連なる部分）を増幅し、ｐＩＢ−ＢｍＯｒｃｏベクターのＢｓｐＨ１部位に、増幅されたタンパク質発現カセットを挿入し、デュアル発現ベクターｐＩＢ−ＢｍＯＲ３−ＢｍＯｒｃｏを構築した。

【0052】

構築したデュアル発現ベクターを、リポフェクション法（ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎＩＩの添付のマニュアルに従って、Ｓｆ２１細胞に導入した。これにより、ＢｍＯＲ３受容体及び共受容体ＢｍＯｒｃｏを発現しているＳｆ２１細胞を得た。また、同様の手法により、Ｏｒ１３ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏを発現しているＳｆ２１細胞を得た。

【0053】

（匂いセンサの製造）
上述したように、ＢｍＯＲ３受容体及び共受容体ＢｍＯｒｃｏを発現しているＳｆ２１細胞と、Ｏｒ１３ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏを発現しているＳｆ２１細胞と、を用意した。それぞれのＳｆ２１細胞を、１日から３日間、継代した。その後、Ｓｆ２１細胞をアッセイバッファーに分散させ、セルカウンターを用いて、溶液中の細胞濃度を１．０×１０⁶細胞／ｍＬから１．５×１０⁶細胞／ｍＬに調整した。アッセイバッファーの組成は、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、 ４．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ₂、１１．２６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ₂、１１．３２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ₄、９．４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳであり、アッセイバッファーのｐＨは７．２であった。

【0054】

次に、２００μＬのＳｆ２１細胞を含む溶液を、ＭＯＳＦＥＴの伸長ゲート電極を囲むチャンバーに滴下することにより、Ｓｆ２１細胞を伸長ゲート電極上に播種した。その後、３０分間静置して、図３及び図４に示すように、Ｓｆ２１細胞を伸長ゲート電極上に接着させた。なお、図３に示す匂いセンサは、アルミニウム（Ａｌ）伸長ゲート電極を備える。また、図４に示す匂いセンサは、イオン感応膜として、アルミニウム伸長ゲート電極上にスパッタリングによって形成した、酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）膜を備える。

【0055】

（匂い物質含有液の調製）
ＢｍＯＲ３受容体に結合する匂い分子であるボンビカール（Ｂｏｍｂｙｋａｌ）と、ＢｍＯＲ１受容体に結合する匂い分子であるボンビコール（Ｂｏｍｂｙｋｏｌ）と、Ｏｒ１３ａ受容体に結合する匂い分子である１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌ（シグマアルドリッチ）と、を用意した。ボンビカール及びボンビコールは、筑波大学の松山茂博士にご提供いただいた。用意した匂い分子を、それぞれ、１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシド（０４９−０７２１３、和光純薬工業）を含むアッセイバッファーに溶解させた。ボンビコールとボンビカールの化学式は、図５に示すとおりであり、非常に類似する化学構造を有する。１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌの化学式は、図６に示すとおりである。

【0056】

（匂いセンサのセットアップ）
チャンバー内の溶液に接触するように参照電極を設置した。また、図７から図１０で示す実施例では、チャンバーの導入口と、排出口と、のそれぞれに、ペリスタルティックチューブポンプ（ＭＰ−２０１０：東京理化器械株式会社）を接続した。その後、図７から図９では、導入口及び排出口における流速が１４０μＬ／分となるように設定し、１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーをチャンバー内に流した。図１０では、導入口及び排出口における流速が２５０μＬ／分となるように設定した。図１５から図１８で示す実施例では、ぺリスタ・バイオミニポンプ（ＡＣ−２１２０：ＡＴＴＯ）を、チャンバーの導入口と、排出口と、のそれぞれに接続した。その後、導入口及び排出口における流速が６７０μＬ／分と１５００μＬ／分になるように設定し、１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーをチャンバー内に流した。

【0057】

ＭＯＳＦＥＴのソース電極、ドレイン電極、バックゲート及び参照電極を、ソースメジャーユニット（ＳＭＵ、Ｂ２９０２Ａ、キーサイト・テクノロジー）に接続し、ＳＭＵを用いて、ドレイン電極に２．５Ｖ、ソース電極に―２．５Ｖ、参照電極に０Ｖの電圧を加えた。その後、ＳＭＵで検出されるドレイン電流が安定するまで、５００秒から１０００秒ほど静置した。

【0058】

（酸化アルミニウム上のＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いた匂い検出）
ＢｍＯＲ３受容体を発現しているＳｆ２１細胞を備える匂いセンサのチャンバーに、上記の１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーを流し、次に、３０μｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビコールを含むアッセイバッファーを１００秒間流し、その後、３０μｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビカールを含むアッセイバッファーを１００秒間流した。上述したように、ボンビコールは他の受容体に特異的に結合し、ボンビカールがＢｍＯＲ３受容体に結合する。

【0059】

その結果、図７に示すように、匂い分子を含まないアッセイバッファーを流している間、及びボンビコールを流している間は、ドレイン電流には、バックグラウンドノイズを上回る変調は見られなかった。これに対し、ボンビカールを流すと、ドレイン電流が０．５μＡ上昇した。上述したように、ボンビコールと、ボンビカールと、は、類似する化学構造を有し、分子量の差も近いが、実施例に係る匂いセンサが、ボンビカールを特異的に検出可能であることが示された。

【0060】

（酸化アルミニウム上のＯｒ１３ａ受容体を発現している細胞を用いた匂い検出）
Ｏｒ１３ａ受容体を発現しているＳｆ２１細胞を備える匂いセンサのチャンバーに、上記の１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーを流し、次に、３０μｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビカールを含むアッセイバッファーを１２０秒間流し、その後、３０μｍｏｌ／Ｌの濃度で１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを含むアッセイバッファーを１２０秒間流した。上述したように、ボンビカールは他の受容体に特異的に結合し、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌがＯｒ１３ａ受容体に結合する。

【0061】

その結果、図８に示すように、匂い分子を含まないアッセイバッファーを流している間、及びボンビカールを流している間は、ドレイン電流には、バックグラウンドノイズを上回る変調は見られなかった。これに対し、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを流すと、ドレイン電流が０．１μＡ上昇した。

【0062】

（匂いセンサの洗浄）
ホワイト７−ＡＬ（アルカリ性、無泡性、ユーアイ化成株式会社）を超純水（ｍｉｌｌｉＱ）で２％に希釈し、洗浄液を作製した。匂いセンサのチャンバー内に、１ｍＬの洗浄液を入れ、ピペッティングし、ピペッティング後の洗浄液を廃棄した。当該洗浄を５回繰り返した。次に、チャンバー内に１ｍＬの超純水を入れ、ピペッティングし、ピペッティング後の水を廃棄した。当該洗浄を３回繰り返した。その後、エアーブローを用いて伸長ゲート電極を乾燥させた。

【0063】

ＭＯＳＦＥＴに細胞をＢｍＯＲ３受容体を発現している播種し、匂いを検出することと、ＭＯＳＦＥＴを洗浄することと、を４回繰り返したところ、図９に示すように、複数回洗浄を繰り返しても、匂いセンサは、ボンビカールに特異的に反応することが確認された。

【0064】

（アルミニウム上のＯｒ１３ａ受容体を発現している細胞を用いた匂い検出）
伸長ゲート電極表面が、酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）ではなくアルミニウムである以外は、上記と同様である、Ｏｒ１３ａ受容体を発現しているＳｆ２１細胞を備える匂いセンサを製造した。当該センサのチャンバーに、上記の１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーを流し、次に、１００μｍｏｌ／Ｌの濃度でデカノールを含むアッセイバッファーを１２０秒間流し、その後、１００μｍｏｌ／Ｌの濃度で１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを含むアッセイバッファーを１２０秒間流した。

【0065】

その結果、図１０に示すように、匂い分子を含まないアッセイバッファーを流している間、及びデカノールを流している間は、ドレイン電流には、バックグラウンドノイズを上回る変調は見られなかった。これに対し、１−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌを流すと、ドレイン電流が１．２μＡ上昇した。

【0066】

（アルミニウム基板上における細胞の生存割合）
スパッタリング装置によって、シリコン基板の表面に膜厚５００ｎｍのアルミニウム膜を形成し、アルミニウム基板を得た。また、嗅覚受容体を導入していない、ワイルドタイプのＳｆ２１細胞を用意した。

【0067】

図１１に示すように、Ｓｆ２１細胞をアルミニウム基板上に播種してから５日間、毎日、アルミニウム基板上のＳｆ２１細胞の生死判定を行った。生死判定には、トリパンブルー（和光純薬）を用いた色素排除試験法を用いた。色素排除試験法によれば、死細胞は色素によって青く染色されるため、顕微鏡観察により、生存細胞の割合を求めることが可能である。

【0068】

その結果、図１２に示すように、５日間にわたって、９７％以上のＳｆ２１細胞が、アルミニウム基板上で生存していることが確認された。さらに、図１１に示した顕微鏡観察の結果から、Ｓｆ２１細胞は、アルミニウム基板上でも成長し、細胞密度が増加したことが確認された。

【0069】

次に、ヒト胎児腎由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用意した。図１３に示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をアルミニウム基板上に播種してから５日間、毎日、アルミニウム基板上のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生死判定を行った。生死判定には、トリパンブルー（和光純薬）を用いた色素排除試験法を用いた。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、アルミニウム基板上では時間が経っても細胞成長が遅く、アルミニウム基板の腐食により細胞が死滅する場合も観察された。

【0070】

アルミニウム基板上におけるＳｆ２１細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞の増加曲線を図１４に示す。Ｓｆ２１細胞は、アルミニウム基板上で成長することが確認された。これに対し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、アルミニウム基板上で数が増減し、細胞数が安定しなかった。

【0071】

以上の結果は、昆虫細胞は、アルミニウム基板に対する適合性を有するが、哺乳類細胞は、アルミニウム基板に対する適合性を有しないことを示していた。

【0072】

（ファラデーケージを用いた匂い検出）
酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）膜を形成したＭＯＳＦＥＴの周囲にファラデーケージを設置した場合のドレイン電流のノイズレベルと、ＭＯＳＦＥＴの周囲にファラデーケージを設置しなかった場合のドレイン電流のノイズレベルと、を測定した。その結果、図１５及び図１６に示すように、ファラデーケージを設置すると、ドレイン電流のノイズレベルがおおよそ１／３まで有意に減少することが確認された。

【0073】

（匂い検出における流量の影響の評価）
ＢｍＯＲ３受容体を発現しているＳｆ２１細胞を備える匂いセンサのチャンバーに、上記の１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーを流し、次に、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビカールを含むアッセイバッファーを流量６７０μＬ／分で約６０秒間又は１５００μＬ／分で約３０秒間流した。上述したように、ボンビカールはＢｍＯＲ３受容体に結合する。なお、匂いセンサは卓上除振台上に配置した。また、匂いセンサは、ファラデーケージを備えていた。

【0074】

その結果、図１７に示すように、流量が約６７０μＬ／分のときは、ボンビカールの応答検出の後にドレイン電流が基底値に戻らなかった。これに対し、流量が約１５００μＬ／分のときは、ボンビカールの応答検出の後にドレイン電流が基底値に戻った。なお、適当な流量は、匂いセンサの大きさ、形状、及び感度等に応じて変動しうる。したがって、適当な流量は、匂いセンサの大きさ、形状、及び感度等に応じて、適宜設定されればよい。

【0075】

（酸化アルミニウム上のＢｍＯＲ３受容体を発現している細胞を用いた繰り返し匂い検出）
ＢｍＯＲ３受容体を発現しているＳｆ２１細胞を備える匂いセンサのチャンバーに、１ｖ／ｖ％以下の濃度でジメチルスルホキシドを含むアッセイバッファーを流し、コントロールとして流している溶液と同じアッセイバッファーを約３０秒間流した。次に、１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビカールを含むアッセイバッファーを約３０秒間流した。その後、匂い分子を含まないアッセイバッファーを流し、匂い分子を匂いセンサから脱離させ、ドレイン電流を基底値に戻した。さらにその後、１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度でボンビカールを含むアッセイバッファーを約３０秒間流した。この時の溶液の流量は約１５００μＬ／分となるように設定した。なお、匂いセンサは卓上除振台上に配置した。また、匂いセンサは、ファラデーケージを備えていた。その結果、図１８に示すように、匂い分子を繰り返し検出可能であることが示された。

【符号の説明】

【0076】

１０・・・トランジスター、１１・・・半導体基板、１２・・・ソース電極、１３・・・ドレイン電極、１４・・・ゲート電極、１５・・・参照電極、１６・・・バックゲート、５０・・・昆虫細胞、６０・・・チャンバー、７０・・・溶液、８０・・・検出装置、３００・・・コンピュータシステム

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]